CN113957090A - 一种盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物及其在防晒霜中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防晒霜中应用的Zn‑盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物，该复合物包括Zn‑盐穗木金属硫蛋白HcMT和TiO2纳米颗粒。本发明通过SDS‑PAGE鉴定表达融合蛋白、优化纯化工艺和制备工艺得到TiO2‑Zn‑HcMT复合物粉末，考察Zn‑HcMT粗蛋白的抗氧化性，其对·OH、O2‑·和DPPH等自由基具有较强的清除活性，且总抗氧化能力优异，同时具备一定的还原力，利用其优异的抗氧化性，采用SEM和FTIR表征Zn‑HcMT/TiO2，Zn‑HcMT/TiO2复合物在防晒霜中的抗紫外线能力较有机材料包覆的TiO2显著提升，清除羟自由基、超氧阴离子和DPPH自由基及总抗氧化能力显著增强，可见二者复合具有协同增效作用，解决了TiO2纳米颗粒在防晒霜中应用的问题，在化妆品领域的应用潜力巨大，是一种高效安全的化妆品活性成分。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，本发明涉及一种盐穗木金属硫蛋白复合物及应用的技术领域。
技术背景
金属硫蛋白(Metallothionein,MT)是一类普遍存在于生物体内的富含半胱氨酸的低分子量(6-7Kd)的多功能诱导性蛋白，金属硫蛋白在进化上具有高度的保守性，可根据金属离子含量和氨基酸组成的不同分为MT-I、MT-II、MT-III 及MT-IV四种亚型，MT参与体内各种重要生理活动，如重金属解毒，清除自由基，调节体内微量元素浓度，并且在抗肿瘤，抗凋亡，激素调节和细胞代谢及增殖分化过程中都扮演了重要角色，自1957年美国学者Mackay等首次从马肾中发现并分离出MT以来，科研工作者们陆续从动物、植物和微生物中都分离得到了MT，且在不同物种的组织器官中分离得到的MT在结构和数量上有些许不同，MT能选择性的螯合金属离子，并且每个MT分子内大多含有7-12个金属离子。盐穗木(Halostachys caspica)隶属于藜科(Chenopodiaceae)盐穗木属(HalostachysC.A.Mey)，是沙漠盐碱地常见的一种良好牧草，其含有鞣质、生物碱、多酚、皂苷、黄酮等多种化学活性成分，具有保护肝脏和提高生长性能的作用。发明人前期在专利号为2013105667426、201510703926.1和 201910679114.6等中公开了制备盐穗木金属硫蛋白的方法，其表达的HcMT可以形成单个金属-硫醇盐簇，能够通过十四个半胱氨酸残基结合五个二价金属离子的能力，ZnSO4存在下生长的大肠杆菌细胞中纯化的蛋白HcMT可以结合更多的金属离子，且HcMT自身螯合Zn2+，形成Zn-HcMT，Zn-HcMT是否具有清除自由基能力尚待研究，能否应用于防晒霜也未见报道。
TiO2纳米颗粒(TiO2 Nanoparticles，TiO2 NPs)已广泛应用于工业和消费品中，它还具有光催化活性、抗菌活性和抗紫外线能力，这些特性使其成为了防晒霜成分的理想添加剂，然而纳米级TiO2由于粒径小，表面能较大，存在易团聚、分散性不佳的缺点，需要对其表面进行包覆改性，以改善其在霜体或材料中的分散性能，经物理和化学法有机包覆法TiO2应用于防晒霜，但是由于包覆材料不能被紫外线吸收，甚至会降低TiO2的抗紫外线能力，如何能在保证分散效果的基础上进一步强化TiO2的抗紫外能力，达到协同增效目的是目前TiO2纳米颗粒在防晒霜中应用急需解决的问题。
发明内容
针对TiO2纳米颗粒在防晒霜中应用存在细胞产生活性氧(ROS)以及包覆材料不易被吸收降低TiO2纳米颗粒抗紫外能力的问题，以及未见有文献和专利报道Zn-HcMT的抗氧化性及其与TiO2纳米颗粒复合在防晒霜中的应用。本发明提供一种在防晒霜中应用的Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物及其制备方法和应用，通过SDS-PAGE鉴定表达的融合蛋白，采用SEM和FTIR表征 Zn-HcMT/TiO2，利用其优异的抗氧化性，Zn-HcMT/TiO2复合物在防晒霜中抗紫外线能力较有机材料包覆的TiO2显著提升，同时其抗氧化性包括清除羟自由基、清除超氧阴离子和清除DPPH自由基及总抗氧化能力显著增强，可见二者复合具有协同增效作用，解决了现有TiO2纳米颗粒在防晒霜中应用中存在的问题，为其在防晒霜中的应用提供的数据支持。
