CN113980980A - 盐生草wrky耐盐基因及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了盐生草WRKY耐盐基因及其筛选方法。通过检测31个盐生草WRKY基因在盐胁迫下的表达量，筛选出WRKY23、WRKY19和WRKY27三个耐盐基因。本发明还提供了含有HgWRKY19、HgWRKY23和HgWRKY27基因的表达载体质粒、转基因工程菌和转基因拟南芥种子，丰富了盐生草中WRKY转录因子的研究，为作物耐盐种质创新与新品种选育提供基因资源。

Description

盐生草WRKY耐盐基因及其筛选方法

技术领域

本发明属于盐生草基因工程领域，具体涉及盐生草WRKY耐盐基因及其筛选方法。

背景技术

有数据显示，全球有9.5亿hm²左右的土壤遭受盐碱胁迫^[1]，我国的盐渍土达3.6×10⁷hm²，占可用耕地的1/20^[2]，预计到2050年，全球一半的可耕地可能会受到盐分的影响^[3]。如何有效开发利用盐渍土以及培育耐盐作物新品种已成为亟待解决的全球性农业生产问题和生态环境问题。

WRKY转录因子是植物特有的一类转录因子家族，具有由60个氨基酸残基组成的WRKY 保守结构域，其N端有高度保守的WRKYGQK七肽序列，C端则具有锌指类似结构C2H2(CX4-5CX22-23HXH)或C2HC(CX4-5CX23-24HXC)序列^[4]。WRKY转录因子经识别与结合保守的DNA结合位点W-box来调控基因的转录，进而参与植物体的生长发育、生物与非生物因素的逆境胁迫、以及植物体内的信号转导等问题^[5]。

盐生草(Halogeton glomeratus)为藜科(Chenopodiaceae)双子叶草本植物，广布于甘肃、内蒙、青海等我国荒漠地及盐碱地，土壤里大量盐分富集在盐生草的肉质化叶片中，进一步区隔化在液泡内，保持叶片光合器官内的Na⁺浓度处于较低水平，是盐生草能够抵抗 100～500mM NaCl胁迫而正常生长的重要基础^[6]。目前WRKY家族成员的组成在许多植物中已基本明确，而盐生草作为获取抗旱耐盐基因的理想载体，关于其WRKY转录因子家族的内容却未见报道。利用生物信息学对盐生草WRKY转录因子进行深入研究，明确其调控机理和耐盐机制，为进一步培育耐盐作物新品种提供了更好的基础和证据。

现有技术存在的问题：现有技术中未见盐生草WRKY基因耐盐的报道和应用。盐胁迫是世界农业发展的主要限制因子之一，而WRKY转录因子在植物生物与非生物胁迫响应中具关键作用，尤其在植物遭受盐胁迫时，WRKY转录因子可正向或反向调节相关基因表达，从而使植物产生耐盐性，因此研究抗旱耐盐先锋植物盐生草的WRKY基因对作物耐盐种质创新与新品种选育具有重要作用。

发明内容

本发明要解决的关键技术问题在于提供了一种盐生植物盐生草WRKY耐盐基因及其分离方法。本发明提供的一种盐生植物盐生草WRKY基因在提高植物耐盐性上发挥重要作用，不仅丰富了盐生草中WRKY转录因子的研究，还为实现耐盐性作物新品种的育成提供了新的思路和理论基础。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

1.盐生草耐盐WRKY基因筛选方法，包括如下步骤：(1)盐生草WRKY基因家族的鉴定。(2)盐胁迫下HgWRKYs基因qRT-PCR分析。

2.盐生草WRKY23基因，该基因全长转录本序列如序列表SEQ ID NO.1所示，包含1533bp；其中CDS全长为1137bp，为第123bp至1259bp。

3.盐生草WRKY23基因在提高拟南芥耐盐性中的应用。

4.盐生草WRKY19基因，该基因全长转录本序列如序列表SEQ ID NO.2所示，包含1595bp；其中CDS全长为1170bp，为第84bp至1253bp。

5.盐生草WRKY19基因在提高拟南芥耐盐性中的应用。

6.盐生草WRKY27基因，该基因全长转录本序列如序列表SEQ ID NO.3所示，包含1383bp；其中CDS全长为1170bp，为第161bp至1330bp。

7.盐生草WRKY27基因在提高拟南芥耐盐性中的应用。

有益效果：盐生草能够抵抗100～500mM NaCl胁迫而正常生长，是获取抗旱耐盐基因的重要野生资源，基于盐生草全长转录组数据^[7]，本发明首次利用生物信息学方法对其WRKY 基因家族进行了鉴定分析，并通过qRT-PCR方法筛选出3个盐胁迫响应候选基因。其次，本发明首次克隆到调控盐生草响应盐胁迫的WRKY转录因子HgWRKY19、HgWRKY23和HgWRKY27，它们均在盐生草根系特异性表达，并在24h时表达量达到最高。另外，本发明还提供了含有HgWRKY19、HgWRKY23和HgWRKY27基因的表达载体质粒、转基因工程菌和转基因拟南芥种子，丰富了盐生草中WRKY转录因子的研究，为后期深入分析盐生草 WRKY基因响应盐胁迫的分子机制提供基础，同时为作物耐盐种质创新与新品种选育提供基因资源。

