CN113929671A - 一种具有细胞器依次成像和双色成像功能的光激活探针及其应用 - Google Patents

一种具有细胞器依次成像和双色成像功能的光激活探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于光激活荧光探针的技术领域，公开了一种具有细胞器依次成像和双色成像功能的光激活探针及其应用。光激活荧光探针的结构为式I，R1～R4为独立的氢；R5为亚烷基羧基、亚烷基酯基、亚烷基铵盐基。所述光激活荧光探针在脂滴与线粒体荧光成像中的应用，特别是细胞内脂滴和线粒体的依次成像和双色成像。本发明的光激活荧光探针用于监测脂滴和线粒体在氧化应激下的相互作用以及监测脂滴和/或线粒体在氧化应激下形态变化。本发明的光激活荧光探针能够选择性地点亮处于氧化应激状态的脂滴，其在细胞内原位光激活的产物能够特异性染色线粒体，具有光稳定性好、线粒体驻留能力强、信噪比高、斯托克位移大等优点。

Description

一种具有细胞器依次成像和双色成像功能的光激活探针及其 应用
技术领域
本发明属于医用材料的技术领域，涉及一种光激活探针，具体涉及一种具有细胞器依次成像和双色成像功能的光激活探针及其应用。本发明的光激活探针为三苯胺噻吩乙烯基取代的四氢吡啶衍生物，用于不同细胞器依次成像以及监测不同细胞器在氧化应激下相互作用。
背景技术
氧化应激是指氧化还原失衡的一种状态，与许多疾病的发生和发展息息相关，如：癌症、炎症和神经退行性疾病等。通常，细胞内过量的活性氧(ROS)能够破坏细胞内的氧化还原平衡，进而诱导细胞发生氧化应激。研究表明，细胞器在ROS诱导的氧化应激过程中扮演着重要的角色。例如：脂滴在细胞内ROS含量过高时起到抗氧化保护作用。另外，线粒体被认为对ROS敏感，并在ROS的影响下发生形态变化。因此，在氧化应激过程中实现对不同细胞器的成像及其动态变化监测有助于研究不同细胞器在细胞应对过量ROS时的生理功能。
荧光成像技术因其时空分辨率高的优点，特别适合于细胞器的原位实时动态成像。基于此，许多荧光探针目前已被开发应用于原位实时监测脂滴和线粒体的动态变化。然而，由于脂滴和线粒体性质的差异，其特异性靶向探针的性质也不同：亲脂性的探针通常靶向具有脂质内核的脂滴，而阳离子离域的芳香族基团(如：三苯基膦盐等)则用于靶向带负电的线粒体。因此，为了实现线粒体和脂滴的同时成像，研究人员通常需要加入至少两种荧光染料，但这种方法严重受限于：(1)细胞对不同染料摄入的差异；(2)繁琐的染色过程；(3)染料发射光谱的重叠等。此外，现有的脂滴和线粒体染料均存在不足：一方面，几乎没有脂滴染料能够以“荧光点亮”的方式直接识别处于氧化应激下的脂滴；另一方面，商品化的线粒体染料的驻留能力和光稳定性较差，不利于长期监测线粒体的形态变化。因此，开发一种能够实现脂滴和线粒体双色成像并长期监测两者在氧化应激过程中的动态变化的荧光探针具有十分重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种具有细胞器依次成像和双色成像功能的光激活荧光探针。在光照和有氧的条件下，本发明的探针中部分探针发生光氧化脱氢反应生成三苯胺噻吩乙烯基取代的吡啶鎓盐衍生物，同时产生大量活性氧，活性氧使脂滴表面的通透性增大，进而使未发生光氧化脱氢反应的探针进入脂滴极性较小的疏水内核，从而发光显著增强，实现脂滴特异性荧光成像；而三苯胺噻吩乙烯基取代的吡啶鎓盐衍生物能够特异性染色线粒体，实现线粒体荧光成像。若是通过继续光照，探针继续发生光氧化脱氢反应，三苯胺噻吩乙烯基取代的吡啶鎓盐衍生物的含量增大，活性氧增多，线粒体中荧光增强；另外，光氧化脱氢反应所生成的大量活性氧能够诱导细胞发生氧化应激。
