CN113940928A

CN113940928A - 铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在制备治疗肺炎药物中的应用

Info

Publication number: CN113940928A
Application number: CN202111482476.XA
Authority: CN
Inventors: 徐峰; 戴敏; 夏靖燕
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-12-07
Filing date: 2021-12-07
Publication date: 2022-01-18

Abstract

本发明公开了铁死亡抑制剂Ferrostatin‑1在制备治疗肺炎药物中的应用，具体涉及医药领域。本发明提供的铁死亡抑制剂Ferrostatin‑1在制备治疗肺炎药物中的应用，铁死亡抑制剂Ferrostatin‑1可以显著降低SA诱导的患有肺炎后血清中LDH水平，抑制肺组织中ptgs2表达，促进肺中GPX4表达，抑制炎细胞向肺部浸润。铁死亡抑制剂Ferrostatin‑1对SA诱导肺炎的保护作用与抑制肺细胞铁死亡有关。因此，本发明为临床肺炎的治疗提供了新的可能的方向和具体措施。

Description

铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在制备治疗肺炎药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在制备治疗肺炎药物中的应用。

背景技术

铁死亡是一种铁依赖性、脂质过氧化物驱动的细胞死亡方式，在机制和表型上与其他细胞死亡不同。发生铁死亡的细胞主要有三大特征：游离铁的增加、脂质过氧化物的积累以及在形态学上不同于自噬、凋亡、焦亡或坏死性凋亡的死亡表型。与免疫沉默的细胞凋亡不同，铁死亡具有免疫原性，发生铁死亡的细胞释放损伤相关分子模式(DAMP)和警报蛋白，进一步放大细胞死亡并促进一系列炎症反应。越来越多的研究证实了铁死亡的促炎作用，抑制铁死亡具有显著的抗炎作用。然而，目前尚没有金葡菌感染是否能诱导细胞铁死亡以及铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1，Fer-1)在治疗金葡菌肺炎中的作用。

金黄色葡萄球菌(金葡菌，SA)是一种革兰氏阳性球菌，能够感染人体几乎所有组织，导致肺炎、蜂窝织炎、骨髓炎、心内膜炎、脑脓肿等。金葡菌引起的肺炎是急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的主要原因。金葡菌感染可以募集多种免疫细胞并诱导细胞死亡。高度促炎的细胞死亡，如焦亡和坏死性凋亡会释放多种细胞因子和病原相关分子模式(PAMP)，引起炎症反应。虽然适度的炎症反应有助于招募吞噬细胞并清除感染细胞，但过度的炎症反应也会导致严重的组织损伤和免疫细胞丢失。因此，在病原体清除过程中，过度的免疫反应会加重肺部病理损伤，影响肺功能，从而显著增加死亡率。尽管抗生素治疗能够缓解金葡菌感染，但新的抗生素耐药菌株的出现，如甲氧西林耐药金葡菌(MRSA)，大大提高了致死率。目前，还没有有效治疗MRSA的药物或策略。因此，除了加紧研发新的抗生素外，如何通过调节机体天然免疫系统来抵御金葡菌感染，是感染免疫学领域的重要科学问题。

公开号为CN111529518A的申请专利公开了铁死亡抑制剂在制备防治淹溺所致的肺损伤药物中的应用，该铁死亡抑制剂为Ferrostatin-1，通过小鼠和细胞实验验证，铁死亡抑制剂Ferrostatin-1抑制铁死亡，明显改善了淹溺引起的小鼠肺损伤和细胞损伤，对淹溺导致的肺损伤具有显著的保护作用。授权号为CN109453173B的申请专利公开了铁死亡抑制剂的用途，所述铁死亡抑制剂包括Liproxstatin-1、Ferrostatin-1、rosiglitazone、pioglitazone、troglitazone和Zileuton，所述新用途是该类抑制剂用于治疗放射性肺损伤疾病。但是关于本发明铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在制备治疗肺炎药物中的应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在制备治疗肺炎药物中的应用。

本发明提供了铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在制备治疗肺炎药物中的应用。

优选的，所述肺炎由金黄色葡萄球菌感染引起。

作为本发明的一种优选技术方案：所述应用为促进肺炎组织中GPX4的表达。

谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)是一种调控铁死亡的关键酶，能够通过催化脂质过氧化物的还原反应，进而抑制铁死亡的发生。

作为本发明的一种优选技术方案：所述应用为抑制肺炎组织中ptgs2的表达。

作为本发明的一种优选技术方案：所述应用为降低患肺炎后血清中的乳酸脱氢酶(LDH)水平。

乳酸脱氢酶是体内能量代谢过程中的一个重要的酶。此酶几乎存在于所有组织中，以肝、肾、心肌、骨骼肌、胰腺和肺中为最多。这些组织中的LDH的活力比血清中高得多。所以当少量组织坏死时，该酶即释放而使血液中的活力升高。

