CN113981084A

CN113981084A - 一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物及其应用

Info

Publication number: CN113981084A
Application number: CN202111297267.8A
Authority: CN
Inventors: 徐石宸; 张莉; 蔡刚明; 顾晓波; 吴静; 程献; 俞惠新; 包建东
Original assignee: Jiangsu Institute of Nuclear Medicine
Current assignee: Jiangsu Institute of Nuclear Medicine
Priority date: 2021-11-03
Filing date: 2021-11-03
Publication date: 2022-01-28

Abstract

本发明涉及一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物及其应用，属于医药技术领域。本发明提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物，此分子标志物为ZNF148蛋白突变体或ZNF148基因突变体，此ZNF148蛋白突变体与ZNF148蛋白相比，第540位缬氨酸、第546位天冬氨酸、第554位甘氨酸、第555位谷氨酰胺或第579位脯氨酸中的至少一位发生了突变，此ZNF148基因突变体与ZNF148基因相比，第1619位胸腺嘧啶、第1636位鸟嘌呤、第1660位鸟嘌呤、第1664位腺嘌呤、第1728位腺嘌呤或第1736位胞嘧啶中的至少一位发生了突变；此分子标志物与良性甲状腺结节的发生有很强的相关性。

Description

一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物及其应用，属于医药技术领域。

背景技术

甲状腺结节，特别是甲状腺癌的发病率在全球范围内呈现显著的上升趋势。流行病学研究显示，在碘充足地区，有5％的女性和1％的男性存在可触及的甲状腺结节。在高发的老年和女性人群中，经高分辨率超声检查，19～67％的随机选择人群有甲状腺结节，其中5～15％的甲状腺结节为恶性，即甲状腺癌。良恶性甲状腺结节的临床处理方式不同，对患者生存质量的影响和涉及的医疗花费也有显著差异。面对如此庞大的患者群体，甲状腺结节的良恶性鉴别尤为重要。

高分辨率超声检查是评估甲状腺结节的首选方法，但是，甲状腺结节的超声像图表现复杂多样，良恶性判断困难。并且，高分辨率超声检查有赖于超声设备的性能，更与超声医师的临床经验密切相关，因此，使用其进行临床诊断的过程中仍存在大量可疑的甲状腺结节。

为了减少不必要的甲状腺结节手术，并帮助医生确定恰当的手术方案，提高甲状腺癌的确诊率十分关键。现阶段，临床上常使用细针穿刺(Fine-needle aspirationbiopsy，FNAB)对经超声判断具有高恶性肿瘤风险的甲状腺结节进行进一步诊断以提高甲状腺癌的确诊率。FNAB可将诊断甲状腺癌的阳性预测率提升至50～96％。但是，FNAB也存在一定的局限性，例如，FNAB尚不能区分甲状腺滤泡癌和甲状腺滤泡腺瘤。

随着分子病理诊断的日益发展，对穿刺样本进行某些甲状腺癌分子标志物的检测已被应用于临床实践，对经FNAB仍不能确定良恶性的甲状腺结节进行了有效的补充，进一步提高了甲状腺癌的确诊率。目前，针对甲状腺结节良恶性的分子诊断方法大致可以分为两类：针对恶性甲状腺结节的“划入规则(rule in)”和针对良性甲状腺结节的“排除规则(rule out)”。

其中，针对恶性甲状腺结节的“划入规则(rule in)”已被广泛的研究，其中应用最为广泛的是RAS和BRAF突变以及RET/PTC和Pax8/PPARγ重排，这些基因改变的联合检测对甲状腺癌诊断的特异性和阳性预测率分别可以达到97～100％和87～100％；而针对良性甲状腺结节的“排除规则(rule out)”则仍处于研究起步阶段，仅有SPOP(29/231，11.2％)、EZH1(24/231，9.3％)和ZNF148(14/231，5.4％)这几个确诊率较低的分子标志物。因此，良性甲状腺结节，尤其是腺瘤样结节，在临床细针穿刺检查中，如何明确地与恶性甲状腺结节区分开，还是一个临床确诊的重要难题。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物，所述分子标志物为ZNF148蛋白突变体；所述ZNF148蛋白突变体与ZNF148蛋白相比，第540位缬氨酸、第546位天冬氨酸、第554位甘氨酸、第555位谷氨酰胺或第579位脯氨酸中的至少一位发生了突变；