本发明的另一目的在于提供上述的光激活荧光探针的应用。所述光激活荧光探针在脂滴与线粒体成像中的应用，通过光激活实现脂滴和线粒体的双色成像。所述光激活荧光探针还可以用于监测脂滴与线粒体在氧化应激下的相互作用以及脂滴和线粒体氧化应激下结构和形态的变化。本发明的光激活荧光探针为区分氧化应激状态的脂滴和非氧化应激状态的脂滴的探针，可区分氧化应激状态的脂滴和正常脂滴。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具有细胞器依次成像和双色成像功能的光激活荧光探针，其结构为式I：
Figure BDA0003305918580000021
其中，R1、R2、R3、R4为独立的氢。
R5为-亚烷基羧基(通式为：-R-COOH，R为亚烷基)、-亚烷基酯基(通式为：-R-COO-R′，R为亚烷基，R′为烷基)、亚烷基铵盐基(通式为：-R-N(R′)3X′，R为亚烷基，R′为烷基，X′为阴离子)。
R5中所述亚烷基各自为C1-10亚烷基，优选为直链亚烷基。所述烷基为C1-10烷基，优选为C1-5烷基。
所述R5优选为亚烷基铵盐基，亚烷基铵盐基结构式：-R-N(R′)3X′，R为亚烷基，R′为烷基，X′为阴离子，其中R′优选C1-5烷基，更优选为甲基，阴离子为卤素，更优选为溴离子。
一种利用上述光激活荧光探针制备线粒体荧光成像剂的方法，包括以下步骤：将上述光激活荧光探针在光照和有氧的条件下进行脱氢反应，获得线粒体荧光成像剂。
所述光照为白光或405nm激光。光照的强度为1-40mW/cm2。
所述线粒体荧光成像剂为式II：
Figure BDA0003305918580000031
所述反应在介质中进行，所述介质是指在光照氧化脱氢时，能够提供一价阴离子的介质。所述一价阴离子为氯离子、溴离子、氢氧根离子、硝酸根离子、醋酸根离子、有机羧酸根离子。如：介质为细胞提供的环境，又或者介质为含有非极性或弱极性物质的环境。
式II中，X-为介质提供的一价阴离子，如：Gl-、Br-、OH-等。
式I的三苯胺噻吩乙烯基取代的四氢吡啶衍生物在发生光氧化脱氢反应后会生成式II的三苯胺噻吩乙烯基取代的吡啶鎓盐衍生物，反应方程式：
Figure BDA0003305918580000032
所述光激活荧光探针的制备方法为在有机溶剂中，将式II的三苯胺噻吩乙烯基取代的吡啶鎓盐衍生物通过还原剂还原，得到光激活荧光探针。所述还原剂为硼氢化钠。
光激活探针制备的反应方程式：
Figure BDA0003305918580000041
所述光激活荧光探针在脂滴与线粒体荧光成像中的应用，通过光激活实现脂滴和线粒体的双色成像。光激活的条件为光照和有氧的条件，光照为白光或405nm激光。光照的强度为1-40mW/cm2。所述光激活荧光探针在脂滴与线粒体荧光成像中的应用，作为脂滴与线粒体荧光成像的探针。
所述光激活荧光探针在细胞内脂滴与线粒体荧光成像中的应用，通过光激活实现脂滴和线粒体的依次成像和双色成像。光激活的条件为光照和有氧的条件，光照为白光或405nm激光。光照的强度为1-40mW/cm2。
所述光激活荧光探针用于区分氧化应激状态的脂滴和非氧化应激状态的脂滴。所述光激活荧光探针在氧化应激下的脂滴中发光显著增强，发射波长蓝移。
一种利用光激活探针实现细胞内脂滴与线粒体依次成像和双色成像的方法，包括以下步骤：将细胞与探针孵育，光照，实现脂滴和线粒体依次成像以及脂滴和线粒体双色成像。光照为白光或405nm激光。光照的强度为1-40mW/cm2。
