CN113945554A - 一种血清中抗肿瘤药物5-fu的sers检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血清中抗肿瘤药物5‑FU的SERS检测方法，包括以下步骤：S1、制备表面修饰有亲水稳定剂的纳米粒子溶胶，所述纳米粒子为具有SERS活性的纳米粒子；S2、将血清与溶剂Ⅰ混合均匀，离心，取上清液；S3、将所述上清液与溶剂Ⅱ混合均匀，得到混合液；S4、将表面修饰有亲水稳定剂的纳米粒子溶胶加入所述混合液中形成溶胶相，摇匀，溶胶相体积发生收缩，待溶胶相的体积不再发生变化，利用拉曼光谱仪对溶胶相进行SERS检测。本发明采用微萃取与自组装同步化检测抗肿瘤药物5‑FU，可以提高对5‑FU检测的灵敏性和稳定性，检测过程准确、快速。

Description

一种血清中抗肿瘤药物5-FU的SERS检测方法
技术领域
本发明涉及药物浓度检测技术领域，尤其涉及一种血清中抗肿瘤药物5-FU 的SERS检测方法。
背景技术
肿瘤一直是威胁人类生命健康的重大疾病之一，全世界每年有1400多万新病例和800多万癌症患者死亡。随着医疗行业的不断发展，抗肿瘤药物方面的研究也有着巨大的进步。由于抗肿瘤药物本身就带有毒性，不仅对肿瘤细胞产生效果，也会对自身的其他良好细胞造成一定的伤害，因此出现很多不良症状。5-FU(5-氟尿嘧啶)是一种临床应用于结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌等的治疗药物。它通过抑制DNA来控制肿瘤细胞的增殖，但是其治疗剂量与中毒剂量是相近的，因此建立一种快速有效的检测组织液中5-FU药物浓度的方法，确定5-FU安全有效的剂量，在临床用药方面具有重要意义。
表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)是指当分子吸附于某些粗糙的金属(Ag、Au、Cu等)表面或金属纳米颗粒表面时，吸附分子的散射截面会被金属表面的局域电磁场剧烈放大，其拉曼散射强度会增加104-108倍。SERS技术因快速、灵敏、无损，具备分子指纹、专一性和单分子灵敏性的特点，能在分子水平上提供物质、结构的丰富信息，已逐渐成为化学、生物、环境、食品、药物等领域一种强有力的检测手段。
传统抗肿瘤药物检测方法成本高、耗时长、需要专业的检测人员，而SERS 技术检测可以弥补上述方法的不足。抗肿瘤药物通常在血液或组织液中面临大量其他的生物干扰成分，直接用SERS技术很难满足实际检测抗肿瘤药物的需求。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种血清中抗肿瘤药物5-FU 的SERS检测方法。
本发明提出的一种血清中抗肿瘤药物5-FU的SERS检测方法，包括以下步骤：
S1、制备表面修饰有亲水稳定剂的纳米粒子溶胶，所述纳米粒子为具有 SERS活性的纳米粒子；
S2、将血清与溶剂Ⅰ混合均匀，离心，取上清液；
S3、将所述上清液与溶剂Ⅱ混合均匀，得到混合液；
S4、将所述表面修饰有亲水稳定剂的纳米粒子溶胶加入所述混合液中形成溶胶相，摇匀，溶胶相体积发生收缩，待溶胶相的体积不再发生变化，利用拉曼光谱仪对溶胶相进行SERS检测；
所述溶剂Ⅰ为与水互溶的醇类溶剂、酮类溶剂、腈类溶剂或其组合，所述溶剂Ⅱ与水不互溶且密度大于水，所述溶剂Ⅰ与溶剂Ⅱ互溶。
优选地，所述亲水稳定剂为柠檬酸钠、抗坏血酸、硼氢化钠、叔丁醇、葡萄糖中的至少一种。
优选地，所述具有SERS活性的纳米粒子为结构具有各向同性或各向异性的金、银或者金银合金纳米粒子；优选地，所述具有SERS活性的纳米粒子为金、银或者金银合金纳米颗粒、纳米棒、纳米星中的至少一种。
优选地，所述表面修饰有亲水稳定剂的纳米粒子溶胶的固含量为0.1-5％。
其中，表面修饰有亲水稳定剂的纳米粒子溶胶可以采用本领域常规方法制备，包括：在亲水稳定剂的存在下，在溶剂中原位合成纳米粒子；或者将亲水稳定剂溶液和纳米粒子的分散液混合后，搅拌反应；或者将纳米粒子分散在亲水稳定剂溶液中，搅拌反应；也可以购买市售产品。
具体制备方法例如可以是：