或者，所述分子标志物为ZNF148基因突变体；所述ZNF148基因突变体与ZNF148基因相比，第1619位胸腺嘧啶、第1636位鸟嘌呤、第1660位鸟嘌呤、第1664位腺嘌呤、第1728位腺嘌呤或第1736位胞嘧啶中的至少一位发生了突变。

在本发明的一种实施方式中，所述ZNF148蛋白突变体与ZNF148蛋白相比，第540位缬氨酸突变为了丙氨酸，第546位天冬氨酸突变为了组氨酸，第554位甘氨酸突变为了精氨酸，第555位谷氨酰胺突变为了亮氨酸，和/或，第579位脯氨酸突变为了亮氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述ZNF148基因突变体与ZNF148基因相比，第1619位胸腺嘧啶突变为了胞嘧啶，第1636位鸟嘌呤突变为了胞嘧啶，第1660位鸟嘌呤突变为了胞嘧啶，第1664位腺嘌呤突变为了胸腺嘧啶，第1728位腺嘌呤突变为了胸腺嘧啶，和/或，第1736位胞嘧啶突变为了胸腺嘧啶。

在本发明的一种实施方式中，所述ZNF148蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述ZNF148基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述诊断甲状腺结节良恶性包含区分甲状腺滤泡癌和甲状腺滤泡腺瘤。

本发明还提供了检测上述分子标志物的检测试剂在制备用于诊断甲状腺结节良恶性的产品中的应用。

本发明还提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒，所述试剂盒包含检测试剂；所述检测试剂能够检测ZNF148蛋白的第540位突变、第546位突变、第554位突变、第555位突变或第579位突变中的至少一个；或者，所述检测试剂能够检测ZNF148基因的第1619位突变、第1636位突变、第1660位突变、第1664位突变、第1728位突变或第1736位突变中的至少一个。

在本发明的一种实施方式中，所述检测试剂包含能够与ZNF148蛋白中第540位V→A突变，第546位D→H突变，第554位G→R突变，第555位Q→L突变，和/或，第579位P→L突变特异性结合的抗体；

或者，所述检测试剂包含能够与ZNF148基因中第1619位的T→C突变，第1636位的G→C突变，第1660位的G→C突变，第1664位的A→T突变，第1728位的A→T突变，和/或，第1736位的C→T突变特异性结合的引物、探针或芯片。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒还包含扩增试剂；所述扩增试剂能够特异性扩增ZNF148基因的第1402～1916位；或者，所述扩增试剂能够特异性扩增ZNF148基因中，含有第1402～1916位的片段。

在本发明的一种实施方式中，所述扩增试剂为核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示的引物对；或者，所述扩增试剂为核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒用于良性甲状腺结节的辅助判断。

在本发明的一种实施方式中，所述辅助判断包含区分甲状腺滤泡癌和甲状腺滤泡腺瘤。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒的使用对象为甲状腺结节细针穿刺样本。

本发明技术方案，具有如下优点：

1、本发明提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物，所述分子标志物为ZNF148蛋白突变体或ZNF148基因突变体，所述ZNF148蛋白突变体与ZNF148蛋白相比，第540位缬氨酸、第546位天冬氨酸、第554位甘氨酸、第555位谷氨酰胺或第579位脯氨酸中的至少一位发生了突变，所述ZNF148基因突变体与ZNF148基因相比，第1619位胸腺嘧啶、第1636位鸟嘌呤、第1660位鸟嘌呤、第1664位腺嘌呤、第1728位腺嘌呤或第1736位胞嘧啶中的至少一位发生了突变；所述分子标志物与良性甲状腺结节的发生有很强的相关性，因此，以所述分子标志物作为检测对象进行甲状腺结节良恶性的诊断，具有阴性预测率高(高达97.7％)的优势；并且，所述分子标志物在甲状腺滤泡腺瘤中的突变率很高(高达57.1％)，因此，所述分子标志物在区分甲状腺滤泡癌和甲状腺滤泡腺瘤中具有极高的应用前景。

