CN113980147A - 一种聚多肽与fgf21融合蛋白突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于融合蛋白领域，具体的涉及一种聚多肽与FGF21融合蛋白突变体及其应用。所述突变体从N端到C端依次含有一种聚多肽分子、成纤维细胞生长因子21(FGF21)中的一个氨基酸序列经过取代而衍生的一种蛋白突变体。本发明在保留了原蛋白的相关性质及其与靶受体亲和力基础上，有效提高了纯度及稳定性，改善原型融合蛋白的成药性。

Description

一种聚多肽与FGF21融合蛋白突变体及其应用
技术领域
本发明属于融合蛋白领域，具体的涉及一种聚多肽与FGF21融合蛋白突变体及其应用。
背景技术
随着生物医药产业的快速发展，蛋白质药物在自身免疫性疾病、炎症、心血管疾病、癌症等疾病的治疗中展现出了巨大潜力。由于蛋白质药物具有良好的生物活性、高度专一性以及副作用小等优点，相对于化学药物更加安全、有效，因此广泛应用于疾病治疗。
成纤维细胞生长因子FGF21是FGF家族中FGF19亚家族成员之一。FGF19亚家族包括FGF19、FGF21及FGF23。多个动物模型已经显示出FGF19家族，特别是FGF21在调节脂质、葡萄糖代谢和肝纤维化方面的显著作用。它们具有在细胞外基质和共受体蛋白结合的特性，在局部旁分泌/自分泌和全身内分泌水平起作用。FGF21分子能够在肝脏和脂肪组织中优先表达，并于系统中循环时与辅因子结合蛋白β-Klotho特异性结合。FGF21、β-Klotho与成纤维细胞生长因子受体(FGFR)结合形成三元复合物，传递生长因子信号级联的下游信号，而生长因子信号级联与脂肪和葡萄糖代谢有关。FGF21已被认为是治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的一种可能途径，靶向FGF21/FGFR/β-Klotho通路可以阻止或逆转肝脏脂肪浸润、炎症和纤维。同时作为FGF家族中独特的一员，FGF21是目前发现的唯一没有促有丝分裂活性的成员，从而大大降低了临床用药的风险。
FGF21作为一种蛋白药物，其具有局限性，如分子量较小(～22kDa)容易被肾小球滤过，体内半衰期较短(0.5h-2h)、易聚合、生物利用度低等，限制了其临床应用。
近年来为了延长蛋白质药物的体内半衰期，多种长效化蛋白质药物已经研制成功并广泛应用于临床治疗。相应的长效化技术主要包括化学偶联聚合物或聚糖；偶联、融合白蛋白或免疫球蛋白；融合到重组聚合物类似物；包被或共价结合纳米粒子；翻译后修饰如N-糖基化等。其中应用最为广泛的长效化方法是聚乙二醇(PEG)修饰技术。PEG修饰技术是将蛋白类药物与PEG衍生物共价交联。PEG衍生物是一种亲水的、pH中性的、生理惰性的化学聚合物，与蛋白质类药物交联后通过增大药物的流体动力学体积来阻碍肾小球过滤，从而延长药物的血浆半衰期，但其不足在于：其下游纯化工艺复杂、产量低、长期使用导致人体中产生抗PEG抗体、长期给药对肾脏的毒性等。
聚多肽融合技术是基于PEG修饰的优缺点所开发的一种新兴技术，即利用DNA重组技术将药用蛋白与特异性的氨基酸链融合表达，达到延长药物血浆半衰期的目的。其具有以下优点为：(1)全人工设计，可自由选择氨基酸组成和种类；(2)由天然氨基酸构成，没有毒性的代谢过程；(3)不含疏水氨基酸，没有抗原表位；(4)由DNA序列编码，可精确调控序列及其长度，产物均一；(5)原核、真核系统均能表达，可通过发酵大规模生产等。
本实验室前期【ZL201510675827.7】以20种天然氨基酸为基础，结合计算机辅助分子设计及生物化学与分子生物学等技术，确定脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甘氨酸五种氨基酸为聚多肽的组成氨基酸，构建得到含有无规则卷曲结构、不带电荷、无免疫原性的聚多肽分子PsTag，并连接于FGF21分子的N端融合表达，获得PsTag-FGF21融合蛋白。其在保留了与靶受体的亲和力的基础上，显著提高了原型FGF21蛋白的体内半衰期(相较于原型FGF21延长了约20倍)，克服了原型FGF21在体内半衰期极短的问题，且对NASH具有明显的治疗效果。
后期研究发现，聚多肽-FGF21融合蛋白样品经反向高效液相色谱检测时，在一定的保留时间下存在固定比例的杂质，纯度只能维持在92％左右。后续通过质谱法对聚多肽-FGF21蛋白及杂质的C末端序列进行测定，确定杂质是全长聚多肽-FGF21蛋白C末端掉落12个氨基酸的产物。由于杂质与目的蛋白性质极为相近，通过纯化方式无法有效去除，严重影响产品质量均一性，限制其成药。且通过查阅文献发现其原型人FGF21分子在纯化过程中可能也存在类似的切割情况。
因此需要通过一定的手段有效去除或降低主要杂质比例，提高聚多肽-FGF21融合蛋白的纯度及稳定性，改善聚多肽-FGF21融合蛋白的成药性质。
发明内容
发明目的
本发明的目的是针对上述遇到的问题，提供一种纯度高，稳定性优良的聚多肽-FGF21融合蛋白突变体。
技术方案
一种聚多肽与成纤维细胞生长因子21融合蛋白突变体，其特征在于，在原型融合蛋白基础上进行改造，所述蛋白突变体包括：
(a)一种聚多肽分子
(b)成纤维细胞生长因子21中位于169位缬氨酸被亮氨酸取代。
