CN113960023B - 一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法，包括将含巯基L‑半胱氨酸、水、0.8％的琼脂溶液按比例混合成1mL溶液加入到容量为2mL玻璃小瓶中，冷却后形成无色透明凝胶基底，向其上方加入0.3mL待检测水样，用瓶盖封口后放入金属浴中孵育后取出，吸取上层溶液，再加入HAuCl4溶液，封瓶后再次放入金属浴孵育后取出能在凝胶上层看见颜色明显的色带，对比未加Hg(Ⅱ)形成的色带，颜色一致证明水体中不含Hg(Ⅱ)或含量在检出限之下，颜色不一致证明水体中Hg(Ⅱ)含量在检出限之上。本发明提供的利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法，形成的色带与未加Hg(Ⅱ)形成的色带对比明显，可以达到对Hg(Ⅱ)检测的目的，对于Hg(Ⅱ)的检出限降至0.01μM。
Description
技术领域
本发明属于重金属离子浓度检测技术领域，特别是涉及一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法。
背景技术
重金属非常难以被生物降解，相反却能在食物链的生物放大作用下，成千百倍地富集，最后进入人体。重金属在人体内能和蛋白质及酶等发生强烈的相互作用，使它们失去活性，也可能在人体的某些器官中累积，造成慢性中毒。如何治理污水中的重金属离子成为治理环境水污染中的重中之重。在环境监测方面，对重金属离子识别的大多数可视方法都是基于等离子体纳米材料的聚集思路，这种聚集可能受到局域表面等离子体共振(LSRP)效应产生的响应性光吸收的影响。与金纳米粒子的大小和形状相关的颜色有助于比色分析和肉眼识别，但纳米探针的稳定性和抗干扰能力较弱，水相分析容易受到限制。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法。该方法通过以HAuCl4溶液为目视指标的变色凝胶可以实现环境分析中水质的快速初步评价。本发明所采用的技术方案是：
一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法，将含巯基L-半胱氨酸10μL、水490μL、0.8％的琼脂溶液500μL混合成1mL溶液加入到容量为2ml的样品瓶中，冷却后形成无色透明凝胶基底，向其中加入含0.01μMHg(Ⅱ)的300μL水样，用瓶盖封口后放入金属浴在40℃孵育60min后取出，吸取上层溶液，再加入300μL0.3mMHAuCl4，封瓶后再次放入金属浴在40℃孵育60min后取出能看见颜色明显的色带，对比未加Hg(Ⅱ)形成的色带，颜色一致证明水体中不含Hg(Ⅱ)或含量在检出限之下，颜色不一致证明水体中Hg(Ⅱ)含量在检出限之上。
其中，含巯基L-半胱氨酸的c＝10mM。
本发明的优点如下：
本发明提供的利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法，形成的色带与未加Hg(Ⅱ)形成的色带对比明显，可以达到对Hg(Ⅱ)检测的目的，对于Hg(Ⅱ)的检出限降至0.01uM。实现了高灵敏度、高抗干扰的Hg(Ⅱ)的可视化和便携式检测。在肉眼识别的基础上，可以快速、简便地测定Hg(Ⅱ)。这种非水相传感具有操作简单、重复性和可靠性高的优点，在实验室传感策略、商业化等方面具有很大的潜力。并且纳米材料在非水体系中的原位生长可以消除共存物质可能存在的影响，未来有望可用于疾病诊断和环境监测。
附图说明
图1是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的不加含Hg(Ⅱ)水样、HAuCl4浓度不同的样品示意图(由左到右：1-8号样品孵育的HAuCl4浓度为0.05mM，1号水样不含Hg(Ⅱ)，2-8号水样所含Hg(Ⅱ)的浓度分别为：0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5mM)；