2、本发明提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒，所述试剂盒包含检测试剂，所述检测试剂能够检测ZNF148蛋白的第540位突变、第546位突变、第554位突变、第555位突变或第579位突变中的至少一个，或者，所述检测试剂能够检测ZNF148基因的第1619位突变、第1636位突变、第1660位突变、第1664位突变、第1728位突变或第1736位突变中的至少一个；所述试剂盒的检测对象与良性甲状腺结节的发生有很强的相关性，因此，使用所述试剂盒进行甲状腺结节良恶性的诊断，具有阴性预测率高(高达97.7％)的优势；并且，所述试剂盒的检测对象在甲状腺滤泡腺瘤中的突变率很高(高达57.1％)，因此，所述试剂盒在区分甲状腺滤泡癌和甲状腺滤泡腺瘤中具有极高的应用前景。

附图说明

图1：ZNF148基因在481例甲状腺结节样本中出现的突变类型和频率信息。

图2：同时出现2个及以上ZNF148突变的样本测序信息。

图3：ZNF148突变核苷酸测序图(P583P)。

图4：ZNF148突变核苷酸测序图(V540A)。

图5：ZNF148突变核苷酸测序图(D546H)。

图6：ZNF148突变核苷酸测序图(G554R)。

图7：ZNF148突变核苷酸测序图(Q555L)。

图8：ZNF148突变核苷酸测序图(S576S)。

图9：ZNF148突变核苷酸测序图(P579L)。

图10：ZNF148突变判断甲状腺结节良恶性工作流程图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实验例1：分子标志物的获取

1、样本准备和DNA提取

经江苏省原子医学研究所附属江原医院伦理委员会批准，并在患者知情同意后，从481位患者的手术标本中共获得481例甲状腺结节组织样本，其中包括313位甲状腺癌患者与168位良性结节患者，所有样本经组织病理确认(患者基本信息见表1)。所有患者在标本采集前均未接受治疗(放疗或化疗)。所有组织收集时迅速放入组织固定液中保存，并独立分析，以最大程度减少污染和干扰。经有经验的病理科医师检阅核对HE染色切片后，使用DEXPAT reagent(TaKaRa)试剂盒对病理证实的区域提取DNA(甲状腺乳头状癌组织的细胞密度＞80％)。

表1 481例甲状腺结节组织样本来源患者的基础临床病理学特征

注：^a,b部分临床信息缺失；结节大小和多灶性的分析在51个良性结节和307个恶性肿瘤中进行。

2、使用PCR和Sanger一代测序检测突变

使用特异性引物(上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)扩增ZNF148基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)第10个外显子(ZNF148基因总共有10个外显子)的突变热点区域，PCR反应程序如下：95℃初始变性5min，扩增采用95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，设置30个循环扩增，随后72℃最终延伸5min(Applied Biosystems Veriti PCR仪)。所得PCR产物经琼脂糖核酸电泳并回收目的条带进行纯化。PCR产物由3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystems)测序，并使用测序分析软件(SnapGene 2.3.2)进行分析。所有阳性的突变均根据原始测序的文件通过人工核对进行确认(具体结果可见表2～4和图1～9)。

表2 ZNF148基因及蛋白的突变情况

核苷酸突变情况	氨基酸突变情况
		基因编码区第1619位，T→C	基因编码区V540A
基因编码区第1636位，G→C	基因编码区D546H
		基因编码区第1660位，G→C	基因编码区G554R
基因编码区第1664位，A→T	基因编码区Q555L
		基因编码区第1728位，A→T	同义突变
基因编码区第1736位，C→T	基因编码区P579L
		基因编码区第1749位，G→A	同义突变