所述的融合蛋白突变体，其中所述的聚多肽分子是脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甘氨酸为基础氨基酸构建组合而成的含有无规则卷曲结构，不带电荷，无免疫原性的一种聚多肽分子。
所述的融合蛋白突变体，其特征在于，所述的融合蛋白突变体的氨基酸序列为SEQID NO.1。
所述的融合蛋白突变体在制备治疗降血脂、降血糖或肝纤维化药物中的应用。
具体而言：
本发明提供了一种聚多肽-FGF21融合蛋白突变体，其是在原型聚多肽-FGF21融合蛋白基础上，对FGF21部分的169位缬氨酸进行逐一替换为其他19种基础氨基酸，分别经过分子构建，蛋白表达纯化，通过SDS-PAGE检测及反向高效液相检测，筛选确定出在169位缬氨酸替换为亮氨酸的聚多肽-FGF21融合蛋白突变体。
本发明针对原型融合蛋白与主要杂质的C端测序结果，考虑到FGF21分子在169位缬氨酸位置(即开始掉落氨基酸的位置)被酶切水解，故对此位点进行突变，以改变相应酶切位点防止被降解。经测定，突变后的蛋白突变体的相关蛋白性质及与活性均无明显改变。
在一些实施方案中，本发明提供的聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L),其经过多次重复实验验证，其SDS-PAGE检测泳道呈单一条带，反向高效液相色谱检测纯度可维持到98％左右。
在一个实施方案中，所得的蛋白突变体稳定性良好，经4℃短期保存，检测纯度无明显变化，稳定性良好，且血浆稳定性良好。
在一些实施方案中，本发明提供的蛋白突变体的相关蛋白性质，包括分子量，等电点，二级结构，紫外吸收分布等，与原型聚多肽-FGF21融合蛋白相比，无明显改变。
在一些实施方案中，本发明提供的蛋白突变体与原型聚多肽-FGF21融合蛋白相比，活性无明显变化甚至有所提高，且与FGF21的辅因子结合蛋白β-Klotho(KLB)的结合亲和力也有所提高。
在一个实施方案中，本发明提供的蛋白突变体具有增强的药代动力学性质，包括血浆半衰期较原型FGF21提高了约25倍。
本发明的难点在于聚多肽-FGF21融合蛋白突变体的分子构建及筛选过程，在切割酶未知的情况下,无法确定特定突变类型，故逐一设计包含不同氨基酸突变的多对引物进行分子构建。并分别将构建后的突变体表达纯化后对蛋白性质进行比较，最终筛选获得本发明的V169L蛋白突变体。
有益效果
本发明的融合蛋白突变体相比原型聚多肽-FGF21融合蛋白，展现出了更好的纯度及稳定性，在蛋白相关性质无明显变化且维持与靶受体亲和力的基础上，仍能有效解决FGF21蛋白单独使用时半衰期极短，无法满足生物药用药质量要求的问题，提高了其成药性，同时也为其他相关FGF21蛋白纯化过程提供参考。
附图说明
图1是经过纯化后的融合蛋白突变体样品的SDS-PAGE检测图，验证其纯度。M:蛋白Marker26632；1，2，3泳道分别是三批聚多肽-FGF21融合蛋白样品，4.5.6泳道是三批V169L蛋白突变体样品。
图2是三批不同时间表达纯化的V169L蛋白突变体样品经过RP-HPLC的检测图，通过三次重复实验(A-C)有效验证其纯度及稳定性，D为原型聚多肽-FGF21蛋白样品的检测图。
图3是聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的分子量测定图，使用LC-30A&Triple TOFTM4600系统，采用ACQUITY UPLC BEH300 C4 1.7um 2.1*50mm,Waters色谱柱，使用分析软件对原始数据进行去卷积分析，获得精确分子量数值。
图4是聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的圆二色谱(CD)测定图，以25mM柠檬酸-柠檬酸钠，200mM NaCl作为对照溶液，在200-260nm范围中采样，分辨率为1nm，以分析蛋白的二级结构。
图5是聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的等电点测定图，将样品和相关试剂放入仪器中，编写序列后进行检测。得到的数据由iBioCE version 1.0.进行数据分析。
图6是聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的紫外吸收分布图，使用Nano Drop2000仪器分析供试品在190-400nm范围内的紫外吸收光谱。绿色的线表示聚多肽-FGF21融合蛋白，蓝色的线表示V169L蛋白突变体。
图7是聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的体外活性测定图，横坐标为蛋白浓度的对数值，纵坐标为葡萄糖摄取率，黄色的点代表V169L蛋白突变体，黑色的点代表聚多肽-FGF21融合蛋白。
图8是对聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的短期保存稳定性的测定图，每个点表示的是每一天样品经过RP-HPLC检测得到的主峰峰面积占比，横坐标为放置天数，纵坐标为蛋白主峰峰面积占比(即纯度)，此图可反应该蛋白突变体在4℃下，短期放置的稳定性。
