CN113966228A - 黏膜疫苗配制剂 - Google Patents
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Abstract
猿腺病毒载体与生物黏附剂和赋形剂一起配制,保持免疫原性。它们可以经黏膜施用以提供有效的防治和疗法。
Description
发明领域
本发明在预防和治疗疾病的领域。特别地,本发明涉及适合于猿腺病毒疫苗的黏膜施用的配制剂。
发明背景
已经证明腺病毒载体提供防治性和治疗性递送平台,借此将编码治疗性分子的核酸序列掺入到腺病毒基因组中,并在将腺病毒颗粒施用至经治疗的受试者时表达。大多数人暴露于人腺病毒并对其形成免疫力。因此,需要有效地将防治性或治疗性分子递送至人受试者,同时最小化预先存在的免疫力对人腺病毒血清型的影响的载体。猿腺病毒就这一点而言是有效的,因为人对猿病毒几乎不或不具有预先存在的免疫力,但这些病毒与人病毒足够密切相关以有效地诱发受预先存在的免疫力影响最小的强免疫应答(Vitelli etal.(2017)Expert Rev Vaccines 16:1241)。
疫苗接种是预防感染性疾病最有效的方法之一。疫苗通常经由肌内途径施用,但是已经报道了替代递送途径,例如皮内、口腔、黏膜等。已经显示通过黏膜途径递送基于腺病毒的疫苗可以规避预先存在的免疫力的影响并诱导针对编码抗原的显著免疫应答。例如,表达埃博拉(Ebola)并经口或鼻内递送的人腺病毒保护免受埃博拉攻击(Croyle etal.(2008)PLoS One 3:e3548)。
然而,配制用于黏膜施用的腺病毒疫苗提出了挑战。腺病毒必须以高浓度施用以在必需的小体积中达到有效剂量,并且必须在这些高浓度下保持稳定。疫苗的黏度必须足以维持与黏膜接触。关于舌下施用,唾液中的蛋白酶降解疫苗;唾液可以导致部分疫苗被吞咽,从而对于舌下黏膜造成损失;而舌下上皮的表面积相对较小。保留很困难,并需要相当大的努力来保持疫苗与上皮接触。因此,本领域中需要可以经黏膜施用的有效、稳定的疫苗配制剂。
发明概述
本发明提供具有生物黏附聚合物的疫苗配制剂,其增加病毒疫苗载体的保留并因此增加其吸收和渗透。本发明还提供了经由黏膜途径递送腺病毒以诱导抗原特异性体液和细胞免疫应答。
在实施方案中,本发明提供了组合物,其包含在包含猿腺病毒和一种或多种生物黏附剂的水性配制剂中的编码免疫原性转基因的重组猿腺病毒和生物黏附赋形剂。配制剂可以包含无定形糖。在具体实施方案中,无定形糖可以是海藻糖或蔗糖。它可以包含低浓度的盐。在具体实施方案中,生物黏附剂可以是泊洛沙姆,例如,普朗尼克,例如普朗尼克F-68、普朗尼克127或泊洛沙姆407;卡波姆,羟丙基甲基纤维素;水溶性壳聚糖或羧甲基纤维素(CMC)。在更具体的实施方案中,生物黏附剂是CMC或泊洛沙姆407。在甚至更具体的实施方案中,CMC的浓度为0.25%至5.0%、0.5%至5.0%,例如0.5%至4.0%。0.5%至3.0%、0.5%至2.5%、0.75%至4.0%、0.75%至3.0%、0.75%至2.5%、1.0%至4.0%、1.0%至3.0%、1.0%至2.5%、1.0%-2.0%、1.25%-1.75%或1.5%w/v。在另一个具体实施方案中,泊洛沙姆407的浓度为10%至30%,例如,10%至25%、15%至30%、15%至25%、15%至20%、20%至25%、18%至22%、19%至21%或20%(w/v)。
在本发明的实施方案中,载体可以经黏膜施用。在本发明的实施方案中,载体可以舌下施用。在本发明的实施方案中,载体可以经颊施用。
在本发明的实施方案中,以小体积施用腺病毒。因此,腺病毒是高度浓缩的,例如,以免疫有效浓度。可以以以下施用腺病毒,即本发明组合物中腺病毒的浓度为1012vp/ml、1011vp/ml、1010vp/ml、109vp/ml或108vp/ml。
在本发明的实施方案中,腺病毒与生物黏附剂一起配制。在实施方案中,腺病毒与Tris缓冲液一起配制。在实施方案中,腺病毒与组氨酸一起配制。在实施方案中,腺病毒与氯化钠一起配制。在实施方案中,腺病毒与氯化镁一起配制。在本发明的实施方案中,腺病毒与无定形糖一起配制。在实施方案中,腺病毒与表面活性剂一起配制。在实施方案中,腺病毒与维生素E琥珀酸盐/酯(VES)一起配制。在实施方案中,腺病毒与白蛋白一起配制。在实施方案中,腺病毒与乙醇一起配制。在实施方案中,腺病毒与乙二胺四乙酸(EDTA)一起配制。在实施方案中,腺病毒与聚乙二醇(PEG)一起配制。
在本发明的实施方案中,猿腺病毒与一种或多种生物黏附剂以比通常在可注射液体浓度中发现更高的病毒浓度一起配制。
附图说明
图1:HEK293细胞中猿腺病毒的稳定性通过感染性确定并通过六邻体ELISA测量。将病毒配制成配制剂1(圆圈)、配制剂2(正方形)、具有1.5%CMC的配制剂2(三角形)或具有20%普朗尼克的配制剂2(倒三角形),并在4℃下温育六个月。在14、30、60、90、120、150和180天测定每ml感染性颗粒的数目(ip/ml)。
图2:舌下(SL)或肌内(IM)施用包含狂犬病转基因(ChAd155-RG)的腺病毒后,猿腺病毒在小鼠中的免疫原性。在第4周(圆圈)、第8周(正方形)和第12周(三角形)测量病毒中和抗体。虚线表示抗狂犬病免疫的血清转换阈值。
图3:在存在或不存在佐剂的情况下舌下(SL)施用后和鼻内(IN)施用后,小鼠中对猿腺病毒的系统性IgG应答。在第4周(引发(prime)后)、第7周(加强前)和第8周(加强后)测量血清IgG。条形指示对RSV pre-F转基因的IgG血清滴度。
图4:舌下(SL)或鼻内(IN)施用包含RSV pre-F转基因的腺病毒后,小鼠中对猿腺病毒的系统性中和抗体反应。在第4周(空心柱)和第8周(阴影柱)测量病毒中和抗体并表示为ED60。虚线表示检测限,且条形上方的数字表示ED60。
图5:在存在或不存在佐剂的情况下舌下(SL)施用或鼻内(IN)施用后,小鼠中对猿腺病毒的分泌性IgA (sIgA)应答。在第4周(引发后)和第8周(加强后一周)通过ELISA测量唾液中的分泌性IgA。条形表示405nm处的光密度,对应于sIgA滴度。
图6:在舌下(SL)或鼻内(IN)施用后,在第4周(引发后)和第8周(加强后)通过IFNγELISpot在小鼠的脾和肺中测量对猿腺病毒的T细胞应答。结果表示为每106个淋巴细胞的斑点形成单位。
图7:在存在或不存在佐剂的情况下舌下施用后以及鼻内或肌内施用后,小鼠中对猿腺病毒的系统性IgG应答。在第4周、第8周、第12周(加强前)和第13周(加强后)测量血清IgG。条形指示抗pre-F IgG血清滴度。
图8:舌下(SL)或鼻内(IN)施用包含RSV pre-F转基因的病毒后,小鼠中对猿腺病毒的系统性中和抗体反应。在第4周(空心条)、第8周(浅点画)、第12周(增强前)(中等点画)和第13周(增强后)(深点画)测量病毒中和抗体。条形指示抗pre-F IgG血清滴度。
图9:在存在或不存在佐剂的情况下舌下(SL)施用、鼻内(IN)施用或肌内(IM)施用后,小鼠中对猿腺病毒的分泌性IgA应答。在第4周和第13周(加强后)测量分泌性IgA。条形指示450nm处的光密度,对应于sIgA滴度。
图10:血清IgG耗尽后的血清(系统性)IgA水平。在第4周、第8周、第12周(加强前)和第13周(加强后)测量血清IgA滴度。条形指示450nm处的光密度,对应于血清IgA滴度。
图11:舌下(SL)或鼻内(IN)施用后,通过IFNγELISpot在小鼠的脾和肺中测量对猿腺病毒的T细胞应答。结果表示为每106个淋巴细胞的斑点形成单位。
发明详述
构建体、抗原和变体
本发明提供了可用作免疫原性组合物组分的构建体,用于在受试者中诱导针对由感染性病原性生物体引起的疾病的免疫应答。这些构建体可用于抗原的表达、其在治疗中的使用方法以及其制造方法。“构建体”是经基因工程化改造的分子。“核酸构建体”是指经基因工程化改造的核酸并且可以包含RNA或DNA,包括非天然存在的核酸。在一些实施方案中,本文公开的构建体编码病原性生物体例如病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生物的野生型多肽序列、其变体或片段。
