CN113980922A - 一种重组脂肪氧合酶及其诱导表达方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组脂肪氧合酶及其诱导表达方法和用途。本发明重组脂肪氧合酶，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。重组脂肪氧合酶的诱导表达方法，包括以下步骤：将基因工程菌在液体培养基中培养，至菌液OD600值为0.8‑1.0时，加入IPTG诱导表达；取菌液离心，弃上清，加入PBS缓冲液重悬并超声破碎，再次离心，收集上清液，经纯化后得到重组脂肪氧合酶。本发明所获得的脂肪氧合酶vvLOX具有更好专一催化性和优良的的稳定性，可明显提高氢过氧化酶活。

Description

一种重组脂肪氧合酶及其诱导表达方法和用途

技术领域

本发明属于生物技术和酶工程领域，涉及一种重组脂肪氧合酶及其诱导表达方法和用途。

背景技术

脂肪氧合酶(Lipoxygenase，EC1.13.11.12，LOX)属于氧化还原酶，在好氧生物中广泛存在，它可以通过氧化脂质形成脂质氢过氧化物的自由基，参与生物的各种反应。

在工业生产中，简单地从天然生物提取脂肪氧合酶因经济成本过高、效率低而无法满足实际生产需求。采用基因工程技术构建脂肪氧合酶工程菌，可制备符合工业需要的重组酶制剂，酶法催化脂质氢过氧化物因其具有高选择性、专一性、高收率，而且能最大限度地降低副反应发生的优势而备受关注。

脂质氢过氧化物可以作为生成具有不同风味物质的前体物质，可用于香精香料的生物合成。脂质氢过氧化物除了可以产生许多风味物质外，还可以作为药物合成的中间体，经还原可以得到羟基脂肪酸，也可在洗涤剂、聚氯乙烯增塑剂、染料、涂料的工业化生产上有所应用，因此LOX也可以被用于其它工业催化用途，使植物油脂转变为高附加值的产品，利用LOX对脂肪酸进行选择性催化，对生成特定的产物进行环氧化，生成环氧化脂质，形成增塑剂，从而可以减小对石油的依赖。

发明内容

针对现有的氢过氧化物化学工艺副反应多、反应得率低的缺点，本发明的目的在于提供一种重组脂肪氧合酶及其诱导表达方法和用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种重组脂肪氧合酶，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示。

所述重组脂肪氧合酶的DNA序列的克隆方法，包括以下步骤：

提取草菇(Volvariella volvacea)RNA，构建cDNA文库；以cDNA文库为模板，分别以引物对1、引物对2、引物对3扩增得到三个片段，以同源重组方法完成重组连接，得到如SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

所述的引物对1为：

1FP：5’-atgagtcgtatcattaagcaatttgcg-3’(SEQ ID NO.5)

1RP：5’-gctcgggatcagtgatagttgtagg-3’(SEQ ID NO.6)；

所述的引物对2为：

2FP：5’-ctatcactgatcccgagcaactcc-3’(SEQ ID NO.7)

2RP：5’-cttcgttcttatcagtgattggtcc-3’(SEQ ID NO.8)；

所述的引物对3为：

3FP：5’-aatcactgataagaacgaagcaatact-3’(SEQ ID NO.9)

3RP：5’-ttaagctttcaagggtgcaggagt-3’(SEQ ID NO.10)。

重组脂肪氧合酶的表达载体，含有所述重组脂肪氧合酶的DNA序列(SEQ IDNO.1)；

所述的表达载体，是以所述重组脂肪氧合酶的DNA序列和表达质粒的序列为模板，以线性化引物扩增得到；

所述的表达质粒优选pET-28a；

所述线性化引物为：

L-FP：5’-cccttgaaagcttaagaattcgagctccgtcgacaag-3’(SEQ ID NO.11)

L-RP：5’-aatgatacgactcatatggctgccgcgcggcac-3’(SEQ ID NO.12)。

表达重组脂肪氧合酶的基因工程菌或转基因细胞系，含有所述表达载体；

所述的基因工程菌，是将所述表达载体转化大肠杆菌BL21菌株后得到。

重组脂肪氧合酶的诱导表达方法，包括以下步骤：

将所述的基因工程菌在液体培养基中培养，至菌液OD600值为0.8-1.0时，加入IPTG诱导表达；取菌液离心，弃上清，加入PBS缓冲液重悬并超声破碎，再次离心，收集上清液，经纯化后得到重组脂肪氧合酶；

所述的纯化优选采用镍离子亲和层析纯化，所述上清液上柱后，先以10mM、pH值6.0磷酸盐缓冲液(含20mM咪唑)洗脱，再以梯度浓度的10-50mM、pH值6.0磷酸盐缓冲液(含500mM咪唑)缓冲液洗脱，收集50mM、pH值6.0磷酸盐缓冲液(含500mM咪唑)缓冲液洗脱组分，为重组脂肪氧合酶；