图9是对聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的血浆稳定性的测定，分别为SDS-PAGE测定图及Western Blotting测定图。从两种方面来确定V169L蛋白突变体在体外血浆中的稳定性。图A SDS-PAGEM:蛋白Marker26632；1：空白血浆；2：V169L蛋白突变体；3-9：分别为蛋白突变体与血浆孵育0h，1h，3h，6h，18h，24h，48h的样品。图B Western BlottingM：蛋白Marker26619；1：空白血浆；2：V169L蛋白突变体；3-9：分别为蛋白突变体与血浆孵育0h，1h，3h，6h，18h，24h，48h的样品。
图10是聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的药时曲线，横坐标为给药时间，纵坐标为血浆内的药物浓度。图A为聚多肽-FGF21融合蛋白作为对照。图B为V169L蛋白突变体
具体实施方式
在描述本发明的实施方案之前，应该理解这些实施方案只是以举例方式提供，在实施本发明时可以使用此处所述的本发明实施方案的各种替代方案。在不偏离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到大量的变化，改变和替换。另外，材料，方法和实施只是说明性的，并非意在限制。
本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的定义。
下面通过实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，本发明的实施例仅仅是用于说明本发明，而不是本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1：表达载体的构建
构建一种能够表达聚多肽-FGF21融合蛋白突变体的工程菌
使用的菌株为PsTag-FGF21/DH10B△lpp(参照文献构建：Gao,Wen,et al."Engineering extracellular expression systems in Escherichia coli based ontranscriptome analysis and cell growth state."ACS synthetic biology7.5(2018):1291-1302.)，，是带有人工合成的PsTag-FGF21融合基因的重组质粒pBADK-OmpA-PsTag-FGF21转化的大肠杆菌DH10B△lpp菌株(委托金斯瑞构建)。
利用重叠延伸PCR技术，使用在重叠区域引入突变氨基酸的，具有重叠片段及互补末端的多对引物，经95℃退火后连接成两端带有HindⅢ和NaeⅠ酶切位点的一条异源双链DNA。该DNA片段与载体pBADK-OmpA-PsTag-FGF21的双酶切产物通过T4DNA连接酶16℃过夜连接后转化入提前制备的DH10B△lpp感受态细胞中。通过挑取阳性单克隆培养后进行测序验证,验证正确的菌保藏菌种。表1列举了构建突变体序列的引物。
表1用于构建聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的引物
Figure BDA0003377219410000041
实施例2聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的表达纯化
在下列实施例中，在DH10B△lpp大肠杆菌表达系统中分别表达聚多肽-FGF21融合蛋白和聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)。在下面将相关表达纯化方式描述之后，涉及到的融合蛋白均按照本实施例中所述方法纯化，除非另有说明。
将菌种(PsTag-FGF21(V169L)/DH10B△lpp)以1:100(v/v)比例接种于含有2mL体系的2*YT培养基的试管中(1L培养基含有16g蛋白胨，10g酵母粉，5g氯化钠，Kan抗性)进行活化，12h后接种至含有20mL2*YT培养基的摇瓶中进行二次扩培，培养约5h后再以1：100(v/v)比例接种至含100ml2*YT培养基的摇瓶中，于37℃，220rpm发酵5-6h后加入体积比为2％的L-阿拉伯糖诱导剂，于25℃，220rpm下诱导10h。
诱导后菌液在4℃，8000rpm条件下离心10min，收集上清液。按照35％体积比向上清液中加入硫酸铵固体，以适度的速度搅拌至硫酸铵全部溶解，于4度，8000rpm条件下离心25min后收集沉淀。沉淀按照每升培养基加入200mL 20mM Tris-HCL，PH8.0的比例复溶至沉淀完全溶解。
对复溶后的溶液进行透析操作，透析液为20mM Tris-HCL，PH8.0，每2h换液一次，换液3次，最后一次过夜透析，透析后样品离心取上清。
然后使用Q-Sepharose FF对澄清样品进行阴离子交换层析，先以20mM Tris，20mMNaCl，PH8.0缓冲液洗杂，后以20mM Tris，100mM NaCl，PH8.0缓冲液洗脱，最后再以20mMTris，500mM NaCl，PH8.0缓冲液洗去柱上所有蛋白。各阶段收集的蛋白样品经SDS-PAGE分析。
使用25mM柠檬酸-柠檬酸钠，PH4.5缓冲液将Q柱洗脱液稀释5倍，然后使用羧甲基纤维素CM树脂对稀释溶液进行阳离子交换层析，以25mM柠檬酸-柠檬酸钠，200mM NaCl，PH4.5缓冲液洗脱目的蛋白。收集到的各组分经SDS-PAGE分析并通过BCA测定蛋白浓度。