表3 481例甲状腺结节组织样本中测序发现的ZNF148基因突变分布情况

注：Heterozygote和Homozygote是P583P的两个亚分类。

表4 481例甲状腺结节样本中BRAF、ZNF148基因突变与病理诊断之间的比较

基因型	良性结节(n＝168)	甲状腺癌(n＝313)
			BRAF V600E(n＝207)	0(0％)	207(66.1％)
BRAF野生型(n＝274)	--	--
			ZNF148突变(n＝43)	42(25％)	1(0.3％)
ZNF148野生(n＝231)	126(75％)	105(33.6％)

表5 ZNF148的基因突变在甲状腺滤泡性腺瘤和甲状腺滤泡癌中的分布情况

基因型	滤泡性腺瘤(n＝7)	滤泡癌(n＝10)
			ZNF148突变(n＝43)	4(57.1％)	0(0.0％)
ZNF148野生(n＝231)	3(42.9％)	10(100％)

3、研究结果

由表2～4和图1～9可知：

在甲状腺结节中共发现了7个不同的ZNF148突变，其中发生率最高的突变为一个ZNF148的同义突变，即ZNF148 P583P，该突变在甲状腺良性结节以及甲状腺癌组织样本中普遍存在，没有组织特异性，且发生率较高，不考虑作为甲状腺结节良恶性鉴别的突变检测位点。

此外，在481例甲状腺结节样本中还发现了6种全新的突变，分别为V540A(n＝4，0.8％)、D546H(n＝3，0.6％)、G554R(n＝31，6.4％)、Q555L(n＝1，0.2％)、S576S(n＝1，0.2％)、P579L(n＝13，2.7％)。有9例甲状腺结节样本出现了2个及以上的ZNF148基因突变。共有42个(42/168，25％)甲状腺良性结节患者存在ZNF148的基因突变。而在甲状腺恶性结节中仅发现一例ZNF148的错义突变，即ZNF148 P579L突变，其发生率在甲状腺恶性结节中仅为0.3％。这一结果提示，ZNF148突变(G554R，或者，G554R和V540A、D546H、Q555L、S576S或P579L中的一个或多个的组合)是可行的甲状腺良性结节的分子标志物。进一步地，在481个甲状腺结节样本中，测序发现43个样本出现了ZNF148的基因突变，通过与病理诊断比较，其中42个样本为甲状腺良性结节，1个样本为甲状腺癌，因此，ZNF148突变通过“排除法”对甲状腺良性结节鉴别的阴性预测率可达97.7％(42/43，97.7％)。

并且，在481例甲状腺结节样本中，有10个滤泡癌和7个滤泡性腺瘤。10个滤泡癌没有ZNF148的基因突变，7个滤泡性腺瘤中有4个存在ZNF148的基因突变，突变率有57.1％，是一个很高的突变率。因此，ZNF148突变可有效区分超声、细针穿刺和分子诊断都较难区分的甲状腺滤泡癌和甲状腺滤泡腺瘤。

综上，以本实验例的481例甲状腺结节组织样本为例，在临床诊断过程中，如果按照图10的工作流程，先检测BRAF V600E的突变状态，以纳入法可以确定甲状腺恶性结节的患者(207/481，43.0％)，然后对于BRAF阴性的患者(274/481，57.0％)，通过检测ZNF148的突变情况(G554R，或者，G554R和V540A、D546H、Q555L、S576S或P579L中的一个或多个的组合)，以排除法进一步排除11.3(31/274)～15.3(42/274)％的甲状腺良性结节患者(尤其是甲状腺滤泡腺瘤患者)，预期可使得这部分人能够通过分子病理受益。

实施例1-1：一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物

本实施例提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物，所述分子标志物为ZNF148蛋白突变体；所述ZNF148蛋白突变体与ZNF148蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)相比，第554位甘氨酸突变为了精氨酸。