本发明的探针为具有脂滴和线粒体依次荧光成像和双色成像功能的探针，通过光激活实现氧化应激状态的脂滴和线粒体特异性荧光成像的探针。
本发明的探针在未光激活时，细胞中脂滴的荧光强度较弱，光激活过程中，探针产生大量活性氧，诱导细胞发生氧化应激，使探针在脂滴中荧光强度增强并发射波长蓝移，同时光激活后的探针能够实现线粒体特异性荧光成像，因此，本申请的探针具有脂滴和线粒体依次荧光成像功能。在光激活下，本发明的探针发生光氧化脱氢反应生成三苯胺噻吩乙烯基取代的吡啶鎓盐衍生物，本发明的探针和三苯胺噻吩乙烯基取代的吡啶鎓盐衍生物发射光谱几乎没有重叠，因此，本发明的探针在氧化应激状态脂滴中荧光成像和三苯胺噻吩乙烯基取代的吡啶鎓盐衍生物线粒体中荧光成像为双色荧光成像。
本发明的光激活荧光探针用于监测不同细胞器在氧化应激下的相互作用，尤其是用于监测脂滴和线粒体在氧化应激下的相互作用。细胞中脂滴和线粒体在氧化应激下相互靠近、接触。
本发明的光激活荧光探针用于监测脂滴和/或线粒体在氧化应激下形态变化。
所述光激活荧光探针可用于不同细胞器的依次成像并监测其相互作用，尤其是针对氧化应激下脂滴与线粒体的依次荧光点亮成像及两者相互作用的监测。本发明的光激活荧光探针在白光照射下即能快速高效激活，生成发光显著红移的产物，且无毒副产物生成；将具有细胞器依次成像功能的光激活荧光探针应用于细胞中，并在有氧的条件下进行光照，利用其光动力活性诱导细胞氧化应激及其光激活所生成的发光显著红移的产物，实现脂滴、线粒体的依次荧光点亮成像，并监测两者在氧化应激过程中的相互作用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明的光激活荧光探针可用于脂滴与线粒体的依次光激活荧光成像。与现有的尼罗红(Nile Red)脂滴染料相比，本发明的光激活荧光探针能够选择性地点亮处于氧化应激状态的脂滴，可反映脂滴结构在氧化应激下的变化。本发明的光激活荧光探针在光照发生结构转变后可选择性地染色线粒体，其与现有的线粒体深红(MitoTracker Deep Red)和四甲基罗丹明乙酯(TMRE)线粒体染料相比具有更好的光稳定性和更强的线粒体驻留能力，可长期监测线粒体在氧化应激过程中的形态变化。
2、本发明的光激活荧光探针能够在光照下实现对脂滴与线粒体的原位双色同时荧光成像，进而监测两者在氧化应激下的相互作用。该方法简便、避免了多种染料的加入、及荧光成成像时不同染料发射光谱间的串扰。
附图说明
图1为化合物I-1在光照下实现脂滴-线粒体依次成像及其成像机理的示意图；
图2为化合物I-1的核磁氢谱和碳谱图；左图为氢谱图，右图为碳谱图；
图3为化合物I-1的高分辨质谱结果图；
图4为化合物I-1光物理性质的表征图；(A)化合物I-1的紫外吸收光谱图，及其在磷酸缓冲液或1，4-二氧六烷中的荧光发射光谱图(40μM)；(B)化合物I-1在1，4-二氧六烷和水的混合溶液中不断增加1，4-二氧六烷含量的荧光发射光谱图(40μM)，激发波长为371nm；(C)化合物I-1(10μM)在1，4-二氧六烷和水的混合溶液中不断增加1，4-二氧六烷含量的463nm处荧光发射强度的比值变化图及其最大发射波长变化图；(D)化合物I-1的LUMO和HOMO能级示意图；
图5为化合物II-1光物理性质的表征；(A)化合物II-1的紫外吸收光谱图，及其在磷酸缓冲液或脂质体溶液中的荧光发射光谱图(10μM)；(B)化合物II-1的LUMO和HOMO能级示意图；
图6为化合物I-1和化合物II-1的归一化紫外吸收光谱图和荧光发射光谱图；