将CM柱洗脱液用10KD截留分子量的超滤管进行浓缩超滤，超滤至20mg/mL浓度。最后使溶液通过聚醚砜PES 0.22μM水系滤器进行过滤，-80℃保存。
聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)为氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
实施例3聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)纯度测定
分别使用SDS-PAGE检测法及RP-HPLC测定法对蛋白突变体纯度进行不同方面的验证，以确定其具有较高纯度。
使用10％的分离胶，配制胶液并制胶(厚度1.0mm，10孔)，制样：样品中加入5*Loading biffer后混合均匀，在95℃下煮样10min。上样后，选择80V电压进行浓缩胶电泳，后续采用120V电压恒压进行分离胶电泳，电泳结束后剥胶进行染色脱色。图1表示了聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)在SDS-PAGE检测时，其所在泳道均为单一条带。
采用反相高效液相色谱法，流动相为水-乙腈，采用XBridge BEH 300 C4色谱柱，方法设置为：检测波长210nm，25min内30％-40％的乙腈洗脱，柱温40℃，流速1.0mL/min，按面积归一化法计算聚多肽-FGF21融合蛋白蛋白及其V169L蛋白突变体的纯度。图2分别表示了经三次重复实验验证的纯度测定，均可达到98％左右，数值稳定。
实施例4聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的分子量测定
取适量蛋白样品采用超高效液相色谱分离。采用LC-30A&Triple TOFTM4600LC-MS系统，使用ACQUITY UPLC BEH300 C4 1.7um 2.1*50mm,Waters色谱柱，具体的实验参数如下：流动相：流动相A(0.1％FA in Water)；流动相B(0.1％FAinACN)；流速0.4mL/min，柱温80℃，检测波长280nm，1-8min完成2％-95％乙腈的洗脱梯度。质谱分析采用高分辨TripleTOFTM4600(AB SCIEX)质谱仪，选择正离子检测方式，母离子扫描范围为800-3800m/z，采用UNIFI(1.8.2，Waters)软件处理分析数据。
前期通过Expasy网站的ProtParam工具分析聚多肽-FGF21(V169L)蛋白突变体的理论分子量为74549.9Da，图3表示的仪器测定结果为74552.9Da，误差＜1％，测定结果与理论值相一致。其与聚多肽-FGF21融合蛋白的分子量(73869Da)相比，无明显差异。
实施例5聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的二级结构测定
利用圆二色谱(CD)技术分析聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的二级结构。蛋白样品浓度为0.5mg/mL，溶剂为25mM柠檬酸-柠檬酸钠，200mM NaCl，PH4.5缓冲液，鉴定温度为室温。实验仪器为Jasco J-810，采样范围为200-260nm，分辨率为1nm，扫描速度为50nm/min。数据分析采用Jasco Secondary Structure Estimation。
图4显示了两种融合蛋白的二级结构，两种蛋白样品均在200nm附近有显著负峰，二级结构以无规则卷曲为主，且突变体蛋白(V169L)与原聚多肽-FGF21融合蛋白峰形基本一致，无明显区别，表明聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)二级结构无明显改变。
实施例6聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的等电点测定
使用毛细管等电聚焦电泳(cIEF)进行测定，实验方法如下：取浓度为1mg/mL的蛋白样品10μL，1％甲基纤维素35μL，Phamalyte 3-10两性电解质2.5μL，Phamalyte 8-10.5电解质2.5μL，PI分别为4.65和8.18的pI Marker各0.5μL，水11.5μL，8M Urea 37.5μL混合并涡旋振荡1min，13000g离心5min后取80μL上机检测，通过10-15min的冲洗、进样、分离、定量程序，蛋白质在正负电压下向其等电点的pH位置靠近并聚焦。每10s记录下整个毛细管柱的紫外吸收图像。得到的数据由iBioCE version 1.0.进行数据分析。
通过毛细管等电聚焦电泳(cIEF)测定到的等电点，图5显示聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的主带的等电点为5.93，与原聚多肽-FGF21融合蛋白的等电点(6.128)无明显差异。
实施例7聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的紫外吸收分布
