CN113981060A - 基因型检测方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本申请的实施例提供一种基因型检测方法和试剂盒，基因型检测方法以及试剂盒被用于对如下与冠心病用药相关的SNP位点中的至少一个的基因型进行检测：rs号为rs1065776的SNP位点、rs号为rs20417的SNP位点、rs号为rs3135507的SNP位点。根据本发明实施例的基因型检测方法和试剂盒可以有效获取的冠心病用药相关的SNP位点基因型检测结果，该检测结果可以被用于指导冠心病的用药。

Description

基因型检测方法和试剂盒
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种基因型检测方法和试剂盒。
背景技术
冠心病是全球高发的心血管疾病，致残、致死率高，目前的诊疗主要基于经验以及循证医学，但是由于个体差异，患者对药物治疗的反应参差不齐，难以达到预期的治疗效果，期望能够通过单核苷酸多态性位点的基因型检测来实现冠心病的用药指导。
发明内容
鉴于上述问题，提出了本申请以便提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的基因型检测方法和试剂盒。
根据本申请实施例的第一方面，提供一种基因型检测方法，用于检测与冠心病用药相关的SNP位点(单核苷酸多态性位点)的基因型，所述方法包括如下步骤：获取样本DNA；将反应液与所述样本DNA混合，所述反应液中包括引物和DNA聚合酶，以使所述样本DNA进行PCR反应，将所述样本DNA中包含SNP位点的DNA片段进行扩增，其中，所述SNP位点包括如下与冠心病用药相关的SNP位点中的至少一个：rs号为rs1065776的SNP位点、rs号为rs20417的SNP位点、rs号为rs3135507的SNP位点；向所述反应液中加入与所述SNP位点的多种基因型对应的多种探针，所述多种探针中分别设置有不同颜色的荧光基团，其中，当所述探针与所述扩增后的所述DNA片段结合时所述探针的荧光基团在所述DNA聚合酶的作用下被切割并游离在所述反应液中；使用激发光激发所述反应液中的游离的荧光基团，根据荧光基团发射的荧光确定所述SNP位点的基因型。
根据本申请实施例的另一个方面，提供一种试剂盒，包括用于扩增与冠心病用药相关的SNP位点的引物；以及与所述SNP位点的多种基因型对应的多种探针，其中，与冠心病用药相关的所述SNP位点包括以下至少之一：rs号为rs1065776的SNP位点、rs号为rs20417的SNP位点、rs号为rs3135507的SNP位点。
根据本申请实施例的基因型检测方法和试剂盒对冠心病用药相关的SNP位点基因型进行检测，该检测结果可以被用于指导冠心病的用药。
附图说明
图1为根据本申请实施例的基因型检测方法流程图；
图2为根据本申请实施例的探针与DNA片段结合的原理示意图；
图3为根据本申请实施例的荧光强度曲线示意图。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例的附图，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本申请的一个实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本申请的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
需要说明的是，除非另外定义，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本申请所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。若全文中涉及“第一”、“第二”等描述，则该“第一”、“第二”等描述仅用于区别类似的对象，而不能理解为指示或暗示其相对重要性、先后次序或者隐含指明所指示的技术特征的数量，应该理解为“第一”、“第二”等描述的数据在适当情况下可以互换。若全文中出现“和/或”，其含义为包括三个并列方案，以“A和/或B”为例，包括A方案，或B方案，或A和B同时满足的方案。
根据本申请的实施例首先提供一种基因型检测方法，用于检测与冠心病用药相关的SNP位点(单核苷酸多态性位点)的基因型，单核苷酸多态性主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP位点是一种二态的标记，由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致，本申请的实施例中对发明人所提出的与冠心病用药相关的SNP位点的基因型进行检测，该检测结果能够有效地指导冠心病的用药选择。具体所选用的SNP位点以及所针对的碱基将会在下文中的相关部分进行描述。