图2是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的0.5mMHAuCl4下不同浓度Hg(Ⅱ)存在下色带形成情况的示意图(由左到右：1-8组)；
图3是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的5mMHAuCl4下不同浓度Hg(Ⅱ)存在下色带形成情况的示意图(由左到右：1-8组)；
图4是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的没有Hg(Ⅱ)出现的色带颜色差别的示意图(由左到右：1-5组)；
图5是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的是有Hg(Ⅱ)出现的色带颜色差别的示意图(由左到右：1-5组)；
图6是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的吸出上层溶液前的示意图(由左到右为1-4组)；
图7是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的吸出上层溶液后的示意图(由左到右为1-4组)；
图8是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的0.3mMHAuCl4不同浓度Hg(Ⅱ)形成的色带的示意图(由左到右：1-9)；
图9是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的0.4mMHAuCl4不同浓度Hg(Ⅱ)形成的色带的示意图(由左到右：1-9)；
图10是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的0.1mMHAuCl4不同浓度Hg(Ⅱ)形成的色带的示意图(由左到右：1-7)；
图11是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的0.2mMHAuCl4不同浓度Hg(Ⅱ)形成的色带的示意图(由左到右：1-7)；
图12是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的0.5mMHAuCl4不同浓度Hg(Ⅱ)形成的色带的示意图(由左到右：1-6)；
图13是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的0.1μMHg(Ⅱ)下不同浓度L-半胱氨酸形成的色带的示意图(由左到右：1-8)；
图14是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的0.2mMHAuCl4不同浓度Fe(Ⅲ)形成的色带的示意图(由左到右：1-5)；
图15是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的0.3mMHAuCl4不同浓度Fe(Ⅲ)形成的色带的示意图(由左到右：1-5)；
图16是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的0.05mMHAuCl4不同浓度Ca(Ⅱ)、Mg(Ⅱ)形成的色带的示意图(由左到右：1-5)；
图17是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的不同温度下色带形成情况的示意图(由左到右：1-4，每一组前为不加Hg(Ⅱ)，后为加入0.1μMHg(Ⅱ))；
图18是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的40℃孵育下不同时间有无Hg(Ⅱ)的色带形成情况的示意图；
图19是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的50℃孵育下不同时间有无Hg(Ⅱ)的色带形成情况的示意图；
图20是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的60℃孵育下不同时间有无Hg(Ⅱ)的色带形成情况的示意图；