将聚多肽-FGF21融合蛋白和蛋白突变体分别用0.01mol/L PBS稀释至浓度为0.1mg/mL，作为供试品溶液，使用Nano Drop 2000仪器分析供试品在190-400nm范围内的紫外吸收光谱。
采用Nano Drop 2000仪器测定PsTag-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的紫外吸收光谱，图6显示，由于聚多肽缺少含有共轭双键的芳香族氨基酸，所以其在280nm处特征吸收峰消失，在210nm处存在末端吸收，所以将210nm作为紫外光谱的检测波长。与原聚多肽-FGF21融合蛋白紫外吸收光谱基本一致。
实施例8聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的体外活性
使用葡萄糖摄取法检测融合蛋白突变体的体外活性，其检测原理：葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下被氧化成葡萄糖酸，同时消耗溶液中的氧产生过氧化氢，在510nm波长下进行比色测定，该法最终产生的红色醌类化合物，与样品中葡萄糖含量成正比，由OD值进行量化，通过OD值计算葡萄糖摄取率。运用GraphPad软件，以浓度对数值为横坐标，葡萄糖摄取率为纵坐标绘制量效曲线，并拟合EC50值。
使用0.25％胰蛋白酶消化处于对数生长期的HL7702细胞，离心后加入RPMI 1640培养基制备成单细胞悬液。采用count star细胞计数仪计数并将细胞稀释至2X10^5cell/mL，铺板96孔板，每孔100uL，放置于37度，5％CO2下培养过夜。细胞饥饿12h后，吸去上清，使用培养基稀释的蛋白样品至浓度16mg/mL作为稀释起始点，按照2倍倍比稀释10个浓度，每孔加入100uL，设置两个复孔，并以培养基作为阴性对照，放置于37℃，5％CO2下孵育48h，使用葡萄糖摄取试剂盒检测细胞培养上清中葡萄糖的含量。数据处理使用Graphpad软件绘制量效曲线，拟合EC50值。
使用Graphpad软件绘制曲线见图7，并拟合EC50值，结果分别如下：聚多肽-FGF21融合蛋白：35.81ug/mL，聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)：28.54ug/mL，FGF21蛋白：5.897ug/mL(表2)，其中蛋白突变体的EC50值约为FGF21的4.83倍，表明经修饰后的FGF21部分活性位点被遮蔽，其活性有所降低，但其活性与原聚多肽-FGF21融合蛋白活性相当，甚至略高。
表2各融合蛋白与KLB蛋白间的EC50值
聚多肽-FGF21融合蛋白 聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L) FGF21
EC50(ug/mL) 35.81 28.54 5.897
使用微量热泳动技术(MST)检测三种蛋白：聚多肽-FGF21融合蛋白，聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)，FGF21分别与其辅因子结合蛋白KLB间的亲和力。按照蛋白与FITC摩尔比1：5将一定量的KLB蛋白与FITC混合均匀，4℃过夜孵育，经脱盐柱(G25)脱去未标记上的FITC，收集样品即为荧光标记蛋白溶液。分别使用MST缓冲液(50mM Tris-HCL，PH7.8；150mM NaCl；10mM MgCl2；0.05％Tween-20)对FGF21、聚多肽-FGF21融合蛋白及聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)样品倍比稀释至16管，每管加入10uL荧光标记蛋白溶液，混合均匀，利用毛细管吸取并置于NanoTemper Monolith NT.115仪器中进行测定，并通过MSTanalyze软件进行数据处理。
通过MST来确定上述三种蛋白与KLB蛋白之间的结合亲和力，以配体浓度作为横坐标，以Fnorm值作纵坐标，绘制S型曲线，并拟合Kd值，其Kd值越小，则表明蛋白与KLB配体的结合亲和力越大。其中，聚多肽-FGF21融合蛋白，聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)及FGF21蛋白与KLB蛋白的Kd值分别为：88.406+/-12nM，49.226+/-18nM，29.365+/-0.11nM(表3)。FGF21蛋白与KLB的亲和力与其他文献中提及的数值较为一致，亲和力较大，聚多肽-FGF21融合蛋白，蛋白突变体与KLB的结合常数分别高于FGF21约3倍，2倍，亲和力较原型FGF21降低，但仍具中等亲和力且聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)略高于原型蛋白。
表3各融合蛋白与KLB蛋白结合的Kd值
聚多肽-FGF21融合蛋白 聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L) FGF21
Kd值 88.406+/-12nM 49.226+/-18nM 29.365+/-0.11nM
上述实施例均表明相比于原型融合蛋白，聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的体外活性无明显改变，甚至略高于原型，并维持了与其靶受体的结合亲和力。
