CN113980124A - 基于新型冠状病毒快速制备高亲和力多表位诊断抗体方法 - Google Patents

基于新型冠状病毒快速制备高亲和力多表位诊断抗体方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于新型冠状病毒快速制备高亲和力多表位诊断抗体方法，包括原料和辅料；所述原料组分及重量份数配比为：青霉素3％～5％、氨苄青霉素1％～3％、卡那霉素1％～2％、SARS‑CoV‑2多表位抗原3％～5％、NTA0.6％～0.8％、树脂8％～10％、蛋白溶液6％～8％、弗氏完全佐剂0.7％～0.9％、弗氏不完全佐剂0.7％～0.9％、IgY0.8％～1％、pET32a(+)0.7％～0.9％、蛋白质6％～8％、PBS0.5％～0.7％、碳酸盐缓冲液0.7％～0.9％、封闭液8％～10％、BSA1％～2％、酪蛋白0.5％～0.7％、酪蛋白酸0.6％～0.8％、TMB缓冲液0.4％～0.6％、其余全都脱脂牛奶。该方法具有解决现有新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)免疫检测用抗体制备成本高，风险大，存在易与血液样本中其他因子出现交叉反应，且灵敏度和特异度受限的问题，在普通条件实验室可进行操作，简便易行，高效安全，具有极大的可重复性，应用了体外表达的IgY免疫蛋白，能够避免活毒扩散。

Description

基于新型冠状病毒快速制备高亲和力多表位诊断抗体方法
技术领域
本发明涉及抗体制备技术领域，具体为基于新型冠状病毒快速制备高亲 和力多表位诊断抗体方法。
背景技术
目前新型冠状病毒肺炎疫情仍在发展中，给人类健康和经济带来了巨大 的威胁，需要快速有效的手段来确定检测对象的实际感染情况，为后续实施 的治疗及防疫措施提供依据。
当前应用的核酸检测方法虽为诊断SARS-CoV-2感染的金标准，但受咽拭 子样本采集方式限制，检测人员感染风险较高，且后续步骤繁琐，实验条件 要求高，尚不能满足目前大规模检测以排查疑似患者、无症状感染者的需要。
而目前SARS-CoV-2血清学诊断中的抗体多来源于以SARS-CoV-2特异性 抗原免疫小鼠、家兔等哺乳动物得到的特异性IgM/IgG，最后利用ELISA、胶 体金等技术手段来定性或定量检测样本，能够下沉至医院等现场大量使用， 便捷高效，30分钟至一个小时内可得出结果。但该免疫抗体制备方法成本高， 得到的抗体滴度较低，开发后大量生产困难，并且用于检测用抗体影响因素 众多，会受到灵敏度和特异性限制，难以准确判断潜伏期、感染初期以及治 愈转阴的病人，易与样本中免疫球蛋白、补体和类风湿因子发生交叉反应， 出现假阳性，尚不能作为新冠肺炎确诊和排除的唯一依据。
而与产生于哺乳动物的IgM/IgG相比，IgY具有特异性高、成本低、产量 高的优点，一只鸡就可以产生大量特异性抗体，每个月大约可达3克IgY，是 家兔的10-20倍，并且IgY具有耐热性，保存方便，不激活哺乳动物补体系 统，与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉血清学反应。因此，有必要提 供一种快速制备新型冠状病毒的高亲和力诊断用IgY抗体的方法。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了基于新型冠状病毒快速制 备高亲和力多表位诊断抗体方法，具有解决现有新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 免疫检测用抗体制备成本高，风险大，存在易与血液样本中其他因子出现交 叉反应，且灵敏度和特异度受限的问题，提供一种快速制备具有高亲和力的 多表位诊断用SARS-CoV-2卵黄抗体的方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于新型冠状病毒高亲和 力多表位诊断抗体，包括原料和辅料；所述原料组分及重量份数配比为：青 霉素3％～5％、氨苄青霉素1％～3％、卡那霉素1％～2％、SARS-CoV-2多表位抗原 3％～5％、NTA0.6％～0.8％、树脂8％～10％、蛋白溶液6％～8％、弗氏完全佐剂0.7％～0.9％、 弗氏不完全佐剂0.7％～0.9％、IgY0.8％～1％、pET32a(+)0.7％～0.9％、蛋白质6％～8％、 PBS0.5％～0.7％、碳酸盐缓冲液0.7％～0.9％、封闭液8％～10％、BSA1％～2％、酪蛋 白0.5％～0.7％、；酪蛋白酸0.6％～0.8％、TMB缓冲液0.4％～0.6％、其余全都脱脂 牛奶；所述辅料组分及重量份数配比为：咪唑0.02％～0.04％、 Tris-HC0.01％～0.03％、蒸馏水0.01％～0.03％、辣根过氧化物酶0.02％～0.04％、 山羊抗人IgG(H+L)0.02％～0.04％、4-氯-1-萘酚0.01％～0.03％、过氧化氢酶 0.02％～0.04％、H2SO40.01％～0.03％、辛酸0.02％～0.04％、硫酸钠0.01％～0.03％、 产蛋母鸡50只。