本发明的组合物可以在有或没有佐剂的情况下施用。替代地或另外地,组合物可以包含一种或多种佐剂(例如疫苗佐剂)或与其联合施用。
如本文所用,术语“抗原”是指含有一个或多个表位(例如,线性、构象或两者)的分子,其将刺激宿主的免疫系统产生体液应答,即B细胞介导的抗体产生,和/或细胞抗原特异性免疫应答,即T细胞介导的免疫。“表位”是决定其免疫特异性的抗原的部分。
多肽序列的“变体”包括与参考序列相比时具有一个或多个氨基酸添加、取代和/或缺失的氨基酸序列。变体可以包含与全长野生型多肽至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的氨基酸序列。或者,或除此之外,多肽的片段可以包含全长多肽的免疫原性片段(即含有表位的片段),其可以包含与全长多肽的连续氨基酸序列相同的至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少20或更多个氨基酸或由其组成。
为了比较两个密切相关的多核苷酸或多肽序列,可以使用比对程序,诸如(可在blast.ncbi.nlm.nih.gov获得,最后访问于2015年3月9日)使用标准设置计算第一序列和第二序列之间的“%同一性”。%同一性是相同残基的数目除以参考序列中的残基数目,乘以100。上述和权利要求中提到的%同一性数字是通过这种方法计算出的百分比。%同一性的替代定义是相同残基的数目除以比对残基的数目,乘以100。替代方法包括使用空位方法,其中比对中的空位,例如一个序列中相对于另一个序列的缺失,在评分参数中计入空位分数或空位成本。关于更多信息,参见情况说明书,其可在ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/factsheets/HowTo_BLASTGuide.pdf获得,最后访问于2015年3月9日。
保留多核苷酸或由其编码的多肽的功能的序列可能更接近相同。如果多肽或多核苷酸序列在其整个长度上共享100%的序列同一性,则称它们与其他多肽或多核苷酸序列相同或同一。
序列之间的“差异”是指与第一序列相比,第二序列的位置中单个氨基酸残基的插入、缺失或取代。两个多肽序列可以含有一个、两个或更多个此类氨基酸差异。在其他方面与第一序列相同(100%序列同一性)的第二序列中的插入、缺失或取代导致降低的序列同一性百分比。例如,如果相同序列是9个氨基酸残基长,则第二序列中的一个取代导致88.9%的序列同一性。如果相同序列是17个氨基酸残基长,则第二序列中的两个取代导致88.2%的序列同一性。如果相同序列是7个氨基酸残基长,则第二序列中的三个取代导致57.1%的序列同一性。如果第一和第二多肽序列是9个氨基酸残基长并且共享6个相同的残基,则第一和第二多肽序列共享大于66%的同一性(第一和第二多肽序列共享66.7%的同一性)。如果第一和第二多肽序列是17个氨基酸残基长并共享16个相同的残基,则第一和第二多肽序列共享大于94%的同一性(第一和第二多肽序列共享94.1%的同一性)。如果第一和第二多肽序列的长度是7个氨基酸残基长并且共享3个相同的残基,则第一和第二多肽序列共享大于42%的同一性(第一和第二多肽序列共享42.9%的同一性)。
或者,为了将第一参考多肽序列与第二比较多肽序列进行比较,可以确定为产生第二序列对第一序列进行添加、取代和/或缺失的数目。添加是将一个氨基酸残基添加到第一多肽的序列中(包括在第一多肽任一端的添加)。取代是用一个不同的氨基酸残基取代第一多肽的序列中的一个氨基酸残基。缺失是从第一多肽的序列中使一个氨基酸残基缺失(包括在第一多肽任一端的缺失)。
为了将第一参考多核苷酸序列与第二比较多核苷酸序列进行比较,可以确定为产生第二序列对第一序列进行添加、取代和/或缺失的数目。添加是将一个核苷酸残基添加到第一多核苷酸的序列中(包括在第一多核苷酸任一端的添加)。取代是用一个不同的核苷酸残基取代第一多核苷酸的序列中的一个核苷酸残基。缺失是从第一多核苷酸的序列中使一个核苷酸残基缺失(包括在第一多核苷酸任一端的缺失)。
适当地,本发明序列中的取代可以是保守取代。保守取代包括用具有与被取代的氨基酸相似化学性质的另一氨基酸取代氨基酸(参见,例如,Stryer et al,Biochemistry,5th Edition 2002,pages 44-49)。优选地,保守取代是选自由以下组成的组的取代:(i)用另一个不同的碱性氨基酸取代碱性氨基酸;(ii)用另一个不同的酸性氨基酸取代酸性氨基酸;(iii)用另一个不同的芳香族氨基酸取代芳香族氨基酸;(iv)用另一个不同的非极性脂肪族氨基酸取代非极性脂肪族氨基酸;和(v)用另一个不同的极性的、不带电荷的氨基酸取代极性的、不带电荷的氨基酸。碱性氨基酸优选地选自由精氨酸、组氨酸和赖氨酸组成的组。酸性氨基酸优选天冬氨酸或谷氨酸。芳香族氨基酸优选地选自由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸组成的组。非极性脂肪族氨基酸优选地选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸组成的组。极性的、不带电荷的氨基酸优选地选自由丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的组。与保守氨基酸取代相反,非保守氨基酸取代是将一个氨基酸与不属于上述保守取代(i)至(v)的任何氨基酸交换。
替代地或另外地,疫苗构建体的交叉保护广度可以通过包含抗原的中心点(medoid)序列而增加。“中心点”意指与其他序列具有最小相异的序列。替代地或另外地,本发明的载体包含蛋白质或其免疫原性片段的中心点序列。替代地或另外地,中心点序列衍生自在NCBI数据库中注释的所有相关蛋白质序列中具有最高平均氨基酸同一性百分比的天然病毒株。
由于遗传密码的冗余,多肽可以由多种不同的核酸序列编码。编码偏好于使用一些同义密码子,即编码相同氨基酸的密码子,多于其他密码子。“密码子优化”意指在不改变氨基酸序列的情况下对重组核酸的密码子组成进行修饰。密码子优化已用于通过使用生物体特异性密码子使用频率来改善不同生物体中的mRNA表达。
除了密码子偏倚,且与其无关,开放阅读框中密码子的并置不是随机的,并且一些密码子对比其他的更频繁使用。这种密码子对偏倚意味着一些密码子对代表过度和其他代表不足。“密码子对优化”意指在不改变单个密码子的氨基酸序列的情况下进行密码子配对的修饰。本发明的构建体可以包含密码子优化的核酸序列和/或密码子对优化的核酸序列。
“多肽”意指定义序列并通过酰胺键连接的多个共价连接的氨基酸残基。该术语可与“肽”和“蛋白质”互换使用,并且不限于多肽的最小长度。如本领域已知的,术语多肽还包括通过化学或酶催化反应引入的翻译后修饰。该术语可以指多肽的片段或多肽的变体,诸如添加、缺失或取代。
本发明的多肽可以是非天然存在的形式(例如重组形式或修饰形式)。本发明的多肽可以在C端和/或N端具有共价修饰。它们还可以采用各种形式(例如天然、融合、糖基化、非糖基化、脂化、非脂化、磷酸化、非磷酸化、肉豆蔻酰化、非肉豆蔻酰化、单体、多聚体、颗粒、变性等)。多肽可以是天然或非天然糖基化的(即多肽可以具有与在相应天然存在的多肽中发现的糖基化模式不同的糖基化模式)。
技术人员将认识到,改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比氨基酸的蛋白质的单独取代、缺失或添加是“免疫原性衍生物”,其中改变导致用功能相似的氨基酸取代氨基酸或不影响免疫原性功能的残基的取代/缺失/添加。
提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域公知的。一般而言,此类保守取代将属于以下规定的氨基酸分组之一,但在一些情况下,其他取代可以是可能的而基本上不影响抗原的免疫原性特性。以下八组各自包含通常彼此作为保守取代的氨基酸:
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);和
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)