所述的液体培养基优选含有一定浓度抗生素的LB液体培养基；

所述加入IPTG优选加入至终浓度0.1mmol/L，于18℃诱导表达；

所述的再次离心，是12000r/min离心15min。

所述的重组脂肪氧合酶可以用于制备氢过氧化物多不饱和脂肪酸；

具体包括以下步骤：

将多不饱和脂肪酸与所述的重组脂肪氧合酶混合，通入氧气并加压反应，反应后反应液上层有机相即含有氢过氧化物多不饱和脂肪酸；

所述的多不饱和脂肪酸包括亚油酸、亚麻酸、大豆油、亚麻籽油、鱼油。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、该目的基因是对来源于草菇(Volvariella volvacea)的脂肪氧合酶进行RNA提取，构建cDNA文库，再分基因片段拼接而获得的，所述基因片段分成3段进行基因克隆，并在扩增的基因片段间设计同源序列，利用同源重组的方法完成重组连接，其中第1个片段958bp为SEQ ID NO.2，第2个片段1236bp为SEQ ID NO.3，第3个片段1174bp为SEQ ID NO.4。本发明所获得的脂肪氧合酶vvLOX具有更好专一催化性和优良的的稳定性，可明显提高氢过氧化酶活。

2、本发明利用脂肪氧合酶vvLOX催化脂质进行氢过氧化物反应，没有副反应发生，氢过氧化物产物得率高、成分单一、易于分离回收，生产过程可控性强，具有经济性和环保性。

附图说明

图1是本发明重组脂肪氧合酶的SDS-PAGE分析结果图；

其中，泳道1：总蛋白；泳道2：上清液；泳道3：穿透液；泳道4：10mM、pH值6.0磷酸盐缓冲液(含20mM咪唑)洗脱液；泳道5：10mM、pH值6.0磷酸盐缓冲液(含500mM咪唑)洗脱液；泳道6：20mM、pH值6.0磷酸盐缓冲液(含500mM咪唑)洗脱液；泳道7：30mM、pH值6.0磷酸盐缓冲液(含500mM咪唑)洗脱液；泳道8：40mM、pH值6.0磷酸盐缓冲液(含500mM咪唑)洗脱液；泳道9：50mM、pH值6.0磷酸盐缓冲液(含500mM咪唑)洗脱液。

图2是本发明重组脂肪氧合酶在不同pH下的酶活曲线图。

图3是本发明重组脂肪氧合酶在不同温度下的酶活曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1.1脂肪氧合酶vvLOX的构建：对来源于草菇(Volvariella volvacea)的脂肪氧合酶进行总RNA提取，构建cDNA文库，根据草菇基因组基因序列(GenBank:GCA_000355865.1)标注的脂肪氧合酶基因位点，分3段进行基因克隆，并在扩增的基因片段间设计同源序列，利用同源重组的方法完成重组连接(DNA序列如SEQ ID NO.1所示)，根据DNA序列以及pET-28a序列信息，设计线性化引物扩增，得到重组pET-28a-vvLOX质粒序列，并委托上海生工生物工程股份有限公司合成。

以cDNA文库为模板，利用扩增引物:1FP:5’-atgagtcgtatcattaagcaatttgcg-3’(SEQ ID NO.5)，1RP:5’-gctcgggatcagtgatagttgtagg-3’(SEQ ID NO.6)扩增得到第1个片段958bp，序列如SEQ ID NO.2所示；

以cDNA文库为模板，以引物2FP:5’-ctatcactgatcccgagcaactcc-3’(SEQ IDNO.7)，2RP:5’-cttcgttcttatcagtgattggtcc-3’(SEQ ID NO.8)进行第2个1236bp片段扩增，序列如SEQ ID NO.3所示；

以cDNA文库为模板，以引物3FP:5’-aatcactgataagaacgaagcaatact-3’(SEQ IDNO.9)，3RP:5’-ttaagctttcaagggtgcaggagt-3’(SEQ ID NO.10)为引入下一个1174bp片段，序列如SEQ ID NO.4所示；

线性化引物为：

L-FP：5’-cccttgaaagcttaagaattcgagctccgtcgacaag-3’(SEQ ID NO.11)

L-RP：5’-aatgatacgactcatatggctgccgcgcggcac-3’(SEQ ID NO.12)

1.2脂肪氧合酶vvLOX表达和重组蛋白纯化：脂肪氧合酶vvLOX在宿主大肠杆菌BL21中自诱导表达，自诱导实验过程如下：

(1)菌体培养及诱导表达：将测序正确的重组质粒pET-28a-vvLOX转化BL21表达菌株，挑取平板上的单克隆菌落接种于60mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min培养10～12h。按照1:100的比例将菌液转接到新的1L含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中扩大培养，37℃、200r/min条件下培养至菌液OD600值为0.8-1.0时，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L，于18℃诱导表达18h。

(2)重组蛋白表达鉴定与纯化制备：取5mL诱导表达后的菌液在12000r/min条件下离心1min，弃去上清，加入PBS缓冲液进行重悬，用超声细胞破碎仪进行超声破碎，获得总蛋白样品(图1泳道1)；取总蛋白样品，在12000r/min条件下离心5min，取上清液(图1泳道2)进行SDS-PAGE分析样品(如图1所示)。

将其余诱导表达后的菌液在7000r/min条件下离心15min，弃去上清。将收集到的菌体沉淀加入PBS缓冲液进行重悬，用超声细胞破碎仪进行超声破碎，将破碎后的菌液在12000r/min条件离心15min，收集上清液，上清液上样镍离子亲和层析柱，取穿透液(图1泳道3)；先以10mM、pH值6.0磷酸盐缓冲液(含20mM咪唑)洗脱3个上样样品体积(图1泳道4)，再以10-50mM、pH值6.0磷酸盐缓冲液(含500mM咪唑)缓冲液洗脱(图1泳道5-泳道9)，洗脱样品进行SDS-PAGE电泳分析(如图1所示)；