图21是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的基于已开发的原位生长方法的Hg2+识别，(a)利用半胱氨酸-琼脂糖凝胶检测样品的过程；(b)用不同浓度的Hg2+离子处理半胱氨酸-琼脂糖凝胶，再用0.5mMHAuCl4孵化，显示出可分辨的色带，样品2至8中Hg2+离子的浓度为0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM、5.0mM；(c)该图表明基于半胱氨酸-琼脂糖水凝胶的高通量分析；(d)通过酶标仪温育0.000mM至1.000mM范围内的各种浓度的Hg2+后，半胱氨酸-琼脂糖水凝胶的吸收光谱；
图22是本发明所述一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法的高通量检测有毒金属离子，(a和b)孵化不同的金属离子后，HAuCl4染色的半胱氨酸-琼脂糖凝胶的吸收曲线和数据分析；(c)用于识别不同金属离子(1-7：Pb2+，Al3+，Mn2+，Cu2+，Cr3+，Ba2 +和Ni2+；8：对照样品)；(d)利用酶标版代替样品瓶，溶液体积减少十倍，观察到该方案对不同金属离子的变色响应(金属离子浓度均为100nM)；(e)在其他金属离子存在条件下，不同浓度倍数的金属离子对Hg2+响应的影响(Hg2+离子浓度为100nM)。
具体实施方式
下面对本发明作进一步的说明，但本发明并不局限于这些内容。
1、实施例
一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法，将含巯基L-半胱氨酸10μL、水490μL、0.8％的琼脂溶液500μL混合成1mL溶液加入到2ml样品小瓶中，冷却后形成无色透明凝胶基底，向其中加入含0.01μMHg(Ⅱ)的300μL水样，用瓶盖封口后放入金属浴在40℃孵育60min后取出，吸取上层溶液，再加入300μL0.3mMHAuCl4，封瓶后再次放入金属浴在40℃孵育60min后取出能看见颜色明显的色带，对比未加Hg(Ⅱ)形成的色带，颜色一致证明水体中不含Hg(Ⅱ)或含量在检出限之下，颜色不一致证明水体中Hg(Ⅱ)含量在检出限之上。
其中，含巯基L-半胱氨酸的c＝10mM。
2、前期研究：
2.1未加Hg(Ⅱ)，在不同浓度HAuCl4下L-半胱氨酸还原形成的色带情况：
结论：从图1中可以看出高低浓度HAuCl4的情况下形成的色带都比较清晰明显，因此高低浓度各选一组进行后续探究——高浓度HAuCl4：5mM；低浓度HAuCl4：0.5mM。
2.2在0.5mM和5mMHAuCl4下分别探究不同浓度汞(Ⅱ)存在下色带形成情况
结论：如图3所示，5mMHAuCl4在有Hg(Ⅱ)的后七组中形成的色带都宽，Hg(Ⅱ)浓度低时(2、3组)形成的色带颜色区别小，不符合降低检出限的初衷，如图2所示，0.5mMHAuCl4下色带窄、颜色清晰、低浓度Hg(Ⅱ)时颜色区别明显，于是选择0.5mMHAuCl4开展后续试验。
3、检出限优化过程
根据前期结果，定【基底：L-半胱氨酸(c＝10mM，V＝10μL)；水(V＝490μL)；琼脂糖溶液(w＝0.8％，V＝500μL)】；HAuCl4(c＝0.5mM，V＝200μL)；T＝40℃；t＝60min(两次孵育都是)为初始条件，在此基础上进行优化以探究该检测方法对Hg(Ⅱ)的最低检出限。根据图2和图3可知，在初始条件下水样中含0.05mM的Hg(Ⅱ)就可以被检测到，即在此条件下，检出限≤0.05Mm。由于L-半胱氨酸可以还原Fe(Ⅲ)，可能形成与Hg(Ⅱ)存在时相同的色带，因此也需探究Fe(Ⅲ)的影响。以下实验将从L-半胱氨酸、水、琼脂糖溶液的体积比(即优化L-半胱氨酸的浓度)，HAuCl4的浓度，孵育温度，孵育时间和Fe(Ⅲ)的影响这五个方面进行探究优化。
3.1优化HAuCl4的浓度：
以HAuCl4浓度从0.1-0.5mM，Hg(Ⅱ)为0.05mM做五组并做不加Hg(Ⅱ)为对照组，观察在哪一个浓度下加Hg(Ⅱ)和不加Hg(Ⅱ)出现的色带颜色差别最大。