优选的，所述原料组分及重量份数配比为：青霉素3％、氨苄青霉素1％、 卡那霉素1％、SARS-CoV-2多表位抗原3％、NTA0.6％、树脂8％、蛋白溶液6％、 弗氏完全佐剂0.7％、弗氏不完全佐剂0.7％、IgY0.8％、pET32a(+)0.7％、蛋白 质6％、PBS0.5％碳酸盐缓冲液0.7％、封闭液8％、BSA1％、酪蛋白0.5％、；酪蛋 白酸0.6％、TMB缓冲液0.4％、其余全都脱脂牛奶；所述辅料组分及重量份数 配比：咪唑0.02％、Tris-HC0.01％、蒸馏水0.01％、辣根过氧化物酶0.02％、 山羊抗人IgG(H+L)0.02％、4-氯-1-萘酚0.01％、过氧化氢酶0.02％、H2SO40.01％、 辛酸0.02％、硫酸钠0.01％、产蛋母鸡50只。
优选的，所述原料组分及重量份数配比为：青霉素3％、氨苄青霉素1％、 卡那霉素1％、SARS-CoV-2多表位抗原3％、NTA0.7％、树脂9％、蛋白溶液7％、 弗氏完全佐剂0.8％、弗氏不完全佐剂0.8％、IgY0.8％、pET32a(+)0.8％、蛋白 质7％、PBS0.6％、碳酸盐缓冲液0.8％、封闭液9％、BSA1％、酪蛋白0.6％、；酪 蛋白酸0.7％、TMB缓冲液0.6％、其余全都脱脂牛奶；所述辅料组分及重量份 数配比：咪唑0.03％、Tris-HC0.02％、蒸馏水0.02％、辣根过氧化物酶0.03％、 山羊抗人IgG(H+L)0.03％、4-氯-1-萘酚0.02％、过氧化氢酶0.03％、H2SO40.02％、 辛酸0.03％、硫酸钠0.02％、产蛋母鸡50只。
优选的，所述原料组分及重量份数配比为：青霉素5％、氨苄青霉素3％、 卡那霉素3％、SARS-CoV-2多表位抗原5％、NTA1％、树脂10％、蛋白溶液8％、 弗氏完全佐剂0.9％、弗氏不完全佐剂0.9％、IgY1％、pET32a(+)0.9％、蛋白质 6％、PBS0.7％、碳酸盐缓冲液0.9％、封闭液10％、BSA3％、酪蛋白0.7％、；酪蛋 白酸0.8％、TMB缓冲液0.6％；所述辅料组分及重量份数配比：咪唑0.04％、 Tris-HC0.03％、蒸馏水0.03％、辣根过氧化物酶0.04％、山羊抗人 IgG(H+L)0.04％、4-氯-1-萘酚0.03％、过氧化氢酶0.04％、H2SO40.03％、辛酸0.04％、硫酸钠0.03％、产蛋母鸡50只。
优选的，包括以下步骤：
S1、抗原制备：所述通过IEDB的BeipRed2.0软件获得SARS-CoV-2候选 抗原表位，选择富含CTL、Th表位和B细胞表位的氨基酸序列，将这些序列 按一定的顺序串联构建新的多表位融合抗原，并重新预测以验证融合序列中 的T细胞和B细胞表位是否发生变化，最后选择表位不变的融合序列(称为 SARS-CoV-2多表位抗原)进行进一步分析；
S2、表达：所述抗原表位位于SARS-CoV-2的S蛋白及N蛋白上；
S3、鉴定和纯化：所述为表达融合的多表位抗原，使用原核系统的密码 子将SARS-CoV-2多表位抗原的氨基酸序列翻译成核苷酸序列，并克隆到原核 表达载体的位点中，以构建重组质粒，然后通过限制性内切酶消化和DNA测 序证实该重组质粒，确认插入的序列后，用质粒诱导转化大肠杆菌BL21(DE3)， 通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析 (Westernblot)验证SARS-CoV-2多表位抗原的表达和鉴定，然后纯化重组 蛋白，PBS，pH7.4透析使蛋白质复性，并通过SDS-PAGE分级分离，然后通过BCA蛋白质定量方法确定其浓度，最后储存样品备用；
S4、卵黄抗体制备：所述将制备的SARS-CoV-2多表位抗原取370μL与 等量佐剂混合处理后作为免疫原混合溶液，通过背部皮下注射免疫产蛋母鸡3 次，每次间隔2周，第三次免疫3周后收集鸡蛋用来制备抗体，将收集的鸡 蛋样品在4℃下储存；
S5、选取：所述免疫原混合溶液浓度为每毫升溶液含约1.35mgSARS-CoV-2 多表位抗原，首次免疫使用弗氏完全佐剂，第二次免疫和第三次免疫使用弗 氏不完全佐剂，SARS-CoV-2多表位抗原卵黄抗体的粗提：去蛋清得蛋黄，用 水稀释后用辛酸调pH至5.2～6.0进行第一次沉淀后离心取上清，加19％硫酸 钠溶液进行第二次沉淀后离心去除上清，得到白色沉淀即为SARS-CoV-2多表 位抗原卵黄抗体粗品；
S6、沉淀离心：所述将第一次沉淀、第二次沉淀时的温度均为4℃；所述 离心的速率均为8000～10000r/min；所述离心的时间均为20～60min，将得到 的SARS-CoV-2多表位抗原卵黄抗体粗品过标记有SARS-CoV-2多表位抗原的 Sepharose4B层析柱，亲和纯化SARS-CoV-2多表位抗原卵黄抗体；