实施例9聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的稳定性考察
首先对其在4℃条件下进行短期保存(7天)，来确定其短期稳定性。使用浓度0.5mg/mL的聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)及原型蛋白作为对照，通过聚醚砜PES0.22μM水系滤器进行过滤后每管分装100uL，分7管，放置于4℃保存。每天分别取出一管进行RP-HPLC检测，测定纯度的变化程度，以检测其短期保存稳定性。
由图8显示，在4℃条件下短期保存，融合蛋白及蛋白突变体均可保持稳定，无明显降解。
然后对聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的血浆稳定性进行考察。将一只BALB/c小鼠摘眼球取血，使用抗凝管收集血液并静置30min，于3000rpm离心15min，吸取上清得到小鼠血浆。将聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)用PBS稀释至0.5mg/mL，与BALB/c小鼠血浆(体积比为83％V/V)在37℃共孵育48h。在0h，1h，3h，6h，18h，24h，48h时分别取样40μL，用PBS稀释10倍，再加入5×蛋白电泳上样缓冲液，经过煮样离心后，取上清上样。使用10％的SDS-PAGE电泳和Western-blotting进行检测。
检测结果如图9所示，在37℃的条件下，聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)至少可以在体外血浆中稳定存在48h。
实施例10聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)的体内药代动力学测定
使用体重约为25g左右6～8周龄的C57BL/6雄性小鼠12只，随机分为两组，分别称重并标记，分为聚多肽-FGF21融合蛋白给药组和V169L蛋白突变体给药组。设置给药剂量为3.8mg/kg，通过尾静脉给药，按照一定的时间点(1h,2h,4h,8h,12h,24h,48h,72h；96h)采取眼眶后静脉丛取血的方式采集各组小鼠血样，使用抗凝管接取血样，并室温静置30min后3000rpm离心15min，小心吸取上清即为所需血浆，-80℃冻存。使用R&D的人FGF21 ELISA试剂盒检测小鼠血浆中FGF21含量。
采用R&D的人FGF21 ELISA试剂盒测定小鼠血清中人FGF21的含量，检测灵敏度为4.67pg/mL。典型药代动力学参数见表4，聚多肽-FGF21融合蛋白突变体(V169L)在小鼠体内的血药浓度-时间曲线如图10所示。根据文献报道，原型FGF21在小鼠体内半衰期为0.5小时左右，而我们的聚多肽-FGF21融合蛋白及V169L融合蛋白突变体在小鼠体内的半衰期分别可达13.24h、14.50h，显著增加了FGF21的体内半衰期。
表4聚多肽-FGF21融合蛋白与V169L蛋白突变体的药代参数
Figure BDA0003377219410000081
Figure BDA0003377219410000091
aT1/2,terminal half-life；bCmax,maximum concentration；cAUC,area underthe plasma concentration curve；dMRT,mean residence time；eVz,the apparentvolume of distribution during the terminal phase；fCl,clearance；gVss,theapparent volume of the plasma compartment.Data are means±SD.
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 一种聚多肽与FGF21融合蛋白突变体及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 837
<212> PRT
<213> 聚多肽与FGF21融合蛋白突变体(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 1
Gly Ser Gly Ser Ser Gly Pro Ser Gly Thr Pro Ala Ser Thr Gly Pro
1 5 10 15
Ala Thr Pro Ser Gly Thr Ser Gly Pro Ser Gly Thr Pro Ala Ser Thr
20 25 30
Gly Pro Ala Thr Pro Ser Gly Thr Ser Gly Pro Ala Gly Ser Thr Pro
35 40 45
Ser Thr Gly Pro Ser Ala Pro Thr Gly Ser Thr Gly Pro Ser Gly Thr
50 55 60
Pro Ala Ser Thr Gly Pro Ala Thr Pro Ser Gly Thr Ser Gly Pro Ala
65 70 75 80