参照图1，基因型检测包括如下步骤：
S102：样本获取步骤，获取样本DNA；
S104：DNA扩增步骤，将反应液与样本DNA混合，反应液中包括引物和DNA聚合酶，以使样本DNA进行PCR反应，将样本DNA中包含SNP位点的DNA片段进行扩增，其中，SNP位点包括如下与冠心病用药相关的SNP位点中的至少一个：rs号为rs1065776的SNP位点、rs号为rs20417的SNP位点、rs号为rs3135507的SNP位点；
S106：探针结合步骤，向反应液中加入与SNP位点的多种基因型对应的多种探针，多种探针中分别设置有不同颜色的荧光基团，其中，当探针与扩增后的DNA片段结合时探针的荧光基团在DNA聚合酶的作用下被切割并游离在反应液中；
S108：荧光激发步骤，使用激发光激发反应液中的游离的荧光基团，根据荧光基团发射的荧光确定SNP位点的基因型。
S104的DNA扩增步骤、S106的探针结合步骤以及S108的荧光激发步骤均可以在荧光定量PCR仪器中进行，当然，本领域技术人员也可以选择其他合适的方式来实现上述步骤，只需能够满足DNA聚合酶在扩增和结合时所需要的反应条件，以及能够实现荧光基团的激发即可，在此不再赘述。
本申请的发明人提出了与冠心病用药相关的三个SNP位点，包括：rs号为rs1065776的SNP位点、rs号为rs20417的SNP位点、rs号为rs3135507的SNP位点。在实际检测的过程中，本领域技术人员可以选择同时检测这三个SNP位点的基因型，也可以选分别对这三个SNP位点的基因型进行检测或者根据实际需求选择仅检测其中的一部分SNP位点的基因型，对此不做具体的限定。
下表中示出了本申请实施例中针对上述SNP位点所使用的引物与探针的序列。
Figure BDA0003282363060000041
Figure BDA0003282363060000051
如上表所示的，在本申请实施例中，在扩增rs号为rs1065776的SNP位点时，使用如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物来进行。在扩增rs号为rs20417的SNP位点时，使用如SEQ ID NO.3所示的正向引物和如SEQ ID NO.4所示的反向引物。在扩增rs号为rs3135507的SNP位点时，使用如SEQ ID NO.5所示的正向引物和如SEQ IDNO.6所示的反向引物。本领域技术人员可以基于上述序列表使用本领域中任何合适的方法来制备上述引物，在此不再赘述。
进一步，如上表所示的，在针对rs号为rs1065776的SNP位点的多种基因型进行检测时，可以使用如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的两种探针，其中，如SEQ ID NO.7所示的探针与该SNP位点的野生型相对应，其针对该SNP位点的野生型中的C碱基进行检测，在一些实施例中，其5’端修饰有FAM荧光基团，3’端修饰有MGB淬灭基团。而如SEQ ID NO.8所示的探针与该SNP位点的突变型相对应，其针对该SNP位点的突变型中的T碱基进行检测，在一些实施例中，其5’端修饰有VIC荧光基团，3’端修饰有MGB淬灭基团。
在针对rs号为rs20417的SNP位点的多种基因型进行检测时，可以使用如SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10所示的两种探针，其中，如SEQ ID NO.9所示的探针与该SNP位点的野生型相对应，其针对该SNP位点的野生型中的C碱基进行检测，在一些实施例中，其5’端修饰有FAM荧光基团，3’端修饰有MGB淬灭基团。而如SEQ ID NO.10所示的探针与该SNP位点的突变型相对应，其针对该SNP位点的突变型中的G碱基进行检测，在一些实施例中，其5’端修饰有VIC荧光基团，3’端修饰有MGB淬灭基团。
在针对rs号为rs 3135507的SNP位点的多种基因型进行检测时，可以使用如SEQID NO.11和SEQ ID NO.12所示的两种探针，其中，如SEQ ID NO.11所示的探针与该SNP位点的野生型相对应，其针对该SNP位点的野生型中的C碱基进行检测，在一些实施例中，其5’端修饰有FAM荧光基团，3’端修饰有MGB淬灭基团。而如SEQ ID NO.12所示的探针与该SNP位点的突变型相对应，其针对该SNP位点的突变型中的T碱基进行检测，在一些实施例中，其5’端修饰有VIC荧光基团，3’端修饰有MGB淬灭基团。