实施例1-2：一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物

本实施例提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物，所述分子标志物为ZNF148基因突变体；所述ZNF148基因突变体与ZNF148基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)相比，第1660位鸟嘌呤突变为了胞嘧啶。

实施例1-3：一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物

本实施例提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物，所述分子标志物为ZNF148蛋白突变体；所述ZNF148蛋白突变体与ZNF148蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)相比，第540位缬氨酸突变为了丙氨酸，第546位天冬氨酸突变为了组氨酸，第554位甘氨酸突变为了精氨酸，第555位谷氨酰胺突变为了亮氨酸，以及，第579位脯氨酸突变为了亮氨酸。

实施例1-4：一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物

本实施例提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物，所述分子标志物为ZNF148基因突变体；所述ZNF148基因突变体与ZNF148基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)相比，第1619位胸腺嘧啶突变为了胞嘧啶，第1636位鸟嘌呤突变为了胞嘧啶，第1660位鸟嘌呤突变为了胞嘧啶，第1664位腺嘌呤突变为了胸腺嘧啶，第1728位腺嘌呤突变为了胸腺嘧啶，以及，第1736位胞嘧啶突变为了胸腺嘧啶。

实施例2-1：一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒

本实施例提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒，所述试剂盒包含检测试剂；所述检测试剂包含能够与ZNF148蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)中第554位G→R突变特异性结合的抗体。

实施例2-2：一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒

本实施例提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒，所述试剂盒包含检测试剂和扩增试剂；

所述检测试剂包含能够与ZNF148基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)中第1660位的G→C突变特异性结合的引物、探针或芯片；

所述扩增试剂为核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。

实施例2-3：一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒

本实施例提供了一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒，所述试剂盒包含检测试剂；所述检测试剂包含能够与ZNF148蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)中第540位V→A突变，第546位D→H突变，第554位G→R突变，第555位Q→L突变，以及，第579位P→L突变特异性结合的抗体。

实施例2-4：一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒

所述检测试剂包含能够与ZNF148基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)中第1619位的T→C突变，第1636位的G→C突变，第1660位的G→C突变，第1664位的A→T突变，第1728位的A→T突变，以及，第1736位的C→T突变特异性结合的引物、探针或芯片；

所述扩增试剂为核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 江苏省原子医学研究所

<120> 一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物及其应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 794

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Asn Ile Asp Asp Lys Leu Glu Gly Leu Phe Leu Lys Cys Gly Gly

1 5 10 15

Ile Asp Glu Met Gln Ser Ser Arg Thr Met Val Val Met Gly Gly Val

20 25 30

Ser Gly Gln Ser Thr Val Ser Gly Glu Leu Gln Asp Ser Val Leu Gln

35 40 45

Asp Arg Ser Met Pro His Gln Glu Ile Leu Ala Ala Asp Glu Val Leu

50 55 60

Gln Glu Ser Glu Met Arg Gln Gln Asp Met Ile Ser His Asp Glu Leu

65 70 75 80

Met Val His Glu Glu Thr Val Lys Asn Asp Glu Glu Gln Met Glu Thr

85 90 95

His Glu Arg Leu Pro Gln Gly Leu Gln Tyr Ala Leu Asn Val Pro Ile

100 105 110

Ser Val Lys Gln Glu Ile Thr Phe Thr Asp Val Ser Glu Gln Leu Met

115 120 125

Arg Asp Lys Lys Gln Ile Arg Glu Pro Val Asp Leu Gln Lys Lys Lys

130 135 140

Lys Arg Lys Gln Arg Ser Pro Ala Lys Ile Leu Thr Ile Asn Glu Asp

145 150 155 160

Gly Ser Leu Gly Leu Lys Thr Pro Lys Ser His Val Cys Glu His Cys

165 170 175

Asn Ala Ala Phe Arg Thr Asn Tyr His Leu Gln Arg His Val Phe Ile

180 185 190

His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Gln Cys Ser Gln Cys Asp Met Arg Phe