适当地,此类取代不发生在表位区域中,并因此不会对抗原的免疫原性特性具有显著影响。
免疫原性衍生物还可以包括与参考序列相比插入了另外氨基酸的那些。适当地,此类插入不发生在表位区域中,并因此不会对抗原的免疫原性特性具有显著影响。插入的一个实例包括一小段组氨酸残基(例如2-6个残基)以帮助所讨论的抗原的表达和/或纯化。
免疫原性衍生物包括与参考序列相比缺失了氨基酸的那些。适当地,此类缺失不发生在表位区域中,并因此不会对抗原的免疫原性特具有显著影响。技术人员将认识到特定的免疫原性衍生物可以包含取代、缺失、插入和添加(或其任何组合)。
腺病毒
腺病毒是具有约36kb的线性双链DNA基因组的无包膜的二十面体病毒。腺病毒可以转导几种哺乳动物物种的多种细胞类型,包括分裂细胞和非分裂细胞两者,而不整合到宿主细胞的基因组中。人腺病毒载体目前用于基因疗法和疫苗,但具有在先前暴露于常见的人腺病毒之后,预先存在的免疫力在全球范围流行率高的缺点。猿腺病毒的优势在于它们与人病毒的关系足够密切相关,使得它们可以进入人细胞并递送转基因,但人几乎不或不具有预先存在的免疫力。
腺病毒具有二十面体衣壳的特征形态,该衣壳包含三种主要蛋白质,六邻体(II)、五邻体碱基(III)和突起纤维(knobbed fiber)(IV),以及许多其他次要蛋白质,VI、VIII、IX、IIIa和IVa2。六邻体占衣壳结构组分的大部分,所述衣壳由240个三聚体六邻体壳粒和12个五邻体碱基组成。六邻体有三个保守的双桶,且顶部有三个塔,每个塔含有来自形成大部分衣壳的每个亚基的环。六邻体的碱基在腺病毒血清型之间高度保守,而表面环是可变的。五邻体是另一种腺病毒衣壳蛋白;它形成纤维附着的五聚体碱基。三聚体纤维蛋白在衣壳的12个顶点的每个处从五邻体碱基突出并且是突起杆状结构。该纤维蛋白的主要作用是经由突起区域与细胞受体的相互作用将病毒衣壳拴系到细胞表面。柔性轴和纤维的突起区域的变化是不同腺病毒血清型的特征。
已经很好地表征了腺病毒基因组。线性双链DNA与强碱性蛋白VII和小肽pX(也称为mu)缔合。另一种蛋白质V与这种DNA-蛋白质复合物一起包装,并经由蛋白质VI提供与衣壳的结构连接。腺病毒基因组的整体组织中,关于类似定位(例如每种病毒的E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4和L5基因的位置)的特定开放阅读框,存在普遍的保守性。腺病毒基因组的每个末端包含称为反向末端重复(ITR)的序列,其是病毒复制所必需的。腺病毒基因组的5’末端含有包装和复制所必需的5’顺式元件;即,5’ITR序列(其可以发挥复制起点的功能)和天然5’包装增强子结构域,其含有包装线性腺病毒基因组和E1启动子的增强子元件所必需的序列。腺病毒基因组的3’末端包括包装和衣壳化所必需的3’顺式元件,包括ITR。该病毒还包含病毒编码的蛋白酶,其是加工产生感染性病毒粒子所需的一些结构蛋白所必需的。
基于宿主细胞转导后病毒基因表达的顺序来描述腺病毒基因组的结构。根据转录发生在DNA复制开始之前或之后,将病毒基因称为早期(E)或晚期(L)基因。在转导早期,表达腺病毒的E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4基因,为病毒复制准备宿主细胞。认为E1基因是主开关,它充当转录激活物参与早期和晚期基因转录。E2参与DNA复制;E3参与免疫调控,且E4调节病毒mRNA代谢。在感染晚期期间,激活编码病毒颗粒结构组分的晚期基因L1-L5的表达。晚期基因通过选择性剪接由主要晚期启动子(MLP)转录而来。
在历史上,腺病毒疫苗的开发主要集中在有缺陷的、非复制载体上。通过删除对复制必不可少的E1区基因使它们产生复制缺陷。通常,也删除非必需的E3区域基因以便为外源性转基因腾出空间。也可以删除E4区基因。然后插入包含受外源启动子控制的转基因的表达盒。然后在E1互补细胞中产生这些复制缺陷病毒。还描述了有复制能力的腺病毒(WO2019/076877)。本发明的腺病毒包括有复制能力和复制缺陷的猿腺病毒。
术语“复制缺陷的”或“无复制能力的”腺病毒是指不能够复制的腺病毒,因为已经将其工程化改造为包含至少功能缺失(或“功能丧失”突变),即损害基因功能而不完全去除基因的缺失或突变,例如人工终止密码子的引入、活性位点或相互作用结构域的缺失或突变、基因调控序列的突变或缺失等,或完全去除编码对病毒复制必不可少的基因产物的基因,诸如选自以下的一个或多个腺病毒基因:E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4(诸如E3 ORF1、E3ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8、E3 ORF9、E4 ORF7、E4 ORF6、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2和/或E4 ORF1)。适当地,删除E1和任选地E3和/或E4。如果已删除,在确定相对于另一序列的百分比同一性时,在比对中将适当地不考虑上述删除的基因区域。
术语“有复制能力的”腺病毒是指可以在不存在包含在细胞中的任何重组辅助蛋白的情况下,可以在宿主细胞中复制的腺病毒。适当地,“有复制能力的”腺病毒包含完整的结构基因和以下完好的或功能上必需的早期基因:E1A、E1B、E2A、E2B和E4。从特定动物中分离的野生型腺病毒在该动物中将是有复制能力的。
本发明的载体
“载体”是指相对于野生型序列已经基本上改变和/或掺入异源性序列的核酸,即从不同来源获得的核酸,并当引入细胞(即“宿主细胞”)时复制和/或表达插入的多核苷酸序列。在复制缺陷腺病毒的情况下,宿主细胞可以是E1、E3或E4互补的。本发明的载体可以包括任何遗传元件,包括裸DNA、噬菌体、转座子、黏粒、附加体、质粒或病毒组分。在本发明的腺病毒载体的实施方案中,腺病毒DNA能够进入哺乳动物靶细胞,即它是有感染性的。
本发明的载体可以含有猿腺病毒DNA。在一个实施方案中,本发明的腺病毒载体衍生自非人猿腺病毒,也称为“猿腺病毒”。已经从非人猿,诸如黑猩猩、倭黑猩猩、恒河猴、猩猩和大猩猩中分离出许多腺病毒。衍生自这些腺病毒的载体可以诱导对这些载体所编码的转基因的强免疫应答。基于非人猿腺病毒的载体的某些优点包括在人的靶群体中相对缺乏针对这些腺病毒的交叉中和抗体,因此它们的使用克服了对人腺病毒的预先存在的免疫力。
本发明的腺病毒载体可以衍生自非人猿腺病毒,例如衍生自黑猩猩(Pantroglodytes)、倭黑猩猩(Pan paniscus)、大猩猩(Gorilla gorilla)和猩猩(Pongoabelii和Pongo pygnaeus)。它们包括来自B组、C组、D组、E组和G组的腺病毒。黑猩猩腺病毒包括但不限于ChAd3、ChAd15、ChAd19、ChAd25.2、ChAd26、ChAd27、ChAd29、ChAd30、ChAd31、ChAd32、ChAd33、ChAd34、ChAd35、ChAd37、ChAd38、ChAd39、ChAd40、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd157、ChAdOx1、ChAdOx2和SAdV41。或者,腺病毒载体可以衍生自从倭黑猩猩分离的非人猿腺病毒,诸如PanAd1、PanAd2、PanAd3、Pan 5、Pan 6、Pan 7(也称为C7)和Pan 9或大猩猩,诸如GADNOU19和GADNOU20。载体可以全部或部分地包括编码非人腺病毒的纤维、五邻体或六邻体的核苷酸。
在本发明的实施方案中,载体是腺病毒载体的功能性或免疫原性衍生物。“腺病毒载体的衍生物”意指载体的修饰形式,例如载体的一个或多个核苷酸经缺失、插入、修饰或取代。此类猿腺病毒载体衍生自其中质粒载体所携带病毒基因组的分子克隆。使用衍生自细菌质粒的载体消除了可能由未鉴定的病原体污染的风险,这些病原体可能会在细胞培养中不引人注意地繁殖并导致对人接受体的伤害。
如前所述,复制缺陷载体的基因表达盒插入位点的选择主要集中在替换已知参与病毒复制的区域。有复制能力的载体的基因表达盒插入位点的选择必须保留复制机制。因此,有复制能力的病毒载体必须保留复制所需的序列,同时为功能性表达盒留出空间。