可以理解地，本领域人员可以基于上述序列表使用本领域中任何合适的方法来制备上述探针，在制备探针的过程中，5’端所修饰的荧光基团可以根据实际情况来进行选择，并不局限于序列表中所展示的荧光基团，例如还可以使用IAF、TET、FITC等其他的荧光基团。在一些实施例中，如果需要同时对多个SNP位点的基因型进行检测，则意味着需要同时加入多对探针，则此时优选地在每一个探针的5’端上分别使用不同颜色的荧光基团进行修饰，以方便进行后续的结果判读。
图2中示出了S106探针结合步骤的原理示意图，1和2分别代表野生型与突变型的DNA片段，如a和c部分所示，当DNA片段与其基因型对应的探针结合时，探针5’端上的荧光基团将会被DNA聚合酶切割，成为游离在反应液中的荧光基团。而如b和d部分所示，如果DNA片段与不对应的探针相遇时，DNA聚合酶将无法进行切割，进而该探针中的荧光基团将会保持结合状态，不会被激光所激发。基于这样的原理，在S108荧光激发步骤中能够根据被激发的荧光来判断样本DNA的SNP位点基因型。
在一些实施例中，由于DNA片段的扩增以及探针的结合均需要使用到DNA聚合酶并且对于反应条件有类似的需求，因此可以在PCR反应开始前就向反应液中加入探针，从而提高检测效率，具体的反应条件和反应时间可以由本领域技术人员根据实际情况以及本领域的公知常识来确定，在此不再赘述。在一些实施例中，本领域技术人员也可以选择在PCR反应结束后再加入探针。
在一些实施例中，在根据荧光基团发射的荧光确定SNP位点基因型时，可以具体包括如下步骤：
在PCR反应进行过程中持续检测反应液中游离的荧光基团发射的荧光的强度；
根据不同颜色的荧光基团在PCR反应过程中发射的不同颜色荧光的强度变化曲线来确定SNP位点的基因型。
图3中示出了某一SNP位点的不同基因型的荧光强度变化曲线，如a和b部分所示出的，当仅有一条曲线呈现明显上升趋势时(例如a部分中的FAM曲线，b部分中的VIC曲线)，指示该DNA样本为纯合子，并可以进一步的根据呈现上升趋势的曲线所指示的荧光基团来确定其为野生型纯合子还是突变型纯合子。如c部分所示出的，如果FAM和VIC两条曲线呈现上升趋势，则表示其为杂合子。
在一些实施例中，S102的样本获取步骤中，可以具体包括如下步骤：获取血液样本，使用裂解液和蛋白酶将血液样本中的白细胞裂解，以获取白细胞裂解时释放的DNA作为样本DNA。在一些其他的实施例中，本领域技术人员也可以选择其他合适的方法来获取样本DNA，在此不再赘述。
在一些实施例中，为了保证样本DNA的质量，在获取血液样本后，可以检测血液样本的溶血情况和血脂含量，在出现溶血或者血脂含量大于预设阈值时，可以重新获取血液样本。在一些实施例中，可以直接通过目测的方式来判断样本是否出现溶血或者血脂含量过高，在一些其他的实施例中，也可以通过仪器检测的方式来进行。
在一些实施例中，在使用裂解液和蛋白酶将血液样本中的裂解后，可以使用磁珠吸附白细胞裂解释放的DNA，而后使用洗脱液将磁珠吸附的DNA与磁珠分离，使DNA溶解在洗脱液中，以获取DNA作为样本DNA。在DNA溶解到洗脱液之后，可以通过磁体吸附来将磁珠取出，而后吸取洗脱液中的上清液即可获取样本DNA。通过这样的方式来进行DNA的提取能够有效减少DNA中的各种杂质，提高纯度。
在一些实施例中，对于提取的DNA样本，还需要进一步的进行质检，质检的指标可以包括一下中的至少一个：DNA浓度、DNA纯度和DNA的降解程度。当这些指标中的任意一个在期望范围以外时，需要重新获取样本DNA。
在一些实施例中，可以具体使用Q-bit 4.0来检测DNA浓度，使用紫外分光光度计检测DNA纯度，使用琼脂糖凝胶电泳检测其DNA降解程度。本领域技术人员也可以选择其他合适的方式来进行上述之间指标的检测，对此不做具体的限定。在一些实施例中，质检指标的期望范围可以包括：浓度≥50ng/uL，体积不小于50uL；1.7<A260/A280<1.9；A260/A230>1.5；电泳条带主带明显，无拖带或明显降解。
根据本发明实施例的另一个方面，还提供了一种试剂盒，试剂盒可以包括：用于扩增与冠心病用药相关的SNP位点的引物；以及与所述SNP位点的多种基因型对应的多种探针，其中，与冠心病用药相关的所述SNP位点包括以下至少之一：rs号为rs1065776的SNP位点、rs号为rs20417的SNP位点、rs号为rs3135507的SNP位点。