附图说明

图1是200mM NaCl胁迫下31个HgWRKYs在盐生草叶片和根系中的表达量。

图2是HgWRKY23基因PCR扩增凝胶电泳图。

图3是200mM NaCl胁迫下HgWRKY23基因的表达变化图。

图4是HgWRKY23基因在烟草叶片中的亚细胞定位图；

其中，从左到右分别为A：绿色荧光；B：叶绿体自发荧光；C：明场；D：叠加场；白色箭头指示细胞核。

图5是200mM NaCl胁迫10天后的转HgWRKY23基因拟南芥表型。

图6是HgWRKY19基因PCR扩增凝胶电泳图。

图7是200mM NaCl胁迫下HgWRKY19基因的表达变化图。

图8是HgWRKY19基因在烟草叶片中的亚细胞定位图；

其中，从左到右分别为A：绿色荧光；B：叶绿体自发荧光；C：明场；D：叠加场；白色箭头指示细胞核。

图9是200mM NaCl胁迫10天后的转HgWRKY19基因拟南芥表型；

图10是HgWRKY27基因PCR扩增凝胶电泳图；

图11是200mM NaCl胁迫下HgWRKY27基因的表达变化图；

图12是HgWRKY27基因在烟草叶片中的亚细胞定位图；

其中，从左到右分别为A：绿色荧光；B：叶绿体自发荧光；C：明场；D：叠加场；白色箭头指示细胞核。

图13是200mM NaCl胁迫10天后的转HgWRKY27基因拟南芥表型。

具体实施方法

本发明专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

本实施例提供盐生草耐盐WRKY基因筛选方法，包括如下步骤：

1、盐生草WRKY基因家族的鉴定。本实验室利用PacBio RS II测序平台构建了首个盐生草三代全长转录组数据库，为本次盐生草WRKY耐盐基因的筛选提供了数据基础。经数据库比对以及去除冗余和缺失序列的转录因子，最终鉴定筛选出31个盐生草WRKY家族成员，分别命名为HgWRKY1～HgWRKY31。

2、盐胁迫下HgWRKYs基因qRT-PCR分析。盐生草植株生长至100d后使用200mM NaCl模拟盐胁迫环境，分别在盐胁迫后0h、6h、24h、48h采集盐生草叶片和根系样品，3次生物学重复，然后将收集的盐生草样品用植物总RNA提取试剂盒(天根)分别提取RNA，1％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，第一链cDNA试剂盒(天根)进行反转录。使用Primer 5.0软件设计用于实时荧光定量试验的PCR引物，用SuperReal荧光定量预混试剂实行qRT-PCR反应，反应体系(20μL)为：2×SuperReal PreMix Plus 10μL、正反向引物(10μM)各0.6μL、 cDNA模板(80ngμL^-1)1μL、50×ROX Reference Dye 0.4μL、RNase-free ddH₂O 7.4μL。反应程序采用两步法，为：95℃预变性15min，95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。以盐生草Actin基因作为内参，上游引物F：5’-TGTTCTCAGTGGTGGTACAA-3’，下游引物R： 5’-GTGCCACCACCTTAATCTTC-3’。基因的相对表达量使用2^-△△CT公式计算。

通过qRT-PCR的方法分析了200mM NaCl胁迫下31个HgWRKYs在盐生草叶片和根系的表达水平(图1)，发现HgWRKYs主要在根系中表达，具有组织特异性，其中HgWRKY19、HgWRKY23和HgWRKY27在根中的表达量最高，故选择以上3个盐生草基因作为耐盐胁迫候选基因。

实施例2

本实施例提供盐生草WRKY23基因，包括如下步骤：

本实施例提供盐生草WRKY23基因，该基因全长转录本序列如序列表SEQ ID NO.1所示，包含1533bp；其中CDS全长为1137bp，为第123bp至1259bp。

实施例3

本实施例提供盐生草WRKY23基因的应用，包括如下步骤：

1、HgWRKY23基因克隆。用植物总RNA提取试剂盒(天根)提取盐生草根系总RNA，将提取好的RNA样品用核酸测定仪检测浓度，OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值范围在1.8～2.0则视为合格，然后用1％琼脂糖凝胶电泳分析其质量。综合以上检测结果，将RNA产物使用第一链cDNA 试剂盒反转录得到cDNA，放进-20℃冰箱保存。基于盐生草转录组数据设计引物，其中上游引物F:5’-CTCCATTTCTTCTTCTTCTTC-3’，下游引物R:5’- ACATTATCATGACTCAAACAG-3’。PCR扩增总体系25μL，各组分如下：Green Taq Mix 12.5 μL、上游引物F(10uM)1μL，下游引物R(10uM)1μL、cDNA 1μL、ddH₂O 9.5μL。以 cDNA第一链为模板进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸90s，进行35个循环，72℃延伸10min。然后用1％琼脂糖凝胶电泳对盐生草HgWRKY23基因的PCR扩增产物进行检验，如图2，检验成功之后将产物切胶并用试剂盒回收，连接到克隆载体pMDTM19-T Vector上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选阳性克隆，送公司测序。得到的HgWRKY23基因的核苷酸序列，片段长度共1533bp，具体如序列表SEQ ID NO.1所示。

2、HgWRKY23基因的生物信息学分析。HgWRKY23基因的分子量大小为40884.7Da，编码378个氨基酸蛋白，等电点为9.6，属于碱性蛋白；二级结构中α螺旋占17.2％，β转角10.05％，延长链19.58％，无规则卷曲53.17％，HgWRKY23编码的蛋白为亲水性蛋白；用NetPhos 2.0 Server软件预测HgWRKY23基因编码蛋白的磷酸化位点，存在丝氨酸，苏氨酸以及酪氨酸。