S7、透析：所述用5倍柱体积的PBS平衡亲和层析柱，将卵黄抗体粗品 用PBS溶液溶解后上柱，然后用5倍柱体积的PBS洗涤，最后4MMgCl2洗脱 液进行洗脱，再用PBS进行透析；
S8、检测：所述用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析述步骤2.3中所纯化的 SARS-CoV-2多表位IgY的滴度水平，所述将所纯化的SARS-CoV-2多表位IgY 检测新冠病人血清；
S9、新型冠状病毒优势表位选择：所述使用IEDB的BeipRed2.0软件进 行表位预测并进行比较，最终选择3个SARS-CoV-2优势线性B细胞表位：位 于NTD上的氨基酸序列SEQIDNO.1(CVNLTTRTQLPPAYTNS)，位于RBD上的氨基 酸序列SEQIDNO.2(DEVRQIAPGQTGKI)，以及RBD上的氨基酸序列SEQIDNO.3 (LDSKVGGN)；,3个SARS-CoV-2优势T细胞表位：SEQIDNO.4(KIADYNYKL)， SEQIDNO.5(EILPVSMTK)，SEQIDNO.6(IPFAMQMAYRFNGIG)；2个优势CTL表位： SEQIDNO.7(ELSPRWYFY)，SEQIDNO.8(TSTGNYNYK)，所述选择的表位大小均 大于8个氨基酸且保守性均超过80％；
S10、克隆：所述优势表位以不同的排列组合方式连接在一起，设计包含 两个限制性位点进行双酶切，并将佐剂添加到序列的氮末端区域以促进抗原 呈递及免疫反应，碳末端加上标签，表位连接接头选择EAAAK、KK、AAY和GPGPG 氨基酸接头；优选地，以上限制性位点选择XhoI，EcoRI，BamHI或HindIII； 优选地，以上佐剂选择β-防御素(TLR-3激动剂)；优选地，以上标签选择His 标签，使用原核系统的密码子将SARS-CoV-2多表位抗原的氨基酸序列翻译成 核苷酸序列，并克隆到原核表达载体的位点中，构建重组质粒，然后通过限 制性内切酶消化和DNA测序证实该重组质粒；
S11、加热培养：所述在42℃下用热休克转换法以步骤S2.2所得质粒转 化大肠杆菌BL21(DE3)，所述在过夜培养后，取7ml菌液接种于含有100ng/ml 青霉素的1LLuria-Bertani培养基的2.8L容量烧瓶中；
S12、搅拌离心：所述在230rpm搅拌直至A600达到0.6，在37℃下用1mM 的IPTG诱导表达4小时，在4℃下以6500rpm离心10分钟，弃上清后将细胞 重悬于100ml结合缓冲液中，并在冰上超声处理(48×10s)，所述结合缓冲 液为500mMNaCl，5mM咪唑，20mMTris-HCl，pH7.9；所述将裂解液在4℃下以 17,000rpm离心20分钟，然后将上清液通过0.45μm过滤器过滤，将5ml床体 积的NTA装入柱中，并用结合缓冲液平衡，将样品装入柱中，并先用20树脂体积的结合缓冲液洗涤柱，然后用10树脂体积的洗涤缓冲液洗涤，所述洗涤 缓冲液为500mMNaCl，40mM咪唑，20mMTris-Cl，pH7.9；
S13、储存检测：所述将洗脱的蛋白质用膜管在4℃的蒸馏水中透析过夜， 脱盐后的溶液冷冻干燥，并在20℃下储存，所述用分光光度计检测OD280， 并使用消光系数计算蛋白质浓度；
S14、加热培养：所述通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析(Westernblot)验证SARS-CoV-2多表位抗 原的表达和鉴定，然后纯化重组蛋白，用pH7.4的PBS透析使蛋白质复性， 并通过SDS-PAGE分级分离，然后通过BCA蛋白质定量方法确定其浓度，最后 储存SARS-CoV-2多表位抗原样品备用；
S15、分类：所述选取产蛋母鸡，分为免疫组和空白对照组，每组4只；
S16、注射：将实施例2制备的SARS-CoV-2多表位抗原作为免疫原，浓 度为2.7mg/ml，免疫剂量为250μg/只，总共免疫3次，免疫间隔为14天， 首次免疫使用弗氏完全佐剂与蛋白溶液各370ul等量混合，用注射器和软管 进行乳化后免疫，空白组用等量的PBS进行免疫；第二次免疫和第三次免疫 使用弗氏不完全佐剂进行加强免疫；
S17、收集提取：所述第三次免疫后收集鸡蛋，去除蛋清，无菌取出蛋黄 后量取体积，标记后-20℃保存，用来制备IgY抗体，所述将冻存于-20℃的 IgY4℃化冻后，加入9倍体积的pH5.0-5.2的过滤ddH2O，搅拌均匀，放4℃ 静置6小时或者过夜，再4℃13000r/min离心15分钟，弃沉淀，上清即为粗 提的IgY抗体水溶液；
S18、纯化：所述将得到的SARS-CoV-2多表位IgY抗体水溶液用截留量 为10kD的超滤浓缩管进行浓缩和进一步纯化，得到IgY抗体；