将氯金酸溶液加入超纯水中，煮沸后，加入柠檬酸钠溶液，继续加热反应，然后离心，将沉淀物用超纯水洗涤后，分散在超纯水中，得到表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒溶胶。
优选地，S2中，血清与溶剂Ⅰ的体积比为的体积比为1：(1-5)；优选地，所述溶剂Ⅰ为乙醇、甲醇、正丁醇、丙酮、乙腈中的至少一种。
优选地，S3中，上清液与溶剂Ⅱ的体积比为(5-6)：1；优选地，所述溶剂Ⅱ为氯仿、四氯化碳、二氯甲烷、溴苯中的至少一种。
优选地，S4中，表面修饰有亲水稳定剂的纳米粒子溶胶与混合液的体积比为(1-10)：1000。
优选地，S4中，拉曼光谱仪进行检测的激发光波长为785nm。
优选地，所述血清是经血液静置凝固后取其上层清液获得。
优选地，S3中，上清液与溶剂Ⅱ是在离心管、比色皿或者96孔板中混合。
本发明的血清中抗肿瘤药物5-FU的SERS检测方法，是一种基于微萃取与自组装同步化的检测方法，其原理如下：血清含有大量的蛋白质、多种脂溶性小分子、无机盐离子等会干扰5-FU的检测，因此，本发明建立了一种针对5-FU 的快速前处理与SERS检测同步化的方法。首先，利用与水互溶的有机溶剂能使蛋白质在水中的溶解度显著降低的特性，通过加入与水互溶的溶剂Ⅰ与血清混合，离心后取上清液，达到去除蛋白质、分离与纯化5-FU的目的；然后，将纯化后的血清上清液和与水不互溶且密度大于水的溶剂Ⅱ混合，基于相似相溶原理，上清液中的脂溶性物质溶于溶剂Ⅱ，减少其进入溶胶相而干扰检测；再将表面修饰有亲水稳定剂的纳米粒子溶胶滴加到混合液中，一方面，由于溶剂Ⅰ与水、溶剂Ⅱ都可以互溶，因此上清液中的5-FU通过相似相溶原理，经过微萃取进入溶胶相；其次，由于溶剂Ⅰ的存在，溶胶相和溶剂Ⅱ的互溶程度增加，使溶胶相中的水发生转移，溶胶相体积会快速收缩，纳米颗粒间距减小，从而同时实现5-FU的微萃取与纳米颗粒的高密度稳定组装，因此进入溶胶相的5-FU 能够获得高灵敏、高稳定检测。
本发明的有益效果如下：
1、本发明通过对血清中的5-FU进行分离和富集，避免血清中其他杂质对 5-FU分子检测的干扰；
2、本发明构筑的增强基底是液态三维热点溶胶结构，通过溶剂Ⅰ调节溶胶相和溶剂Ⅱ的互溶程度，达到溶胶体积缩小、纳米颗粒间距减小的目的，进而实现稳定三维热点纳米单元的组装；
3、本发明将溶剂Ⅰ纯化的血清上清液与溶剂Ⅱ混合，利用相似相溶原理，通过溶胶的微萃取和自组装过程，可以把5-FU分离和提纯出来，避免其他杂质 (糖类、氨基酸、蛋白、磷脂类)的影响。
4、本发明中微萃取与纳米颗粒组装过程速度快，约2-5分钟就可以完成，该过程方便、快速。
5、本发明对5-FU具有较高的灵敏性、重复性、稳定性，检测限均在1mg/mL 以下。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒的扫描图片。
图2为本发明实施例1中溶胶相发生体积收缩的光学图片。
图3为实施例1的SERS检测光谱图。
图4为实施例2-4的SERS检测光谱图。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
分别对含有2.5μg/mL 5-FU标准品的血清样品和不含5-FU的血清对照品进行检测，具体步骤如下：
S1、制备表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒溶胶；
S2、将血清与乙醇按体积比为1:2混合均匀，离心，取上清液；
S3、将上清液与氯仿按体积比为5:1在离心管中混合均匀，得到混合液；
S4、将5μL表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒溶胶加入5mL混合液中形成溶胶相，摇匀，溶胶相体积发生收缩，待溶胶相的体积不再发生变化，利用拉曼光谱仪在激发光波长在785nm的条件下对溶胶相进行SERS检测。
其中，制备表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒溶胶的具体方法如下：