3、盐胁迫下HgWRKY23基因qRT-PCR分析。使用Primer 3.0软件，设计用于定量试验的引物，上游引物F：5’-CATTGCTCCTCGTCAAAGCG-3’，下游引物R：5’-GCCGTATTTGCGCCATGAAT-3’。以盐生草Actin基因为内参，上游引物F: 5’-TGTTCTCAGTGGTGGTACAA-3’，下游引物R:5’-GTGCCACCACCTTAATCTTC-3’。对200mM NaCl胁迫0h、6h、24h、48h下的盐生草叶片和根系样品分别提取RNA，反转录为cDNA，然后将cDNA稀释，用SuperReal荧光定量预混试剂实行qRT-PCR反应试验。以上试剂盒均购自天根生物公司。基因的相对表达量使用2^-△△CT公式计算。由图3可知，盐生草根系中HgWRKY23基因的表达水平显著高于叶片，具有组织特异性。在6h、24h、48h 盐处理下根系中的盐生草WRKY基因表达呈现先上升后下降的趋势，且在24h时表达最高。

4、HgWRKY23基因在烟草叶片中的定位。

(1)pCAMBIA-HgWRKY23载体构建

在所述的盐生草WRKY23基因的特异性引物上分别加入KpnⅠ和BamHⅠ两个酶切位点，上游引物F:5’-GGGGTACCCTCCATTTCTTCTTCTTCTTC-3’，下游引物R:5’-CGGGATCCACATTATCATGACTCAAACAG-3’。以盐生草cDNA为模板，用上述引物进行 PCR扩增，扩增体系和程序均与步骤1相同。PCR产物用1％琼脂糖凝胶条带进行胶回收，连接到克隆载体pMDTM19-T Vector上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选阳性克隆，送公司测序。对测序成功的菌液提取质粒，用KpnⅠ和BamHⅠ两个限制性内切酶酶切，同时对过表达载体pCAMBIA1300的质粒也进行酶切，电泳分别检测双酶切后的目的片段和表达载体，片段检测合适后，切胶并回收目的基因和载体。酶切体系及条件：3μL通用Buffer 10×K、1μL KpnⅠ、1μL BamHⅠ、5μL ddH₂O、10μL质粒，37℃条件下过夜酶切。T-4DNA 连接酶分别对胶回收成功的HgWRKY23基因片段和表达载体连接，各组分如下：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL、T4DNA Ligase 1μL、HgWRKY23胶回收片段6μL、表达载体胶回收产物1μL、ddH₂O 1μL，16℃连接。连接成功的产物为pCAMBIA-HgWRKY23。将连接产物分别转化大肠杆菌，无需进行蓝白斑筛选，直接挑取白斑置于含100mg/L Kan的LB液体培养基，37℃，220rpm，黑暗条件下过夜摇培12h。然后进行菌液PCR，再进行跑胶鉴定目的条带是否合适。

(2)pCAMBIA-HgWRKY23表达载体转化农杆菌感受态

将pCAMBIA-HgWRKY23重组质粒使用冻融法转入农杆菌感受态细胞(EHA105)。涂布后的平板在28℃、黑暗条件下培养60h，然后挑取单菌落，加入含有Kan和利福平(Rif) 的LB液体培养基，28℃，220rpm摇床中摇菌。再进行菌液PCR反应，反应条件和体系同基因扩增，最后经电泳验证、筛选，保存转化成功的菌种。

(3)农杆菌注射渗透法注射烟草

表达载体pCAMBIA1300上连接有EGFP，可直接用于亚细胞定位试验。取保存的含有重组质粒的农杆菌菌液，以及空载体菌液，置于冰上融化后，以1:100的比例加入LB(含0.01％ Kan，0.01％Rif)液体培养基内，28℃、220rpm摇培12h以活化菌液。再以相同比例取上一步摇培后的菌液于新的LB(含0.01％Kan，0.01％Rif)液体培养基中，相同条件下培养12h，然后取活化好的菌液按2:25的比例加入LB(含0.05g/L Kan，0.05g/L Rif，10mM MES乙磺酸)，20μM ACE)液体培养基内，28℃，220rpm，黑暗条件下摇培6h，测定OD₆₀₀的值为0.5即可，在4℃、5000rpm条件下离心10min，弃去上清。1％MS液体培养基(含150μM ACE、10mMMES、10mM MgCl₂)进行重悬，重悬液体OD₆₀₀为0.5左右，冰浴静置3h。选取时期为4叶期的烟草叶，含不同基因的菌液各注射3～5片；从叶片下表皮将静置后的重悬液注射进烟草，暗培养2～3d后观察。避开叶脉，在其周围剪取一小块侵染的烟草叶片，置于载玻片上，用激光共聚焦显微镜观察烟草表皮细胞(pCAMBIA1300-EGFP空载体为对照)。观察结果见图4，HgWRKY23效应蛋白在细胞膜和细胞核上发出绿色荧光，细胞质中则无荧光出现，而pCAMBIA1300-EGFP在细胞核、细胞质与细胞膜中均有荧光信号。因此， HgWRKY23初步定位在细胞核内。

5、pCAMBIA-HgWRKY23表达载体转化拟南芥

盐生草pCAMBIA-HgWRKY23表达载体转化拟南芥，具体操作采用浸花法。取出保存的农杆菌菌液，测定菌液OD₆₀₀＝2.0，6000rpm室温离心，弃去上清液。浸染液配置：5％蔗糖、0.03％Silwet L-77、ddH₂O，重悬沉淀菌体，测定浸染液OD₆₀₀在0.5左右。挑取刚抽薹、开花多的野生型拟南芥植株，剪去已结的果荚，将花浸染在浸染液中20s，然后黑暗处理24h。黑暗处理结束后，在22℃光照条件下生长，7d后再次浸染。二次浸染结束后，让拟南芥在 22℃左右的光照条件下正常生长，待种子成熟后分别收获，将种子在28℃条件下干燥15d，然后储藏。将获得的转基因种子置于含50mg/L Kan的1/2MS固体培养基中培养，4℃条件下放置3d，3d后转移到26℃培养箱培养，在10d左右观察。抗Kan的拟南芥种子发芽且长出两片子叶，不抗Kan的种子发芽后子叶变黄，将抗Kan的拟南芥移栽到育苗盘中，使其正常生长。待长成幼苗后提取阳性植株的DNA，用与PCR扩增时相同的引物和PCR扩增条件进行电泳检测。