195 200 205

Ile Gln Lys Tyr Leu Leu Gln Arg His Glu Lys Ile His Thr Gly Glu

210 215 220

Lys Pro Phe Arg Cys Asp Glu Cys Gly Met Arg Phe Ile Gln Lys Tyr

225 230 235 240

His Met Glu Arg His Lys Arg Thr His Ser Gly Glu Lys Pro Tyr Gln

245 250 255

Cys Glu Tyr Cys Leu Gln Tyr Phe Ser Arg Thr Asp Arg Val Leu Lys

260 265 270

His Lys Arg Met Cys His Glu Asn His Asp Lys Lys Leu Asn Arg Cys

275 280 285

Ala Ile Lys Gly Gly Leu Leu Thr Ser Glu Glu Asp Ser Gly Phe Ser

290 295 300

Thr Ser Pro Lys Asp Asn Ser Leu Pro Lys Lys Lys Arg Gln Lys Thr

305 310 315 320

Glu Lys Lys Ser Ser Gly Met Asp Lys Glu Ser Ala Leu Asp Lys Ser

325 330 335

Asp Leu Lys Lys Asp Lys Asn Asp Tyr Leu Pro Leu Tyr Ser Ser Ser

340 345 350

Thr Lys Val Lys Asp Glu Tyr Met Val Ala Glu Tyr Ala Val Glu Met

355 360 365

Pro His Ser Ser Val Gly Gly Ser His Leu Glu Asp Ala Ser Gly Glu

370 375 380

Ile His Pro Pro Lys Leu Val Leu Lys Lys Ile Asn Ser Lys Arg Ser

385 390 395 400

Leu Lys Gln Pro Leu Glu Gln Asn Gln Thr Ile Ser Pro Leu Ser Thr

405 410 415

Tyr Glu Glu Ser Lys Val Ser Lys Tyr Ala Phe Glu Leu Val Asp Lys

420 425 430

Gln Ala Leu Leu Asp Ser Glu Gly Asn Ala Asp Ile Asp Gln Val Asp

435 440 445

Asn Leu Gln Glu Gly Pro Ser Lys Pro Val His Ser Ser Thr Asn Tyr

450 455 460

Asp Asp Ala Met Gln Phe Leu Lys Lys Lys Arg Tyr Leu Gln Ala Ala

465 470 475 480

Ser Asn Asn Ser Arg Glu Tyr Ala Leu Asn Val Gly Thr Ile Ala Ser

485 490 495

Gln Pro Ser Val Thr Gln Ala Ala Val Ala Ser Val Ile Asp Glu Ser

500 505 510

Thr Thr Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gln Ala Leu Asn Val Glu Ile Lys