作为本发明的一种优选技术方案：所述应用为抑制肺炎组织中发生铁死亡。

作为本发明的一种优选技术方案：所述应用为减少炎症细胞向肺部浸润。

作为本发明的一种优选技术方案：所述应用为抑制肺炎组织中的细菌负荷。

本发明还提供了一种用于治疗肺炎的药物，活性成分为铁死亡抑制剂Ferrostatin-1或其医学上可接受的盐。

优选的，所述肺炎由金黄色葡萄球菌感染引起。

本发明的有益效果：本发明提供了铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在制备治疗肺炎药物中的应用采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：

(1)本发明提供的铁死亡抑制剂Ferrostatin-1可以显著降低SA诱导的患有肺炎后血清中LDH水平，抑制肺组织中ptgs2表达，促进肺中GPX4表达，抑制炎细胞向肺部浸润。

(2)铁死亡抑制剂Ferrostatin-1对SA诱导肺炎的保护作用与抑制肺细胞铁死亡有关。因此，本发明为临床肺炎的治疗提供了新的可能的方向和具体措施。

附图说明

图1为金葡菌感染后诱导的细胞死亡及Fer-1对细胞死亡的保护作用图；其中，a为不同感染复数(multiple of infection，MOI)金葡菌感染诱导的细胞死亡百分比图；b为加入不同浓度Fer-1后的细胞死亡百分比图；“*”代表p<0.05，“**”代表p<0.01，“****”代表p<0.0001。

图2为对金葡菌诱导的BMDMs铁死亡的抑制实验图；其中，a为铁死亡抑制剂Fer-1对金葡菌诱导GPX4相关表达的影响图；b为铁死亡抑制剂Fer-1对金葡菌诱导铁死亡标志物ptgs2相关表达的影响图；c为铁死亡抑制剂Fer-1对金葡菌诱导细胞ROS水平图；d为铁死亡抑制剂Fer-1对金葡菌诱导细胞脂质过氧化物水平图；e为铁死亡抑制剂Fer-1对金葡菌诱导细胞中Fe²⁺的水平图；f为铁死亡抑制剂Fer-1对金葡菌诱导细胞中线粒体形态图；“*”代表p<0.05，“**”代表p<0.01。

图3为铁死亡抑制剂Fer-1对金葡菌肺炎的保护作用图；其中，a为铁死亡抑制剂Fer-1对金葡菌肺炎小鼠生存率的影响图；b和c为铁死亡抑制剂Fer-1对金葡菌肺炎小鼠炎症因子IL-6和TNF-α的影响图；d为铁死亡抑制剂Fer-1对金葡菌肺炎小鼠肺组织细菌负荷的影响图；e为铁死亡抑制剂Fer-1对金葡菌肺炎小鼠肺部病理变化的影响图；“*”代表p<0.05，“**”代表p<0.01，“***”代表p<0.001。

具体实施方式

实施例1

对金葡菌感染的骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)损伤的保护实验。

(1)提取C57BL/6小鼠BMDMs，使用不同MOI金葡菌进行刺激(MOI＝0，50，100，200)，3小时后直接收取上清，用碧云天乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒检测上清中乳酸脱氢酶(LDH)水平，评估细胞死亡程度。

(2)提取C57BL/6小鼠BMDMs，使用金葡菌刺激(MOI＝200)，刺激前一个小时加入浓度为0、5和10μM的铁死亡抑制剂Fer-1，3小时后收取上清，检测上清中LDH水平，评估细胞死亡程度。

不同浓度金葡菌感染诱导的细胞死亡百分比以及加入不同浓度Fer-1后的细胞死亡百分比如图1所示。结果显示，图1-a中，金葡菌感染后细胞死亡百分比增加，MOI越高，细胞死亡百分比越大；图1-b中，Fer-1显著抑制金葡菌诱导的细胞死亡。

实施例2

对金葡菌诱导的BMDMs铁死亡的抑制实验。

提取C57BL/6小鼠BMDMs，使用金葡菌刺激(MOI＝200)后3小时收样，实验分为四组：PBS、SA、SA+Fer-1、SA+DMSO，其中PBS组为向细胞中加入50μL PBS；SA组为向细胞中加入MOI＝200，体积为50μL的金葡菌悬液；SA+Fer-1组为向细胞中加入MOI＝200，体积为50μL的金葡菌悬液，同时加入10μM的铁死亡抑制剂Fer-1；SA+DMSO组为向细胞中加入MOI＝200，体积为50μL的金葡菌悬液，同时加入与Fer-1等体积的DMSO。

(1)PCR检测谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)和前列腺素内过氧化物合酶2(ptgs2)表达。

(2)根据试剂盒说明书(碧云天活性氧检测试剂盒，产品编号：S0033M；同仁二价铁离子检测探针-FerroOrange，货号：F374；同仁Liperfluo-细胞脂质过氧化物检测，货号：L248)，用无血清培养基将染液稀释为(1-10μM)的工作液，除去培养基后，用无血清培养基清洗一次，加入400μL合适浓度的工作液，在37℃培养箱孵育30min，除去上清后，无血清培养基洗两次，冰甲醇固定10min，将细胞爬片正面向下盖在滴有DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)的载玻片上，指甲油固定，共聚焦观察细胞内ROS(活性氧)、脂质过氧化物和Fe²⁺水平。