将1mL浓度为1wt％的氯金酸溶液加入99mL超纯水中，煮沸后，加入4mL 浓度为1wt％的柠檬酸钠溶液，溶液从无色变化为黑色，继续加热反应直至溶液呈酒红色，然后离心，将沉淀物用超纯水洗涤后，分散在超纯水中，得到固含量为1％的表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒溶胶。
图1是实施例1制备的表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒的扫描图片，从图1可以看出，表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒大小均一。
图2是实施例1的S4中，溶胶相体积发生收缩的光学图片，从图2可以看出，将表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒溶胶加入混合液后，形成了溶胶相，且溶胶相的体积逐渐收缩，最后形成稳定的纳米结构。
图3是实施例1的SERS检测光谱图。其中，位于上方的谱图为含有2.5μg/mL 5-FU标准品的血清样品的SERS检测光谱图，位于下方的谱图为不含5-FU的血清对照品的SERS检测光谱图；由图3可知，利用此检测方法可以成功实现血清样品中5-FU的检测，含5-FU的血清拉曼谱图中在785cm-1、1235cm-1、1340cm-1和1667cm-1处有特征峰出现。
实施例2
对含有25μg/mL 5-FU标准品的血清样品进行检测，具体步骤如下：
S1、制备表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒溶胶；
S2、将血清与乙醇按体积比为1:2混合均匀，离心，取上清液；
S3、将上清液与氯仿按体积比为5:1在离心管中混合均匀，得到混合液；
S4、将5μL表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒溶胶加入5mL混合液中形成溶胶相，摇匀，溶胶相体积发生收缩，待溶胶相的体积不再发生变化，利用拉曼光谱仪在激发光波长在785nm的条件下对溶胶相进行SERS检测。
其中，制备表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒溶胶的具体方法同实施例1。
实施例3
对含有10μg/mL 5-FU标准品的血清样品进行检测，具体步骤如下：
S1、制备表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒溶胶；
S2、将血清与乙醇按体积比为1:2混合均匀，离心，取上清液；
S3、将上清液与氯仿按体积比为5:1在离心管中混合均匀，得到混合液；
S4、将5μL表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒溶胶加入5mL混合液中形成溶胶相，摇匀，溶胶相体积发生收缩，待溶胶相的体积不再发生变化，利用拉曼光谱仪在激发光波长在785nm的条件下对溶胶相进行SERS检测。
其中，制备表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒溶胶的具体方法同实施例1。
实施例4
对含有1μg/mL 5-FU标准品的血清样品进行检测，具体步骤如下：
S1、制备表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒溶胶；
S2、将血清与乙醇按体积比为1:2混合均匀，离心，取上清液；
S3、将上清液与氯仿按体积比为5:1在离心管中混合均匀，得到混合液；
S4、将5μL表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒溶胶加入5mL混合液中形成溶胶相，摇匀，溶胶相体积发生收缩，待溶胶相的体积不再发生变化，利用拉曼光谱仪在激发光波长在785nm的条件下对溶胶相进行SERS检测。
其中，制备表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒溶胶的具体方法同实施例1。
图4是实施例2-4血清样品的SERS检测光谱图，从图4可以得知，本发明的检测方法可以实现浓度为1μg/mL的5-FU灵敏检测。
