CN113943726A - 一种提高dna编码化合物库纯度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高DNA编码化合物库纯度的方法，属于DNA编码化合物库提纯领域。本发明所述的DNA编码化合物库的纯化方法具有以下优势：1)能够快速、有效的去除DEL库中的杂质片段，显著提升DEL库的纯度；2)目的DNA片段回收率高，且没有特异的DNA序列片段的丢失。
Description
技术领域
本发明属于DNA编码化合物库纯化的技术领域，具体涉及一种利用羧基磁珠提高DNA编码化合物库纯度的方法。
背景技术
DNA编码化合物库(DEL)合成与筛选技术，在1992年由Brenner,S.和Lerner,R.A.两位科学家首次提出了这个概念(PNAS，1992，89(12)：5381-5383)。该方法将组合化学和分子生物学技术结合起来：使用组合化学中的“拆分-组合”的模式进行2个或以上的循环，可以快速构建数量巨大的化合物库，同时使用一段独特的DNA序列对一个有机化学试剂的反应结果进行编码，可以保证化合物库中每一个化合物都与独特的DNA序列一一标记。DNA编码化合物的合成和筛选技术相比于传统小分子化合物库有很多优势：1、DNA编码化合物库能够快速规模化地合成数百亿至万亿的化合物，而传统化合物库经历数十年也只积累了百万级的化合物；2、DNA编码化合物库能够在3-6个月完成整个化合物库多条件平行筛选，而传统的化合物库需要经历6-12个月对化合物逐一进行单条件筛选；3、DNA编码化合物的储存仅需要数个低温冰箱存放，筛选不依赖于大型筛选设备，成本低廉，使用方便，而传统小分子化合物库需要昂贵且复杂的样品储存和管理系统，依赖于大型筛选设备，需要巨额的资金投入。
DNA编码化合物库在合成的过程涉及到多轮DNA连接，每一步连接反应都会存在部分原料剩余，且多轮反应的剩余原料也会积累和反应，从而导致目的DNA片段纯度的下降。在最终产品的毛细电泳分析中，未经纯化处理的DNA编码化合物库的目的片段纯度相对较低，只有40％左右。目的片段DNA纯度过低会对后续筛选产生非常不利的影响：1、为了保证有效DNA编码化合物库的投入量，需要投入更多的总DNA，引入更多的杂质，影响DNA编码化合物库的溶解性及筛选效果；2、部分DNA杂质可能携带完整的小分子，DNA片段却不完整，这样的杂质可以与目的靶标结合，但其DNA分子不能被DNA测序仪读出，减小了阳性小分子被筛选出来的可能性。因此，提高DEL库目的DNA片段的纯度，将能够有效提升DEL库的质量，提升应用价值。
目前DEL库纯化一般使用HPLC进行纯化，虽然能够去除部分多余的短片段，但仍然存在一些问题：1)HPLC主要依靠极性进行分离，对带小分子的DNA杂质去除效果不够理想；2)HPLC为线性串联的分离方式，HPLC纯化柱每次只能纯化一个样品，需要大量时间进行充分洗脱，成本较高；3)不同的DEL库使用同一个纯化柱进行纯化可能会导致库与库之间出现交叉污染。因此需要开发一种方便、快速的能够有效去除杂质DEL片段的方法，提升DEL库质量。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用羧基磁珠提高DNA编码化合物库纯度的方法，向DNA编码化合物库中加入羧基磁珠溶液，使目的DNA片段与羧基磁珠结合，使杂质DNA保留于溶液中，所述目的DNA片段的长度为80～150个碱基，将结合目的DNA片段的羧基磁珠与杂质DNA片段溶液分离；再使目的DNA片段与羧基磁珠分离，即对目的DNA片段提纯。
本发明的具体技术方案如下：
一种提高DNA编码化合物库纯度的方法，包括以下步骤：
(1)向DNA编码化合物库中加入缓冲溶液，将溶液浓度稀释至0.5-3.0μg/μL；
(2)向步骤(1)溶液中加入羧基磁珠溶液，混合均匀后在室温放置5～30分钟；使DNA编码化合物库中的目的DNA片段与羧基磁珠结合，杂质DNA片段保留于溶液中；
(3)利用磁场作用使羧基磁珠沉降，吸出上清液；
(4)对羧基磁珠进行洗涤，洗涤完成后再利用磁场作用使羧基磁珠沉降，吸出上清液；
(5)再向步骤(4)中加入洗脱液，使所有羧基磁珠均重悬，室温放置5～30分钟；再利用磁场作用，直至羧基磁珠全部沉降，收集上清液，即目的DNA片段。
作为优选，步骤(1)所述的缓冲溶液为浓度10mM的Tris缓冲盐溶液，pH为7.0～8.0。
本发明中所述DNA编码化合物库(DEL)可以按照WO2005058479、WO2006135786或CN103882532等所公开的方法进行制备，由单链或双链DNA与小分子化合物部分组成。
作为优选，步骤(2)中所述的目的DNA片段的长度为80～150个碱基，所述杂质DNA片段为DNA编码化合物库合成过程中未完全反应的DNA或带小分子的DNA原料，长度一般小于80个碱基。