仍可参照上文中的序列表，在一些实施例中，用于扩增rs号为rs1065776的SNP位点的引物包括：如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物；用于扩增rs号为rs20417的SNP位点的引物包括：如SEQ ID NO.3所示的正向引物和如SEQ ID NO.4所示的反向引物；用于扩增rs号为rs3135507的SNP位点的引物包括：如SEQ ID NO.5所示的正向引物和如SEQ ID NO.6所示的反向引物。
在一些实施例中，与rs号为rs1065776的SNP位点的多种基因型对应的多种探针包括：如SEQ ID NO.7所示的探针，与rs号为rs1065776的SNP位点的野生型对应，如SEQ IDNO.8所示的探针，与rs号为rs1065776的SNP位点的突变型对应；与rs号为rs20417的SNP位点的多种基因型对应的多种探针包括：如SEQ ID NO.9所示的探针，与rs号为rs20417的SNP位点的野生型对应，如SEQ ID NO.10所示的探针，与rs号为rs20417的SNP位点的突变型对应；与rs号为rs3135507的SNP位点的多种基因型对应的多种探针包括：如SEQ ID NO.11所示的探针，与rs号为rs3135507的SNP位点的野生型对应，如SEQ ID NO.12所示的探针，与rs号为rs3135507的SNP位点的突变型对应。
根据本申请实施例的试剂盒可以被用于进行如上文所描述的基因型检测方法，进而被用于指导冠心病的用药选择。在一些实施例中，试剂盒还可以包括反应液，引物和探针可以被保存在反应液中，在一些实施例中，试剂盒还可以包括DNA聚合酶，其同样可以被保存在反应液中，引物、探针以及DNA聚合酶可以被分别存储在不同容器中，也可以存储在同一容器中，对此不做具体的限定。该试剂盒的具体使用方法可以参照上文所描述的基因型检测方法，在此不再赘述。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本申请的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本申请的限制，本领域的普通技术人员在本申请的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Figure IDA0003282363120000011
Figure IDA0003282363120000021
Figure IDA0003282363120000031

Claims (14)

1.一种基因型检测方法，用于检测与冠心病用药相关的SNP位点(单核苷酸多态性位点)的基因型，所述方法包括如下步骤：
获取样本DNA；
将反应液与所述样本DNA混合，所述反应液中包括引物和DNA聚合酶，以使所述样本DNA进行PCR反应，将所述样本DNA中包含SNP位点的DNA片段进行扩增，其中，所述SNP位点包括如下与冠心病用药相关的SNP位点中的至少一个：rs号为rs1065776的SNP位点、rs号为rs20417的SNP位点、rs号为rs3135507的SNP位点；
向所述反应液中加入与所述SNP位点的多种基因型对应的多种探针，所述多种探针中分别设置有不同颜色的荧光基团，其中，当所述探针与所述扩增后的所述DNA片段结合时所述探针的荧光基团在所述DNA聚合酶的作用下被切割并游离在所述反应液中；
使用激发光激发所述反应液中的游离的荧光基团，根据荧光基团发射的荧光确定所述SNP位点的基因型。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，用于扩增rs号为rs1065776的SNP位点的引物包括：如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物；
用于扩增rs号为rs20417的SNP位点的引物包括：如SEQ ID NO.3所示的正向引物和如SEQ ID NO.4所示的反向引物；
用于扩增rs号为rs3135507的SNP位点的引物包括：如SEQ ID NO.5所示的正向引物和如SEQ ID NO.6所示的反向引物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，与rs号为rs1065776的SNP位点的多种基因型对应的多种探针包括：
与rs号为rs20417的SNP位点的多种基因型对应的多种探针包括：如SEQ ID NO.9所示的探针，与rs号为rs20417的SNP位点的野生型对应，如SEQ ID NO.10所示的探针，与rs号为rs20417的SNP位点的突变型对应；