S19、检测：所述从用pET32a(+)空白载体转化的大肠杆菌BL21(DE3)中 纯化的6×His蛋白用作对照，将实施例3所制备IgY和来自新冠肺炎患者的 血清作为一级抗体，用辣根过氧化物酶结合的山羊抗人IgG(H+L)作为二级抗 体，使用0.005％(w/v)4-氯-1-萘酚和0.015％(v/v)过氧化氢酶显色底物使蛋 白质条带可视化；
S20、滴度：所述将抗原按照所需的浓度用PBS(pH＝7.2±0.1)或1×碳 酸盐缓冲液(pH＝9.6)稀释，100μl/孔加入到96孔ELISA板中，4℃孵育过 夜后使用PBST洗5次，每孔加入200μl封闭液，室温孵育1小时，用同样方 法洗板，每孔加入100μl稀释好的实施例3所制备的一抗，实验组为 SARS-CoV-2多表位IgY抗体，对照组为免疫空白组母鸡所制备的IgY抗体， 室温孵育1小时，用同样方法洗板，：每孔加入100μl已经稀释好的二抗，室 温孵育1小时，用同样方法洗板，将新配好的TMB缓冲液以100μl/孔加入到 ELISA板中，室温条件下孵育15分钟；
S21、终止：所述每孔加入50μl3MH2SO4，轻轻振荡，用酶标仪在OD450 处读数，抗体滴度定义为实验组和阴性对照组光吸收比值≥2.0时最大的血清 稀释倍数。
本发明提供了基于新型冠状病毒快速制备高亲和力多表位诊断抗体方 法，该方法利用目前已知序列人工合成抗原，并采用多表位嵌合的抗原产生 IgY抗体，该IgY免疫蛋白针对SARS-CoV-2多表位区域，特异性高，能够作为 新冠肺炎患者的检测用抗体，应用了体外表达的IgY免疫蛋白，能够避免活毒 扩散，在普通条件实验室可进行操作，简便易行，高效安全，具有极大的可 重复性，该IgY制备成本低、产量高，保存方便，能够大量开发以应用于目前 的大规模检测。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所 描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的
下面结合一些实施例对本发明作进一步解释，应该理解以下实施例旨在 说明，不应被视为对本发明的限制。
实施例一
基于新型冠状病毒高亲和力多表位诊断抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1、抗原制备：所述通过IEDB的BeipRed2.0软件获得SARS-CoV-2候选 抗原表位，选择富含CTL、Th表位和B细胞表位的氨基酸序列，将这些序列 按一定的顺序串联构建新的多表位融合抗原，并重新预测以验证融合序列中 的T细胞和B细胞表位是否发生变化，最后选择表位不变的融合序列(称为 SARS-CoV-2多表位抗原)进行进一步分析；
S2、表达：所述抗原表位位于SARS-CoV-2的S蛋白及N蛋白上；
S3、鉴定和纯化：所述为表达融合的多表位抗原，使用原核系统的密码 子将SARS-CoV-2多表位抗原的氨基酸序列翻译成核苷酸序列，并克隆到原核 表达载体的位点中，以构建重组质粒，然后通过限制性内切酶消化和DNA测 序证实该重组质粒，确认插入的序列后，用质粒诱导转化大肠杆菌BL21(DE3)， 通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析 (Westernblot)验证SARS-CoV-2多表位抗原的表达和鉴定，然后纯化重组 蛋白，PBS，pH7.4透析使蛋白质复性，并通过SDS-PAGE分级分离，然后通过BCA蛋白质定量方法确定其浓度，最后储存样品备用；
S4、卵黄抗体制备：所述将制备的SARS-CoV-2多表位抗原取370μL与 等量佐剂混合处理后作为免疫原混合溶液，通过背部皮下注射免疫产蛋母鸡3 次，每次间隔2周，第三次免疫3周后收集鸡蛋用来制备抗体，将收集的鸡 蛋样品在4℃下储存；
S5、选取：所述免疫原混合溶液浓度为每毫升溶液含约1.35mgSARS-CoV-2 多表位抗原，首次免疫使用弗氏完全佐剂，第二次免疫和第三次免疫使用弗 氏不完全佐剂，SARS-CoV-2多表位抗原卵黄抗体的粗提：去蛋清得蛋黄，用 水稀释后用辛酸调pH至5.2～6.0进行第一次沉淀后离心取上清，加19％硫酸 钠溶液进行第二次沉淀后离心去除上清，得到白色沉淀即为SARS-CoV-2多表 位抗原卵黄抗体粗品；
S6、沉淀离心：所述将第一次沉淀、第二次沉淀时的温度均为4℃；所述 离心的速率均为8000～10000r/min；所述离心的时间均为20～60min，将得到 的SARS-CoV-2多表位抗原卵黄抗体粗品过标记有SARS-CoV-2多表位抗原的 Sepharose4B层析柱，亲和纯化SARS-CoV-2多表位抗原卵黄抗体；
S7、透析：所述用5倍柱体积的PBS平衡亲和层析柱，将卵黄抗体粗品 用PBS溶液溶解后上柱，然后用5倍柱体积的PBS洗涤，最后4MMgCl2洗脱 液进行洗脱，再用PBS进行透析；