图7为化合物I-1光激活过程的表征；(A)化合物I-1在脂质体溶液中随光照(40mW/cm2)时间变化的紫外吸收光谱图(40μM)；(B)化合物I-1在脂质体溶液中随光照(40mW/cm2)时间变化的荧光发射光谱图(40μM)，激发波长为371nm；(C)化合物I-1在脂质体溶液中随光照(40mW/cm2)时间变化的荧光发射光谱图(40μM)，激发波长为488nm；(D)化合物I-1在脂质体溶液中的371nm和481nm处吸收强度随光照(40mW/cm2)时间的比值变化图；(E)化合物I-1在脂质体溶液中的445nm处荧光发射强度随光照(40mW/cm2)时间的比值变化图，激发波长为371nm；(F)化合物I-1在脂质体溶液中的582nm处荧光发射强度随光照(40mW/cm2)时间的比值变化图，激发波长为488nm；
图8为化合物I-1用于细胞荧光成像及其与尼罗红共定位的结果；(A)化合物I-1(5μM)染色未处理的HeLa宫颈癌细胞的荧光照片，且与尼罗红的共定位结果；(B)化合物I-1(5μM)染色油酸处理的HeLa宫颈癌细胞的荧光照片，且与尼罗红的共定位结果；(C)化合物I-1(5μM)染色油酸处理的HeLa宫颈癌细胞且用405nm激光(功率2％)扫描20次后的荧光照片，且与尼罗红的共定位结果；
图9为化合物I-1光照下点亮脂滴的机理研究；(A)405nm激光(功率2％)光照前后的化合物I-1染色的HeLa宫颈癌细胞的Lambda模式照片；(B)A图中白圈所对应的荧光发射光谱；(C)在有无化合物I-1或化合物II-1的存在下，9，10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)(单线态氧指示剂)在380nm处吸收强度随光照(40mW/cm2)时间的比值变化图；(D)化合物I-1染色多聚甲醛固定的HeLa宫颈癌细胞的荧光照片，且与尼罗红的共定位结果；
图10为化合物I-1染色的HeLa宫颈癌细胞荧光照片(对照组)，化合物I-1(绿光通道)和亚甲基蓝或二氢卟吩e6(黄光通道)染色的HeLa宫颈癌细胞在633nm激光(功率2％)光照前后的荧光照片(红光通道：化合物I-1光激活生成的化合物II-1)；
图11为化合物I-1染色的HeLa宫颈癌细胞的光激活荧光照片(绿光通道：化合物I-1；红光通道：化合物I-1光激活生成的化合物II-1；放大区域为红光通道中白色虚线框区域)；
图12为化合物I-1细胞内原位光激活生成的化合物II-1的细胞染色结果；(A)化合物I-1细胞内原位光激活生成的化合物II-1与商品化线粒体染料线粒体深红的共染结果；(B)图A中白色箭头上所对应的荧光强度分布图；(C)线粒体深红的荧光强度和化合物I-1细胞内原位光激活生成的化合物II-1荧光发射强度随光照(40mW/cm2)时间的比值变化图；
图13为线粒体染料四甲基罗丹明乙酯(TMRE)染色的HeLa宫颈癌细胞在有无化合物I-1时随光照(40mW/cm2)时间变化的荧光照片；
图14为化合物I-1在光照下用于脂滴-线粒体依次成像及两者相互作用监测的荧光照片；(A)化合物I-1在白光照射后及在黑暗中继续孵育的荧光照片(区域1、2、3为叠加通道中白色虚线框放大后的图像；白色箭头所示为绿色荧光与红色荧光重叠的位置)；(B)脂滴的直径在化合物I-1光照下诱导的细胞氧化应激过程中的变化；(C)肿胀线粒体的数目在化合物I-1光照下诱导的细胞氧化应激过程中的变化；
图15为化合物I-1染色的HeLa宫颈癌细胞随光照(40mW/cm2)时间变化的荧光照片及细胞凋亡试剂盒Annexin/PI的染色结果；
图16为化合物I-1在有无光照(40mW/cm2)条件下的细胞毒性结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