由图1可以看出，泳道9的洗脱样品杂蛋白最少，纯度最高。

将50mM、pH值6.0磷酸盐缓冲液(含500mM咪唑)缓冲液洗脱样品做超滤(截留分子量10kDa)，获高浓度蛋白样品，用超微量紫外分光光度计测定其质量浓度。

(3)重组脂肪氧合酶vvLOX酶活力测定：

3mL反应体系中含有2.78mL酶反应缓冲液(0.02mol/L磷酸缓冲液(pH＝5.5-8.0))、200μL底物(50mL底物中包含27μL亚油酸，25μL吐温20，0.5mol/L NaOH 1.1mL，并用脱氧蒸馏水定容至刻度)和20μL超滤后酶液，混合均匀后在设定温度下(30-60℃)测定其在234nm处的吸光值变化。反应体系每分钟吸光值增加0.0001定义为1个酶活力单位(U/mL)。

结果如图2和图3所示，重组脂肪氧合酶vvLOX的最适pH值为6.5，最适温度为35℃，最大酶活力为9100U/mL。

实施例2

取100g亚油酸置于酶反应器中，加入10g pH 6.5的磷酸盐缓冲液和10g实施例1步骤(2)经超滤的vvLOX，通入氧气并加压在35℃进行搅拌，反应24h。待反应结束后，将反应混合物静置5min进行分层，回收上层有机相即得到氢过氧化物亚油酸。检测其反应得率为92.8％，经液相色谱-质谱分析产物氢过氧化物亚油酸含量为95.6％。

实施例3

取100g亚麻酸置于酶反应器中，加入10g pH 6.5的磷酸盐缓冲液和10g实施例1步骤(2)经超滤的vvLOX，通入氧气并加压在35℃进行搅拌，反应24h。待反应结束后，将反应混合物静置5min进行分层，回收上层有机相即得到氢过氧化物亚麻酸。检测其反应得率为94.6％，经液相色谱-质谱分析产物氢过氧化物亚麻酸含量为97.2％。

实施例4

取100g大豆油置于酶反应器中，加入10g pH 6.5的磷酸盐缓冲液和10g实施例1步骤(2)经超滤的的vvLOX，通入氧气并加压在35℃进行搅拌，反应24h。待反应结束后，将反应混合物静置5min进行分层，回收上层有机相即得到氢过氧化物大豆油。检测其反应得率为96.8％，经液相色谱-质谱分析产物氢过氧化物大豆油含量为85.8％。

实施例5

取100g亚麻籽油置于酶反应器中，加入10g pH 6.5的磷酸盐缓冲液和10g实施例1步骤(2)经超滤的vvLOX，通入氧气并加压在35℃进行搅拌，反应24h。待反应结束后，将反应混合物静置5min进行分层，回收上层有机相即得到氢过氧化物亚麻籽油。检测其反应得率为95.6％，经液相色谱-质谱分析产物氢过氧化物亚麻籽油含量为88.6％。

实施例6

取100g鱼油置于酶反应器中，加入10g pH 6.5的磷酸盐缓冲液和10g实施例1步骤(2)经超滤的vvLOX，通入氧气并加压在35℃进行搅拌，反应24h。待反应结束后，将反应混合物静置5min进行分层，回收上层有机相即得到氢过氧化物鱼油。检测其反应得率为94.9％，经液相色谱-质谱分析产物氢过氧化物鱼油含量为90.2％。

对比例1

取100g亚油酸置于反应器中，加入10g三氯化铁，通入氧气并加压在35℃进行搅拌，反应24h。待反应结束后，将反应混合物静置5min进行分层，回收上层有机相即得到氢过氧化物亚油酸。检测其反应得率为82.3％，经液相色谱-质谱分析产物氢过氧化物亚油酸含量为60.4％。

对比例2

采用市售大豆脂肪氧合酶Type I-B(Sigma-Aldrich公司)，其他反应条件同实施例4。

反应后检测反应得率为90.6％，经液相色谱-质谱分析产物氢过氧化物大豆油含量为70.3％。

对比例3

采用市售斑马鱼脂肪氧合酶ALOX5(Sigma-Aldrich公司)，其他反应条件同实施例3。

反应后检测反应得率为83.9％，经液相色谱-质谱分析产物氢过氧化物亚麻酸含量为59.4％。

对比例4

采用市售奶牛脂肪氧合酶ALOX5(Sigma-Aldrich公司)，其他反应条件同实施例5。

反应后检测反应得率为77.8％，经液相色谱-质谱分析产物氢过氧化物亚麻籽油含量为52.6％。

对比例5

采用市售猪脂肪氧合酶ALOX5(Sigma-Aldrich公司)，其他反应条件同实施例6。

反应后检测反应得率为72.8％，经液相色谱-质谱分析产物氢过氧化物鱼油含量为55.8％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所

<120> 一种重组脂肪氧合酶及其诱导表达方法和用途

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3330

<212> DNA

<213> 草菇(Volvariella volvacea)