6、转HgWRKY23基因拟南芥耐盐性鉴定

连续进行抗生素Kan筛选，直至获得转HgWRKY23基因拟南芥T₂代纯系种子，将T₂代纯系和野生型拟南芥种子(Col-1)分别播种到培养基质中，待一个月后进行200mmol/L的盐胁迫处理。10天后观察幼苗生长状况发现(图5)，在200mmol/L的NaCl处理下植物生长缓慢，野生型植株叶片小，出现枯黄等症状，而转HgWRKY23基因植株可以正常生长，长势明显强于野生型。说明HgWRKY23基因能显著提高拟南芥耐盐性，该基因可应用于耐盐作物新品种的培育当中。

实施例4

本实施例提供盐生草WRKY19基因，包括如下步骤：

本实施例提供盐生草WRKY19基因，该基因全长转录本序列如序列表SEQ ID NO.2所示，包含1595bp；其中CDS全长为1170bp，为第84bp至1253bp。

实施例5

本实施例提供盐生草WRKY19基因的应用，包括如下步骤：

步骤1、盐生草WRKY19基因(即HgWRKY19基因)克隆。用植物总RNA提取试剂盒 (天根)提取盐生草根系总RNA，将提取好的RNA样品用核酸测定仪检测浓度，OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值范围在1.8～2.0则视为合格，然后用1％琼脂糖凝胶电泳分析其质量。综合以上检测结果，把RNA产物使用第一链cDNA试剂盒反转录得到cDNA，放进-20℃冰箱保存。基于盐生草转录组数据设计引物，其中上游引物F:5’-TATTTCAACATTCTTTGTTC-3’，下游引物 R:5’-GAGAAGGTGCTTTGGACTTTTC-3’。PCR扩增总体系25μL，各组分如下：Green Taq Mix 12.5μL、上游引物F(10uM)1μL，下游引物R(10uM)1μL、cDNA 1μL、ddH₂O 9.5 μL。

以cDNA第一链为模板进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性50s，60.6℃退火50s，72℃延伸90s，进行35个循环，72℃延伸10min。然后用1％琼脂糖凝胶电泳对盐生草HgWRKY19基因的PCR扩增产物进行检验，如图6，检验成功之后将产物切胶并用试剂盒回收，连接到克隆载体pMDTM19-T Vector上，转化大肠杆菌感受态细胞 DH5α，筛选阳性克隆，送公司测序，得到HgWRKY19基因的片段长度共1595bp，具体如SEQ ID No：2所示。

2、HgWRKY19基因的生物信息学分析。HgWRKY19基因的分子量大小为42129.4Da，编码389个氨基酸蛋白，等电点为9.56，属于碱性蛋白；二级结构中α螺旋23.39％，β转角4.88％，延长链10.28％，无规则卷曲61.44％；HgWRKY19编码的蛋白为亲水性蛋白；用NetPhos 2.0 Server软件预测HgWRKY19基因编码蛋白的磷酸化位点，存在丝氨酸(Ser，Serine)，苏氨酸(Thr，Threonine)以及酪氨酸(Tyr，Tyrosine)。

3、盐胁迫下HgWRKY19基因qRT-PCR分析。使用Primer3.0软件，设计用于定量试验的引物，上游引物F:5’-CCGACAGTGTTCAACCGTCT-3’，下游引物R:5’-TGGCAACGACCAGAAGATCC-3’。以盐生草Actin基因为内参，其上游引物F: 5’-TGTTCTCAGTGGTGGTACAA-3’，下游引物R:5’-GTGCCACCACCTTAATCTTC-3’。对 200mM NaCl胁迫0h、6h、24h、48h下的盐生草叶片和根系样品分别提取RNA，反转录为cDNA，然后将cDNA稀释，用SuperReal荧光定量预混试剂实行qRT-PCR反应试验。以上试剂盒均购自天根生物公司。基因的相对表达量使用2^-△△CT公式计算。由图7可知， HgWRKY19在盐生草根系中的表达显著高于叶片中，表明HgWRKY19的表达具有组织特异性。在6h、24h、48h盐处理下根系中的盐生草WRKY基因表达呈现先上升后下降的趋势，且在24h时表达最高。

4、HgWRKY19基因在烟草叶片中的定位。

(1)pCAMBIA-HgWRKY19载体构建

在所述的盐生草WRKY19基因的特异性引物上分别加入BamHⅠ和XbaⅠ两个酶切位点，上游引物F:5’-CGGGATCCTATTTCAACATTCTTTGTTC-3’，下游引物R:5’-GCTCTAGAGAGAAGGTGCTTTGGACTTTTC-3’。

以盐生草cDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，扩增体系和程序均与步骤1相同。PCR产物用1％琼脂糖凝胶条带进行胶回收，连接到克隆载体pMDTM19-T Vector上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选阳性克隆，送公司测序。对测序成功的菌液提取质粒，用 BamHⅠ和XbaⅠ两个限制性内切酶酶切，同时对过表达载体pCAMBIA1300的质粒也进行酶切，电泳分别检测双酶切后的目的片段和表达载体，片段检测合适后，切胶并回收目的基因和载体。酶切体系及条件：通用Buffer 10×K 3μL、双酶各1μL、ddH₂O 5μL、质粒10μL， 37℃条件下过夜酶切。T-4DNA连接酶分别对胶回收成功的各基因片段和表达载体连接，各组分如下：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL、T4 DNA Ligase 1μL、HgWRKY19胶回收片段6μL、表达载体胶回收产物1μL、ddH₂O 1μL，16℃连接。连接成功的产物为pCAMBIA-HgWRKY19。将连接产物分别转化大肠杆菌，无需进行蓝白斑筛选，直接挑取白斑置于含100mg/L Kan的 LB液体培养基，37℃，220rpm，黑暗条件下过夜摇培12h。然后进行菌液PCR，再进行跑胶鉴定目的条带是否合适。