本发明载体的调节元件,即表达控制序列,包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列;高效的RNA加工信号,诸如剪接和聚腺苷酸化(poly A)信号包括兔β-珠蛋白polyA;四环素调节系统、微小RNA、转录后调节元件例如WPRE,土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件);稳定细胞质mRNA的序列;提高翻译效率的序列(例如,Kozak共有序列);增强蛋白质稳定性的序列;以及当期望时,增强编码产物的分泌的序列。
“启动子”是允许RNA聚合酶结合并指导基因转录的核苷酸序列。通常,启动子位于基因的非编码区,转录起始位点的近端。在启动转录中起作用的启动子内的序列元件通常特征在于共有核苷酸序列。启动子的实例包括但不限于来自细菌、酵母、植物、病毒和哺乳动物(包括猿和人)的启动子。大量的表达控制序列,包括内部的、天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的启动子,是本领域已知的并且可以利用。
本发明的启动子包括但不限于CMV启动子、β-肌动蛋白启动子,例如鸡β肌动蛋白(CAG)启动子、CASI启动子、人磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、TBG启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒LTR启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、EF1a启动子、锌诱导绵羊金属硫氨酸(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动系统、蜕皮激素昆虫启动子、四环素抑制系统、四环素诱导系统、RU486诱导系统和雷帕霉素诱导系统。
合适的启动子包括巨细胞病毒(CMV)启动子和CASI启动子。CMV启动子强大且有无处不在的活性。它具有在许多组织类型中驱动高水平转基因表达的能力并且是本领域公知的。CMV启动子可以用于本发明的载体中,具有或不具有CMV增强子。CASI启动子是合成启动子,将其描述为CMV增强子、鸡β-肌动蛋白启动子以及泛素(UBC)增强子侧翼的剪接供体和剪接受体的组合(US8865881)。
如本文所用,“转录后调节元件”是当转录时增强由本发明的病毒载体递送的转基因或其片段的表达的DNA序列。转录后调节元件包括但不限于乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)和土拨鼠肝炎转录后调节元件(WPRE)。WPRE是三方顺式作用元件,已经证明其增强由某些(但不是全部)启动子驱动的转基因表达。
本发明的载体可以包含用于递送期望的RNA或蛋白质序列,例如异源性序列,用于体内表达的转基因。“转基因”是与转基因侧翼的载体序列异源的核酸序列,其编码感兴趣的多肽。核酸编码序列以允许转基因在宿主细胞中转录、翻译和/或表达的方式与调节组分可操作地连接。在本发明的实施方案中,载体以治疗性或防治性水平表达转基因。转基因多肽的“功能衍生物”是多肽的修饰形式,例如,其中一个或多个氨基酸经缺失、插入、修饰或取代。“表达盒”包含转基因和转基因在宿主细胞中的翻译、转录和/或表达所必需的调节元件。
任选地,携带编码治疗上有用或免疫原性产物的转基因的载体还可以包含可选择的标志物或报告基因。报告基因可以选自本领域已知的那些。合适的报告基因包括但不限于增强绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、萤光素酶和分泌性胚胎碱性磷酸酶(seAP),其可以包括编码遗传霉素、潮霉素或嘌呤霉素抗性的序列等。此类可选择的报告基因或标志物基因(可以位于或可以不位于病毒基因组外以包装成病毒颗粒)可以用于标示细菌细胞中质粒的存在,诸如氨苄青霉素抗性。载体的其他组分可以包括复制起点。
除了转基因之外,表达盒还包括常规控制元件,其以允许转基因在用腺病毒载体转染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与转基因可操作地连接。如本文所用,“可操作地连接的”序列包括与感兴趣的基因连续的表达控制序列和以反式或在远距离作用以控制感兴趣的基因的表达控制序列两者。
转基因可以用于防治或治疗,例如作为诱导免疫应答的疫苗,以通过校正或替换缺陷或缺失基因来校正遗传缺陷,或作为癌症治疗剂。如本文所用,免疫应答的诱导是指蛋白质诱导对该蛋白质的T细胞和/或体液抗体免疫应答的能力。
由转基因诱发的免疫应答可以是产生中和抗体的抗原特异性B细胞应答。诱发的免疫应答可以是抗原特异性T细胞应答,其可以是系统性和/或局部应答。抗原特异性T细胞应答可以包括CD4+T细胞应答,诸如涉及表达细胞因子(例如干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和/或白细胞介素2(IL2))的CD4+T细胞应答。替代地,或另外地,抗原特异性T细胞应答包括CD8+T细胞应答,诸如涉及表达细胞因子(例如IFNγ、TNFα和/或IL2)的CD8+T细胞的应答。
转基因序列的组成将取决于所得载体的用途。在实施方案中,转基因是编码可用于生物学和/或医学的产物的序列,诸如防治性转基因、治疗性转基因或免疫原性转基因,例如蛋白质或RNA。蛋白质转基因包括抗原。本发明的抗原性转基因诱导对致病生物体的免疫原性应答。RNA转基因包括tRNA、dsRNA、核糖体RNA、催化RNA和反义RNA。有用的RNA序列的实例是在治疗的动物中使靶定核酸序列的表达消失的序列。转基因序列可以包括报告序列,其在表达时产生可检测信号。
本发明的载体是使用本文提供的技术结合本领域技术人员已知的技术生成的。此类技术包括cDNA常规克隆技术诸如在课文中描述的那些、腺病毒基因组的重叠寡核苷酸序列的使用、聚合酶链反应以及提供期望核苷酸序列的任何合适的方法。
改良痘苗病毒安卡拉
改良痘苗病毒安卡拉(MVA)是正痘(Orthopox)家族的成员,其衍生自皮肤痘苗株安卡拉并已减毒以用于人。通过连续传代进行减毒,因此,根据传代数目,有许多不同的毒株或分离株。本发明中的MVA是任何适用于人的减毒株。
已经描述了MVA的基因组组构(Virology(1998)244:365)。已知该病毒是高度免疫原性的。其优选作为加强而不是引发病毒,并且已描述为DNA疫苗的有效加强(US7384644)。
生物黏附配制剂
生物黏附剂增加配制剂对生物组织例如黏膜的黏附,并且还可以增强配制剂到组织中的渗透。这增加了腺病毒在黏膜处的停留时间。本发明的组合物包括生物黏附剂并且可以在缓冲水溶液中包括盐、无定形糖、表面活性剂、二价金属离子、金属离子螯合剂、组氨酸、维生素E琥珀酸盐/酯(VES)和重组人血清白蛋白(rHSA)中的一种或多种。
“生物黏附”是合成和天然大分子黏附在生物表面的过程,并且“黏膜黏附”是生物表面为黏膜组织时的生物黏附。本发明的生物黏附剂允许腺病毒掺入体内并且对其从黏膜释放到体循环中几乎不或不提供阻碍。如果将生物黏附剂掺入药物配制剂中,可以增强黏膜细胞的吸收或在该位点处的释放达延长的一段时间。在合成聚合物的情况下,生物黏附和黏膜黏附可以源自许多不同的物理化学相互作用。本发明的生物黏附剂及其降解产物应该是不可吸收的、对黏膜无刺激性的并且快速黏附到大多数组织上。在一些实施方案中,它们具有一定程度的位点特异性。
生物黏附剂例如,黏膜黏附剂可以通过改善在黏膜递送位点的停留时间来提高活性剂的生物利用度。这些药剂的优选特性是它们无毒、多数情况下不可吸收、对黏膜无刺激并且与上皮细胞表面形成强非共价键。优选地,它们快速黏附到组织上,对黏膜(例如口腔的黏膜)具有一些特异性,不阻碍活性疫苗组分从其配制剂中释放并且在疫苗的保质期内稳定。