化合物I-1的制备：
称取化合物II-1(28.3mg，0.04mmol)于反应容器中，向其中加入5mL甲醇，超声使固体完全溶解；称取硼氢化钠(15.5mg，0.41mmol)加入上述反应液中，且在氮气氛围下室温搅拌反应半小时；待反应结束，使用旋转蒸发仪减压出去反应液，获得待处理的粗产物；往粗产物中加入10mL超纯水，超声，过滤得到褐色固体产物，将此沉淀真空干燥，获得化合物I-1，收率～8.5％。
化合物I-1的结构为
Figure BDA0003305918580000071
化合物II-1的结构为
Figure BDA0003305918580000072
产物化学结构表征数据如下：
1H NMR(MeOD，400MHz)：δ7.49(d，J＝8.8Hz，2H)，7.29(t，J1＝15.6Hz，J2＝8.4Hz，4H)，7.22(d，J＝8.0Hz，2H)，7.19(d，J＝3.6Hz，2H)，7.07(d，J＝2.4Hz，2H)，7.06(t，J1＝2.8Hz，J2＝1.2Hz，2H)，7.03(t，J1＝3.2Hz，J2＝1.2Hz，2H)，6.99(d，J＝8.4Hz，2H)，6.78(d，J＝16.0Hz，2H)，6.65(d，J＝16.0Hz，2H)，5.85(s，1H)，3.86(s，2H)，3.50-3.45(m，4H)，3.21(s，9H)，3.18(d，J＝6.4Hz)，2.73(t，J1＝8.4Hz，J2＝4.0Hz，2H)，2.26-2.35(m，2H).13C NMR(MeOD，101MHz)：δ149.0，148.8，144.9，141.9，135.5，130.5，129.7，127.4，125.8，124.5，124.4，124.0，123.9，64.3，53.9，52.1，50.5，40.4，23.2，19.9.ESI-HRMS(m/z)：calcd.for(C35H40N3S+)：534.2937；found：534.2940.
图2为化合物I-1的核磁氢谱和碳谱图；左图为氢谱图，右图为碳谱图；图3为化合物I-1的高分辨质谱结果图。
图1为化合物I-1在光照下实现脂滴-线粒体依次成像及其成像机理的示意图。化合物I-1具有分子内电荷转移(ICT)的性质，其发光行为受极性影响：进入细胞后，由于周围环境极性减小，化合物I-1染色脂滴的表面，通过光照，部分化合物I-1发生光氧化脱氢反应生成发光显著红移的化合物II-1，同时产生大量活性氧，进而诱导细胞发生氧化应激。活性氧使脂滴表面的通透性增大，进而使未发生光氧化脱氢反应的化合物I-1能够进入脂滴极性较小的疏水内核，从而发光显著增强；另外，化合物I-1在细胞内光激活原位生成化合物II-1能够特异性染色线粒体，从而监测线粒体在氧化应激过程中的形态变化。由于化合物I-1和化合物II-1的发射光谱几乎没有重叠，因而可实现双色监测脂滴和线粒体在氧化应激过程中的相互靠近接触过程。
实施例2
化合物I-1和化合物II-1光物理性质的表征，如表1所示：
表1化合物I-1和化合物II-1在不同溶剂中光物理性质的表征
Figure BDA0003305918580000081
图4为化合物I-1光物理性质的表征图；(A)化合物I-1的紫外吸收光谱图，及其在磷酸缓冲液或1，4-二氧六烷中的荧光发射光谱图(40μM)；(B)化合物I-1在1，4-二氧六烷和水的混合溶液中不断增加1，4-二氧六烷含量的荧光发射光谱图(40μM)，激发波长为371nm；(C)化合物I-1(10μM)在1，4-二氧六烷和水的混合溶液中不断增加1，4-二氧六烷含量的463nm处荧光发射强度的比值变化图及其最大发射波长变化图；(D)化合物I-1的LUMO和HOMO能级示意图；