Thr Pro Ser Gly Thr Ser Gly Pro Ser Thr Ala Gly Pro Thr Ser Gly
85 90 95
Pro Ser Ala Thr Pro Gly Thr Ser Gly Pro Ser Gly Thr Ser Pro Thr
100 105 110
Ala Gly Pro Ala Gly Ser Thr Pro Ser Thr Gly Pro Ser Ala Pro Thr
115 120 125
Gly Ser Thr Gly Pro Ala Gly Ser Thr Pro Ser Thr Gly Pro Ser Ala
130 135 140
Pro Thr Gly Ser Thr Gly Pro Ser Ala Thr Pro Gly Ser Thr Gly Pro
145 150 155 160
Thr Ser Ala Pro Gly Ser Thr Gly Pro Thr Ser Ala Pro Gly Thr Ser
165 170 175
Gly Pro Ser Thr Pro Gly Thr Ser Ala Gly Pro Thr Ser Ala Pro Gly
180 185 190
Ser Thr Gly Pro Ser Ala Gly Thr Pro Ser Thr Gly Pro Ala Thr Pro
195 200 205
Ser Gly Thr Ser Gly Pro Ser Thr Ala Gly Pro Thr Ser Gly Pro Ser
210 215 220
Ala Thr Pro Gly Ser Thr Gly Pro Thr Ser Ala Pro Gly Ser Thr Gly
225 230 235 240
Pro Ala Thr Pro Ser Gly Thr Ser Gly Pro Ser Thr Ala Gly Pro Thr
245 250 255
Ser Gly Pro Ser Ala Thr Pro Gly Thr Ser Gly Pro Ser Gly Thr Ser
260 265 270
Pro Thr Ala Gly Pro Thr Ser Ala Pro Gly Thr Ser Gly Pro Ser Thr
275 280 285
Pro Gly Thr Ser Ala Gly Pro Ala Gly Ser Thr Pro Ser Thr Gly Pro
290 295 300
Ser Ala Pro Thr Gly Ser Thr Gly Pro Ser Gly Thr Pro Ala Ser Thr
305 310 315 320
Gly Pro Ala Thr Pro Ser Gly Thr Ser Gly Pro Ser Ala Thr Pro Gly
325 330 335
Ser Thr Gly Pro Thr Ser Ala Pro Gly Ser Thr Gly Pro Ser Ala Thr
340 345 350
Pro Gly Thr Ser Gly Pro Ser Gly Thr Ser Ala Pro Thr Gly Pro Ser
355 360 365
Ala Thr Pro Gly Thr Ser Gly Pro Ser Gly Thr Ser Ala Pro Thr Gly
370 375 380
Pro Thr Ser Ala Pro Gly Thr Ser Gly Pro Ser Thr Pro Gly Thr Ser
385 390 395 400
Ala Gly Pro Thr Ser Ala Pro Gly Ser Thr Gly Pro Ser Ala Gly Thr
405 410 415
Pro Ser Thr Gly Pro Thr Ser Ala Pro Gly Ser Thr Gly Pro Ser Ala
420 425 430
Gly Thr Pro Ser Thr Gly Pro Ser Ala Thr Pro Gly Ser Thr Gly Pro
435 440 445
Thr Ser Ala Pro Gly Ser Thr Gly Pro Ala Thr Pro Ser Gly Thr Ser
450 455 460
Gly Pro Ser Thr Ala Gly Pro Thr Ser Gly Pro Ser Gly Thr Pro Ala
465 470 475 480
Ser Thr Gly Pro Ala Thr Pro Ser Gly Thr Ser Gly Pro Ser Ala Thr
485 490 495
Pro Gly Thr Ser Gly Pro Ser Gly Thr Ser Pro Thr Ala Gly Pro Ala
500 505 510
Gly Ser Thr Pro Ser Thr Gly Pro Ser Ala Pro Thr Gly Ser Thr Gly
515 520 525
Pro Ala Gly Ser Thr Pro Ser Thr Gly Pro Thr Ser Gly Pro Thr Ala
530 535 540
Ser Gly Pro Ser Ala Thr Pro Gly Ser Thr Gly Pro Thr Ser Ala Pro
545 550 555 560