(2)pCAMBIA-HgWRKY19表达载体转化农杆菌感受态

将pCAMBIA-HgWRKY19重组质粒转入农杆菌感受态细胞(EHA105)，操作方法使用冻融法。涂布后的平板28℃、黑暗条件下培养60h，然后挑取单菌落，加入含有Kan和利福平(Rif)的LB液体培养基，28℃，220rpm摇床中摇菌。再进行菌液PCR反应，反应条件和体系同基因扩增，最后经电泳验证、筛选，保存转化成功的菌种。

(3)农杆菌注射渗透法注射烟草

表达载体pCAMBIA1300上连接有EGFP，可直接用于亚细胞定位试验，因此，取保存的含有重组质粒的农杆菌菌液，以及空载体菌液，置于冰上融化后，以1:100的比例加入LB(含0.01％Kan，0.01％Rif)液体培养基内，28℃、220rpm摇培12h以活化菌液；再以相同比例取上一步摇培后的菌液于新的LB(含0.01％Kan，0.01％Rif)液体培养基中，相同条件下培养12h；然后取活化好的菌液按2:25的比例加入LB(含0.05g/L Kan，0.05g/L Rif， 10mMMES乙磺酸)，20μM ACE)液体培养基内，28℃，220rpm，黑暗条件下摇培6h，测定OD₆₀₀的值为0.5即可；4℃，5000rpm离心10min收菌，弃去上清；1％MS液体培养基(含150μM ACE、10mMMES、10mM MgCl₂)进行重悬，重悬液体OD₆₀₀为0.5左右，冰浴静置3h；选取时期为4叶期的烟草叶，含不同基因的菌液各注射3～5片；从叶片下表皮将静置后的重悬液注射进烟草，暗培养2～3d后观察。

避开叶脉，在其周围剪取一小块侵染的烟草叶片，置于载玻片上，用激光共聚焦显微镜观察烟草表皮细胞(pCAMBIA1300-EGFP空载体为对照)。观察结果见图8，pCAMBIA1300-EGFP在细胞核、细胞质与细胞膜中均有荧光信号，而HgWRKY19效应蛋白在细胞膜和细胞核上发出绿色荧光，细胞质中则无荧光出现。因此，HgWRKY19初步定位于细胞核内。

5、pCAMBIA-HgWRKY19表达载体转化拟南芥

采用浸花法将盐生草HgWRKY19基因的表达载体转化拟南芥。取出保存的农杆菌菌液，测定菌液OD₆₀₀＝2.0，6000rpm室温离心，弃去上清液。浸染液配置：5％蔗糖、0.03％Silwet L-77、ddH₂O，重悬沉淀菌体，测定浸染液OD₆₀₀在0.5左右。挑取刚抽薹、开花多的野生型拟南芥植株，剪去已结的果荚，将花浸染在浸染液中20s，然后黑暗处理24h。黑暗处理结束后，在22℃光照条件下生长，7d后再次浸染。二次浸染结束后，让拟南芥在22℃左右的光照条件下正常生长，待种子成熟后分别收获，将种子在28℃条件下干燥15d，然后储藏。

将获得的转基因种子置于含50mg/L Kan的1/2MS固体培养基中培养，4℃条件下放置3d， 3d后转移到26℃培养箱培养，在10d左右观察。抗Kan的拟南芥种子发芽且长出两片子叶，不抗Kan的种子发芽后子叶变黄，将抗Kan的拟南芥移栽到育苗盘中，使其正常生长。待长成幼苗后提取阳性植株的DNA，用与PCR扩增时相同的引物和PCR扩增条件进行电泳检测。

6、转HgWRKY19基因拟南芥耐盐性鉴定

连续进行抗生素Kan筛选，直至获得T₂代转HgWRKY19基因拟南芥纯系种子，将T₂代纯系和野生型拟南芥种子(Col-1)分别播种到培养基质中，待一个月后进行200mmol/L的盐胁迫处理，经观察幼苗生长状况发现(图9)，在200mmol/L的NaCl处理下，植物生长缓慢，野生型植株出现枯黄等症状，但转HgWRKY19基因植株可以正常生长。说明HgWRKY19 基因能显著提高拟南芥耐盐性，该基因可应用于耐盐作物新品种的培育当中。

实施例6

本实施例提供盐生草WRKY27基因，包括如下步骤：

本实施例提供盐生草WRKY27基因，该基因全长转录本序列如序列表SEQ ID NO.3所示，包含1383bp；其中CDS全长为1170bp，为第161bp至1330bp。

实施例7

本实施例提供盐生草WRKY27基因的应用，包括如下步骤：

1、盐生草WRKY27基因(即HgWRKY27基因)克隆。用植物总RNA提取试剂盒(天根)提取盐生草根系总RNA，将提取好的RNA样品用核酸测定仪检测浓度，OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值范围在1.8～2.0则视为合格，然后用1％琼脂糖凝胶电泳分析其质量。综合以上检测结果， RNA产物使用第一链cDNA试剂盒反转录得到cDNA，放进-20℃冰箱保存。基于盐生草转录组数据设计引物，其中上游引物F:5’-CGAACTTTATTTTTTTAAAA-3’，下游引物R:5’-AGTGACTTGCTAAATTGCTA-3’。PCR扩增总体系25μL，各组分如下：Green Taq Mix 12.5 μL、上游引物F(10uM)1μL，下游引物R(10uM)1μL、cDNA 1μL、ddH₂O 9.5μL。