为了达到以上技术目的，本发明采用的技术方案：
本发明提供一种防晒霜中应用的Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物，该复合物包括Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT和TiO2纳米颗粒，Zn-盐穗木金属硫蛋白 HcMT复合物具体采用如下步骤制备：
(1)通过SDS-PAGE鉴定表达的融合蛋白，将表达载体pET-32a-HcMT，转化感受态细胞BL21中，筛选阳性单克隆，将阳性单克隆接种于10mL的LB 培养基中，于37℃，220rpm摇床中培养8～12h，再按体积比1：100接入500mL 培养基中，37℃，220rpm摇床培养4h，直到菌液浓度OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.6mM的诱导剂IPTG和终浓度为200μM的ZnSO4溶液，继续培养6h，12000rpm离心1min收集诱导后的菌体，加入蛋白Loading buffer，沸水浴15min，冰浴2min，15％SDS-PAGE检测蛋白表达情况。
(2)将步骤(1)诱导后的菌液经6000rpm离心15min后去上清，用一定量pH＝8.0浓度为50mM的Tris-HCl重悬三次，最后一次重悬彻底混匀定容至 30mL，超声破碎至重悬液成淡黄澄清液体，6000rpm离心15min，保留上清液，采用镍柱对上清液进行纯化。
(3)将20～60mL Zn-HcMT溶液加入到140～180mL浓度为0.5-1.5mM的 TiO2溶液中，于4℃冰箱中用磁力搅拌器搅拌12-36h，将TiO2-Zn-HcMT溶液置于冷冻干燥仪进行24-48h的冷冻干燥，得到TiO2-Zn-HcMT复合物粉末。
本发明提供的在防晒霜中应用的Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物，所述复合物的制备方法中盐穗木金属硫蛋白HcMT的纯化中，镍柱在使用前先用10 倍柱床体积，pH＝8浓度为10mM的咪唑溶液洗涤两次，将上清液加入镍柱，低温低转速结合洗涤1.5h，收集流穿液，置于4℃冰箱，在低温下用10倍柱床体积的5mM(pH＝8)咪唑洗涤两次，每次8min，或者用pH＝8浓度为10mM 的咪唑溶液、pH＝8浓度为100mM的咪唑溶液、pH＝8浓度为200mM的咪唑溶液、pH＝8浓度为500mM的咪唑溶液各洗涤一次，收集每一次的洗脱液，每次取60μL洗脱液加入10μL Loading buffer，沸水浴15min，冰浴2min， 15％SDS-PAGE检测纯化情况。
本发明提供的在防晒霜中应用的Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物，所述复合物的制备方法中将40mLZn-HcMT溶液加入到160mL的浓度为1.0mM的 TiO2溶液，磁力搅拌时间为24h，冷冻干燥时间为36h。
同时本发明提供一种在防晒霜中应用的盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物的应用。
通过实施以上技术方案，本发明获得以下技术效果：
(1)本发明提供的一种在防晒霜中应用的Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物，制备工艺简单，成本低，解决了现有TiO2纳米颗粒在防晒霜中应用中存在的问题，为其在防晒霜中的应用提供的数据支持。
(2)本发明提供的Zn-盐穗木金属硫蛋白Zn-HcMT具有较强的自由基清除活性，其清除·OH和O2-·的IC50分别为0.386mg/mL和0.038mg/mL；在同等浓度下对DPPH自由基的清除率达到37.43±0.0068％；Zn-HcMT的还原能力表现出明显浓度依赖性，在同等浓度下ΔOD700高达0.101，表现出了较高水平的还原能力；在同等施用浓度下的TEAC值为0.412±0.08mM，表现出了更高的总抗氧化能力。