图5为化合物II-1光物理性质的表征图；(A)化合物II-1的紫外吸收光谱图，及其在磷酸缓冲液或脂质体溶液中的荧光发射光谱图(10μM)；(B)化合物II-1的LUMO和HOMO能级示意图；
图6为化合物I-1和化合物II-1的归一化紫外吸收光谱图和荧光发射光谱图。
如图4(A)所示，化合物I-1(10μM)在磷酸缓冲液中的最大吸收波长为371nm，最大发射波长为502nm，几乎不发出荧光，量子产率为1.95％(表1)。相比之下，化合物I-1(10μM)在1，4-二氧六烷(即1，4-二氧六环)中可发出明亮的荧光，量子产率为35.5％，并且发射波长蓝移至486nm(表1)。并且，如图4(B)和(C)所示，在1，4-二氧六烷和水的混合溶剂中，随着1，4-二氧六烷含量的上升，化合物I-1的发光强度逐渐增强且发光蓝移。以上结果表明化合物I-1具有分子内电荷转移(ICT)的性质，且发光行为是极性敏感的。图4(D)中理论计算的结果验证了化合物I-1的ICT性质。
如图5(A)所示，化合物II-1(10μM)在磷酸缓冲液中的最大吸收波长为480nm，其在磷酸缓冲液中无明显荧光，量子产率低于检测限(表1)。相比之下，化合物II-1(10μM)在脂质体(1mg/mL)溶液(模拟磷脂双分子层结构)中可发出明亮的荧光，量子产率为27.0％，最大发射波长581nm。该结果表明化合物II-1同样具有ICT的性质。图5(B)中理论计算的结果验证了化合物II-1的ICT性质。
如图6所示，化合物I-1和化合物II-1的荧光发射光谱几乎没有重叠，可有效避免两者在荧光成像中的光谱串扰，有助于细胞的双色荧光成像。
实施例3
化合物I-1光激活过程的表征：
图7为化合物I-1光激活过程的表征图；(A)化合物I-1在脂质体溶液中随光照(40mW/cm2)时间变化的紫外吸收光谱图(40μM)；(B)化合物I-1在脂质体溶液中随光照(40mW/cm2)时间变化的荧光发射光谱图(40μM)，激发波长为371nm；(C)化合物I-1在脂质体溶液中随光照(40mW/cm2)时间变化的荧光发射光谱图(40μM)，激发波长为488nm；(D)化合物I-1在脂质体溶液中的371nm和481nm处吸收强度随光照(40mW/cm2)时间的比值变化图；(E)化合物I-1在脂质体溶液中的445nm处荧光发射强度随光照(40mW/cm2)时间的比值变化图，激发波长为371nm；(F)化合物I-1在脂质体溶液中的582nm处荧光发射强度随光照(40mW/cm2)时间的比值变化图，激发波长为488nm。
如图7(A)和(D)所示，在白光(40mW/cm2)的持续光照下，脂质体(1mg/mL)溶液中的化合物I-1(40μM)在371nm处的吸收强度逐渐减小，而在481nm处的吸收强度逐渐增强，表明溶液中化合物I-1的量逐渐减少，化合物II-1的量逐渐增多，即化合物I-1在白光光照下生成了化合物II-1。
如图7(B)和(E)所示，在白光(40mW/cm2)的持续光照下，脂质体(1mg/mL)溶液中的化合物I-1(40μM)在445nm处荧光发射强度逐渐降低，表明溶液中化合物I-1的量逐渐减少。如图7(C)和(F)所示，溶液中在582nm处荧光发射强度逐渐升高，表明溶液中化合物II-1的量逐渐增多。
实施例4
化合物I-1的细胞荧光成像结果：
图8为化合物I-1用于细胞荧光成像及其与尼罗红共定位的结果；(A)化合物I-1(5μM)染色未处理的HeLa宫颈癌细胞的荧光照片，且与尼罗红的共定位结果；(B)化合物I-1(5μM)染色油酸处理的HeLa宫颈癌细胞的荧光照片，且与尼罗红的共定位结果；(C)化合物I-1(5μM)染色油酸处理的HeLa宫颈癌细胞且用405nm激光(功率2％)扫描20次后的荧光照片，且与尼罗红的共定位结果。
