CN113943729A - U型接头及采用u型接头介导的磁珠偶联转座酶进行rna快速均一化建库的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于结合磁珠并偶联转座酶的U型接头,所述U形接头为:5’‑[Phos]CTGTCTCTTATACACATCTNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTT[Int NH2 C6 dT]TTTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGATGTGTATAAGAGACAG‑3’、5’‑GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNAGATGTGTATAAGAGACAG‑3’以及5’‑[Phos]‑CTGTCTCTTATACACAAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT‑3’三条寡核苷酸序列的退火产物,磁珠为羧基磁珠。并公开了采用U型接头介导的磁珠偶联转座酶进行RNA快速均一化建库的方法。本发明方法具有效率高、均一性好和产量高等显著的优点,非常适用于RNA自动化建库和低投入量RNA建库,也提供了应用于单细胞转录组测序的可能性。
Description
技术领域
本发明涉及一种U型接头及采用U型接头介导的磁珠偶联转座酶进行RNA快速均一化建库的方法,属于生物技术领域。
背景技术
RNA二代测序技术(RNA Next-generation sequencing,RNA-seq)是一种高通量大规模的RNA并行测序技术,可以同时对几十万乃至几百万个RNA分子进行序列测定,用于未知病原的鉴定、生物遗传进化分析、基因表达差异分析和RNA合成及加工分析等。因此,RNA-seq广泛用于科学研究和疾病诊断等领域,并取得了许多突破性的结果。
RNA NGS文库构建是指通过逆转录和接头连接等过程将RNA转化为二代测序仪可识别的双链DNA的过程,是RNA-seq的关键步骤。传统的RNA建库方法操作繁琐,需要通过RNA片段化、逆转录、二链合成、磁珠回收、末端修复、接头连接、磁珠回收、文库扩增和磁珠回收等9个步骤才能完成RNA文库的构建,整个流程操作繁琐,RNA损失严重、耗时长(需要5个小时),非常不适合自动化建库和低丰度RNA建库。此外,由于RNA中包含90%左右的核糖体RNA(rRNA),因此在RNA建库前需要进行rRNA的去除。常规的RNaseH切割法和杂交捕获法去除rRNA需要近2个小时,大大地增加了RNA建库的难度和耗时。我们在之前开发了一种利用逆转录阻碍探针的快速核糖体RNA去除技术(专利号:ZL202110257924.X),可以在RNA NGS建库过程中一步快速去除核糖体RNA,整个过程仅需2分钟,非常适用于快速自动化建库和病原RNA NGS诊断。
近期,有不少研究表明转座酶Tn5可以介导DNA和RNA杂交链的片段化(Di,L.,Fu,Y.,Sun,Y.,Li,J.,&Wang,J..(2020).RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids.Proceedings of the National Academy of Sciences,117(6),201919800;Lu,B.,Dong,L.,Yi,D.,Zhang,M.,&Yi,C..(2020).Transposase assisted tagmentationof RNA/DNA hybrid duplexes.eLife Sciences,9;202010111715.X;202010111715.X;202010958566.0)。这极大地缩短了RNA建库的时长,减少了RNA建库的操作。在RNA自动化建库和低投入量RNA(如单细胞RNA)建库过程中具有重要的应用前景和价值。但是,由于转座酶对RNA/DNA底物具有很低的片段化活性,因此在片段化效率和片段化产物分布上具有严重的偏好性和不均一性。