S8、检测：所述用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析述步骤2.3中所纯化的 SARS-CoV-2多表位IgY的滴度水平，所述将所纯化的SARS-CoV-2多表位IgY 检测新冠病人血清；
S9、新型冠状病毒优势表位选择：所述使用IEDB的BeipRed2.0软件进 行表位预测并进行比较，最终选择3个SARS-CoV-2优势线性B细胞表位：位 于NTD上的氨基酸序列SEQIDNO.1(CVNLTTRTQLPPAYTNS)，位于RBD上的氨基 酸序列SEQIDNO.2(DEVRQIAPGQTGKI)，以及RBD上的氨基酸序列SEQIDNO.3 (LDSKVGGN)；,3个SARS-CoV-2优势T细胞表位：SEQIDNO.4(KIADYNYKL)， SEQIDNO.5(EILPVSMTK)，SEQIDNO.6(IPFAMQMAYRFNGIG)；2个优势CTL表位： SEQIDNO.7(ELSPRWYFY)，SEQIDNO.8(TSTGNYNYK)，所述选择的表位大小均 大于8个氨基酸且保守性均超过80％。
实施例二
基于新型冠状病毒高亲和力多表位诊断抗体的制备方法，包括以下步骤：
S10、克隆：所述优势表位以不同的排列组合方式连接在一起，设计包含 两个限制性位点进行双酶切，并将佐剂添加到序列的氮末端区域以促进抗原 呈递及免疫反应，碳末端加上标签，表位连接接头选择EAAAK、KK、AAY和GPGPG 氨基酸接头；优选地，以上限制性位点选择XhoI，EcoRI，BamHI或HindIII； 优选地，以上佐剂选择β-防御素(TLR-3激动剂)；优选地，以上标签选择His 标签，使用原核系统的密码子将SARS-CoV-2多表位抗原的氨基酸序列翻译成 核苷酸序列，并克隆到原核表达载体的位点中，构建重组质粒，然后通过限 制性内切酶消化和DNA测序证实该重组质粒；
S11、加热培养：所述在42℃下用热休克转换法以步骤S2.2所得质粒转 化大肠杆菌BL21(DE3)，所述在过夜培养后，取7ml菌液接种于含有100ng/ml 青霉素的1LLuria-Bertani培养基的2.8L容量烧瓶中；
S12、搅拌离心：所述在230rpm搅拌直至A600达到0.6，在37℃下用1mM 的IPTG诱导表达4小时，在4℃下以6500rpm离心10分钟，弃上清后将细胞 重悬于100ml结合缓冲液中，并在冰上超声处理(48×10s)，所述结合缓冲 液为500mMNaCl，5mM咪唑，20mMTris-HCl，pH7.9；所述将裂解液在4℃下以 17,000rpm离心20分钟，然后将上清液通过0.45μm过滤器过滤，将5ml床体 积的NTA装入柱中，并用结合缓冲液平衡，将样品装入柱中，并先用20树脂体积的结合缓冲液洗涤柱，然后用10树脂体积的洗涤缓冲液洗涤，所述洗涤 缓冲液为500mMNaCl，40mM咪唑，20mMTris-Cl，pH7.9；
S13、储存检测：所述将洗脱的蛋白质用膜管在4℃的蒸馏水中透析过夜， 脱盐后的溶液冷冻干燥，并在20℃下储存，所述用分光光度计检测OD280， 并使用消光系数计算蛋白质浓度；
S14、加热培养：所述通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析(Westernblot)验证SARS-CoV-2多表位抗 原的表达和鉴定，然后纯化重组蛋白，用pH7.4的PBS透析使蛋白质复性， 并通过SDS-PAGE分级分离，然后通过BCA蛋白质定量方法确定其浓度，最后 储存SARS-CoV-2多表位抗原样品备用；
实施例三
基于新型冠状病毒高亲和力多表位诊断抗体的制备方法，包括以下步骤：
S15、分类：所述选取产蛋母鸡，分为免疫组和空白对照组，每组4只；
S16、注射：将实施例2制备的SARS-CoV-2多表位抗原作为免疫原，浓 度为2.7mg/ml，免疫剂量为250μg/只，总共免疫3次，免疫间隔为14天， 首次免疫使用弗氏完全佐剂与蛋白溶液各370ul等量混合，用注射器和软管 进行乳化后免疫，空白组用等量的PBS进行免疫；第二次免疫和第三次免疫 使用弗氏不完全佐剂进行加强免疫；
S17、收集提取：所述第三次免疫后收集鸡蛋，去除蛋清，无菌取出蛋黄 后量取体积，标记后-20℃保存，用来制备IgY抗体，所述将冻存于-20℃的 IgY4℃化冻后，加入9倍体积的pH5.0-5.2的过滤ddH2O，搅拌均匀，放4℃ 静置6小时或者过夜，再4℃13000r/min离心15分钟，弃沉淀，上清即为粗 提的IgY抗体水溶液；
S18、纯化：所述将得到的SARS-CoV-2多表位IgY抗体水溶液用截留量 为10kD的超滤浓缩管进行浓缩和进一步纯化，得到IgY抗体；
实施例四
基于新型冠状病毒高亲和力多表位诊断抗体的制备方法，包括以下步骤：