<400> 1

atgagtcgta tcattaagca atttgcgcag accatcgatt cgatttctga gtccagggca 60

ccctacgaca cagatggtgc tcagccagaa actgaggtgc atgagaggcg gtggtctgag 120

atccacgcgc ttgtggcaaa gccagccttc tccatcgagg atctgccggc ttacttggat 180

gcgatcaaga atgccaattc tgctggcctc gacgatcgcg agcttctgct cgagaaagtc 240

ctcgtattga tgtcccgcct caaggagagc gacatctctg ccagactcca acaggtcgtg 300

attggactgc tgtacaagga ccttccccac cctcccagtg gctacttgtc cgtaccgcca 360

ccttcacatc cagagcaggt cttcgctacc cagcaagctg ttgcgccgcg tacaaaaaac 420

aataccgctg tcagatacgc cttccgttcc accgatgggt ccaactacaa cccacttttc 480

cctgacctgg gaaaagcagg aacgccctac gcccgatctg ttccttcgtc gagcatcatt 540

cctgcctctg tgctgcctga cccaagactg gtctttgaca ccctcttgaa gagggagaag 600

ttcgaggggc acccagatgg gatttcaagc ctgttcttcg cgtttgcaga tctggtcatt 660

cacagcatat tcgataccga ccataaggat tggacgatca acaagaccag cagctacttg 720

gacttgagta ttctttatgg aagcactcaa gctcaagttg actccattag gaggaaggac 780

ggaactggaa agttgttcga agacgtgttc gcggacagga ggttgctctt catgcctcct 840

gccagttgcg cattgctggt cttgctcagc aggaaccata actacgtagc acaaaaattg 900

ctggatatca atgagaatgg gacgttcaag gatcctacaa ctatcactga tcccgagcaa 960

ctccaaatcc aagatgacga gctgttccac cgcacacgcc tcgtcaactg tggatacttc 1020

atgcacatca tcctcggaga ttatgtcggc gccatccttg gacttgttcg tgacgggtct 1080

gactggaggt tggacccctt gatggccaca cgagaaggga atcacgaagt ttcacctcgg 1140

ggtgaaggaa acgtcgtttc attggaattc aacagcctct atcgctggca tgctaccttg 1200

tccgagaagg acaccgagtg gacagagcgc caattcaagg acgtctttgg cgataattac 1260

aagaatctca cccccaggac ctttagtgaa ggtgtggcca agcacatggc caaactcggt 1320

gacgtgaaga cttggacttt cggaggaatc aatcgcggac ctgatggccg tttcagcgat 1380

gatgatctcg cgcgcatcct tcagaatgcc actgaatgga gatctggttc attccgggcg 1440

cgcggaacac cggaagtttt gcgtgtcatt gagattatgg gaatcgaaca gggtaggaca 1500

tggggaactt gctctttgaa tgaattcagg aagtttattg ggttgaggcc atacaagaca 1560

tttgttgaat ggaatccgga cccgaaggtt tcggaaaccg cggaaaagct gtatcgggat 1620

atcaacaatc tggagctata cgtgggatta caagctgaac aagccaaagt tccaggacca 1680

ggagctggcc tgtgcccagg atacaccatc tcccgtgcta ttctagctga tgccgtctgt 1740

ctcactcggg gtgacaggtt cttgactgtc gactatacac catacaacct cactgcttgg 1800

ggataccaag actgccaata cgacaagaag gatggatctt acggaggact gcttaccaag 1860

ttgctcttcc gaactctgcc taatcactac ccagctggct ctgcttatgc ccacttccca 1920

ttcacggtac cctcagttat gaaggatcat atgtccaagg atcctgctac taagaagttt 1980

gtgcacaagt acaagtggac taggccagaa cttcctcgac ccattgtgca cttgaagacc 2040

tacggagcag tcaaggctgt cctcgctgat caggcatctt ttgcatctcc ttacgaggag 2100

cgattgttca cagttgttcg ggatctcatt gtaccagaat ctgttatccg cggaccaatc 2160

actgataaga acgaagcaat actccgggca gctttgcgcg acttgcagaa agggcaagca 2220

gctgttacta aagttcttgc ctcccaagga actaaattgg ccaagttctt cgcggagagg 2280

acccagcacc tcgtgaagca gaagactgtg agccatattg gacgacccga gaaatatctc 2340

gacgttgtca aggatgtgat taatcttctg cctttacatt ggatttctga gcaaatcact 2400

ggattgaact tgaagactca agatcgccag aatggacagc attacgagca gaacatctac 2460

gatttgttct cggacgtagc gagatacgtc ttcttgacgt ttgaccctgc ccatgattgg 2520

cgactccgcg agagcgcaat ccgcgcggca caaattatca ctgatgccac acaagatgat 2580

ctctctagtg ttgagtccgt cttcagacag actctccgcg acgtcatcaa gtctgagggc 2640

aaggcttcct atgaattcct caaatccgtc aaagacgcta acaagggatg gacacccgaa 2700

caaacttcca cttacatctt tgcagccgtc gttcctacct ctgctcactt ctcacaagct 2760

ctgtcgcatg tggtcaactt ctacttgaat cctgagcatg cgagggcgaa ggaggagctt 2820