适用于本发明的生物黏附剂包括聚氧乙烯、聚(乙二醇)(PEG);聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP);聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA);聚合混合物,例如普朗尼克,例如普朗尼克F-68、普朗尼克127和泊洛沙姆407(P407)(LUTROL);聚丙烯酸酯;卡波姆,例如卡波姆910、卡波姆934、卡波姆934P、卡波姆940、卡波姆941、卡波姆971P和卡波姆974P;聚卡波非;透明质酸;壳聚糖,例如壳聚糖、N-三甲基壳聚糖(TMC)和单-N-羧甲基壳聚糖(MCC);海藻酸盐;瓜尔豆胶;角叉菜胶;和衍生自纤维素的聚合物。纤维素成本低、可再生产地制造且是生物相容的。纤维素生物黏附剂包括羧甲基纤维素(CMC)、微晶线纤维素、氧化再生纤维素、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、甲基纤维素和羧甲基纤维素钠。生物黏附性羧甲基纤维素(CMC)是天然纤维素聚合物的化学衍生物。它不可消化,无毒,且无变应原性。
泊洛沙姆,也称为普朗尼克,是非离子三嵌段共聚物,由侧翼为两条聚氧乙烯亲水链的聚氧丙烯的中心疏水链组成。泊洛沙姆溶液以温度依赖性的方式自组装并展现出热凝胶行为。泊洛沙姆的浓缩水溶液在低温下为液体,并在较高温度下以可逆过程形成凝胶。在这些系统中发生的转变取决于聚合物组成(分子量和亲水/疏水摩尔比)。当与水混合时,泊洛沙姆的浓缩溶液可以形成易于挤出的水凝胶,并可以充当其他颗粒(例如载体)的载剂。
卡波姆是丙烯酸的合成高分子量聚合物。它们可以是丙烯酸的均聚物或与季戊四醇的烯丙醚、蔗糖的烯丙醚或丙烯的烯丙醚交联。
壳聚糖是无毒、生物相容的阳离子生物聚合物,通常通过甲壳质的碱性脱乙酰作用获得。它可以作为黏膜黏附剂,且增强上皮细胞的渗透性,从而增强吸收。壳聚糖打开黏膜屏障的紧密连接并促进亲水性大分子的细胞旁转运。它还具有对金属离子的螯合能力和对广泛范围的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及真菌的抗微生物作用。微晶壳聚糖(MCCh)比非晶壳聚糖具有更高的结晶度、氢键能和保水性。
适用于本发明的盐是由酸和碱的中和反应产生的离子化合物,且由相关数量的阳离子和阴离子组成,使得产物不带净电荷。组分离子可以是无机的或有机的,并且可以是单原子的或多原子的。在实施方案中,盐是NaCl。在实施方案中,配制剂中的盐浓度小于100mM、小于75mM、小于50mM、小于25mM、小于10mM、小于7.5mM或小于5mM。在特定实施方案中,盐是浓度为约5.0mM的NaCl。在另一个特定的实施方案中,盐是浓度为约75mM的NaCl。
适用于本发明的无定形糖可以选自蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、棉子糖、乳糖醇、乳糖酸、葡萄糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖、乳果糖、麦芽糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖醇、异麦芽糖醇(palatinit)、水苏糖、松三糖、右旋糖酐或其组合。在实施方案中,无定形糖是浓度为5-25%、10-20%、25-17%或约16%的蔗糖。在实施方案中,无定形糖是浓度为5-25%、10-20%、25-17%或约16%的海藻糖。
适用于本发明的表面活性剂包括选自以下的表面活性剂:泊洛沙姆表面活性剂(例如泊洛沙姆188)、聚山梨醇酯表面活性剂(例如聚山梨醇酯80和/或聚山梨醇酯20)、octoxinal表面活性剂、聚多卡醇表面活性剂、聚氧乙烯硬脂酸酯表面活性剂、聚氧乙烯蓖麻油表面活性剂、N-辛基-葡萄糖苷表面活性剂、聚乙二醇15羟基硬脂酸酯,及其组合。相对于水性混合物计算,表面活性剂可以以至少0.001%、至少0.005%、至少0.01%(w/v),和/或至多0.5%(w/v)的量存在。在实施方案中,表面活性剂选自泊洛沙姆表面活性剂(例如泊洛沙姆188)和聚山梨醇酯表面活性剂(例如聚山梨醇酯80和/或聚山梨醇酯20)。在实施方案中,表面活性剂是浓度为0.005-0.05%、0.01-0.04%、约0.02%或约0.25%的聚山梨醇酯80。
适用于本发明的二价金属离子包括Mg2+、Ca2+或Mn2+。在实施方案中,二价金属离子是盐形式的Mg2+、Ca2+或Mn2+(诸如MgCl2、MgSO4、CaCl2或MnSO4)。在特定实施方案中,二价金属离子是Mg2+。二价金属离子可以以0.05至5.0mM之间的浓度存在于水性混合物中。在实施方案中,二价金属离子是Mg2+盐MgCl2并且以约1.0mM的浓度存在。
适用于本发明的金属离子螯合剂包括乙二胺、乙二胺四乙酸(EDTA)、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、维生素B12和二巯基丁二酸。在实施方案中,金属离子螯合剂以小于0.5%(w/v)、小于0.25%(w/v)、小于0.1%(w/v)或小于0.05%(w/v)的量存在。在实施方案中,金属离子螯合剂是浓度为0.01-1.0mM、0.05-0.5mM或约0.1mM的EDTA。
本发明的配制剂还可以任选地包括浓度为1.0-50mM、5.0-25mM或约10mM的组氨酸。本发明的配制剂可以任选地包括浓度为0.005mM-0.5mM、0.01-0.1或约0.05mM的维生素E琥珀酸盐/酯(VES)。本发明的配制剂可以任选地包括浓度为0.01-1.0mM、0.05-0.5mM或约0.1mM的重组人血清白蛋白(rHSA)。
适用于本发明的缓冲剂包括Tris、琥珀酸盐/酯、硼酸盐/酯、马来酸盐/酯、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、柠檬酸盐/酯、碳酸盐/酯或其组合。缓冲液可以以至少0.5mM的量存在于水性混合物中。缓冲液可以以小于50mM的量存在于水性混合物中。水性混合物的pH为至少6.0且小于10。在实施方案中,缓冲剂是pH为6.5-9.5或7.0-9.0的Tris。在实施方案中,缓冲液是Tris pH7.4。在一个实施方案中,缓冲液是Tris pH8.4。在实施方案中,缓冲液是Tris pH8.5。
黏膜免疫
“黏膜”是覆盖身体部位内表面并产生黏液以保护它们的薄皮。它通常由覆盖在松散结缔组织层上的一层或多层上皮细胞组成。黏膜组织包括颊、结直肠、眼睑下、胃肠道、肺、鼻、眼、舌下和阴道组织。
虽然肠胃外疫苗接种可以通过诱导系统性应答来预防或治疗疾病,但黏膜免疫在病原体进入部位处诱导免疫。黏膜免疫应答包括分泌性IgA和细胞毒性T细胞,这两者都起着至关重要的作用。黏膜免疫的诱导通常需要有效的抗原递送到免疫诱导位点,其刺激先天免疫,进而产生适应性免疫应答。
黏膜疫苗递送为疫苗的肌内递送提供了几个优势。由于黏膜与身体外部相连,与肠胃外疫苗相比,黏膜疫苗在纯度略低的情况下可以有效且安全,因此其更容易生产。它们通常在低剂量下也有效,因此具有成本效益。黏膜疫苗是无针的,从而消除对肠胃外施用的疼痛和恐惧、重复使用的针头的感染风险和针头刺伤。它们不需要由训练有素的专业人员提供,因此可以更容易地传布甚至自行施用。
黏膜疫苗可以递送到口腔中,例如,舌下、颊或牙龈。舌下和颊黏膜具有非角化上皮,而牙龈黏膜覆盖有类似于皮肤的角化上皮。鼻-口-咽中的淋巴组织,例如扁桃体和腺样体,介导对经由这些途径呈递的抗原的免疫应答。这些淋巴组织,尤其是舌扁桃体,可以对递送到口腔黏膜的疫苗抗原进行取样,以诱导免疫应答。口腔上皮也富含树突状抗原呈递细胞。
颊和舌下黏膜的非角化上皮具有少量中性和极性脂质,诸如硫酸胆固醇和葡萄糖神经酰胺;不存在少量非极性脂质如神经酰胺和酰基神经酰胺。因此,它比角化上皮具有更大的渗透性。经由口腔途径的疫苗递送提供了穿过分层的鳞状非角化上皮层进入的抗原,该层比舌下层稍厚。口腔施用还靶向朗格汉斯细胞并诱导系统性应答。具有100-200μm厚度的舌下黏膜,比颊黏膜(厚度500-800μm)相对更薄且血管化更多,并且已经证明具有更高的渗透性。经舌下或颊递送的抗原靶向黏膜内的朗格汉斯细胞和固有层中的髓样树突细胞。
“颊”意指脸颊内层。“牙龈”意指齿龈、口黏膜或嘴唇的内表面。“舌下”意指舌的腹侧面或舌下方的口底。