(3)透射电镜观察线粒体形态：2.5％戊二醛(PBS配制)固定过夜后，用1％四氧化锇进行固定，并用酒精脱水，然后将样品嵌入环氧丙烷和树脂(1:1)的混合物中过夜。之后，将样品切成100nm切片，然后使用4％醋酸铀酰和0.5％柠檬酸铅进行染色。最后，在透射电子显微镜下观察线粒体的超微结构。

铁死亡抑制剂Fer-1对金葡菌诱导GPX4和铁死亡标志物ptgs2的表达、细胞ROS、脂质过氧化物和Fe²⁺的水平，对线粒体形态的影响如图2所示。结果显示，图2-a中，铁死亡抑制剂Fer-1减少了金葡菌对GPX4表达的抑制；图2-b中，铁死亡抑制剂Fer-1降低金葡菌诱导的ptgs2表达；图2-c中，铁死亡抑制剂Fer-1减少金葡菌诱导的ROS；图2-d中，铁死亡抑制剂Fer-1减少金葡菌诱导的脂质过氧化物；图2-e中，铁死亡抑制剂Fer-1减少金葡菌诱导的Fe²⁺；图2-f中，铁死亡抑制剂Fer-1减轻金葡菌诱导的线粒体形态改变。

实施例3

小鼠金葡菌肺炎模型的构建。

C57BL/6小鼠(雌性，18-20g)，经水合氯醛麻醉后，经气道滴注50μL PBS或金葡菌悬液，小鼠平躺至苏醒，金葡菌感染前1h腹腔注射Fer-1(12.5μmoL/kg)或相同体积的DMSO(溶解在PBS中，占总体积1％)。实验分为4组：PBS组、SA组、SA+Fer-1组和SA+DMSO组，其中PBS组为经气道滴注50μL PBS处理组；SA组为经气道滴注50μL金葡菌悬液处理组；SA+Fer-1组为经气道滴注50μL金葡菌悬液，金葡菌感染前1h腹腔注射Fer-1(每只小鼠按12.5μmoL/kg的量注射)处理组；SA+DMSO组为经气道滴注50μL金葡菌悬液，金葡菌感染前1h腹腔注射DMSO(溶解在PBS中，占总体积1％，和SA+Fer-1组相同体积注射)处理组。生存率实验给予菌落数为4×10⁸CFU的金葡菌，其他实验给予菌落数为1×10⁸CFU的金葡菌。

对金葡菌感染小鼠的保护实验。

(1)生存率实验：将致死剂量的金葡菌经气道滴注到小鼠气管内，观察小鼠生存情况。

(2)24h后收取肺泡灌洗液(BALF)，ELISA检测炎症因子IL-6和TNF-α；收取肺，一部分匀浆，检测肺组织细菌载量；一部分用4％多聚甲醛固定，HE染色观察肺组织病理变化。

铁死亡抑制剂Fer-1对金葡菌肺炎小鼠生存率、炎症因子、肺组织细菌负荷和病理变化的影响如图3所示。结果显示，图3-a中，铁死亡抑制剂Fer-1显著增加金葡菌肺炎小鼠生存率；图3-b和图3-c中，铁死亡抑制剂Fer-1显著减少炎症因子IL-6和TNF-α；图3-d中，铁死亡抑制剂Fer-1显著减少肺组织细菌负荷；图3-e中，铁死亡抑制剂Fer-1显著缓解金葡菌感染引起的肺组织损伤。

结论：金葡菌感染诱导巨噬细胞发生铁死亡，铁死亡抑制剂Fer-1抑制金葡菌感染诱导的巨噬细胞铁死亡，对金葡菌感染引起的肺损伤有显著的保护作用。

Claims

1.铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在制备治疗肺炎药物中的应用。

2.如权利要求1所述的铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在制备治疗肺炎药物中的应用，其特征在于，所述肺炎由金黄色葡萄球菌感染引起。

3.如权利要求1所述的铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在制备治疗肺炎药物中的应用，其特征在于，所述应用为促进肺炎组织中GPX4的表达。

4.如权利要求1所述的铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在制备治疗肺炎药物中的应用，其特征在于，所述应用为抑制肺炎组织中ptgs2的表达。

5.如权利要求1所述的铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在制备治疗肺炎药物中的应用，其特征在于，所述应用为降低患肺炎后血清中的乳酸脱氢酶水平。

6.如权利要求1所述的铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在制备治疗肺炎药物中的应用，其特征在于，所述应用为抑制肺炎组织中发生铁死亡。

7.如权利要求1所述的铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在制备治疗肺炎药物中的应用，其特征在于，所述应用为减少炎症细胞向肺部浸润。

8.如权利要求1所述的铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在制备治疗肺炎药物中的应用，其特征在于，所述应用为抑制肺炎组织中的细菌负荷。

9.一种用于治疗肺炎的药物，其特征在于，活性成分为铁死亡抑制剂Ferrostatin-1或其医学上可接受的盐。

10.如权利要求9所述用于治疗肺炎的药物，其特征在于，所述肺炎由金黄色葡萄球菌感染引起。