S19、检测：所述从用pET32a(+)空白载体转化的大肠杆菌BL21(DE3)中 纯化的6×His蛋白用作对照，将实施例3所制备IgY和来自新冠肺炎患者的 血清作为一级抗体，用辣根过氧化物酶结合的山羊抗人IgG(H+L)作为二级抗 体，使用0.005％(w/v)4-氯-1-萘酚和0.015％(v/v)过氧化氢酶显色底物使蛋 白质条带可视化；
S20、滴度：所述将抗原按照所需的浓度用PBS(pH＝7.2±0.1)或1×碳 酸盐缓冲液(pH＝9.6)稀释，100μl/孔加入到96孔ELISA板中，4℃孵育过 夜后使用PBST洗5次，每孔加入200μl封闭液，室温孵育1小时，用同样方 法洗板，每孔加入100μl稀释好的实施例3所制备的一抗，实验组为 SARS-CoV-2多表位IgY抗体，对照组为免疫空白组母鸡所制备的IgY抗体， 室温孵育1小时，用同样方法洗板，：每孔加入100μl已经稀释好的二抗，室 温孵育1小时，用同样方法洗板，将新配好的TMB缓冲液以100μl/孔加入到 ELISA板中，室温条件下孵育15分钟；
S21、终止：所述每孔加入50μl3MH2SO4，轻轻振荡，用酶标仪在OD450处 读数，抗体滴度定义为实验组和阴性对照组光吸收比值≥2.0时最大的血清稀 释倍数。
该发明利用目前已知序列人工合成抗原，并采用多表位嵌合的抗原产生 IgY抗体，该IgY免疫蛋白针对SARS-CoV-2多表位区域，特异性高，能够作为 新冠肺炎患者的检测用抗体，应用了体外表达的IgY免疫蛋白，能够避免活毒 扩散，在普通条件实验室可进行操作，简便易行，高效安全，具有极大的可 重复性，该IgY制备成本低、产量高，保存方便，能够大量开发以应用于目前 的大规模检测。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不 局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根 据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明 的保护范围之内。

Claims (5)

1.基于新型冠状病毒高亲和力多表位诊断抗体，其特征在于：包括原料和辅料；所述原料组分及重量份数配比为：青霉素3％～5％、氨苄青霉素1％～3％、卡那霉素1％～2％、SARS-CoV-2多表位抗原3％～5％、NTA0.6％～0.8％、树脂8％～10％、蛋白溶液6％～8％、弗氏完全佐剂0.7％～0.9％、弗氏不完全佐剂0.7％～0.9％、IgY0.8％～1％、pET32a(+)0.7％～0.9％、蛋白质6％～8％、PBS0.5％～0.7％、碳酸盐缓冲液0.7％～0.9％、封闭液8％～10％、BSA1％～2％、酪蛋白0.5％～0.7％、；酪蛋白酸0.6％～0.8％、TMB缓冲液0.4％～0.6％、其余全都脱脂牛奶；
所述辅料组分及重量份数配比为：咪唑0.02％～0.04％、Tris-HC0.01％～0.03％、蒸馏水0.01％～0.03％、辣根过氧化物酶0.02％～0.04％、山羊抗人IgG(H+L)0.02％～0.04％、4-氯-1-萘酚0.01％～0.03％、过氧化氢酶0.02％～0.04％、H2SO40.01％～0.03％、辛酸0.02％～0.04％、硫酸钠0.01％～0.03％、产蛋母鸡50只。
2.根据权利要求1所述的基于新型冠状病毒高亲和力多表位诊断抗体，其特征在于：所述原料组分及重量份数配比为：青霉素3％、氨苄青霉素1％、卡那霉素1％、SARS-CoV-2多表位抗原3％、NTA0.6％、树脂8％、蛋白溶液6％、弗氏完全佐剂0.7％、弗氏不完全佐剂0.7％、IgY0.8％、pET32a(+)0.7％、蛋白质6％、PBS0.5％碳酸盐缓冲液0.7％、封闭液8％、BSA1％、酪蛋白0.5％、；酪蛋白酸0.6％、TMB缓冲液0.4％、其余全都脱脂牛奶；所述辅料组分及重量份数配比：咪唑0.02％、Tris-HC0.01％、蒸馏水0.01％、辣根过氧化物酶0.02％、山羊抗人IgG(H+L)0.02％、4-氯-1-萘酚0.01％、过氧化氢酶0.02％、H2SO40.01％、辛酸0.02％、硫酸钠0.01％、产蛋母鸡50只。
3.根据权利要求1所述的基于新型冠状病毒高亲和力多表位诊断抗体，其特征在于：所述原料组分及重量份数配比为：青霉素3％、氨苄青霉素1％、卡那霉素1％、SARS-CoV-2多表位抗原3％、NTA0.7％、树脂9％、蛋白溶液7％、弗氏完全佐剂0.8％、弗氏不完全佐剂0.8％、IgY0.8％、pET32a(+)0.8％、蛋白质7％、PBS0.6％、碳酸盐缓冲液0.8％、封闭液9％、BSA1％、酪蛋白0.6％、；酪蛋白酸0.7％、TMB缓冲液0.6％、其余全都脱脂牛奶；所述辅料组分及重量份数配比：咪唑0.03％、Tris-HC0.02％、蒸馏水0.02％、辣根过氧化物酶0.03％、山羊抗人IgG(H+L)0.03％、4-氯-1-萘酚0.02％、过氧化氢酶0.03％、H2SO40.02％、辛酸0.03％、硫酸钠0.02％、产蛋母鸡50只。