经由舌下途径的疫苗递送提供了穿过非常薄的分层鳞状非角化上皮层快速进入的抗原,在那里它靶向朗格汉斯细胞并诱导系统性应答。舌下递送的抗原变得可用于舌下黏膜中密集的树突状细胞的网络。经舌下递送的有复制能力的病毒绕过肝,从而避免首过代谢,增加其持久性,从而潜在地产生更强的免疫应答。
舌下施用需要低体积,与口服施用相比减少了暴露于消化酶,并避免肠道。与鼻内疫苗相比较,舌下疫苗接种具有较低的中枢神经系统并发症的风险。舌下给药避免了低胃pH和肠酶降解的障碍,以及避免了口服给药遇到的首过肝脏代谢。舌下施用可以在舌下以滴剂形式施用,易于控制剂量且无需水。
尽管有这些优点,但迄今为止,还没有许可供人使用的用于感染性疾病的舌下疫苗。迄今为止,已经观察到舌下施用的不同反应。变量包括但不限于疫苗与舌下黏膜接触的时间、黏度和免疫原性的动力学。舌下疫苗已经显示是安全的,但并不总是有效。在一些情况下,已经观察到响应于舌下施用的系统性和黏膜免疫应答(Czerkinsky et al.(2011)Human Vaccines 7:110)。例如,无定形固体配制剂中的人腺病毒在舌下施用至啮齿动物时具有免疫原性(US 9675550),舌下施用的含佐剂卵清蛋白在小鼠中诱导抗体和T细胞应答(Cuburu et al.(2007)Vaccine 25:8598)以及舌下施用含佐剂的流感疫苗诱发黏膜和系统性免疫应答,后者与无佐剂的肌内疫苗接种等同(Gallorini et al.(2014)Vaccine 32:2382)。然而,用编码HIV蛋白的减毒痘苗病毒进行舌下免疫在防护免受病毒攻击方面无效(Thippeshappa et al.(2016)Clin Vaccine Immunol 23:204)。该文献还表明病毒疫苗载体的配制剂会影响其稳定性和效力。
药物组合物、免疫原性组合物和佐剂
本发明的组合物可以在向受试者施用之前配制成药物组合物。本发明提供了包含本发明的组合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
药物组合物可以具有介于200mOsm/kg和400mOsm/kg之间,例如240-360mOsm/kg之间,或290-310mOsm/kg之间的渗透压。药物组合物可以包括一种或多种防腐剂,诸如硫柳汞或2-苯氧乙醇。优选无汞的组合物,并且可以制备无防腐剂的疫苗。药物组合物可以是防腐的或无菌的。药物组合物可以是无热原的,例如每剂含有<1EU(内毒素单位),且优选每剂<0.1EU。药物组合物可以无谷蛋白。药物组合物可以以单位剂量形式制备。替代地或另外地,单位剂量可以具有0.1-2.0ml之间,例如约1.0或0.5ml的体积。
本发明的组合物可以经由任何已知的剂型递送。这些包括但不限于片剂、软膏剂、凝胶剂、贴剂和膜剂。
本发明的组合物可以在有或没有佐剂的情况下施用。替代地或另外地,组合物可以包含一种或多种佐剂(例如疫苗佐剂)或与其联合施用。
“佐剂”意指增强、刺激、激活、加强或调控对组合物活性成分的免疫应答的药剂。佐剂效应可以发生在细胞或体液水平或两者。佐剂刺激免疫系统对实际抗原的应答,但本身不具有免疫性效应。替代地或另外地,本发明的含佐剂组合物可以包含一种或多种免疫刺激剂。“免疫刺激剂”意指诱导受试者的免疫应答普遍、暂时增加的药剂,无论是与抗原一起还是单独施用。
本发明的佐剂可以增加黏膜和/或系统性免疫应答。它们可以包括,例如,大肠杆菌不耐热肠毒素突变体LTK63、α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)和单磷酰脂质A (MPL)。LTK63是不耐热肠毒素LT的无毒突变体。该突变消除了LT ADP核糖基化活性和相关毒性,同时保留了佐剂活性。认为LTK63是用于蛋白质抗原的鼻腔递送的强效黏膜佐剂,增强抗原特异性血清免疫球蛋白G(IgG)、分泌性IgA以及局部和系统性T细胞应答。它还促进黏膜免疫后对疫苗抗原的Th17应答;这种作用在黏膜表面处保护免受各种病原体方面具有关键作用。α-GalCer是自然杀伤(NK)T细胞的强效和特异性激活剂,并且是用于黏膜施用病毒载体疫苗和用于防护免受黏膜传播病原体的有效佐剂。在施用α-GalCer数小时内,NK细胞产生大量调节性和促炎性细胞因子。MPL是Toll样受体激动剂。
使用方法/用途
提供了诱导有此需要的受试者中针对病原性生物体的免疫应答的方法,其包括施用免疫有效量的如本文公开的构建体或组合物的步骤。一些实施方案提供了本文公开的构建体或组合物诱导有此需要的受试者中对抗原的免疫应答的用途。一些实施方案提供了如本文公开的构建体或组合物在制备诱导受试者中对抗原的免疫应答的药物中的用途。
在一方面,本发明提供了用作疾病或病症的治疗剂、防治剂或改善剂的本发明的组合物。在另一方面,本发明提供了用于治疗、防治或改善疾病或病症的本发明的组合物。在进一步的方面,本发明提供了用于制备用于治疗、防治或改善疾病或病症的药物的本发明的组合物。在又进一步的方面,本发明提供了治疗疾病或病症的方法,其包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明的组合物。
本发明的方法通过对受试者进行免疫或接种疫苗来诱导保护性免疫应答。因此,本发明可以应用于防治、治疗或改善由感染原引起的疾病。
可以单独或联合其他治疗剂采用本发明的组合物。根据本发明的联合疗法包括施用至少一种本发明的组合物和使用至少一种其他治疗活性剂。本发明的组合物和其他治疗剂可以在单一药物组合物中一起施用或分开施用。当分开施用时,这可以同时或以任何顺序依次发生。
“受试者”意指哺乳动物,例如,人或兽医哺乳动物。在一些实施方案中,受试者是人。
“引发”意指比起通过施用单一免疫原性组合物获得的免疫应答,当随后施用相同或不同的免疫原性组合物时,施用免疫原性组合物诱导更高水平的免疫应答。
“加强”意指在施用引发免疫原性组合物之后施用后续免疫原性组合物,其中后续施用产生比对单次施用免疫原性组合物的免疫应答更高水平的免疫应答。
“异源性引发加强”意指用抗原引发免疫应答,并随后用由不同分子和/或载体递送的抗原加强免疫应答。例如,本发明的异源性引发加强方案包括用RNA分子引发和用腺病毒载体加强以及用腺病毒载体引发和用RNA分子加强。
“免疫学有效量”是足以诱发足以对受试者产生有益作用的抗体或T细胞应答或两者的活性组分的量。
试剂盒
本发明提供了药物试剂盒,其用于立即施用免疫原性、防治性或治疗性方案以治疗由病原性生物体引起的疾病或病症。该试剂盒可以设计用于通过施用包含免疫有效量的一种或多种由猿腺病毒载体编码的抗原的引发疫苗和随后施用包含免疫有效量的一种或多种猿腺病毒所编码抗原的加强疫苗来诱导免疫应答的方法。
该试剂盒含有至少一种免疫原性组合物,该组合物包含编码抗原的猿腺病毒载体。该试剂盒可以含有每种组分载体的多个预先包装剂量,用于每种组分载体的多次施用。试剂盒的组分可以容纳于小瓶中。该试剂盒还包含在本文所述的引发/加强方法中使用免疫原性组合物的说明。它还可以含有进行与组分的免疫原性相关的测定的说明。试剂盒还可以含有赋形剂、稀释剂、佐剂、注射器、其他施用免疫原性组合物的适当方式或去污染或其他处置说明。
使用本文提供的技术结合本领域技术人员已知的技术生成本发明的载体。此类技术包括cDNA的常规克隆技术诸如在课文中描述的那些、腺病毒基因组的重叠寡核苷酸序列的使用、聚合酶链反应以及提供期望核苷酸序列的任何合适的方法。
除非另有说明,本文使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。除非上下文另有明确说明,单数术语“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。类似地,除非上下文另有明确说明,单词“或”旨在包括“和”。术语“多个”是指两个或更多个。此外,关于物质的浓度或水平,诸如溶液组分浓度或其比率,以及反应条件诸如温度、压力和循环时间,给定的数值限制旨在是近似的。与数值相关的术语“约”是任选的,且表示,例如量±10%。