(3)本发明提供的Zn-HcMT/TiO2复合物在400-800cm-1范围内检测到在 597.93cm-1的TiO2特征吸收峰，且在2596.10cm-1同时检测到了-SH吸收峰， Zn-HcMT/TiO2在FTIR光谱中表现了二者吸收特性，证明Zn-HcMT与TiO2二者结合成功，为Zn-HcMT/TiO2复合物在化妆品领域的应用奠定了基础。
(4)本发明提供的Zn-HcMT/TiO2复合物在防晒霜中应用后，相较于市售的其他物理成分或化学生物活性成分的防晒霜有明显的优势，市售的防晒霜中大部分都添加了纳米TiO2，作为一种常用物理防晒剂，纳米TiO2会刺激皮肤产生各种活性氧(ROS)，而本发明研制的防晒霜添加的活性成分Zn-HcMT对人体安全无毒且能协同纳米TiO2发挥更好的作用，具体为纳米TiO2在发挥优秀的抗紫外线性能的同时，Zn-HcMT能清除因纳米TiO2刺激皮肤而产生的各种活性氧(ROS),如羟自由基和超氧自由基等，减少皮肤因ROS受到的氧化损伤，从侧面延缓了肌肤的老化，在安全性和功能性而言都拥有其他防晒霜难以比拟的优势。
附图说明
图1为重组蛋白Zn-HcMT的表达图。
图2为重组蛋白Zn-HcMT的纯化结果图。
图3为不同浓度的Zn-HcMT对羟自由基的清除率图。
图4不同蛋白质对邻苯三酚自氧化速率抑制曲线图。
图5为浓度梯度稀释的Zn-HcMT对超氧自由基清除率图。
图6为不同浓度的样品对DPPH清除率曲线图。
图7为不同浓度的样品还原力曲线图。
图8为不同浓度样品的总抗氧化能力曲线图。
图9为Zn-HcMT/TiO2复合物的微观SEM图。
图10为Zn-HcMT/TiO2复合物的FTIR光谱图。
具体实施方式
下面举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下属实施例。
本发明中选用的所有材料、实际和仪器的测定方法都为本领域熟知的但不限制本发明的实施，其它本领域熟知的一些试剂和设备都可以适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例1：Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT融合蛋白的表达与纯化
将表达载体pET-32a-HcMT，转化感受态细胞BL21中，筛选阳性单克隆，将阳性单克隆接种于10mL的LB培养基中(Amp终浓度50mM)于37℃，220rpm 摇床中培养8～12h，再按1：100(v/v)接入500mL培养基中，37℃，220rpm 摇床培养4h，直到菌液浓度OD600达到0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG(终浓度为0.6mM)和ZnSO4(终浓度为200μM)继续培养6h。12000rpm离心1min收集诱导后的菌体，加入蛋白Loading buffer，沸水浴15min，冰浴2min， 15％SDS-PAGE检测蛋白表达情况，具体结果见附图1所示。
由图1显示可知，通过SDS-PAGE鉴定表达的融合蛋白，诱导后与诱导前相比在28kD处诱导出一条表达量很高的条带，与目标大小一致，说明诱导成功。诱导后的菌液6000rpm离心15min后去上清，用一定量的50mM Tris-HCl (pH＝8.0)重悬三次，最后一次重悬彻底混匀定容至30mL，超声破碎至重悬液成淡黄澄清液体，6000rpm离心15min，保留上清液，采用镍柱对上清进行纯化。镍柱在使用前先用10倍柱床体积，浓度为10mM咪唑溶液(pH＝8)洗涤两次，将上清加入镍柱，低温低转速结合1.5h，收集流穿液于4℃冰箱，在低温下用 10倍柱床体积的5mM(pH＝8)咪唑洗涤两次，每次8min，同理用10mM(pH＝8) 咪唑、100mM(pH＝8)咪唑、200mM(pH＝8)咪唑、500mM(pH＝8)咪唑各洗涤一次，收集每一次的洗脱液，每次洗脱液取60μL加入10μL Loading buffer，沸水浴15min，冰浴2min，15％SDS-PAGE检测纯化情况，具体结果参见附图2 所示。
由图2显示可知，将所有洗脱液处理后进行15％SDS-PAGE检测，在100mM (pH＝8)咪唑洗脱下获得单一条带，说明蛋白纯化成功，用于后续活性研究。
实施例2：重组蛋白Zn-HcMT的抗氧化性试验
(1)重组蛋白Zn-HcMT清除羟自由基试验