gtgaaggcag ctgagaaggc tgagaaggga gataaggagg ggctgaaagt gtttatgggc 2880

tatgtgagag aagcgttgag gatcgatcct cctgtgtcgg gagcgtttag gacagcagtg 2940

aaggatacag ctacgacgga ggctaagatc aaggccggag accatgtttt ggtggatgtt 3000

gattctgcca acacggatcc tgctgtcttt ggagctcagc ccttgactgc ttcattcgat 3060

cgcaaacccg agactactgg cattatcgcc ctcggggagt atggcctcgt gtcttcttca 3120

ttctttgaaa ctgtcgctcc cagcatcttg aagattgttc tcagtcttcc cgatgttcag 3180

tttggacctg gggcatctgg caagtttacc agattcagag aacggtggca ccaagttgtt 3240

aggagccaat tcattggcac ccgtggatat gttcttcctt ggcccgattc tctcgtcatc 3300

aagtatactc ctgcaccctt gaaagcttaa 3330

<210> 2

<211> 958

<212> DNA

<213> 草菇(Volvariella volvacea)

<400> 2

atgagtcgta tcattaagca atttgcgcag accatcgatt cgatttctga gtccagggca 60

ccctacgaca cagatggtgc tcagccagaa actgaggtgc atgagaggcg gtggtctgag 120

atccacgcgc ttgtggcaaa gccagccttc tccatcgagg atctgccggc ttacttggat 180

gcgatcaaga atgccaattc tgctggcctc gacgatcgcg agcttctgct cgagaaagtc 240

ctcgtattga tgtcccgcct caaggagagc gacatctctg ccagactcca acaggtcgtg 300

attggactgc tgtacaagga ccttccccac cctcccagtg gctacttgtc cgtaccgcca 360

ccttcacatc cagagcaggt cttcgctacc cagcaagctg ttgcgccgcg tacaaaaaac 420

aataccgctg tcagatacgc cttccgttcc accgatgggt ccaactacaa cccacttttc 480

cctgacctgg gaaaagcagg aacgccctac gcccgatctg ttccttcgtc gagcatcatt 540

cctgcctctg tgctgcctga cccaagactg gtctttgaca ccctcttgaa gagggagaag 600

ttcgaggggc acccagatgg gatttcaagc ctgttcttcg cgtttgcaga tctggtcatt 660

cacagcatat tcgataccga ccataaggat tggacgatca acaagaccag cagctacttg 720

gacttgagta ttctttatgg aagcactcaa gctcaagttg actccattag gaggaaggac 780

ggaactggaa agttgttcga agacgtgttc gcggacagga ggttgctctt catgcctcct 840

gccagttgcg cattgctggt cttgctcagc aggaaccata actacgtagc acaaaaattg 900

ctggatatca atgagaatgg gacgttcaag gatcctacaa ctatcactga tcccgagc 958

<210> 3

<211> 1235

<212> DNA

<213> 草菇(Volvariella volvacea)

<400> 3

tatcactgat cccgagcaac tccaaatcca agatgacgag ctgttccacc gcacacgcct 60

cgtcaactgt ggatacttca tgcacatcat cctcggagat tatgtcggcg ccatccttgg 120

acttgttcgt gacgggtctg actggaggtt ggaccccttg atggccacac gagaagggaa 180

tcacgaagtt tcacctcggg gtgaaggaaa cgtcgtttca ttggaattca acagcctcta 240

tcgctggcat gctaccttgt ccgagaagga caccgagtgg acagagcgcc aattcaagga 300

cgtctttggc gataattaca agaatctcac ccccaggacc tttagtgaag gtgtggccaa 360

gcacatggcc aaactcggtg acgtgaagac ttggactttc ggaggaatca atcgcggacc 420

tgatggccgt ttcagcgatg atgatctcgc gcgcatcctt cagaatgcca ctgaatggag 480

atctggttca ttccgggcgc gcggaacacc ggaagttttg cgtgtcattg agattatggg 540

aatcgaacag ggtaggacat ggggaacttg ctctttgaat gaattcagga agtttattgg 600

gttgaggcca tacaagacat ttgttgaatg gaatccggac ccgaaggttt cggaaaccgc 660

ggaaaagctg tatcgggata tcaacaatct ggagctatac gtgggattac aagctgaaca 720

agccaaagtt ccaggaccag gagctggcct gtgcccagga tacaccatct cccgtgctat 780

tctagctgat gccgtctgtc tcactcgggg tgacaggttc ttgactgtcg actatacacc 840

atacaacctc actgcttggg gataccaaga ctgccaatac gacaagaagg atggatctta 900

cggaggactg cttaccaagt tgctcttccg aactctgcct aatcactacc cagctggctc 960

tgcttatgcc cacttcccat tcacggtacc ctcagttatg aaggatcata tgtccaagga 1020

tcctgctact aagaagtttg tgcacaagta caagtggact aggccagaac ttcctcgacc 1080

cattgtgcac ttgaagacct acggagcagt caaggctgtc ctcgctgatc aggcatcttt 1140

tgcatctcct tacgaggagc gattgttcac agttgttcgg gatctcattg taccagaatc 1200

tgttatccgc ggaccaatca ctgataagaa cgaag 1235

<210> 4

<211> 1174

<212> DNA

<213> 草菇(Volvariella volvacea)