与rs号为rs3135507的SNP位点的多种基因型对应的多种探针包括：如SEQ ID NO.11所示的探针，与rs号为rs3135507的SNP位点的野生型对应，如SEQ ID NO.12所示的探针，与rs号为rs3135507的SNP位点的突变型对应。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述向所述反应液加入与所述SNP位点的多种基因型对应的多种探针在所述PCR反应开始前进行。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述根据荧光基团发射的荧光确定所述SNP位点的基因型包括：
在所述PCR反应进行过程中，持续监测所述反应液中游离的荧光基团发射的荧光的强度；
根据不同颜色的荧光基团在所述PCR反应过程中发射的不同颜色荧光的强度变化曲线，确定所述SNP位点的基因型。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述获取样本DNA包括：
获取血液样本；
使用裂解液和蛋白酶将所述血液样本中的白细胞裂解，以获取所述白细胞裂解时释放的DNA作为所述样本DNA。
7.根据权利要求6所述的方法，还包括：
使用裂解液和蛋白酶将所述血液样本中的白细胞破碎后，使用磁珠吸附白细胞裂解释放的DNA；
使用洗脱液将所述磁珠吸附的DNA与所述磁珠分离，使所述DNA溶解在所述洗脱液中，以获取所述DNA作为所述样本DNA。
8.根据权利要求6所述的方法，还包括：
获取血液样本后，检测所述血液样本的溶血情况；
当所述血液样本出现溶血时，重新获取所述血液样本。
9.根据权利要求6所述的方法，还包括：
获取所述血液样本后，检测所述血液样本的血脂含量；
在所述血脂含量大于预设阈值时，重新获取所述血液样本。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，还包括：
在获取所述样本DNA后，对所述样本DNA进行质检；
在所述样本DNA的质检指标在期望范围以外时，重新获取所述样本DNA，所述质检指标包括以下至少之一：
DNA浓度、DNA纯度和DNA降解程度。
11.一种试剂盒，包括：
用于扩增与冠心病用药相关的SNP位点的引物；以及
与所述SNP位点的多种基因型对应的多种探针，其中，与冠心病用药相关的所述SNP位点包括以下至少之一：rs号为rs1065776的SNP位点、rs号为rs20417的SNP位点、rs号为rs3135507的SNP位点。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，用于扩增rs号为rs1065776的SNP位点的引物包括：如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物；
用于扩增rs号为rs20417的SNP位点的引物包括：如SEQ ID NO.3所示的正向引物和如SEQ ID NO.4所示的反向引物；
用于扩增rs号为rs3135507的SNP位点的引物包括：如SEQ ID NO.5所示的正向引物和如SEQ ID NO.6所示的反向引物。
13.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，与rs号为rs1065776的SNP位点的多种基因型对应的多种探针包括：如SEQ ID NO.7所示的探针，与rs号为rs1065776的SNP位点的野生型对应，如SEQ ID NO.8所示的探针，与rs号为rs1065776的SNP位点的突变型对应；
与rs号为rs20417的SNP位点的多种基因型对应的多种探针包括：如SEQ ID NO.9所示的探针，与rs号为rs20417的SNP位点的野生型对应，如SEQ ID NO.10所示的探针，与rs号为rs20417的SNP位点的突变型对应；
与rs号为rs3135507的SNP位点的多种基因型对应的多种探针包括：如SEQ ID NO.11所示的探针，与rs号为rs3135507的SNP位点的野生型对应，如SEQ ID NO.12所示的探针，与rs号为rs3135507的SNP位点的突变型对应。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的试剂盒在指导冠心病用药选择上的应用。
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