取8支10mL试管，依次加入9mMFeSO4 lmL、9mM水杨酸-乙醇1mL、分别加入不同浓度的Zn-HcMT溶液1mL(0.3114，0.2803，0.2491，0.2180，0.1868， 0.1557，0.1246，0.0934mg/mL)，混匀后加入浓度为8.8mM的H2O2 lmL启动反应，于37℃水浴加热反应0.5h，以蒸馏水为参照，在510nm下测量吸光值。设置实验组(Ax)，本底吸光组(Ax0)和空白对照组(A0)，羟自由基清除率＝[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100％，每个浓度进行三组平行试验，具体结果参见附图3。
由图3数据可知，羟自由基清除率和Zn-HcMT存在的明显的浓度依赖关系，用羟自由基清除率和Zn-HcMT浓度数据做出标准曲线，对标准曲线做对数回归，使用SPSS软件计算出Zn-HcMT对羟自由基的IC50为0.386mg/mL，这表明当溶液中的Zn-HcMT浓度为0.386mg/mL时，能对此实验中的羟自由基具有50％的清除效果。
(2)重组蛋白Zn-HcMT清除超氧离子试验
将浓度为5mM的邻苯三酚于25℃水浴锅中预热10min，取10mL试管，依次分别加入4.7mL浓度为50mM、pH＝8.2的Tris-HCl缓冲溶液和4mL的去离子水，充分混匀后于25℃水浴锅中保温10min，取出加入0.3mL已预热过的邻苯三酚，充分混匀于波长320nm下测定OD值，当OD320值达到0.2时每隔 30s测定OD320值，测定4min内每30s OD320的变化，平行重复三次。具体结果参见附图4所示，其中，邻苯三酚自动氧化速率计算公式为：
其中：ΔA0为邻苯三酚的自氧化速率；A1为第1min的OD320值；A4为第4min 的OD320值。
由图4结果可知，邻苯三酚在碱性环境下能迅速发生自动氧化反应，同时产生O2-·和有色的中间产物。伴随邻苯三酚自动氧化的持续发生，中间产物与 O2-·相互作用使得中间产物颜色逐渐加深，故该反应体系的吸光值随着时间推移而逐渐增大。当添加具有清除O2-·能力的物质于该自氧化反应体系中时，部分 O2-·被有效去除，进而阻碍有色中间产物的颜色持续加深，测得邻苯三酚自氧化速率为9.5％，加入浓度为0.3114mg/mL Zn-HcMT后，邻苯三酚自氧化速率降为0.23％，与BSA对比，Zn-HcMT对邻苯三酚自氧化产生的超氧自由基清除率达到了97.58％，BSA对超氧阴离子清除率为5.6％，二者数值具有显著差异，且随着时间的增加，Zn-HcMT表现出了较为稳定的清除效率。
Zn-HcMT抑制邻苯三酚自氧化速率的测定：取5支10mL试管，分别依次加入浓度为50mM的Tris-HCl(pH＝8.2)缓冲溶液4.7mL和4mL五个浓度的 Zn-HcMT溶液(0.3114，0.24912，0.18684，0.12456，0.06228mg/mL)，于25℃水浴锅中保温10min，取出后加入0.3mL已预热过的邻苯三酚立即混匀测定 OD320值，平行重复三次。具体结果参见附图5所示，其中，Zn-HcMT对超氧离子的清除率计算公式为：
其中：ΔA0为邻苯三酚的自氧化速率；ΔA为加入Zn-HcMT后邻苯三酚的自氧化速率，以BSA作为阴性对照。
由图5结果可知，不同浓度Zn-HcMT对邻苯三酚在碱性条件下的自氧化速率抑制情况不同，用邻苯三酚受抑制的自氧化速率和原本的自氧化速率的比值间接测定Zn-HcMT对O2-·清除速率。Zn-HcMT对O2-·的清除率在较低浓度时表现出随浓度增加而快速增长的趋势，随着浓度越加，清除率曲线趋于平稳。根据Zn-HcMT浓度-清除率曲线，得线性回归方程，用SPSS软件做对数回归，得 Zn-HcMT清除超氧自由基得IC50为0.038mg/mL。
(3)重组蛋白Zn-HcMT清除DPPH自由基试验
用5mL无水乙醇溶解4mg DPPH，再用体积百分比浓度为50％的乙醇水溶液定容至100mL，配成0.1mM DPPH溶液；取5支1.5mL EP管，加入50μL 0.1 mM DPPH溶液，150μL不同浓度的样品溶液(0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL)，避光反应30min，在517nm处测吸光度值为As；取50μL 0.1mM DPPH 溶液，加入150μL体积百分比浓度为50％的乙醇水溶液，避光反应30min，在517nm处测吸光度值为A0；取50μL体积百分比浓度为50％的乙醇水溶液，加入150μL同上的样品溶液，避光反应30min，在517nm处测吸光度值为A1，具体结果参见附图6所示，其中，清除率计算公式如下：