我们之前还开发了一种U型接头介导的新型磁珠偶联转座酶并用于DNA快速均一化建库技术,命名为DOT-seq(Dual On-bead Tagmentation and sequencing)(申请号:CN202110775101.6)。DOT-seq使用了更加高效的磁珠偶联转座酶方法,能够有效保证转座酶二聚体中结合的接头是异质性接头,也能够保证转座酶在磁珠上的分布更加均匀化。因此,相较于传统的磁珠偶联转座酶法DNA建库,DOT-seq具有耗时更短、文库产量更高,对DNA质量和投入量要求更低(50pg-1μg)和文库均一性更好等优点,适用于各类DNA NGS建库需求,尤其是低质量的病源DNA样本。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于结合磁珠并偶联转座酶的U型接头,所述U形接头为:5’-[Phos]CTGTCTCTTATACACATCTNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTT[Int NH2 C6 dT]TTTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGATGTGTATAAGAGACAG-3’、5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNAGATGTGTATAAGAGACAG-3’以及5’-[Phos]-CTGTCTCTTATACACAAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-3’三条寡核苷酸序列的退火产物,磁珠为羧基磁珠。其中“5’-[Phos]”代表寡核苷酸的5’端经过磷酸化修饰,“[IntNH2 C6 dT]”表示胸腺嘧啶上带有氨基修饰,NNNNNNNN代表8个随机碱基的细胞识别标识
优选的,三条寡核苷酸中,长寡核苷酸与两条短寡核苷酸的摩尔量比为1:3:3-1:10:10。
优选的,U型接头的退火程序为95℃ 5min,90℃ 5min,85℃ 5min,80℃ 5min,75℃ 1h,4℃ hold。
本发明还公开了一种采用U型接头介导的磁珠偶联转座酶进行RNA快速均一化建库的方法,其特征在于其步骤包括:
(1)使用随机引物对RNA样本进行逆转录,得到DNA/RNA杂交链;
(2)使用U型接头介导的磁珠偶联转座酶对DNA/RNA杂交链进行片段化反应;
(3)片段化产物末端修复和文库扩增;
其中所述的U型接头为上述的U型接头。
优选的,逆转录反应中还加入rRNA的逆转录阻碍探针。
优选的,片段化反应条件为55℃反应10-30min。
优选的,片段化产物末端修复和文库扩增同时进行,末端修复使用逆转录酶,文库扩增使用翌圣生物的2×HieffGold PCR Master Mix高保真酶预混液,反应温度为40-65℃,反应时间为10-30min。
本发明提供了一种U型接头,并提供了采用U型接头介导的磁珠偶联转座酶进行RNA快速均一化建库的方法,命名为RNA DOT-seq。原理是利用含测序接头的随机引物对RNA进行逆转录,生产RNA/DNA杂交双链;使用DOT-seq中的磁珠偶联转座酶对RNA/DNA杂交双链进行片段化;使用链置换酶进行末端修复,文库扩增。使用本方法进行RNA NGS建库,具有效率高、均一性好和产量高等显著的优点,非常适用于RNA自动化建库和低投入量RNA建库,也提供了应用于单细胞转录组测序的可能性。结合之前开发的快速核糖体RNA去除技术(专利号:202110257924.X),应用于单细胞转录组测序中不仅可以检测mRNA,也能够检测lncRNA和circRNA等不带polyA尾的RNA,基因检出数多、文库产量高、操作方便、均一性好,这极大地提高了转座酶在RNA NGS测序技术中的应用价值和应用前景。
附图说明
图1、RNA DOT-seq原理示意图。
图2、RNA DOT-seq流程示意图。
图3、游离Tn5介导的RNA建库在不同RNA投入量上的建库比较。
图4、线形接头介导的RNA DOT-seq在不同RNA投入量上的建库比较。
图5、U型接头介导的RNA DOT-seq在不同RNA投入量上的建库比较。
图6、三种建库方法的GC偏好性比较。
图7、RNA DOT-seq在不同质量FFPE RNA上的建库比较。
图8、单细胞转录组测序技术scRNA DOT-seq磁珠U型接头结构及序列示意图。
图9、单细胞转录组测序技术scRNA DOT-seq的流程示意图。
图10、scRNA DOT-seq在三种处理条件下的细胞RNA建库的文库大小分布图。
图11、scRNA DOT-seq在三种处理条件下的细胞测序数据相关性分析。
图12、scRNA DOT-seq在三种处理条件下的细胞测序数据聚类分析。
图13、scRNA DOT-seq在基因上覆盖均一性分析。
图14、scRNA DOT-seq测序数据rRNA占比。
图15、scRNA DOT-seq基因检出数分析。
图16、scRNA DOT-seq检测RNA种类分析。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。本实施例所使用的接头序列及修饰如表1所示,
表1接头序列及修饰
实施例1:RNA DOT-seq流程。
本实施例公布了RNA DOT-seq的流程及方法(原理如图1,流程如图2)。具体实施方式如下:
1)随机引物逆转录
表2
85℃ 1min,75℃ 1min,50℃ 2min,4℃ hold。
表3