作为优选，步骤(2)中所述的羧基磁珠浓度为0.8～1.2mg/mL，加入量为步骤(1)溶液体积的1.2-2.4倍；更优选地，羧基磁珠浓度为1.0mg/mL；羧基磁珠溶液中除羧基磁珠外还包含：质量浓度为15-20％的PEG8000,10mM的Tris缓冲盐溶液，1mM的EDTA盐溶液，1M的氯化钠和0.05％的吐温20溶液，pH＝7.0-8.0。
作为优选，步骤(4)中对羧基磁珠进行洗涤，具体洗涤步骤为：向步骤(3)中加入2～4倍的步骤(1)溶液体积、浓度为70％-80％的乙醇对羧基磁珠进行洗涤，以去除步骤(3)中未去除干净的上清及羧基磁珠表面的无机盐；更优选地，向步骤(3)中加入3倍的步骤(1)溶液体积、浓度为70％-80％的乙醇对羧基磁珠进行洗涤。
作为优选，重复步骤(4)1～2次，洗涤完成后将乙醇吸干，室温放置5-10min直至乙醇完全挥发。
作为优选，步骤(5)中所述洗脱液为浓度10mM的Tris缓冲盐溶液，其pH为7.0-8.0，加入量为步骤(1)中溶液体积的0.8-1.2倍。
步骤(3)中所述的上清液为DNA编码化合物库与羧基磁珠孵育后的不结合部分，包含羧基磁珠溶液中除羧基磁珠外的组分、未与羧基磁珠结合的DNA编码化合物库组分。
步骤(4)中所述的上清液主要是浓度为70％-80％的乙醇溶液，溶解了步骤(3)中未去除干净的上清液和羧基磁珠表面的无机盐。
步骤(5)中所述的上清液为纯化后的目的DNA编码化合物库，溶解于10mM,pH为7.0-8.0的Tris盐溶液。
本发明所述的用于DNA编码化合物库的纯化方法，相较于传统的DNA编码化合物库纯化方法具有以下优势：
1)能够快速、有效的去除DEL库中的杂质片段，显著提升DEL库的纯度，目的片段纯度提升30-40％；
2)低成本，操作简单；
3)样品与样品之间不需要任何清洗步骤，多个样品可以平行操作；
4)目的DNA片段回收率较高，能达到80％左右，没有特异的DNA序列片段的丢失。
附图说明
图1：实施例1中DNA编码化合物库1的琼脂电泳胶图。
图2：实施例1中DNA编码化合物库1的安捷伦2100生物分析仪检测结果。
图3：实施例1中DNA编码化合物库2的琼脂电泳胶图。
图4：实施例1中DNA编码化合物库2的安捷伦2100生物分析仪检测结果。
图5：实施例2中不同品牌的羧基磁珠纯化DNA编码化合物库的琼脂糖电泳图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1DNA编码化合物库的羧基磁珠纯化
本实施例对2种不同的DNA编码化合物库使用相同的方法进行纯化。所述DNA编码化合物库(DEL)可以按照WO2005058479等所公开的方法进行制备。
DNA编码化合物库1的目的片段由99个碱基长度的DNA链和约五百万不同的小分子化合物组成。DNA编码化合物库2的目的片段由112个碱基长度的DNA链和约一亿不同的小分子化合物组成。
使用安捷伦2100生物分析仪对样品的目的片段进行分析、定量，纯度均为47％(图2和图4纯化前溶液)。对上述DNA编码化合物库进行羧基磁珠纯化，具体方法如下：
1.羧基磁珠纯化前准备：
1.1从冰箱中将羧基磁珠拿出，室温放置使其温度恢复到室温；
1.2使用Qubit对DNA编码化合物库进行定量，根据定量结果，使用Tris缓冲盐溶液(pH＝8.0,10mM)将浓度稀释至0.7-3.0μg/μL；
2.DEL库进行羧基磁珠纯化
2.1将羧基磁珠溶液震荡混匀后，吸取1.4倍步骤1.2溶液体积的羧基磁珠溶液加入到DNA编码化合物库溶液中，室温放置5分钟；
2.2待羧基磁珠全部沉降后，通过磁力吸附到管壁，将上清液吸出；
2.3加入3倍的步骤1.2溶液体积、浓度为70％的乙醇对羧基磁珠进行洗涤，静置，待羧基磁珠全部沉降后，通过磁力吸附到管壁，将上清液吸出；
2.4重复步骤2.3一次；
2.5将残余的废液尽量吸取干净，室温放置5-10分钟直至乙醇完全挥发；
2.6加入体积为步骤1.2溶液体积1.0倍的Tris缓冲盐溶液(pH＝8.0，10mM)，离心管震荡混匀，重悬后室温放置5分钟；
2.7使用离心机将离心管瞬离3秒，静置后待羧基磁珠全部沉降，将上清液吸出，转移至另一个新的离心管；
2.8重复2.7步骤，将2次上清合并，即得到目的DNA片段。
3.纯化效果检测
对纯化前溶液、纯化后的上清、纯化中的上清进行电泳检测和定量：将上述样品稀释到10pmol/μL进行琼脂糖电泳；电泳参数：电压120V，时间40分钟，使用BIO-RAD凝胶成像仪进行胶图成像。
Agilent 2100检测：将纯化前溶液、纯化后的上清进行Qubit定量，根据定量结果将样品稀释到10ng/μL，然后进行Agilent 2100检测。
上述纯化后的上清：指步骤2.8收集的上清液；上述纯化中的上清：指2.2、2.3、2.4、2.5收集的混合上清液。
使用琼脂糖和安捷伦2100生物分析仪对DNA编码化合物库纯化前后的样品进行检测，检测结果参见图1至图4.