以Vc作阳性对照，BSA作阴性对照，每个浓度下的样品做三次独立重复实验，取平均值计算清除率。
由图6结果可知，DPPH自由基在乙醇和乙醇-水溶液中呈深紫色，在517nm 处有最大吸收波长，当有自由基清除剂存在时，DPPH自由基被还原，导致溶液褪色，其褪色程度与自由基清除剂的含量有定量关系。Zn-HcMT对DPPH自由基具有明显清除能力且表现出一定的浓度依赖关系，在同等浓度下，Zn-HcMT 对DPPH自由基的清除能力稍弱于强抗氧化剂Vc，但也表现出较强的DPPH自由基清除能力，和BSA对比，Zn-HcMT和Vc对DPPH自由基的清除率都呈现随浓度增加而增强的趋势，且二者数值在各浓度下均和BSA有显著差异。
(4)重组蛋白Zn-HcMT还原能力测试试验
5支取1.5mL的EP管，分别加入100μL5个浓度的样品溶液(0.1，0.15， 0.2，0.25，0.3mg/mL)，250μLPBS缓冲液(pH＝6.6)、250μL质量百分比浓度为1％的铁氰化钾水溶液，混匀，50℃恒温水浴放置20min，取出，加入250μL 体积百分比浓度为10％的三氯乙酸水溶液，混匀，3000rpm离心10min，取250 μL上清液，加入250μL蒸馏水、50μL质量百分比浓度为0.1％的三氯化铁水溶液，反应10min，摇匀，以去离子水为对照，测定反应后体系在700nm处的吸光度，平行重复3次，以GSH作为阳性对照，BSA为阴性对照，先测定空白对照的OD700，样品组的吸光值减去空白对照的OD700即得到ΔOD700，该值越大，则还原力越强，具体结果参见附图7所示。
样品将铁氰化钾的三价铁还原成二价铁(亚铁氰化钾)，然后二价铁与三氯化铁反应生成普鲁士蓝，普鲁士蓝在700nm处有最大吸光度，即可定量测定样品的还原力，吸光度越大，还原力越强，空白组的吸光值平均值为0.03。由图7结果可知，GSH有很强的还原力表现，Zn-HcMT也有较强的还原力，且和 GSH一样呈现随浓度增加而增强的趋势，GSH在低浓度时增强趋势更为明显， BSA基本不具备还原力，也未表现出浓度依赖关系，和预期相符。
(5)重组蛋白Zn-HcMT总抗氧化能力测试试验
配制ABTS工作液：100μLABTS溶液和100μL氧化剂溶液避光存放12h，使用前用PBS缓冲液(0.2M，pH＝7.4)进行稀释，得到ABTS工作液。要求 ABTS工作液的吸光度值减去PBS溶液的空白对照后，A734为0.7±0.05。
用PBS缓冲液(0.2M，pH＝7.4)将10mM Trolox标准溶液稀释成0.2、0.3、 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mM。向96孔板的检测孔中加入200μLABTS工作液，而后加入10μL不同浓度的Trolox溶液，混匀后室温反应4min，以PBS溶液为空白对照，用酶标仪在734nm处测量吸光度值。每个样品平行测定三次，取平均值。各组吸光值减去空白对照组吸光值得到ΔOD734，以Trolox浓度和ΔOD734作图，取线性回归，得到标准方程。
样品总抗氧化能力的测定：用PBS溶液稀释样品溶液为0.1，0.15，0.2，0.25，0.3mg/mL，按照上述步骤操作，测定其ΔOD734，样品的抗氧化能力用 Trolox-EquivalentAntioxidant Capacity(TEAC)来表示。以GSH作为阳性对照， BSA为阴性对照，具体结果参见附图8。
由图8数据得出，在同等浓度下，GSH具有最高的TEAC值，TEAC值为等效抗氧化能力，是以Trolox为参照标定样品总抗氧化能力的一个常用方式，图中结果表明GSH的总抗氧化能力最强，Zn-HcMT稍弱，但也具有较强的抗氧化能力，与BSA做对比，二者随着浓度增加，其TEAC值有快速增长趋势，且水平一直高于BSA，差异显著。
以上数据分析可知，Zn-HcMT具有较强的自由基清除活性，其清除·OH和 O2 -·的IC50分别为0.386mg/mL和0.038mg/mL；本发明应用的Zn-HcMT在同等浓度下对DPPH自由基的清除率达到37.43±0.0068％，说明其在应对氧化应激损伤方面具有潜在的应用价值；在施用浓度(0.1，0.15，0.2，0.25，0.3mg/mL) 内，Zn-HcMT的还原能力表现出明显浓度依赖性，本发明提供的Zn-HcMT在同等浓度下ΔOD700高达0.101，表现出了较高水平的还原能力；在同等施用浓度下的TEAC值为0.412±0.08mM，表现出了更高的总抗氧化能力。