25℃ 10min,42℃ 30min,85℃ 15min,4℃ hold。
2)U型接头介导的磁珠转座酶片段化
表4
5×片段化缓冲液:50mM TAPS-NaOH,25mM MgCl,40%PEG 8000,8%聚乙烯亚胺。
55℃ 10-30min。反应结束后,加入10ul 0.1%SDS后,于磁力架上去除上清。加入DEPC水清洗磁珠两次。
3)末端修复和接头连接
表5
将表5中的体系加入到上述磁珠中,并重悬。
表6
加入45μLDNA Selection Beads(Yeasen,12601),充分吹打混匀,室温孵育5min。将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约3min),小心移除上清。保持PCR管始终置于磁力架中,加入200μL Nuclease free H2O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30sec后,小心移除上清。重复漂洗一次。用10μL移液器吸干净残留液体。保持PCR管始终置于磁力架中,室温下开盖干燥磁珠(5min)。加入22μL ddH2O,吹打至充分混匀,室温静置5min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5min),小心移取20μL上清至新PCR管中。用Qubit测定文库浓度,在Illumina的NovaSeq 6000进行测序和分析。结果如表7-表9和图3-图6所示,对于不同的RNA投入量,U型接头介导的RNA DOT-seq与其他Tn5 RNA建库方法相比,具有更好的文库产量、文库大小分布、比对率、均一性和基因检出数。并且RNA投入量对文库大小分布影响不大,这说明RNA DOT-seq和DOT-seq具有较宽的模板投入量范围和较高的建库效率。
表7游离Tn5介导的RNA建库(流程参考doi:10.1073/pnas.1919800117.,以下同)
RNA投入量 | 循环数 | 文库产量 | 比对率 | 均一性 | 基因检出数 |
1000ng | 8 | 123ng | 93.2% | 0.71 | 16635 |
100ng | 11 | 107ng | 88.7% | 0.53 | 13426 |
10ng | 14 | 44.5ng | 76.3% | 0.46 | 9436 |
1ng | 18 | 23.1ng | 53.5% | 0.33 | 7813 |
100pg | 21 | 6.2ng | 46.7% | 0.27 | 5024 |
10pg | 25 | 2.1ng | 43.2% | 0.23 | 4682 |
表8线性接头介导的RNA DOT-seq
表9U型接头介导的RNA DOT-seq
RNA投入量 | 循环数 | 文库产量 | 比对率 | 均一性 | 基因检出数 |
1000ng | 8 | 673ng | 99.9% | 0.94 | 28342 |
100ng | 11 | 525ng | 99.8% | 0.95 | 27784 |
10ng | 14 | 489ng | 99.4% | 0.93 | 25816 |
1ng | 18 | 494ng | 98.3% | 0.9 | 22394 |
100pg | 21 | 401ng | 96.0% | 0.84 | 19863 |
10pg | 25 | 421ng | 92.1% | 0.81 | 14832 |
实施例2:RNA DOT-seq在不同质量FFPE RNA建库上的效果。
本实施例检测了RNA DOT-seq对不同质量FFPE RNA的建库效果,具体实施方式如实施例1相同。结果如表10和图7,RNA DOT-seq具有很高的建库效率和均一的建库效果。
表10RNA DOT-seq在不同质量FFPE RNA(100ng)的建库效果
RIN值 | 循环数 | 文库产量 | 比对率 | 均一性 | 基因检出数 |
0.9 | 11 | 307ng | 98.6% | 0.92 | 26139 |
0.7 | 12 | 223ng | 95.2% | 0.88 | 23249 |
0.5 | 13 | 209ng | 92.1% | 0.81 | 19462 |
0.3 | 15 | 152ng | 88.7% | 0.63 | 13075 |
0.2 | 16 | 146ng | 81.3% | 0.52 | 11850 |
实施例3:带有单细胞识别码的U型接头磁珠制备。
本实施例制备了带有单细胞识别码的U型接头磁珠(见图8)。具体实施方式如下:
U形接头退火:将表1中的10对长序列x和短序列Ax一一对应,按照以下方式退火,其中x代表1至10中任一数字。
表11
组分 | 用量 |
100μM长序列x | 1μL |
100μM短序列Ax | 3-10μL |