以cDNA第一链为模板进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性50s，61.3℃退火50s，72℃延伸90s，进行35个循环，72℃延伸10min。然后用1％琼脂糖凝胶电泳对盐生草HgWRKY27基因的PCR扩增产物进行检验，图10为HgWRKY27基因PCR 克隆凝胶电泳图。检验成功之后将产物切胶并用试剂盒回收，连接到克隆载体pMDTM19-T Vector上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选阳性克隆，送公司测序，得到HgWRKY27 基因的片段长度共1383bp，具体如SEQ ID No：3所示。

2、HgWRKY27基因的生物信息学分析。HgWRKY27基因的分子量大小为42129.4Da，编码389个氨基酸蛋白，等电点为9.56，属于碱性蛋白；二级结构中α螺旋23.39％，β转角4.88％，延长链10.28％，无规则卷曲61.44％；HgWRKY27编码的蛋白为亲水性蛋白；用NetPhos 2.0 Server软件预测HgWRKY27基因编码蛋白的磷酸化位点，存在丝氨酸(Ser，Serine)，苏氨酸(Thr，Threonine)以及酪氨酸(Tyr，Tyrosine)。

3、盐胁迫下HgWRKY27基因qRT-PCR分析。使用Primer 3.0软件，设计用于定量试验的引物，其上游引物F:5’-CTTACCCGCACACAAGTCCA-3’，下游引物R: 5’-AGACGGTTGAACACTGTCGG-3’。以盐生草Actin基因为内参，其上游引物F: 5’-TGTTCTCAGTGGTGGTACAA-3’，下游引物R:5’-GTGCCACCACCTTAATCTTC-3’。对 200mM NaCl胁迫0h、6h、24h、48h下的盐生草叶片和根系样品分别提取RNA，反转录为cDNA，然后将cDNA稀释，用SuperReal荧光定量预混试剂实行qRT-PCR反应试验。以上试剂盒均购自天根生物公司。基因的相对表达量使用2^-△△CT公式计算。图11为HgWRKY27 基因在200mM NaCl胁迫下不同时间不同组织中的表达量，可以看出，HgWRKY27在盐生草根系中的表达显著高于叶片中，表明HgWRKY27的表达具有组织特异性。在6h、24h、48h 盐处理下根系中的盐生草WRKY基因表达呈现先上升后下降的趋势，且在24h时表达最高。

4、HgWRKY27基因在烟草叶片中的定位。

(1)pCAMBIA-HgWRKY27载体构建

在所述的盐生草WRKY27基因的特异性引物上分别加入BamHⅠ和XbaⅠ两个酶切位点，上游引物F:5’-CGGGATCCCGAACTTTATTTTTTTAAAA-3’，下游引物R: 5’-GCTCTAGAAGTGACTTGCTAAATTGCTA-3’。

以盐生草cDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，扩增体系和程序均与步骤1相同。PCR产物用1％琼脂糖凝胶条带进行胶回收，连接到克隆载体pMDTM19-T Vector上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选阳性克隆，送公司测序。对测序成功的菌液提取质粒，用 BamHⅠ和XbaⅠ两个限制性内切酶酶切，同时对过表达载体pCAMBIA1300的质粒也进行酶切，电泳分别检测双酶切后的目的片段和表达载体，片段检测合适后，切胶并回收目的基因和载体。酶切体系及条件：通用Buffer 10×K 3μL、双酶各1μL、ddH₂O 5μL、质粒10μL， 37℃条件下过夜酶切。T-4DNA连接酶分别对胶回收成功的各基因片段和表达载体连接，各组分如下：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL、T4 DNA Ligase 1μL、HgWRKY27胶回收片段6μL、表达载体胶回收产物1μL、ddH₂O 1μL，16℃连接。连接成功的产物为pCAMBIA-HgWRKY27。将连接产物分别转化大肠杆菌，无需进行蓝白斑筛选，直接挑取白斑置于含100mg/L Kan的 LB液体培养基，37℃，220rpm，黑暗条件下过夜摇培12h。然后进行菌液PCR，再进行跑胶鉴定目的条带是否合适。

(2)pCAMBIA-HgWRKY27表达载体转化农杆菌感受态

将pCAMBIA-HgWRKY27重组质粒转入农杆菌感受态细胞(EHA105)，操作方法使用冻融法。涂布后的平板28℃、黑暗条件下培养60h，然后挑取单菌落，加入含有Kan和利福平(Rif)的LB液体培养基，28℃，220rpm摇床中摇菌。再进行菌液PCR反应，反应条件和体系同基因扩增，最后经电泳验证、筛选，保存转化成功的菌种。

(3)农杆菌注射渗透法注射烟草

表达载体pCAMBIA1300上连接有EGFP，可直接用于亚细胞定位试验，因此，取保存的含有重组质粒的农杆菌菌液，以及空载体菌液，置于冰上融化后，以1:100的比例加入LB(含0.01％Kan，0.01％Rif)液体培养基内，28℃、220rpm摇培12h以活化菌液；再以相同比例取上一步摇培后的菌液于新的LB(含0.01％Kan，0.01％Rif)液体培养基中，相同条件下培养12h；然后取活化好的菌液按2:25的比例加入LB(含0.05g/L Kan，0.05g/L Rif， 10mMMES乙磺酸)，20μM ACE)液体培养基内，28℃，220rpm，黑暗条件下摇培6h，测定OD₆₀₀的值为0.5即可；4℃，5000rpm离心10min收菌，弃去上清；1％MS液体培养基(含150μM ACE、10mMMES、10mM MgCl₂)进行重悬，重悬液体OD₆₀₀为0.5左右，冰浴静置3h；选取时期为4叶期的烟草叶，含不同基因的菌液各注射3～5片；从叶片下表皮将静置后的重悬液注射进烟草，暗培养2～3d后观察。