实施例3：Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物
一种在防晒霜中应用的Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物，该复合物包括 Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT和TiO纳米颗粒，Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物具体采用如下步骤制备：
(1)通过SDS-PAGE鉴定表达的融合蛋白，将表达载体pET-32a-HcMT，转化感受态细胞BL21中，筛选阳性单克隆，将阳性单克隆接种于10mL的LB 培养基中，于37℃，220rpm摇床中培养8～12h，再按体积比1：100接入500mL 培养基中，37℃，220rpm摇床培养4h，直到菌液浓度OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.6mM的诱导剂IPTG和终浓度为200μM的ZnSO4溶液，继续培养6h，12000rpm离心1min收集诱导后的菌体，加入蛋白Loading buffer，沸水浴15min，冰浴2min，15％SDS-PAGE检测蛋白表达情况。
(2)将步骤(1)诱导后的菌液经6000rpm离心15min后去上清，用一定量pH＝8.0浓度为50mM的Tris-HCl重悬三次，最后一次重悬彻底混匀定容至 30mL，超声破碎至重悬液成淡黄澄清液体，6000rpm离心15min，保留上清液，采用镍柱对上清液进行纯化。
(3)将20～60mL Zn-HcMT溶液加入到140～180mL浓度为0.5-1.5mM的 TiO2溶液中，于4℃冰箱中用磁力搅拌器搅拌12-36h，将TiO2-Zn-HcMT溶液置于冷冻干燥仪进行24-48h的冷冻干燥，得到TiO2-Zn-HcMT复合物粉末。
所述复合物的制备方法中盐穗木金属硫蛋白HcMT的纯化中，镍柱在使用前先用10倍柱床体积，pH＝8浓度为10mM的咪唑溶液洗涤两次，将上清液加入镍柱，低温低转速结合洗涤1.5h，收集流穿液，置于4℃冰箱，在低温下用 10倍柱床体积的5mM(pH＝8)咪唑洗涤两次，每次8min，或者用pH＝8浓度为10mM的咪唑溶液、pH＝8浓度为100mM的咪唑溶液、pH＝8浓度为200mM 的咪唑溶液、pH＝8浓度为500mM的咪唑溶液各洗涤一次，收集每一次的洗脱液，每次取60μL洗脱液加入10μL Loading buffer，沸水浴15min，冰浴2min， 15％SDS-PAGE检测纯化情况。
实施例4：Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物的表征
本实施例在实施例1-3的基础上，对本发明获得的Zn-盐穗木金属硫蛋白 HcMT复合物进行表征。取2mg用于SEM检测复合物微观表面状况；具体结果见附图9；同时取Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物粉末10mg，与KBr按1： 100比例混合，在直接透视模式下记录FTIR光谱，频率范围为4000-400cm-1，分析复合物中的官能团类型，具体结果参见附图10。
由附图9可知，视野中出现许多晶体牢牢包覆在松散的片状结构表面，在 20μm尺度下出现的晶体并非纳米级别的TiO2微晶，推测可能是蛋白缓冲溶液中的NaCl结晶，不明片状结构或为杂质。
由附图10可知，在400-800cm-1范围内检测到在597.93cm-1的TiO2特征吸收峰，且在2596.10cm-1同时检测到了-SH吸收峰，Zn-HcMT/TiO2在FTIR光谱中表现了二者吸收特性，表明Zn-HcMT/TiO2复合材料同时表现出了二者的吸收特性，证明Zn-HcMT与TiO2二者结合成功，为Zn-HcMT在化妆品领域的应用奠定了基础。
实施例5：Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物