<400> 4

aatcactgat aagaacgaag caatactccg ggcagctttg cgcgacttgc agaaagggca 60

agcagctgtt actaaagttc ttgcctccca aggaactaaa ttggccaagt tcttcgcgga 120

gaggacccag cacctcgtga agcagaagac tgtgagccat attggacgac ccgagaaata 180

tctcgacgtt gtcaaggatg tgattaatct tctgccttta cattggattt ctgagcaaat 240

cactggattg aacttgaaga ctcaagatcg ccagaatgga cagcattacg agcagaacat 300

ctacgatttg ttctcggacg tagcgagata cgtcttcttg acgtttgacc ctgcccatga 360

ttggcgactc cgcgagagcg caatccgcgc ggcacaaatt atcactgatg ccacacaaga 420

tgatctctct agtgttgagt ccgtcttcag acagactctc cgcgacgtca tcaagtctga 480

gggcaaggct tcctatgaat tcctcaaatc cgtcaaagac gctaacaagg gatggacacc 540

cgaacaaact tccacttaca tctttgcagc cgtcgttcct acctctgctc acttctcaca 600

agctctgtcg catgtggtca acttctactt gaatcctgag catgcgaggg cgaaggagga 660

gcttgtgaag gcagctgaga aggctgagaa gggagataag gaggggctga aagtgtttat 720

gggctatgtg agagaagcgt tgaggatcga tcctcctgtg tcgggagcgt ttaggacagc 780

agtgaaggat acagctacga cggaggctaa gatcaaggcc ggagaccatg ttttggtgga 840

tgttgattct gccaacacgg atcctgctgt ctttggagct cagcccttga ctgcttcatt 900

cgatcgcaaa cccgagacta ctggcattat cgccctcggg gagtatggcc tcgtgtcttc 960

ttcattcttt gaaactgtcg ctcccagcat cttgaagatt gttctcagtc ttcccgatgt 1020

tcagtttgga cctggggcat ctggcaagtt taccagattc agagaacggt ggcaccaagt 1080

tgttaggagc caattcattg gcacccgtgg atatgttctt ccttggcccg attctctcgt 1140

catcaagtat actcctgcac ccttgaaagc ttaa 1174

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1FP

<400> 5

atgagtcgta tcattaagca atttgcg 27

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1RP

<400> 6

gctcgggatc agtgatagtt gtagg 25

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2FP

<400> 7

ctatcactga tcccgagcaa ctcc 24

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 2RP

<400> 8

cttcgttctt atcagtgatt ggtcc 25

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 3FP

<400> 9

aatcactgat aagaacgaag caatact 27

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 3RP

<400> 10

ttaagctttc aagggtgcag gagt 24

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> L-FP

<400> 11

cccttgaaag cttaagaatt cgagctccgt cgacaag 37

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> L-RP

<400> 12

aatgatacga ctcatatggc tgccgcgcgg cac 33

<210> 13

<211> 1109

<212> PRT

<213> 草菇(Volvariella volvacea)