实施例5
对含有10μg/mL 5-FU标准品的血清样品进行检测，具体步骤如下：
S1、制备固含量为0.1％的表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒溶胶；
S2、将血清与丙酮按体积比为1:1混合均匀，离心，取上清液；
S3、将上清液与二氯甲烷按体积比为6:1在比色皿中混合均匀，得到混合液；
S4、将50μL表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒溶胶加入5mL混合液中形成溶胶相，摇匀，溶胶相体积发生收缩，待溶胶相的体积不再发生变化，利用拉曼光谱仪在激发光波长在785nm的条件下对溶胶相进行SERS检测。
实施例6
对含有10μg/mL 5-FU标准品的血清样品进行检测，具体步骤如下：
S1、制备固含量为5％的表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒溶胶；
S2、将血清与乙腈按体积比为1:5混合均匀，离心，取上清液；
S3、将上清液与四氯化碳按体积比为5.5:1在比色皿中混合均匀，得到混合液；
S4、将10μL表面修饰有柠檬酸钠的金纳米颗粒溶胶加入5mL混合液中形成溶胶相，摇匀，溶胶相体积发生收缩，待溶胶相的体积不再发生变化，利用拉曼光谱仪在激发光波长在785nm的条件下对溶胶相进行SERS检测。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种血清中抗肿瘤药物5-FU的SERS检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备表面修饰有亲水稳定剂的纳米粒子溶胶，所述纳米粒子为具有SERS活性的纳米粒子；
S2、将血清与溶剂Ⅰ混合均匀，离心，取上清液；
S3、将所述上清液与溶剂Ⅱ混合均匀，得到混合液；
S4、将所述表面修饰有亲水稳定剂的纳米粒子溶胶加入所述混合液中形成溶胶相，摇匀，溶胶相体积发生收缩，待溶胶相的体积不再发生变化，利用拉曼光谱仪对溶胶相进行SERS检测；
所述溶剂Ⅰ为与水互溶的醇类溶剂、酮类溶剂、腈类溶剂或其组合，所述溶剂Ⅱ与水不互溶且密度大于水，所述溶剂Ⅰ与溶剂Ⅱ互溶。
2.根据权利要求1所述的血清中抗肿瘤药物5-FU的SERS检测方法，其特征在于，所述亲水稳定剂为柠檬酸钠、抗坏血酸、硼氢化钠、叔丁醇、葡萄糖中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的血清中抗肿瘤药物5-FU的SERS检测方法，其特征在于，所述具有SERS活性的纳米粒子为结构具有各向同性或各向异性的金、银或者金银合金纳米粒子；优选地，所述具有SERS活性的纳米粒子为金、银或者金银合金纳米颗粒、纳米棒、纳米星中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的血清中抗肿瘤药物5-FU的SERS检测方法，其特征在于，所述表面修饰有亲水稳定剂的纳米粒子溶胶的固含量为0.1-5％。
5.根据权利要求1所述的血清中抗肿瘤药物5-FU的SERS检测方法，其特征在于，S2中，血清与溶剂Ⅰ的体积比为1：(1-5)；优选地，所述溶剂Ⅰ为乙醇、甲醇、正丁醇、丙酮、乙腈中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的血清中抗肿瘤药物5-FU的SERS检测方法，其特征在于，S3中，上清液与溶剂Ⅱ的体积比为(5-6)：1；优选地，所述溶剂Ⅱ为氯仿、四氯化碳、二氯甲烷、溴苯中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的血清中抗肿瘤药物5-FU的SERS检测方法，其特征在于，S4中，表面修饰有亲水稳定剂的纳米粒子溶胶与混合液的体积比为(1-10)：1000。
8.根据权利要求1所述的血清中抗肿瘤药物5-FU的SERS检测方法，其特征在于，S4中，拉曼光谱仪进行检测的激发光波长为785nm。
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