本实施例在实施例1-4的基础上，提供一种在防晒霜中应用的Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物，该复合物包括Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT和TiO2纳米颗粒，Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物制备的方法中，包括40mL Zn-HcMT溶液和160mL的浓度为1.0mM的TiO2溶液，搅拌时间为24h，冷冻干燥时间为36h。
实施例6：Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物
本实施例在实施例1-4的基础上，提供一种在防晒霜中应用的Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物，该复合物包括Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT和TiO2纳米颗粒，Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物制备的方法中，包括20mL Zn-HcMT溶液和140mL的浓度为0.5mM的TiO2溶液，搅拌时间为12h，冷冻干燥时间为24h。
实施例7：Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物
本实施例在实施例1-4的基础上，提供一种在防晒霜中应用的Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物，该复合物包括Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT和TiO2纳米颗粒，Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物制备的方法中，包括60mL Zn-HcMT溶液和180mL的浓度为1.5mM的TiO2溶液，搅拌时间为36h，冷冻干燥时间为48h。
实施例8：Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物
本实施例在实施例1-4的基础上，提供一种在防晒霜中应用的Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物，该复合物包括Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT和TiO2纳米颗粒，Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物制备的方法中，包括50mLZn-HcMT 溶液和160mL的浓度为1.2mM的TiO2溶液，搅拌时间为24h，冷冻干燥时间为 36h。
实施例9：盐穗木金属硫蛋白Zn-HcMT复合物在防晒霜中的应用
本实施例在实施例1-8的基础上，提供一种盐穗木金属硫蛋白Zn-HcMT复合物在防晒霜中的应用。本试验考察对比不同添加剂再防晒霜中应用的效果，其中，TiO2/ATP/DHHP防晒霜作为对照试验1，记作对照1；TiO2/ZnO/木质素防晒霜作为对照试验2，记作对照2；同时对本发明实施例5-8进行了测试，每组平行测试3次，取平均值，其余测试条件相同，具体测试结果表1所示。
化妆品防晒指数(SPF值)测试，SPF是化妆品护肤效果的一个重要的指标，在化妆品行业使用非常的广泛，而且是很关键的性能指标，本发明采用行业通用的防晒指数分析仪进行同条件检测；PA(Protection Grade ofUVA)是UVA防晒能力的标示，利用日本岛津的UV 3600型分光光度计测试复合材料的紫外吸光度。用分析天平精准称取待测物并配制成质量分数为50μg/g的分散液，通过石英比色皿测试其液体紫外曲线，扫描范围为200～800nm。
表1：不同防晒霜性能对比
由表1数据可知，本发明提供的TiO2/Zn-HcMT防晒霜具有较好的稳定性，在SPF测试中表现出了很高的防晒性能，SPF值为23-25之间，PA为9-12之间，且自由基清除能力均为“+”，与对照试验防晒霜相比其安全性能更值得信赖，能减少皮肤中自由基带来的氧化应激损伤，维持皮肤状态稳定，有效防止皮肤衰老。说明本发明提供的复合物TiO2/Zn-HcMT具有优异的协同增效作用，改善 TiO2/ZnO复合材料团聚的缺点，且透明度也有所提高，说明包覆Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物后能够最大程度上发挥TiO2的紫外屏蔽能力。同时也表明本发明提供的Zn-HcMT防晒霜的防晒和养肤能力一体，成分温和安全，性质稳定，是具有很强的市场竞争力的一种新型防晒霜。