结论：如图4和图5所示，当HAuCl4浓度为0.1mM和0.5mM(1、5组)，Hg(Ⅱ)为0.05mM时，有无汞的色带颜色相近，区别不大。2组色带颜色浅，因此选择3、4组进行后续优化。
3.2优化L-半胱氨酸的浓度：
不改变配制的L-半胱氨酸的浓度，改变基底中L-半胱氨酸的体积。
结论：如图6和7所示，1-4组浓度的L-半胱氨酸孵育结束后上层溶液中都出现了絮状物质，1、2、3组絮状颜色明显，吸出上层溶液后，絮状物质附着在凝胶表面，凝胶层几乎无颜色。因此这四组L-半胱氨酸浓度偏高。
3.3在3.1的实验结果下优化对Hg(Ⅱ)的检出限：
3.3.1选择HAuCl4浓度为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM，分别探究能检测到的最低浓度的Hg(Ⅱ)：
结论：如图10-图12，当HAuCl4浓度为0.1mM时，上述样品基本都无颜色，当HAuCl4浓度为0.2mM时，Hg(Ⅱ)为50μM时才有明显颜色变化；当HAuCl4浓度为0.3mM和0.4mM时，各对应浓度的样品颜色比较相近，HAuCl4浓度为0.3mM时，Hg(Ⅱ)为0.01μM形成的色带颜色与不加Hg(Ⅱ)(用水代替)对比很明显，HAuCl4浓度为0.4mM时，Hg(Ⅱ)为0.01μM时颜色与不加Hg(Ⅱ)对比不明显；当HAuCl4浓度为0.5mM时，Hg(Ⅱ)为0，0.1，1μM时颜色相近，当Hg(Ⅱ)为10mM时颜色与不加Hg(Ⅱ)差别明显。考虑到降低检出限，选择HAuCl4浓度为0.3mM，此时能检测到的Hg(Ⅱ)浓度为0.01μM。
3.4在3.2和3.3的结果基础上继续优化L-半胱氨酸的浓度。
结论：如图13所示，当L-半胱氨酸为1和3μL时，色带颜色过浅，不利于判断；当L-半胱氨酸为6和8μL时，色带颜色也比较浅；当L-半胱氨酸为20和30μL时，色带窄且形成絮状物质浮在凝胶表面；当L-半胱氨酸为10和15μL时色带颜色相似，宽窄相同。但可以发现，当L-半胱氨酸体积逐渐增大，色带越逐渐变窄，上层清液中形成产生絮状物质并浮在凝胶基底表面，因此选择L-半胱氨酸为10μL，有利于现象的判断。
3.5探究Fe(Ⅲ)的影响：
L-半胱氨酸可以和Fe(Ⅲ)反应，会干扰Hg(Ⅱ)产生的色带，因此对Fe(Ⅲ)是否需要掩蔽和要掩蔽的浓度进行探究。
结论：如图14和图15所示，0.2mMHAuCl4下，Fe(Ⅲ)为0、0.05、0.1、1、10μM时形成的色带颜色都很浅。0.3mMHAuCl4下，Fe(Ⅲ)为0.05μM与只加水对比颜色已有明显差异，故会影响Hg(Ⅱ)的检测。所以当HAuCl4浓度为0.3mM，L-半胱氨酸为10μL，若Fe(Ⅲ)为0.05μM及以上，就需要掩蔽Fe(Ⅲ)。
在探究Fe(Ⅲ)时，也探究了Ca(Ⅱ)、Mg(Ⅱ)，选择的浓度为10mM，结果表明，Ca(Ⅱ)、Mg(Ⅱ)即使是10mM，也不会影响Hg(Ⅱ)的检测，结果如图16：由左到右的色带，分别是第一次孵育加入了各300μL的H2O、浓度为0.05mM的Hg(Ⅱ)，浓度为10mM的Mg(Ⅱ)，浓度为10mM的Ca(Ⅱ)，浓度为10mM的Fe(Ⅲ)；第二次孵育加入300μL0.5mM的HAuCl4，两次孵育时间都是60min，温度都是40℃，基底为10μLL-半胱氨酸+490μLH2O+500μL琼脂糖溶液。可以看出浓度≤10mM的Ca(Ⅱ)、Mg(Ⅱ)的存在不会影响到Hg(Ⅱ)的检测，但是Fe(Ⅲ)会，之前探究发现Al(Ⅲ)也会有这个现象，因此Fe(Ⅲ)Al(Ⅲ)在检测Hg(Ⅱ)需要加入合适的掩蔽剂掩蔽。
3.6优化检测温度：
查阅资料可知琼脂糖的熔点在62～65℃之间，因此选择40℃，50℃，60℃和70℃这四个温度进行优化。
注：对于第4组(70℃)，孵育10min后发现凝胶基底已融化，之后未继续孵育。
结论：从图17中可以看出，孵育时间相同时，当孵育温度升高，色带颜色加深，但是40℃有无Hg(Ⅱ)形成的色带颜色对比更强烈。
3.7优化检测时间：
保持第一次孵育时间为60min，探究加入HAuCl4后第二次孵育不同时间色带的形成情况。