琼脂糖凝胶电泳结果(图1和图3)显示，纯化后目的DNA片段的纯度明显高于纯化前，纯化中的上清液包含的主要是短杂质DNA片段；安捷伦2100生物分析仪的检测纯化前后样品表明目的DNA片段的纯度由纯化前的47％分别提升到了纯化后的79％和78％(图2和图4)。
实施例2不同品牌的羧基磁珠的纯化效果
本实施例中使用2种不同品牌(A和B)的羧基磁珠对相同的DNA编码化合物库进行纯化，验证该方法是否适用于不同品牌的羧基磁珠。
A：Axygen磁珠，货号：MAGN-DNA-SS-250；
B：GE磁珠，货号：65152105050350。
本实施例中使用的DNA编码化合物库目的片段由112个碱基长度的DNA链和约二十亿不同的小分子化合物组成。具体方案如下：
1.羧基磁珠纯化前准备：
1.1从冰箱中将羧基磁珠拿出，室温放置使其温度恢复到室温；
1.2使用Qubit对DNA编码化合物库进行定量，根据定量结果，使用Tris缓冲盐溶液(pH＝8.0,10mM)将浓度稀释至0.7-3.0μg/μL；
2.DEL库进行羧基磁珠纯化
按照实施例1中的相同方法进行羧基磁珠纯化；
3.羧基磁珠纯化效果检测。
对纯化前溶液、纯化后的上清、纯化中的上清进行电泳检测和定量：将上述样品稀释到10pmol/μL进行琼脂糖电泳；电泳参数：电压120V，时间40分钟，使用BIO-RAD凝胶成像仪进行胶图成像。
检测结果见图5，结果显示不同品牌的羧基磁珠纯化DNA编码化合物库的效果没有明显差异，均能明显提升DNA编码化合物库的纯度。
Claims (7)
1.一种提高DNA编码化合物库纯度的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)向DNA编码化合物库中加入缓冲溶液，将溶液浓度稀释至0.5～3.0μg/μL；
(2)向步骤(1)溶液中加入羧基磁珠溶液，混合均匀后放置5～30分钟；使DNA编码化合物库中的目的DNA片段与羧基磁珠结合，杂质DNA片段保留于溶液中；
(3)利用磁场作用使羧基磁珠沉降，吸出上清液；
(4)对羧基磁珠进行洗涤，洗涤完成后再利用磁场作用使羧基磁珠沉降，吸出上清液；
(5)再向步骤(4)中加入洗脱液，使所有羧基磁珠均匀重悬，室温放置5～30分钟；再利用磁场作用，直至羧基磁珠全部沉降，收集上清液，即目的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的缓冲溶液为浓度10mM的Tris缓冲盐溶液，pH为7.0～8.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的目的DNA片段的长度为80～150个碱基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的羧基磁珠浓度为0.8～1.2mg/mL，加入量为步骤(1)溶液体积的1.2～2.4倍。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中对羧基磁珠进行洗涤，具体洗涤步骤为：向步骤(3)中加入2～4倍的步骤(1)溶液体积、浓度为70％～80％的乙醇对羧基磁珠进行洗涤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：重复步骤(4)1～2次，洗涤完成后将乙醇吸干。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所述洗脱液为浓度10mM的Tris缓冲盐溶液，其pH为7.0～8.0，加入量为步骤(1)中溶液体积的0.8～1.2倍。
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