避开叶脉，在其周围剪取一小块侵染的烟草叶片，置于载玻片上，用激光共聚焦显微镜观察烟草表皮细胞(pCAMBIA1300-EGFP空载体为对照)。图12为pCAMBIA-HgWRKY27 亚细胞定位观察。由图11可知，pCAMBIA1300-EGFP在细胞核、细胞质与细胞膜中均有荧光信号，而HgWRKY27效应蛋白在细胞膜和细胞核上发出绿色荧光，细胞质中则无荧光出现。因此，HgWRKY27初步定位于细胞核内。

5、pCAMBIA-HgWRKY27表达载体转化拟南芥

采用浸花法对盐生草HgWRKY27基因的表达载体转化拟南芥。取出保存的农杆菌菌液，测定菌液OD₆₀₀＝2.0，6000rpm室温离心，弃去上清液。浸染液配置：5％蔗糖、0.03％Silwet L-77、ddH₂O，重悬沉淀菌体，测定浸染液OD₆₀₀在0.5左右。挑取刚抽薹、开花多的野生型拟南芥植株，剪去已结的果荚，将花浸染在浸染液中20s，然后黑暗处理24h。黑暗处理结束后，在22℃光照条件下生长，7d后再次浸染。二次浸染结束后，让拟南芥在22℃左右的光照条件下正常生长，待种子成熟后分别收获，将种子在28℃条件下干燥15d，然后储藏。

将获得的转基因种子置于含50mg/L Kan的1/2MS固体培养基中培养，4℃条件下放置3d， 3d后转移到26℃培养箱培养，在10d左右观察。抗Kan的拟南芥种子发芽且长出两片子叶，不抗Kan的种子发芽后子叶变黄，将抗Kan的拟南芥移栽到育苗盘中，使其正常生长。待长成幼苗后提取阳性植株的DNA，用与PCR扩增时相同的引物和PCR扩增条件进行电泳检测。

6、转HgWRKY27基因拟南芥耐盐性鉴定

连续进行抗生素Kan筛选，直至获得T₂代转HgWRKY27基因拟南芥纯系种子，将T₂代纯系和野生型拟南芥种子(Col-1)分别播种到培养基质中，待一个月后进行200mmol/L的盐胁迫处理，经观察幼苗生长状况发现，在200mmol/L的NaCl处理下，植物生长缓慢，野生型植株长势羸弱，出现枯黄等症状，如图13，但转HgWRKY27基因植株可以正常生长。说明HgWRKY27基因能显著提高拟南芥耐盐性，该基因可应用于耐盐作物新品种的培育当中。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

参考文献：

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[5]李岢,周春江.植物WRKY转录因子的研究进展[J].植物生理学报,2014,50(09):1329-1335.

[6]Wang J C,Meng Y C,Li B C,et al.Physiological and proteomicanalyses of salt stress response in the halophyte Halogeton glomeratus[J].Plant,cell&environment,2015,38(4):655-669.

[7]Wang J C,Yao L R,Li B C,et al.Single-molecule long-readtranscriptome dataset of halophyte Halogeton glomeratus[J].Frontiers ingenetics,2017,8:197。