515 520 525

Ser Asn His Asp Lys Asn Val Ile Pro Asp Glu Val Leu Gln Thr Leu

530 535 540

Leu Asp His Tyr Ser His Lys Ala Asn Gly Gln His Glu Ile Ser Phe

545 550 555 560

Ser Val Ala Asp Thr Glu Val Thr Ser Ser Ile Ser Ile Asn Ser Ser

565 570 575

Glu Val Pro Glu Val Thr Pro Ser Glu Asn Val Gly Ser Ser Ser Gln

580 585 590

Ala Ser Ser Ser Asp Lys Ala Asn Met Leu Gln Glu Tyr Ser Lys Phe

595 600 605

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610 615 620

Ser Pro Ser Leu Asn Phe Val Thr Asp Asn Gln Thr Leu Pro Asn Gln

625 630 635 640

Pro Ala Phe Ser Ser Ile Asp Lys Gln Val Tyr Ala Thr Met Pro Ile

645 650 655

Asn Ser Phe Arg Ser Gly Met Asn Ser Pro Leu Arg Thr Thr Pro Asp

660 665 670

Lys Ser His Phe Gly Leu Ile Val Gly Asp Ser Gln His Ser Phe Pro

675 680 685

Phe Ser Gly Asp Glu Thr Asn His Ala Ser Ala Thr Ser Thr Gln Asp

690 695 700

Phe Leu Asp Gln Val Thr Ser Gln Lys Lys Ala Glu Ala Gln Pro Val

705 710 715 720

His Gln Ala Tyr Gln Met Ser Ser Phe Glu Gln Pro Phe Arg Ala Pro

725 730 735

Tyr His Gly Ser Arg Ala Gly Ile Ala Thr Gln Phe Ser Thr Ala Asn

740 745 750

Gly Gln Val Asn Leu Arg Gly Pro Gly Thr Ser Ala Glu Phe Ser Glu

755 760 765

Phe Pro Leu Val Asn Val Asn Asp Asn Arg Ala Gly Met Thr Ser Ser

770 775 780

Pro Asp Ala Thr Thr Gly Gln Thr Phe Gly

785 790

<210> 2

<211> 2385

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atgaacattg acgacaaact ggaaggattg tttcttaaat gtggcggcat agacgaaatg 60