<400> 13

Met Ser Arg Ile Ile Lys Gln Phe Ala Gln Thr Ile Asp Ser Ile Ser

1 5 10 15

Glu Ser Arg Ala Pro Tyr Asp Thr Asp Gly Ala Gln Pro Glu Thr Glu

20 25 30

Val His Glu Arg Arg Trp Ser Glu Ile His Ala Leu Val Ala Lys Pro

35 40 45

Ala Phe Ser Ile Glu Asp Leu Pro Ala Tyr Leu Asp Ala Ile Lys Asn

50 55 60

Ala Asn Ser Ala Gly Leu Asp Asp Arg Glu Leu Leu Leu Glu Lys Val

65 70 75 80

Leu Val Leu Met Ser Arg Leu Lys Glu Ser Asp Ile Ser Ala Arg Leu

85 90 95

Gln Gln Val Val Ile Gly Leu Leu Tyr Lys Asp Leu Pro His Pro Pro

100 105 110

Ser Gly Tyr Leu Ser Val Pro Pro Pro Ser His Pro Glu Gln Val Phe

115 120 125

Ala Thr Gln Gln Ala Val Ala Pro Arg Thr Lys Asn Asn Thr Ala Val

130 135 140

Arg Tyr Ala Phe Arg Ser Thr Asp Gly Ser Asn Tyr Asn Pro Leu Phe

145 150 155 160

Pro Asp Leu Gly Lys Ala Gly Thr Pro Tyr Ala Arg Ser Val Pro Ser

165 170 175

Ser Ser Ile Ile Pro Ala Ser Val Leu Pro Asp Pro Arg Leu Val Phe

180 185 190

Asp Thr Leu Leu Lys Arg Glu Lys Phe Glu Gly His Pro Asp Gly Ile

195 200 205

Ser Ser Leu Phe Phe Ala Phe Ala Asp Leu Val Ile His Ser Ile Phe

210 215 220

Asp Thr Asp His Lys Asp Trp Thr Ile Asn Lys Thr Ser Ser Tyr Leu

225 230 235 240

Asp Leu Ser Ile Leu Tyr Gly Ser Thr Gln Ala Gln Val Asp Ser Ile

245 250 255

Arg Arg Lys Asp Gly Thr Gly Lys Leu Phe Glu Asp Val Phe Ala Asp

260 265 270

Arg Arg Leu Leu Phe Met Pro Pro Ala Ser Cys Ala Leu Leu Val Leu

275 280 285

Leu Ser Arg Asn His Asn Tyr Val Ala Gln Lys Leu Leu Asp Ile Asn

290 295 300

Glu Asn Gly Thr Phe Lys Asp Pro Thr Thr Ile Thr Asp Pro Glu Gln

305 310 315 320

Leu Gln Ile Gln Asp Asp Glu Leu Phe His Arg Thr Arg Leu Val Asn

325 330 335

Cys Gly Tyr Phe Met His Ile Ile Leu Gly Asp Tyr Val Gly Ala Ile

340 345 350

Leu Gly Leu Val Arg Asp Gly Ser Asp Trp Arg Leu Asp Pro Leu Met

355 360 365

Ala Thr Arg Glu Gly Asn His Glu Val Ser Pro Arg Gly Glu Gly Asn

370 375 380

Val Val Ser Leu Glu Phe Asn Ser Leu Tyr Arg Trp His Ala Thr Leu

385 390 395 400

Ser Glu Lys Asp Thr Glu Trp Thr Glu Arg Gln Phe Lys Asp Val Phe

405 410 415

Gly Asp Asn Tyr Lys Asn Leu Thr Pro Arg Thr Phe Ser Glu Gly Val

420 425 430

Ala Lys His Met Ala Lys Leu Gly Asp Val Lys Thr Trp Thr Phe Gly

435 440 445

Gly Ile Asn Arg Gly Pro Asp Gly Arg Phe Ser Asp Asp Asp Leu Ala

450 455 460

Arg Ile Leu Gln Asn Ala Thr Glu Trp Arg Ser Gly Ser Phe Arg Ala

465 470 475 480

Arg Gly Thr Pro Glu Val Leu Arg Val Ile Glu Ile Met Gly Ile Glu

485 490 495

Gln Gly Arg Thr Trp Gly Thr Cys Ser Leu Asn Glu Phe Arg Lys Phe

500 505 510

Ile Gly Leu Arg Pro Tyr Lys Thr Phe Val Glu Trp Asn Pro Asp Pro

515 520 525

Lys Val Ser Glu Thr Ala Glu Lys Leu Tyr Arg Asp Ile Asn Asn Leu

530 535 540

Glu Leu Tyr Val Gly Leu Gln Ala Glu Gln Ala Lys Val Pro Gly Pro

545 550 555 560

Gly Ala Gly Leu Cys Pro Gly Tyr Thr Ile Ser Arg Ala Ile Leu Ala

565 570 575

Asp Ala Val Cys Leu Thr Arg Gly Asp Arg Phe Leu Thr Val Asp Tyr

580 585 590

Thr Pro Tyr Asn Leu Thr Ala Trp Gly Tyr Gln Asp Cys Gln Tyr Asp

595 600 605

Lys Lys Asp Gly Ser Tyr Gly Gly Leu Leu Thr Lys Leu Leu Phe Arg

610 615 620

Thr Leu Pro Asn His Tyr Pro Ala Gly Ser Ala Tyr Ala His Phe Pro

625 630 635 640

Phe Thr Val Pro Ser Val Met Lys Asp His Met Ser Lys Asp Pro Ala

645 650 655

Thr Lys Lys Phe Val His Lys Tyr Lys Trp Thr Arg Pro Glu Leu Pro

660 665 670

Arg Pro Ile Val His Leu Lys Thr Tyr Gly Ala Val Lys Ala Val Leu

675 680 685

Ala Asp Gln Ala Ser Phe Ala Ser Pro Tyr Glu Glu Arg Leu Phe Thr

690 695 700

Val Val Arg Asp Leu Ile Val Pro Glu Ser Val Ile Arg Gly Pro Ile

705 710 715 720