术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”,例如,包含X的组合物可以仅由X组成或者可以包括另外的事物,例如X+Y。术语“基本上”不排除“完全”。例如,基本上不含Z的组合物可以完全不含Z。
现在将通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
实施例1:生物黏附配制剂中腺病毒的体外稳定性
在体外测试了腺病毒的生物黏附配制剂在4℃和37℃下以及冻融后的稳定性。通过定性PCR(qPCR)和用检测培养细胞中腺病毒六邻体蛋白的感染性测定来测量稳定性。使用具有缺失E1/E4基因区域并表达密码子对优化的狂犬病糖蛋白(G)的经基因修饰的复制缺陷型ChAd155载体(ChAd155-RGco2)评估生物黏附试剂对腺病毒稳定性的影响(WO2018/104919)。
通过在4℃的受控贮存温度下测量病毒制剂随时间的感染性,以实验的方式评估ChAd155病毒粒子在各种贮存介质中的降解。在HEK293细胞中使用六邻体ELISA测定确定感染性,该测定测量细胞感染后病毒六邻体蛋白的表达。稳定性表示为病毒感染细胞的能力。将病毒感染性定量为纯化配制病毒的每毫升感染性颗粒的数目(IP/ml)。使用与病毒基因组转基因表达盒中的区域杂交的探针,通过定量PCR(qPCR)计算配制病毒的VP/ml。
图1显示了ChAd155-RGco2在4℃下在单独的或添加有1.5%CMC或20%普朗尼克的10mM Tris pH7.4、75mM NaCl、5%蔗糖、0.02%聚山梨醇酯80、0.1mM EDTA、10mM组氨酸和1mM MgCl2(配制剂1)或10mM Tris pH8.5、5mM NaCl、10mM组氨酸、16%蔗糖、0.025%聚山梨醇酯80、1mM MgCl2、0.05mM维生素E琥珀酸盐/酯(VES)和0.1%重组人血清白蛋白(rHSA)(配制剂2)中六个月的稳定性。通过测量VP和IP的数目确定稳定性。如也对配制剂3(10mMTris pH8.4、5mM NaCl、16%海藻糖、0.02%聚山梨醇酯80、0.1mM EDTA)观察到的,病毒颗粒的数目没有随时间变化。
图1还证明CMC或泊洛沙姆407的添加不影响病毒稳定性。在4℃下,病毒在单独的或添加有CMC的配制剂1和配制剂2中是稳定的。当与泊洛沙姆407一起配制时,病毒保持稳定约1个月。
-80℃下冷冻和在室温下解冻后,在有或没有生物黏附试剂1.5%CMC或20%泊洛沙姆407的配制剂2中,如上述实验测量腺病毒的稳定性。在病毒颗粒的数目或它们的感染性方面,均未观察到由于这些生物黏附试剂中的任何一种的存在对稳定性的影响。
实施例2:生物黏附配制剂中腺病毒的体内免疫原性
为确定生物黏附剂对腺病毒免疫原性的影响,将1x109vp ChAd155-RGco2在配制剂2,具有1.5%CMC的配制剂2或具有20%泊洛沙姆407的配制剂2中配制。将7ul舌下递送至六只Balb/c小鼠中的每一只。作为对照,用配制剂2中的1x109vp ChAd155-RGco2对一组小鼠进行肌内免疫。通过荧光抗体病毒中和(FAVN)测试在疫苗接种后4、6和8周测定血清类中抗狂犬病病毒中和抗体(VNA)的滴度。
如图2中所示,舌下免疫的三组之间的抗狂犬病VNA滴度相当,表明配制剂中CMC或泊洛沙姆407的存在对狂犬病疫苗的免疫效力没有负面影响。所有舌下免疫的小鼠的滴度远高于血清转换阈值。正如预期,肌内递送诱导了高血清滴度。
实施例3.已知黏膜佐剂对猿腺病毒免疫原性的影响
实验1
猿腺病毒的舌下施用在小鼠中诱导黏膜部位处的免疫应答和可检测但低的系统性免疫应答。将佐剂LTK63和α-半乳糖苷神经酰胺(α-GalCer)掺入到配制剂2中,并在猿腺病毒舌下递送至BALB/c小鼠后确定它们对黏膜和系统性免疫应答的影响。首先,通过将病毒与佐剂混合并在感染细胞前温育两小时,模拟免疫当天所做的,在体外证实了与这些佐剂一起配制的腺病毒的稳定性。通过六邻体免疫染色在贴壁的Procell 92细胞中评估感染性,并证实这些佐剂不影响病毒的稳定性。
使用6.4x108vp的腺病毒ChAd155-dualRSV对三组Balb/c小鼠进行舌下免疫,并对一组进行鼻内免疫,所述ChAd155-dualRSV编码呼吸道合胞病毒(RSV)蛋白F、N和M2-1,这些蛋白由插入在病毒基因组的不同区域中的两个不同表达盒编码(PCT/EP2018/078212)。组1中的动物接受了7ul的在没有佐剂的情况下配制的病毒。组2中的动物接受了7ul的用5ugLTK63配制的病毒,且组3中的动物接受了7ul用5ugαGalCer配制的病毒。组4中的动物用相同剂量的没有佐剂的病毒疫苗经鼻内免疫。
引发剂量后七周,每组中一半的动物用4.5x106pfu改良的痘苗安卡拉病毒MVA-RSV加强,所述MVA-RSV编码与猿腺病毒引发载体相同的RSV抗原。加强载体在没有佐剂的情况下以7ul的体积递送,且加强后一周处死动物。在处死当天通过腹膜内注射10ug毛果芸香碱收集唾液。毛果芸香碱施用后约20分钟,小鼠开始分泌唾液。
图3证明经由舌下途径的免疫在4周(引发后)、7周(加强前)和8周(加强后)诱导系统性IgG应答。在包被有RSV F蛋白的板上通过ELISA在血清中测量IgG,并且将由疫苗接种诱导的抗F抗体的血清滴度表示为终点滴度。在舌下接种疫苗的动物中,用MVA-RSV加强对无佐剂载体的系统性IgG应答几乎不或不具有影响。在舌下接种疫苗的动物中用含佐剂载体的加强具有轻微的刺激作用。正如预期,鼻内途径在诱导血清IgG应答上非常有效。
图4显示了引发后(第4周)和加强后(第8周)的血清中和抗体(nAb)滴度。通过对Vero细胞的RSV-A微中和测定测量滴度。滴度(ED60)表示为提供斑块形成60%抑制的稀释度。舌下施用诱导了针对血清中抗原的中和性,即功能性抗体。在舌下免疫的动物中没有观察到佐剂的影响。
图5表明经由舌下途径的免疫在第4周(引发后)和第8周(加强后)诱导了分泌性IgA(sIgA)应答。在包被有RSV F蛋白的板上通过ELISA在1:6稀释的唾液中测量分泌性IgA,并表示为光密度(O.D.405)。在存在和不存在佐剂的情况下观察到sIgA应答。在第4周,佐剂LTK63将舌下疫苗接种的动物中的sIgA (sIgA)增加到与鼻内疫苗接种的动物相当的水平。加强后,sIgA的水平保持不变。在第4周,佐剂α-GalCer不增加舌下疫苗接种动物的sIgA,然而,在加强后,观察到与鼻内疫苗接种的动物相当的稳健sIgA应答。LTK63和α-GalCer两者都具有佐剂效应,但该效应不足以克服小鼠之间的个体差异。
猿腺病毒的舌下施用刺激抗原特异性T细胞应答,该应答通过加强和通过佐剂LTK63和α-GalCer得以放大。图6显示了由疫苗接种诱导的系统性(脾)和局部(肺)RSV特异性T细胞应答,在引发后四周和加强后一周时,使用对脾细胞和肺匀浆的IFNγELISpot测定来测量该应答。使用结合到夹有生物素化Ab和与碱性磷酸酶缀合的链霉亲和素的复合物的膜的IFNγ的捕获抗体,导致在抗原特异性细胞所在的膜上产生斑点的显色底物的沉淀,IFNγELISpot分析列举了分泌细胞因子IFNγ的抗原特异性T细胞。
如图6中所示,在4周时(引发后),腺病毒的舌下施用在脾和肺两者中都诱导了抗原特异性T细胞应答。与LTK63或α-GalCer一起配制腺病毒导致疫苗特异性T细胞在系统性(脾)和局部(肺)加强后更大地扩增。
实验2
然后在添加掺入到转基因的佐剂白介素1β(IL1β)的情况下进行类似的实验。用1.0x109vp的腺病毒ChAd155-dualRSV或具有插入转基因盒的IL1β的ChAd155-dualRSV(ChAd155-dualRSV-IL1β),对四组CB6小鼠经舌下免疫,对一组经鼻内免疫以及对一组经肌内免疫,如图下表中所示。所有动物在12周用4.5x106pfu MVA-RSV加强。
图7证明经由舌下途径的免疫诱导了可检测的系统性IgG应答。在第4、8、12(加强前)和13周(加强后),在包被有RSV F蛋白的板上通过IgG ELISA测量血清IgG。如在实验1中,没有观察到佐剂的明显作用,并且用MVA-RSV加强对系统性IgG应答几乎不或不具有影响。正如预期,鼻内和肌内途径在诱导血清抗体应答上非常有效。