cagtcttcca ggacaatggt tgtaatgggt ggagtgtctg gccagtctac tgtgtctgga 120

gagctacagg attcagtact tcaagatcga agtatgcctc accaggagat ccttgctgca 180

gatgaagtgt tacaagaaag tgaaatgaga caacaggata tgatatcaca tgatgaactc 240

atggtccatg aggagacagt gaaaaatgat gaagagcaga tggaaacaca tgaaagactt 300

cctcaaggac tacagtatgc acttaatgtc cctataagcg taaagcagga aattactttt 360

actgatgtat ctgagcaact gatgagagac aaaaaacaaa tcagagagcc agtagactta 420

cagaaaaaga agaagcggaa acaacgttct cccgcaaaaa tccttacaat aaatgaggat 480

ggatcacttg gtttgaaaac ccctaaatct cacgtttgtg agcactgcaa tgctgccttt 540

agaacgaact atcacttaca gagacatgtc ttcattcata caggtgaaaa accatttcaa 600

tgtagtcaat gtgacatgcg tttcatacag aagtacctgc ttcagagaca tgagaagatt 660

catactggtg aaaaaccatt tcgctgtgat gaatgtggta tgagattcat acaaaaatat 720

catatggaaa ggcataagag aactcatagt ggagaaaaac cttaccagtg tgaatactgt 780

ttacagtatt tttccagaac agatcgtgta ttgaaacata aacgtatgtg ccatgaaaat 840

catgacaaaa aactaaatag atgtgccatc aaaggtggcc ttctgacatc tgaggaagat 900

tctggctttt ctacatcacc aaaagacaac tcactgccaa aaaagaaaag gcagaaaacg 960

gagaaaaaat catctggaat ggacaaagag agtgctttgg acaaatctga cctgaaaaaa 1020

gacaaaaatg attacttgcc tctttattct tcaagtacta aagtaaaaga tgagtatatg 1080

gttgcagaat atgctgttga aatgccacat tcgtcagttg ggggctcgca tttagaagat 1140

gcgtcaggag aaatacaccc acctaagtta gttctcaaaa aaattaatag taagagaagt 1200

ctgaaacagc cactggagca aaatcaaaca atttcacctt tatccacata tgaagagagc 1260

aaagtttcaa agtatgcttt tgaacttgtg gataaacagg ctttactgga ctcagaaggc 1320

aatgctgaca ttgatcaggt tgataatttg caggaggggc ccagtaaacc tgtgcatagt 1380

agtactaatt atgatgatgc catgcagttt ttgaagaaga agcggtatct tcaagcagca 1440

agtaacaaca gcagggaata tgcgctgaat gtgggtacca tagcttctca gccttctgta 1500

acacaagcag ctgtggcaag tgtcattgat gaaagtacca cggcatccat attagagtca 1560

caggcactga atgtggagat taagagtaat catgacaaaa atgttattcc agatgaggta 1620

ctgcagactc tgttggatca ttattcccac aaagctaatg gacagcatga gatatccttc 1680

agtgttgcag atactgaagt gacttctagc atatcaataa attcttcaga agtaccagag 1740

gtcaccccgt cagagaatgt tggatcaagc tcccaagcat cctcatcaga taaagccaac 1800

atgttgcagg aatactccaa gtttctgcag caggctttgg acagaactag ccaaaatgat 1860

gcctatttga atagcccgag ccttaacttt gtgactgata accagaccct cccaaatcag 1920

ccagcattct cttccataga caagcaggtc tatgccacca tgcccatcaa tagctttcga 1980

tcaggaatga attctccact aagaacaact ccagataagt cccactttgg actaatagtt 2040

ggtgattcac agcactcatt tcccttttca ggtgatgaga caaaccatgc ttctgccaca 2100

tcaacacagg actttctgga tcaagtgact tctcagaaga aagctgaggc ccagcctgtc 2160

caccaagctt accaaatgag ctcctttgaa cagcccttcc gtgctcccta tcatggatca 2220

agagctggaa tagctactca atttagcact gccaatggac aggtgaacct tcggggacca 2280

gggacaagtg ctgaattttc agaatttccc ttggtgaatg taaatgataa tagagctggg 2340

atgacatctt cacctgatgc cacaactggc cagacttttg gctaa 2385

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgcagtttt tgaagaagaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttgggaggg tctggttatc 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccacatatga agagagcaaa g 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaagcctgct gcagaaactt 20

Claims

1.一种用于诊断甲状腺结节良恶性的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物为ZNF148蛋白突变体；所述ZNF148蛋白突变体与ZNF148蛋白相比，第540位缬氨酸、第546位天冬氨酸、第554位甘氨酸、第555位谷氨酰胺或第579位脯氨酸中的至少一位发生了突变；

2.如权利要求1所述的分子标志物，其特征在于，所述ZNF148蛋白突变体与ZNF148蛋白相比，第540位缬氨酸突变为了丙氨酸，第546位天冬氨酸突变为了组氨酸，第554位甘氨酸突变为了精氨酸，第555位谷氨酰胺突变为了亮氨酸，和/或，第579位脯氨酸突变为了亮氨酸。

3.如权利要求1所述的分子标志物，其特征在于，所述ZNF148基因突变体与ZNF148基因相比，第1619位胸腺嘧啶突变为了胞嘧啶，第1636位鸟嘌呤突变为了胞嘧啶，第1660位鸟嘌呤突变为了胞嘧啶，第1664位腺嘌呤突变为了胸腺嘧啶，第1728位腺嘌呤突变为了胸腺嘧啶，和/或，第1736位胞嘧啶突变为了胸腺嘧啶。

4.如权利要求1～3任一项所述的分子标志物，其特征在于，所述ZNF148蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.如权利要求1～3任一项所述的分子标志物，其特征在于，所述ZNF148基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.检测权利要求1～5任一项所述的分子标志物的检测试剂在制备用于诊断甲状腺结节良恶性的产品中的应用。

7.一种用于诊断甲状腺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测试剂；所述检测试剂能够检测ZNF148蛋白的第540位突变、第546位突变、第554位突变、第555位突变或第579位突变中的至少一个；或者，所述检测试剂能够检测ZNF148基因的第1619位突变、第1636位突变、第1660位突变、第1664位突变、第1728位突变或第1736位突变中的至少一个。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包含能够与ZNF148蛋白中第540位V→A突变，第546位D→H突变，第554位G→R突变，第555位Q→L突变，和/或，第579位P→L突变特异性结合的抗体；

9.如权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含扩增试剂；所述扩增试剂能够特异性扩增ZNF148基因的第1402～1916位；或者，所述扩增试剂能够特异性扩增ZNF148基因中，含有第1402～1916位的片段。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增试剂为核苷酸序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对；或者，所述扩增试剂为核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示的引物对。