结论：如图18所示，40℃，10min时有无Hg(Ⅱ)基本无区别；20min时能看出区别，但色带颜色较浅；30min色带颜色加深，颜色对比明显；40℃颜色更深，对比更加明显；50min色带已稳定，色带颜色和宽窄与60min基本一致。
结论：如图19所示，50℃，10min时有无Hg(Ⅱ)可以看出色带颜色区别；20min时区别加深；之后色带颜色逐步加深，40min时色带状态已基本稳定。
结论：如图20所示，60℃，10min时有无Hg(Ⅱ)色带区别已经明显，之后随着孵育时间的增加，色带颜色加深。
由3.6和3.7的探究可得，温度会影响色带的颜色，温度升高，色带形成稳定时所用的孵育时间缩短。
与水相系统相比，固体水凝胶基质可避免盐分对样品的干扰，从而使检测方法具有很高的可重复性。本文提出了利用L-半胱氨酸掺杂的琼脂糖水凝胶来检测水中的重金属离子的方案(如图21所示)。由于Hg2+离子与巯基之间的强相互作用，其对HAuCl4在水凝胶中的还原会产生影响，实验利用这一特性来识别Hg2+离子。首先，将含Hg2+离子的样品溶液添加至制备好的L-半胱氨酸掺杂的琼脂糖水凝胶上方，进行孵化，该样品溶液包含浓度范围为0.05mM至5.00mM的Hg2+离子(如图21所示)。随着Hg2+离子浓度的增加，金纳米颗粒带的颜色从红色变为紫色；当Hg2+离子的浓度高于1.0mM时，颜色变为蓝色；而在5mM的高浓度下会明显观察到黄绿色带，这可能是由于半胱氨酸-Hg2+离子结合物的形成，从而完全阻止了生长金纳米颗粒的生长。
除Hg2+离子外，半胱氨酸的巯基还可能与其他金属离子结合，且也可能会影响金纳米颗粒的生长。因此，本文提出的半胱氨酸-琼脂糖凝胶测定法也可用于识别其他金属离子，这些金属离子包含Pb2+，Al3+，Mn2+，Cu2+，Cr3+，Ba2+和Ni2+。研究记录了上述离子的紫外可见吸收光谱(如图21所示)，还列出了这些离子在孵化后染色的半胱氨酸-琼脂糖凝胶的吸收峰(如图21所示)。在Pb2+，Al3+，Cu2+的存在下，HAuCl4浸入的半胱氨酸-琼脂糖凝胶的吸光度逐渐降低；此外，当凝胶与Al3+和Pb2+一起孵化时，吸收峰出现红移，从536nm分别移至551nm和565nm；Cr3+，Ba2+和Ni2+对金纳米颗粒的色带没有干扰。此外，研究还发现Pb2+，Al3+，Mn2+，Cu2+离子可能会干扰金纳米颗粒色带的形成(如图21所示)。因此，对于废水中的可与巯基作用的未知重金属离子的监测，HAuCl4染色水凝胶测定法经过后续优化，有潜力发展成为一种重要的分析策略。
综上所述：选择基底为10μLL-半胱氨酸+490μLH2O+500μL琼脂糖溶液，第一次加入含0.01μMHg(Ⅱ)的300μL水样40℃孵育60min，孵育结束后吸出上层溶液，加入300μL0.3mMHAuCl4，在40℃下再次孵育60min。在此条件下形成的色带与未加Hg(Ⅱ)形成的色带对比明显，可以达到对Hg(Ⅱ)检测的目的。对于Hg(Ⅱ)的检出限降至0.01μM。
指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法，其特征在于：将含巯基L-半胱氨酸、水、0.8％的琼脂溶液按比例混合成1mL溶液加入到容量为2ml样品瓶中，冷却后形成无色透明凝胶基底，向其中加入待检测水样，用瓶盖封口后放入金属浴孵育后取出，吸取上层溶液，再加入HAuCl4溶液，封瓶后再次放入金属浴孵育后取出能看见颜色明显的色带，对比未加Hg(Ⅱ)形成的色带，颜色一致证明水体中不含Hg(Ⅱ)或含量在检出限之下，颜色不一致证明水体中Hg(Ⅱ)含量在检出限之上；
其中，巯基L-半胱氨酸、水、0.8％的琼脂溶液的体积分别为10μL、490μL、500μL，巯基L-半胱氨酸的c＝10mM；两次孵育条件均为T＝40℃、t＝60min；HAuCl4溶液的量为300μL0.3mM HAuCl4。
2.根据权利要求1所述的一种利用凝胶实现水样中重金属离子浓度快速检测的方法，其特征在于：所述的待检测水样为含0.01μM Hg(Ⅱ)的300μL水样。
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