综上数据分析可知，本发明提供的一种在防晒霜中应用的Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物及其制备方法和应用，通过SDS-PAGE鉴定表达的融合蛋白，采用SEM和FTIR表征Zn-HcMT/TiO2，Zn-HcMT/TiO2复合物的抗紫外线能力较有机材料包覆的TiO2显著提升，同时其抗氧化性包括清除羟自由基、清除超氧阴离子和清除DPPH自由基及总抗氧化能力显著增强，可见二者复合具有协同增效作用，解决了现有TiO2纳米颗粒在防晒霜中应用颗粒分散性差及包覆材料降低TiO2的抗紫外能力等问题，为其在防晒霜中的应用提供的数据支持。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (4)
1.一种防晒霜中应用的Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物，其特征在于，该复合物包括Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT和TiO2纳米颗粒，Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物具体采用如下步骤制备：
(1)通过SDS-PAGE鉴定表达的融合蛋白，将表达载体pET-32a-HcMT，转化感受态细胞BL21中，筛选阳性单克隆，将阳性单克隆接种于10mL的LB培养基中，于37℃，220rpm摇床中培养8～12h，再按体积比1：100接入500mL培养基中，37℃，220rpm摇床培养4h，直到菌液浓度OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.6mM的诱导剂IPTG和终浓度为200μM的ZnSO4溶液，继续培养6h，12000rpm离心1min收集诱导后的菌体，加入蛋白Loading buffer，沸水浴15min，冰浴2min，15％SDS-PAGE检测蛋白表达情况；
(2)将步骤(1)诱导后的菌液经6000rpm离心15min后去上清，用一定量pH＝8.0浓度为50mM的Tris-HCl重悬三次，最后一次重悬彻底混匀定容至30mL，超声破碎至重悬液成淡黄澄清液体，6000rpm离心15min，保留上清液，采用镍柱对上清液进行纯化；
(3)将20～60mL Zn-HcMT溶液加入到140～180mL浓度为0.5-1.5mM的TiO2溶液中，于4℃冰箱中用磁力搅拌器搅拌12-36h，将TiO2-Zn-HcMT溶液置于冷冻干燥仪进行24-48h的冷冻干燥，得到TiO2-Zn-HcMT复合物粉末。
2.如权利要求1所述的一种在防晒霜中应用的Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物，其特征在于，所述盐穗木金属硫蛋白HcMT的纯化中，镍柱在使用前先用10倍柱床体积，pH＝8浓度为10mM的咪唑溶液洗涤两次，将上清液加入镍柱，低温低转速结合洗涤1.5h，收集流穿液，置于4℃冰箱，在低温下用10倍柱床体积的5mM(pH＝8)咪唑洗涤两次，每次8min，或者用pH＝8浓度为10mM的咪唑溶液、pH＝8浓度为100mM的咪唑溶液、pH＝8浓度为200mM的咪唑溶液、pH＝8浓度为500mM的咪唑溶液各洗涤一次，收集每一次的洗脱液，每次取60μL洗脱液加入10μL Loading buffer，沸水浴15min，冰浴2min，15％SDS-PAGE检测纯化情况。
3.如权利要求1所述的一种在防晒霜中应用的Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物，其特征在于，所述步骤(3)中，40mL Zn-HcMT溶液加入到160mL的浓度为1.0mM的TiO2溶液，磁力搅拌时间为24h，冷冻干燥时间为36h。
4.如权利要求1所述的在防晒霜中应用的Zn-盐穗木金属硫蛋白HcMT复合物的应用。
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