4.根据权利要求1所述的基于新型冠状病毒高亲和力多表位诊断抗体，其特征在于：所述原料组分及重量份数配比为：青霉素5％、氨苄青霉素3％、卡那霉素3％、SARS-CoV-2多表位抗原5％、NTA1％、树脂10％、蛋白溶液8％、弗氏完全佐剂0.9％、弗氏不完全佐剂0.9％、IgY1％、pET32a(+)0.9％、蛋白质6％、PBS0.7％、碳酸盐缓冲液0.9％、封闭液10％、BSA3％、酪蛋白0.7％、；酪蛋白酸0.8％、TMB缓冲液0.6％；所述辅料组分及重量份数配比：咪唑0.04％、Tris-HC0.03％、蒸馏水0.03％、辣根过氧化物酶0.04％、山羊抗人IgG(H+L)0.04％、4-氯-1-萘酚0.03％、过氧化氢酶0.04％、H2SO40.03％、辛酸0.04％、硫酸钠0.03％、产蛋母鸡50只。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的基于新型冠状病毒高亲和力多表位诊断抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、抗原制备：所述通过IEDB的BeipRed2.0软件获得SARS-CoV-2候选抗原表位，选择富含CTL、Th表位和B细胞表位的氨基酸序列，将这些序列按一定的顺序串联构建新的多表位融合抗原，并重新预测以验证融合序列中的T细胞和B细胞表位是否发生变化，最后选择表位不变的融合序列(称为SARS-CoV-2多表位抗原)进行进一步分析；
S2、表达：所述抗原表位位于SARS-CoV-2的S蛋白及N蛋白上；
S3、鉴定和纯化：所述为表达融合的多表位抗原，使用原核系统的密码子将SARS-CoV-2多表位抗原的氨基酸序列翻译成核苷酸序列，并克隆到原核表达载体的位点中，以构建重组质粒，然后通过限制性内切酶消化和DNA测序证实该重组质粒，确认插入的序列后，用质粒诱导转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析(Westernblot)验证SARS-CoV-2多表位抗原的表达和鉴定，然后纯化重组蛋白，PBS，pH7.4透析使蛋白质复性，并通过SDS-PAGE分级分离，然后通过BCA蛋白质定量方法确定其浓度，最后储存样品备用；
S4、卵黄抗体制备：所述将制备的SARS-CoV-2多表位抗原取370μL与等量佐剂混合处理后作为免疫原混合溶液，通过背部皮下注射免疫产蛋母鸡3次，每次间隔2周，第三次免疫3周后收集鸡蛋用来制备抗体，将收集的鸡蛋样品在4℃下储存；
S5、选取：所述免疫原混合溶液浓度为每毫升溶液含约1.35mgSARS-CoV-2多表位抗原，首次免疫使用弗氏完全佐剂，第二次免疫和第三次免疫使用弗氏不完全佐剂，SARS-CoV-2多表位抗原卵黄抗体的粗提：去蛋清得蛋黄，用水稀释后用辛酸调pH至5.2～6.0进行第一次沉淀后离心取上清，加19％硫酸钠溶液进行第二次沉淀后离心去除上清，得到白色沉淀即为SARS-CoV-2多表位抗原卵黄抗体粗品；
S6、沉淀离心：所述将第一次沉淀、第二次沉淀时的温度均为4℃；所述离心的速率均为8000～10000r/min；所述离心的时间均为20～60min，将得到的SARS-CoV-2多表位抗原卵黄抗体粗品过标记有SARS-CoV-2多表位抗原的Sepharose4B层析柱，亲和纯化SARS-CoV-2多表位抗原卵黄抗体；
S7、透析：所述用5倍柱体积的PBS平衡亲和层析柱，将卵黄抗体粗品用PBS溶液溶解后上柱，然后用5倍柱体积的PBS洗涤，最后4MMgCl2洗脱液进行洗脱，再用PBS进行透析；
S8、检测：所述用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析述步骤2.3中所纯化的SARS-CoV-2多表位IgY的滴度水平，所述将所纯化的SARS-CoV-2多表位IgY检测新冠病人血清；
S9、新型冠状病毒优势表位选择：所述使用IEDB的BeipRed2.0软件进行表位预测并进行比较，最终选择3个SARS-CoV-2优势线性B细胞表位：位于NTD上的氨基酸序列SEQIDNO.1(CVNLTTRTQLPPAYTNS)，位于RBD上的氨基酸序列SEQIDNO.2(DEVRQIAPGQTGKI)，以及RBD上的氨基酸序列SEQIDNO.3(LDSKVGGN)；,3个SARS-CoV-2优势T细胞表位：SEQIDNO.4(KIADYNYKL)，SEQIDNO.5(EILPVSMTK)，SEQIDNO.6(IPFAMQMAYRFNGIG)；2个优势CTL表位：SEQIDNO.7(ELSPRWYFY)，SEQIDNO.8(TSTGNYNYK)，所述选择的表位大小均大于8个氨基酸且保守性均超过80％；