<110> 甘肃农业大学

<120> 盐生草WRKY耐盐基因及其筛选方法

<160> 3

<210> 1

<211> 1533

<212> DNA

<213> 盐生草（Halogeton glomeratus）

<400> 1

1 ctccatttct tcttcttctt cttcttttac tccgtccctc cccctcttaa tttctctccc

61 tctctcttta gtttacaatt tgtttattta tttatttatt tatttgttgt agcgtaagtt

121 ggatgggggt tgacagcaga tctgcaggga agatccagat ggaagacgaa ggagtagcaa

181 tagcagaggc agcatctgct ggggtgaagt ccatggaaca tttggtgcgg ctcttgtcat

241 cctatgatga tcaccaaaat gaatgcagac aagtcactga agcaaccgtt ggtaagttca

301 agaaactcat ctctgtgctc aaccgcactg gccacgctcg ctttcgccgt gctcctactc

361 tttctctctc ctccgactcc tcttcttctt cttctcaacc accaccacca ccaccactag

421 aacaaccaca agaagctctg ttatttcatt caaagccacc tgtatctgta tctgtatctc

481 aacaaccaga aaagcccatt cctgtcaggg ctgtcaggca ccaacctcct cctcctcctc

541 ttgctgctgt cactctagac ttcagcaaac ccaatcctca gcctcagcct cagcctccta

601 aacagtctaa ctcggcatcg tttacctcat catcttcttc ctttttgtct tctatcaccg

661 gcgaaggaag cgtctccaat ggcaacttat tcggcggcgg cggtggtgga tctatgttca

721 gtgctccacc gcctccttcg tcgtcttctg gaaagcctcc tctttcgacc acctcttcct

781 cttctcatca caacaagagc aagagcaaga gctgtcatca tcatcatcat caagaattct

841 ccgatgactt ttccggcaaa gtacgctgtc attgctcctc gtcaaagcgt aagaagttga

901 gagttaagaa tactattaga gtcccggcga ttagctccaa aaccgctgat attccttccg

961 atgagtattc atggcgcaaa tacggccaaa agcctatcaa aggatctcct tacccacgag

1021 gatattacaa gtgcagcaca gtgagaggat gcccggcgag gaagcatgtg gagagagcaa

1081 ccgatgatcc gacgatgctg attgtgactt acgaagggga gcaccgtcat tctcctgcac

1141 ctgcaacaca tcataacatc atctctcaat atcatcatca tcattttcaa ggaaccaccg

1201 ccaccgctac accggcatgg ttgcaatccc agcctattct gactttgtcc acggactaaa

1261 tcagctgcca cctcatcgta ttgggttgtg ttgttagttt aggaacttca ttgtgttgta

1321 ctgtactatt gttcatttct tgagttttaa ctaattacta attactgcta ctactgtttt

1381 gacttatgag ttagtttaag gggcaatttg aagaaacgac aaaaataata ttggcttgta

1441 aatttgacaa aaaaatttaa aaaaggtaga gatggtgggg ttaggttagt gggtggtttt

1501 ggtcaattga ttctgtttga gtcatgataa tgt

<210> 2

<211> 1595

<212> DNA

<213> 盐生草（Halogeton glomeratus）

<400> 2

1 tatttcaaca ttctttgttc tattttcgcc tctttacttt tatttttttt tccttttcct

61 aaaaattggc ctaagttttg gccatggcag tggagttaat gatgggcgga ggttataaga

121 gtagctgcgg tggaagcgac agcttcgccg caaggatgga agaaaatgcc gtgcgagaag

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721 cctcgccgcc gatgtcggca accaattctt acatctcgtc attaactgga gacaccgaca

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841 aagtttcatc tgttggaaaa cctcctcttt cttcttcttc aatgaaaagg aagtgtagtt

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<210> 3

<211> 1383

<212> DNA

<213> 盐生草（Halogeton glomeratus）

<400> 3

1 cgaactttat ttttttaaaa taatttaaat ttctcctctt tattatatca ttcacgcagt

61 ctacttcttc ctctaattat ttcaacattc tttgttctat tttcgcctct ttacttttat

121 ttttttttcc ttttcctaaa aattggccta agttttggcc atggcagtgg agttaatgat

181 gggcggaggt tataagagta gctgcggtgg aagcgacagc ttcgccgcaa ggatggaaga

241 aaatgccgtg cgagaagcca ccgcagctgg gctccaaagc gtcgagaaac ttattaagtt

301 gctctcatct caaactcaaa gtcaaagtca aacacacagt aacacacaag atgactcctc

361 cacatcatcc gacggtgccg aggagtacaa ggtagttgct gatttggccg tcaataaatt

421 caaaaaagtc atctccctcc tagaccgctc ccgcacaggc catgcccgct tccgccgcgg

481 cccagtcaac ccccaagccc aagcccaagc cctaatccag ggcaaatcac tatctcagcc

541 ccaacagcat cagcaagaga agaaagtaca gccacagcca cagccacagc cacaacatca

601 gcagctggtg ttggatagta agccatccca cggctcagcg ttcacaagag tatacagctc

661 atcaccctca cagatccaac ggctaccacc gctgccgcac agtagccacc ctgcgcctta

721 cccgcacaca agtccacccc tcggactacc gaagccagtc gatcgtaaag agtgttctac

781 gactatcaac ttttcatcct cgccgccgat gtcggcaacc aattcttaca tctcgtcatt

841 aactggagac accgacagtg ttcaaccgtc tatgtcgatg tcgctgtctt cggggtttca

901 aatcaccaat atgtcccaag tttcatctgt tggaaaacct cctctttctt cttcttcaat

961 gaaaaggaag tgtagttcca tggatgattc taagtgtggt ggatcttctg gtcgttgcca

1021 ttgccccaaa cgaaggaagt caagggtgaa aagggtggtg agggtaccag caataagctt

1081 aaagatggct gatattccac cagatgatta ttcatggaga aaatatggtc aaaaaccaat

1141 caaaggatct cctcacccaa gaggctatta caagtgtagt agcgtacggg gatgtccagc

1201 gcgtaaacat gtggagagag cgttagatga cccatcaatg ttgatcgtga cttacgaagg

1261 cgatcacagc catccccaat ccgtcaccga tgcaactgtc gcagctgccc tcgtactcga

1321 atcatcctag tccgagggat ttaagtaatt tcaaggcgat gtttagcaat ttagcaagtc

1381 act

Claims (10)

1.盐生草WRKY23基因，其特征在于该基因全长转录本序列如序列表SEQ ID NO.1所示，包含1533bp；其中CDS全长为1137bp，为第123bp至1259bp。

2.根据权利要求1所述的盐生草WRKY23基因，其特征在于所述盐生草WRKY23基因在提高拟南芥耐盐性中的应用，并通过过表达WRKY23基因予以实现。

3.一种载体，其特征在于包含如权利要求1所述盐生草WRKY23基因序列。

4.盐生草WRKY19基因，其特征在于该基因全长转录本序列如序列表SEQ ID NO.2所示，包含1595bp；其中CDS全长为1170bp，为第84bp至1253bp。

5.根据权利要求4所述的盐生草WRKY19基因，其特征在于所述盐生草WRKY19基因在提高拟南芥耐盐性中的应用，通过过表达WRKY23基因予以实现。

6.一种载体，其特征在于包含如权利要求4所述盐生草WRKY23基因序列。

7.盐生草WRKY27基因，其特征在于该基因全长转录本序列如序列表SEQ ID NO.3所示，包含1383bp；其中CDS全长为1170bp，为第161bp至1330bp。

8.根据权利要求7所述的盐生草WRKY27基因，其特征在于所述盐生草WRKY27基因在提高拟南芥耐盐性中的应用，并通过过表达WRKY23基因予以实现。

9.一种载体，其特征在于包含如权利要求7所述盐生草WRKY27基因序列。

10.盐生草耐盐WRKY基因筛选方法，包括如下步骤：(1)盐生草WRKY基因家族的鉴定。(2)盐胁迫下HgWRKYs基因qRT-PCR分析。

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