100μM短序列B | 3-10μL |
1M NaCl | 30μL |
补水至 | 30μL |
95℃ 5min,90℃ 5min,85℃ 5min,80℃ 5min,75℃ 1h,4℃ hold。
取200μL羧基磁珠,并加入到上述的3.3μM异质性接头混合物中,加入1mL 0.2MMES、900μL 100mM EDC和100μL100 mM NHS。室温旋转孵育24h。用含0.5%Tween 20的磁珠结合缓冲液(20mM HEPES-KOH(pH 7.5),800mM NaCl,10%甘油、1mM DTT、0.1mM EDTA和0.1%Triton X-100)清洗磁珠3次,用200μL转座酶结合缓冲液悬浮,-20度保存备用。
转座酶组装。取20μL偶联好接头的链霉亲和素磁珠或羧基磁珠,加入5μL LucigenEZ-Tn5后,室温旋转孵育1h,-20度保存备用。
实施例4:单细胞转录组测序scRNA DOT-seq。
本实施例公布了RNA DOT-seq在单细胞转录组测序上的应用(流程示意图见图9)。具体实施方式如下:
准备3份不同处理的293F细胞,一份正常细胞,一份0.5%过氧化氢处理4h的细胞和一份45℃热处理4h后的细胞。
三种细胞各取一部分,分别使用翌圣生物的细胞RNA提取试剂盒进行RNA提取,并使用翌圣生物的RNA建库试剂盒和一步法rRNA去除试剂盒进行RNA文库构建。
对三种细胞进行血球计数板计数后,取等量的三种处理细胞进行混匀。混匀后进行细胞计数,使用流式细胞仪进行单细胞分选出10个单细胞,分选后的细胞按照以下流程进行单细胞转录组建库。
1)随机引物逆转录
表12
组分 | 用量 |
细胞悬浮液 | 0.5μL |
rRNA probe(202110257924.X) | 0.5μL |
2×细胞裂解液 | 1μL |
2×细胞裂解液:0.4%Triton-X 100μL,0.2M DTT 5μL,RNaseOUT 5μL,20μM N8Primer 32μL,25mM dNTPs 10μL,600mM NaCl 8μL。
85℃ 1min,75℃ 1min,50℃ 2min,4℃ hold。
表13
组分 | 用量 |
上述反应体系 | 2μL |
2×逆转录混合液 | 2μL |
2×逆转录混合液:5X FS buffer 0.8μL,0.1M DTT 0.2μL,RnaseOUT 0.1μL,Superscript III 0.2μL,H2O 0.7μL。
25℃ 10min,42℃ 30min,85℃ 15min,4℃ hold。
2)U型接头介导的磁珠转座酶片段化
表12分选出的10个细胞编号与磁珠接头编号一一对应。
细胞编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
磁珠接头编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
表13
组分 | 用量 |
上述反应体系 | 4μL |
实施例3中的磁珠 | 4μL |
5×片段化缓冲液 | 2μL |
55℃ 30min。反应结束后,加入2μL 0.1%SDS后。将10个反应体系混合在一起,共120μL。于磁力架上去上清。加入DEPC水清洗磁珠两次。
3)末端修复和接头连接
表14反应体系
将50μL反应体系直接加入有磁珠的PCR管中,按表15记载的反应程序进行PCR反应。
表15反应程序
加入45μLDNA Selection Beads(Yeasen,12601),充分吹打混匀,室温孵育5min。将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约3min),小心移除上清。保持PCR管始终置于磁力架中,加入200μL Nuclease free H2O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30sec后,小心移除上清。重复漂洗一次。用10μL移液器吸干净残留液体。保持PCR管始终置于磁力架中,室温下开盖干燥磁珠(5min)。加入22μL ddH2O,吹打至充分混匀,室温静置5min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5min),小心移取20μL上清至新PCR管中。用Qubit测定文库浓度,在Illumina的NovaSeq 6000进行测序和分析。