Thr Asp Lys Asn Glu Ala Ile Leu Arg Ala Ala Leu Arg Asp Leu Gln

725 730 735

Lys Gly Gln Ala Ala Val Thr Lys Val Leu Ala Ser Gln Gly Thr Lys

740 745 750

Leu Ala Lys Phe Phe Ala Glu Arg Thr Gln His Leu Val Lys Gln Lys

755 760 765

Thr Val Ser His Ile Gly Arg Pro Glu Lys Tyr Leu Asp Val Val Lys

770 775 780

Asp Val Ile Asn Leu Leu Pro Leu His Trp Ile Ser Glu Gln Ile Thr

785 790 795 800

Gly Leu Asn Leu Lys Thr Gln Asp Arg Gln Asn Gly Gln His Tyr Glu

805 810 815

Gln Asn Ile Tyr Asp Leu Phe Ser Asp Val Ala Arg Tyr Val Phe Leu

820 825 830

Thr Phe Asp Pro Ala His Asp Trp Arg Leu Arg Glu Ser Ala Ile Arg

835 840 845

Ala Ala Gln Ile Ile Thr Asp Ala Thr Gln Asp Asp Leu Ser Ser Val

850 855 860

Glu Ser Val Phe Arg Gln Thr Leu Arg Asp Val Ile Lys Ser Glu Gly

865 870 875 880

Lys Ala Ser Tyr Glu Phe Leu Lys Ser Val Lys Asp Ala Asn Lys Gly

885 890 895

Trp Thr Pro Glu Gln Thr Ser Thr Tyr Ile Phe Ala Ala Val Val Pro

900 905 910

Thr Ser Ala His Phe Ser Gln Ala Leu Ser His Val Val Asn Phe Tyr

915 920 925

Leu Asn Pro Glu His Ala Arg Ala Lys Glu Glu Leu Val Lys Ala Ala

930 935 940

Glu Lys Ala Glu Lys Gly Asp Lys Glu Gly Leu Lys Val Phe Met Gly

945 950 955 960

Tyr Val Arg Glu Ala Leu Arg Ile Asp Pro Pro Val Ser Gly Ala Phe

965 970 975

Arg Thr Ala Val Lys Asp Thr Ala Thr Thr Glu Ala Lys Ile Lys Ala

980 985 990

Gly Asp His Val Leu Val Asp Val Asp Ser Ala Asn Thr Asp Pro Ala

995 1000 1005

Val Phe Gly Ala Gln Pro Leu Thr Ala Ser Phe Asp Arg Lys Pro Glu

1010 1015 1020

Thr Thr Gly Ile Ile Ala Leu Gly Glu Tyr Gly Leu Val Ser Ser Ser

1025 1030 1035 1040

Phe Phe Glu Thr Val Ala Pro Ser Ile Leu Lys Ile Val Leu Ser Leu

1045 1050 1055

Pro Asp Val Gln Phe Gly Pro Gly Ala Ser Gly Lys Phe Thr Arg Phe

1060 1065 1070

Arg Glu Arg Trp His Gln Val Val Arg Ser Gln Phe Ile Gly Thr Arg

1075 1080 1085

Gly Tyr Val Leu Pro Trp Pro Asp Ser Leu Val Ile Lys Tyr Thr Pro

1090 1095 1100

Ala Pro Leu Lys Ala

1105

Claims (10)

1.一种重组脂肪氧合酶，其特征在于DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.重组脂肪氧合酶的DNA序列的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：

提取草菇(Volvariella volvacea)RNA，构建cDNA文库；以cDNA文库为模板，分别以引物对1、引物对2、引物对3扩增得到三个片段，以同源重组方法完成重组连接，得到如SEQ IDNO.1所示的DNA序列；

所述的引物对1为：

1FP：5’-atgagtcgtatcattaagcaatttgcg-3’(SEQ ID NO.5)

1RP：5’-gctcgggatcagtgatagttgtagg-3’(SEQ ID NO.6)；

所述的引物对2为：

2FP：5’-ctatcactgatcccgagcaactcc-3’(SEQ ID NO.7)

2RP：5’-cttcgttcttatcagtgattggtcc-3’(SEQ ID NO.8)；

所述的引物对3为：

3FP：5’-aatcactgataagaacgaagcaatact-3’(SEQ ID NO.9)

3RP：5’-ttaagctttcaagggtgcaggagt-3’(SEQ ID NO.10)。

3.重组脂肪氧合酶的表达载体，其特征在于含有如SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体是以如SEQ ID NO.1所示的DNA序列和表达质粒的序列为模板，以线性化引物扩增得到；

所述线性化引物为：

L-FP：5’-cccttgaaagcttaagaattcgagctccgtcgacaag-3’(SEQ ID NO.11)

L-RP：5’-aatgatacgactcatatggctgccgcgcggcac-3’(SEQ ID NO.12)。

5.表达重组脂肪氧合酶的基因工程菌或转基因细胞系，其特征在于：含有权利要求3或4所述的表达载体。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于：所述的基因工程菌是将权利要求3或4所述的表达载体转化大肠杆菌BL21菌株后得到。

7.重组脂肪氧合酶的诱导表达方法，其特征在于包括以下步骤：

将权利要求5或6所述的基因工程菌在液体培养基中培养，至菌液OD600值为0.8-1.0时，加入IPTG诱导表达；取菌液离心，弃上清，加入PBS缓冲液重悬并超声破碎，再次离心，收集上清液，经纯化后得到重组脂肪氧合酶；

所述的纯化采用镍离子亲和层析纯化，所述上清液上柱后，先以10mM、pH值6.0磷酸盐缓冲液(含20mM咪唑)洗脱，再以梯度浓度的10-50mM、pH值6.0磷酸盐缓冲液(含500mM咪唑)缓冲液洗脱，收集50mM、pH值6.0磷酸盐缓冲液(含500mM咪唑)缓冲液洗脱组分，为重组脂肪氧合酶。

8.根据权利要求7所述的诱导表达方法，其特征在于：

所述的液体培养基是含有一定浓度抗生素的LB液体培养基；

所述加入IPTG是加入至终浓度0.1mmol/L，于18℃诱导表达。

9.权利要求1所述的重组脂肪氧合酶在制备氢过氧化物多不饱和脂肪酸中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于包括以下步骤：

将多不饱和脂肪酸与所述的重组脂肪氧合酶混合，通入氧气并加压反应，反应后反应液上层有机相即含有氢过氧化物多不饱和脂肪酸；

所述的多不饱和脂肪酸包括亚油酸、亚麻酸、大豆油、亚麻籽油、鱼油。

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