Gly Ser Thr Gly Pro Ser Ala Thr Pro Gly Thr Ser Gly Pro Ser Gly
565 570 575
Thr Ser Ala Pro Thr Gly Pro Ser Gly Thr Pro Ala Ser Thr Gly Pro
580 585 590
Ala Thr Pro Ser Gly Thr Ser Gly Pro Ser Ala Thr Pro Gly Thr Ser
595 600 605
Gly Pro Ser Gly Thr Ser Pro Thr Ala Gly Pro Ser Ala Thr Pro Gly
610 615 620
Ser Thr Gly Pro Thr Ser Ala Pro Gly Ser Thr Gly Pro Ser Thr Gly
625 630 635 640
Ser Pro Ala Thr Gly Pro Ser Thr Pro Ala Gly Ser Thr Gly Glu Phe
645 650 655
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
660 665 670
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
675 680 685
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
690 695 700
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
705 710 715 720
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
725 730 735
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
740 745 750
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
755 760 765
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
770 775 780
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
785 790 795 800
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
805 810 815
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Leu Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser
820 825 830
Pro Ser Tyr Ala Ser
835
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
gccggcactg ccggaaccgc 20
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
gcggggccag gatgcccggc ggttccggca gtgccggc 38
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
cgggcatcct ggccccgcaa ccgccggatg tgggttcct 39
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
gacccagcat agacagcgga tcggaggaac ccacatccgg cggtt 45
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
ccgatccgct gtctatgctg ggtccgtccc agggtcgttc cccgtcctat gcgtcataaa 60

Claims (4)

1.一种聚多肽与成纤维细胞生长因子21融合蛋白突变体，其特征在于，在原型融合蛋白基础上进行改造，所述蛋白突变体包括：
(a)一种聚多肽分子
(b)成纤维细胞生长因子21中位于169位缬氨酸被亮氨酸取代。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白突变体，其特征在于，其中所述的聚多肽分子是脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甘氨酸为基础氨基酸构建组合而成的含有无规则卷曲结构，不带电荷，无免疫原性的一种聚多肽分子。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白突变体，其特征在于，所述的融合蛋白突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的融合蛋白突变体在制备治疗降血脂、降血糖或肝纤维化药物中的应用。
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