图8证明舌下施用诱导了血清中针对抗原的中和性,即功能性抗体。如实验1中测量和表达中和抗体。在舌下免疫的动物中未观察到佐剂对系统性中和抗体的影响。
图9证明经由舌下途径的免疫在第4周(引发后)和第13周(加强后)两者均诱导分泌性IgA应答。如实验1中测量和表达唾液中的分泌性IgA。佐剂α-GalCer和IL1β增加了引发后的sIgA产生。含IL1β佐剂的腺病毒的舌下施用导致分泌性IgA唾液水平与通过鼻内施用的无佐剂腺病毒所诱导的那些水平相同。LTK63增加了加强后的sIgA产生。在不存在佐剂或存在α-GalCer或IL1β的情况下,用MVA加强不会增加sIgA产生。正如预期,肌内施用不会导致唾液IgA产生。
图10证明LTK63将血清IgA产生增加至与鼻内免疫相当的水平。在通过用蛋白G琼脂糖处理耗尽干扰血清IgG后,通过F蛋白ELISA测量按1:45稀释的血清IgA。将血清与树脂在室温下温育两小时,并在离心后分析上清液的特异性IgA含量。舌下施用之后,在第4、8和12周(加强前)以及第13周(加强后一周),LTK63将系统性IgA产生增加到与鼻内施用相当的水平。
图11显示了由疫苗接种诱导的系统性和局部RSV特异性T细胞应答,在4周(引发后)和加强后一周,使用对脾细胞和肺匀浆的IFNγELISpot测定来测量该应答。如图11中所示,在引发时与佐剂一起配制猿腺病毒导致加强后肺中疫苗特异性T细胞的更大扩增。佐剂诱发的T细胞应答的扩增在局部,即在肺中特别明显。
总之,通过黏膜途径递送的水性配制剂中的编码免疫原性转基因的猿腺病毒疫苗和生物黏附赋形剂可以在系统和局部都诱导分泌性IgA、系统性抗体应答和疫苗特异性T细胞应答。
Claims (33)
1.组合物,其包含在水性配制剂中的编码免疫原性转基因的重组猿腺病毒和生物黏附赋形剂。
2.权利要求1所述的组合物,其中所述生物黏附剂选自聚氧乙烯、聚(乙二醇)(PEG);聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP);聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA);普朗尼克;聚丙烯酸酯;卡波姆;聚卡波非;透明质酸;壳聚糖;海藻酸盐;瓜尔豆胶;角叉菜胶;以及衍生自纤维素的聚合物。
3.权利要求1或权利要求2所述的组合物,其中所述生物黏附剂是普朗尼克并且选自普朗尼克F-68、普朗尼克127和泊洛沙姆407。
4.前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述普朗尼克是泊洛沙姆407。
5.前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述生物黏附剂衍生自纤维素并且选自羧甲基纤维素(CMC)、微晶纤维素、氧化再生纤维素、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、甲基纤维素和羧甲基纤维素钠。
6.前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述衍生自纤维素的生物黏附剂是羧甲基纤维素(CMC)。
7.前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述组合物包含Tris、NaCl、无定形糖和表面活性剂。
8.前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述组合物进一步包含二价金属离子、EDTA、组氨酸、乙醇、维生素E琥珀酸盐/酯和白蛋白中的一种或多种。
9.权利要求1-6中任一项所述的组合物,其进一步包含Tris、NaCl、无定形糖和聚山梨醇酯表面活性剂。
10.前述权利要求中任一项所述的组合物,其进一步包含LTK63或α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)。
11.权利要求1-10中任一项所述的组合物,其中所述免疫原性转基因包含白介素1β(IL1β)。
12.组合物,其包含在水性配制剂中的编码免疫原性转基因的重组猿腺病毒和生物黏附赋形剂,用于疾病的防治或疗法。
13.权利要求12所述的组合物,其中所述生物黏附剂选自聚氧乙烯、聚(乙二醇)(PEG);聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP);聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA);普朗尼克;聚丙烯酸酯;卡波姆;聚卡波非;透明质酸;壳聚糖;海藻酸盐;瓜尔豆胶;角叉菜胶;以及衍生自纤维素的聚合物。
14.权利要求12或13所述的组合物,其中所述生物黏附剂是普朗尼克并且选自普朗尼克F-68、普朗尼克127和泊洛沙姆407。
15.权利要求12-14中任一项所述的组合物,其中所述普朗尼克是泊洛沙姆407。
16.权利要求12-14中任一项所述的组合物,其中所述生物黏附剂衍生自纤维素并且选自羧甲基纤维素(CMC)、微晶纤维素、氧化再生纤维素、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、甲基纤维素和羧甲基纤维素钠。
17.权利要求12-16中任一项所述的组合物,其中所述衍生自纤维素的生物黏附剂是羧甲基纤维素(CMC)。
18.权利要求12-17中任一项所述的组合物,其中所述组合物包含Tris、NaCl、无定形糖和表面活性剂。
19.权利要求12-18中任一项所述的组合物,其中所述组合物进一步包含二价金属离子、EDTA、组氨酸、乙醇、维生素E琥珀酸盐/酯和白蛋白中的一种或多种。
20.权利要求12-19中任一项所述的组合物,其中所述组合物进一步包含Tris、NaCl、无定形糖和聚山梨醇酯表面活性剂。
21.权利要求12-20中任一项所述的组合物,其中所述组合物进一步包含LTK63或α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)。
22.权利要求12-21中任一项所述的组合物,其中所述免疫原性转基因包含白介素1β(IL1β)。
23.诱导哺乳动物中免疫应答的方法,其通过向所述哺乳动物的黏膜施用在水性配制剂中的编码免疫原性转基因的重组猿腺病毒和生物黏附赋形剂。
24.在水性配制剂中的编码免疫原性转基因的重组猿腺病毒和生物黏附赋形剂在制备用于治疗感染性疾病的药物中的用途。
25.权利要求23或24所述的方法或用途,其中所述配制剂递送至颊、结直肠、眼睑下、胃肠道、肺、鼻、眼、舌下或阴道黏膜。
26.权利要求23-25中任一项所述的方法,其中所述生物黏附剂选自聚氧乙烯、聚(乙二醇)(PEG);聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP);聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA);普朗尼克;聚丙烯酸酯;卡波姆;聚卡波非;透明质酸;壳聚糖;海藻酸盐;瓜尔豆胶;角叉菜胶;以及衍生自纤维素的聚合物。
27.权利要求23-25中任一项所述的方法,其中所述组合物进一步包含NaCl、无定形糖、表面活性剂、二价金属离子、EDTA、组氨酸、乙醇、维生素E琥珀酸盐/酯和白蛋白中的一种或多种。
28.权利要求23-27中任一项所述的方法,其中所述生物黏附剂是普朗尼克。
29.权利要求28所述的方法,其中所述普朗尼克是泊洛沙姆407。
30.权利要求23-27中任一项所述的方法,其中所述生物黏附剂是衍生自纤维素的聚合物。
31.权利要求30所述的方法,其中所述衍生自纤维素的聚合物是羧甲基纤维素(CMC)。
32.权利要求23-31中任一项所述的方法或用途,其中所述组合物进一步包含LTK63或α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)。
33.权利要求23-32中任一项所述的方法或用途,其中所述免疫原性转基因包含白介素1β(IL1β)。
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