文库大小分布见图10,相比于传统的RNA建库,scRNA DOT-seq在文库大小分布上更加均一。相关性分析见图11和图12,细胞编号2、5、7、8与处理条件1具有更好的相关性,细胞编号4、9、10与处理条件2具有更好的相关性、细胞编号1、3、6与处理条件3具有更好的相关性。其中处理1为293F正常细胞,处理2为0.5%过氧化氢处理4h的293F细胞,处理3为45℃热处理4h后的293F细胞。这说明细胞编号2、5、7、8是来源于处理条件1的细胞,这说明细胞编号4、9、10是来源于处理条件2的细胞,这说明细胞编号1、3、6是来源于处理条件3的细胞。这些数据表明基于U型接头的磁珠转座酶单细胞转录组测序技术scRNA DOT-seq可以有效地区分来源于不同处理或种类的细胞测序数据。图13是scRNA DOT-seq测序数据在基因上的信号分布,证明scRNA DOT-seq具有很好的基因检测均一性。图14结果说明结合我们之前开发的快速rRNA去除技术(202110257924.X)能够有效去除scRNA DOT-seq中的rRNA冗余数据。图15结果说明scRNA DOT-seq具有良好的基因检出数。图16说明除了mRNA外,scRNADOT-seq还能检测出lncRNA、circRNA等多种类的不含polyA的非编码RNA。这些结果表明scRNA DOT-seq是一个实用的单细胞转录组测序技术。
综上,本发明开发了U型接头介导的磁珠偶联转座酶并用于RNA快速均一化建库的技术,命名为RNA DOT-seq。原理是利用含测序接头的随机引物对RNA进行逆转录,生产RNA/DNA杂交双链;使用DOT-seq中的磁珠偶联转座酶对RNA/DNA杂交双链进行片段化;使用链置换酶进行末端修复,文库扩增。使用本方法进行RNA NGS建库,具有效率高、均一性好和产量高等显著的优点,非常适用于RNA自动化建库和低投入量RNA建库,也提供了应用于单细胞转录组测序的可能性。结合快速核糖体RNA去除技术(专利号:202110257924.X),单细胞转录组测序中不仅可以检测mRNA,也能够检测lncRNA和circRNA等不带polyA尾的RNA,基因检出数多、文库产量高、操作方便、均一性好,这极大地提高了转座酶在RNA NGS测序技术中的应用价值和应用前景。
Claims (8)
1.一种用于结合磁珠并偶联转座酶的U型接头,所述U形接头为:5’-[Phos] CTGTCTCTTATACACATCTNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTT[Int NH2 C6 dT]TTTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTA
GATGTGTATAAGAGACAG-3’、 5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT
CTNNNNNNNNAGATGTGTATAAGAGACAG-3’以及5’-[Phos] -CTGTCTCTTATACA
CAAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-3’三条寡核苷酸序列的退火产物,磁珠为羧基磁珠。
2.根据权利要求1所述的U型接头,其特征在于三条寡核苷酸中,长寡核苷酸与两条短寡核苷酸的摩尔量比为1:3:3-1:10:10。
3.根据权利要求1或2所述的U型接头,其特征在于U型接头的退火程序为95℃ 5 min,90℃ 5 min,85℃ 5 min,80℃ 5 min,75℃ 1 h,4℃ hold。
4.一种采用U型接头介导的磁珠偶联转座酶进行RNA快速均一化建库的方法,其特征在于其步骤包括:
(1)使用随机引物对RNA样本进行逆转录,得到DNA/RNA杂交链;
(2)使用U型接头介导的磁珠偶联转座酶对DNA/RNA杂交链进行片段化反应;
(3)片段化产物末端修复和文库扩增;
其中所述的U型接头为权利要求1、2或3所述的U型接头。
5.根据权利要求4所述的采用U型接头介导的磁珠偶联转座酶进行RNA快速均一化建库的方法,其特征在于逆转录反应使用随机引物N8,逆转录反应使用翌圣生物的Hifair® ⅡReverse Transcriptase;反应程序为25℃ 10 min,42℃ 30 min,85℃ 5 min。
6.根据权利要求5所述的采用U型接头介导的磁珠偶联转座酶进行RNA快速均一化建库的方法,其特征在于逆转录反应中还加入rRNA的逆转录阻碍探针。
7.根据权利要求4所述的采用U型接头介导的磁珠偶联转座酶进行RNA快速均一化建库的方法,其特征在于片段化反应条件为55℃反应10-30 min。
8.根据权利要求4所述的采用U型接头介导的磁珠偶联转座酶进行RNA快速均一化建库的方法,其特征在于片段化产物末端修复和文库扩增同时进行,末端修复使用逆转录酶,文库扩增使用翌圣生物的2×Hieff Canace® Gold PCR Master Mix高保真酶预混液,反应温度为40-65℃,反应时间为10-30 min。
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