S10、克隆：所述优势表位以不同的排列组合方式连接在一起，设计包含两个限制性位点进行双酶切，并将佐剂添加到序列的氮末端区域以促进抗原呈递及免疫反应，碳末端加上标签，表位连接接头选择EAAAK、KK、AAY和GPGPG氨基酸接头；优选地，以上限制性位点选择XhoI，EcoRI，BamHI或HindIII；优选地，以上佐剂选择β-防御素(TLR-3激动剂)；优选地，以上标签选择His标签，使用原核系统的密码子将SARS-CoV-2多表位抗原的氨基酸序列翻译成核苷酸序列，并克隆到原核表达载体的位点中，构建重组质粒，然后通过限制性内切酶消化和DNA测序证实该重组质粒；
S11、加热培养：所述在42℃下用热休克转换法以步骤S2.2所得质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，所述在过夜培养后，取7ml菌液接种于含有100ng/ml青霉素的1LLuria-Bertani培养基的2.8L容量烧瓶中；
S12、搅拌离心：所述在230rpm搅拌直至A600达到0.6，在37℃下用1mM的IPTG诱导表达4小时，在4℃下以6500rpm离心10分钟，弃上清后将细胞重悬于100ml结合缓冲液中，并在冰上超声处理(48×10s)，所述结合缓冲液为500mMNaCl，5mM咪唑，20mMTris-HCl，pH7.9；所述将裂解液在4℃下以17,000rpm离心20分钟，然后将上清液通过0.45μm过滤器过滤，将5ml床体积的NTA装入柱中，并用结合缓冲液平衡，将样品装入柱中，并先用20树脂体积的结合缓冲液洗涤柱，然后用10树脂体积的洗涤缓冲液洗涤，所述洗涤缓冲液为500mMNaCl，40mM咪唑，20mMTris-Cl，pH7.9；
S13、储存检测：所述将洗脱的蛋白质用膜管在4℃的蒸馏水中透析过夜，脱盐后的溶液冷冻干燥，并在20℃下储存，所述用分光光度计检测OD280，并使用消光系数计算蛋白质浓度；
S14、加热培养：所述通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析(Westernblot)验证SARS-CoV-2多表位抗原的表达和鉴定，然后纯化重组蛋白，用pH7.4的PBS透析使蛋白质复性，并通过SDS-PAGE分级分离，然后通过BCA蛋白质定量方法确定其浓度，最后储存SARS-CoV-2多表位抗原样品备用；
S15、分类：所述选取产蛋母鸡，分为免疫组和空白对照组，每组4只；
S16、注射：将实施例2制备的SARS-CoV-2多表位抗原作为免疫原，浓度为2.7mg/ml，免疫剂量为250μg/只，总共免疫3次，免疫间隔为14天，首次免疫使用弗氏完全佐剂与蛋白溶液各370ul等量混合，用注射器和软管进行乳化后免疫，空白组用等量的PBS进行免疫；第二次免疫和第三次免疫使用弗氏不完全佐剂进行加强免疫；
S17、收集提取：所述第三次免疫后收集鸡蛋，去除蛋清，无菌取出蛋黄后量取体积，标记后-20℃保存，用来制备IgY抗体，所述将冻存于-20℃的IgY4℃化冻后，加入9倍体积的pH5.0-5.2的过滤ddH2O，搅拌均匀，放4℃静置6小时或者过夜，再4℃13000r/min离心15分钟，弃沉淀，上清即为粗提的IgY抗体水溶液；
S18、纯化：所述将得到的SARS-CoV-2多表位IgY抗体水溶液用截留量为10kD的超滤浓缩管进行浓缩和进一步纯化，得到IgY抗体；
S19、检测：所述从用pET32a(+)空白载体转化的大肠杆菌BL21(DE3)中纯化的6×His蛋白用作对照，将实施例3所制备IgY和来自新冠肺炎患者的血清作为一级抗体，用辣根过氧化物酶结合的山羊抗人IgG(H+L)作为二级抗体，使用0.005％(w/v)4-氯-1-萘酚和0.015％(v/v)过氧化氢酶显色底物使蛋白质条带可视化；
S20、滴度：所述将抗原按照所需的浓度用PBS(pH＝7.2±0.1)或1×碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)稀释，100μl/孔加入到96孔ELISA板中，4℃孵育过夜后使用PBST洗5次，每孔加入200μl封闭液，室温孵育1小时，用同样方法洗板，每孔加入100μl稀释好的实施例3所制备的一抗，实验组为SARS-CoV-2多表位IgY抗体，对照组为免疫空白组母鸡所制备的IgY抗体，室温孵育1小时，用同样方法洗板，：每孔加入100μl已经稀释好的二抗，室温孵育1小时，用同样方法洗板，将新配好的TMB缓冲液以100μl/孔加入到ELISA板中，室温条件下孵育15分钟；
S21、终止：所述每孔加入50μl3MH2SO4，轻轻振荡，用酶标仪在OD450处读数，抗体滴度定义为实验组和阴性对照组光吸收比值≥2.0时最大的血清稀释倍数。
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