如图8(A)所示，化合物I-1染色未处理的HeLa宫颈癌细胞后，在细胞内的荧光较弱。利用油酸诱导细胞内脂滴含量的上升后，与尼罗红染色脂滴后发出明亮的荧光不同，化合物I-1染色细胞后发光仍然较弱。以上结果表明化合物I-1不能荧光点亮正常状态的脂滴。如图8(C)所示，在405nm激光(功率2％)扫描20次后，细胞内出现化合物I-1的点状荧光，且其与尼罗红的皮尔森系数为0.85，该结果表明化合物I-1在光照后能够特异性点亮细胞内的脂滴，实现对脂滴的荧光成像。
实施例5
化合物I-1在光照后特异性点亮脂滴：
图9为化合物I-1光照下点亮脂滴的机理研究；(A)405nm激光(功率2％)光照前后的化合物I-1染色的HeLa宫颈癌细胞的Lambda模式照片；(B)A图中白圈所对应的荧光发射光谱；(C)在有无化合物I-1或化合物II-1的存在下，9，10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)(单线态氧指示剂)在380nm处吸收强度随光照(40mW/cm2)时间的比值变化图；(D)化合物I-1染色多聚甲醛固定的HeLa宫颈癌细胞的荧光照片，且与尼罗红的共定位结果。
如图9(A)和(B)所示，在405nm激光(功率2％)光照30s，脂滴内化合物I-1的荧光强度显著增强约2倍，且化合物I-1的发射波长蓝移约40nm。此外，如图9(C)所示，化合物I-1与化合物II-1在光照下能够有效地产生单线态氧。如图9(D)所示，化合物I-1染色多聚甲醛固定后的细胞后，在细胞内为荧光亮点，且其与尼罗红的皮尔森系数为0.80。以上结果表明，化合物I-1在光照下能够有效产生单线态氧，使脂滴的通透性变大，进而插入脂滴极性较小的疏水内部，从而发光显著增强且蓝移。因此，化合物工-1能够区分氧化应激状态和正常状态下的脂滴(405nm激光光照下，化合物I-1能够有效产生活性氧，使细胞处于氧化应激状态，光照后，脂滴处于氧化应激状态)，与现有不能区分两者的商品化脂滴染料尼罗红相比具有优势。
实施例6
在商品化光敏剂存在时，化合物I-1在633nm激光(功率2％)光照前后的细胞荧光图像：
图10为化合物I-1染色的HeLa宫颈癌细胞荧光照片(对照组)、化合物I-1(绿光通道)和亚甲基蓝或二氢卟吩e6(黄光通道)染色的HeLa宫颈癌细胞在633nm激光(功率2％)光照前后的荧光照片(红光通道：化合物I-1光激活生成的化合物II-1)。
如图10所示，单独的633nm激光(功率2％)光照不影响化合物I-1在细胞内的染色行为；当容易进入细胞的亚甲基蓝与化合物I-1共孵育后，在633nm激光(功率2％)光照5分钟后，化合物I-1展现出与405nm激光光照后的染色行为，即细胞内出现化合物I-1的荧光亮点；当不易进入细胞的二氢卟吩e6与化合物I-1共孵育后，在633nm激光(功率2％)光照5分钟后，细胞内未出现化合物I-1的荧光亮点。以上结果表明，化合物I-1能够特异性点亮处于氧化应激状态细胞中的脂滴。
光敏剂亚甲基蓝进入细胞后，在633nm的激光光照后，光敏剂亚甲基蓝产生单线态氧，此时细胞中脂滴处于氧化应激状态，因此化合物I-1可特异性点亮脂滴；而二氢卟吩e6未进入细胞，在633nm激光光照下，细胞内没有足够的单线态氧生成，不足以诱导细胞发生氧化应激，因此化合物I-1不能点亮脂滴。
实施例7
化合物I-1在细胞内原位光激活生成的化合物II-1监测线粒体形态变化的荧光图像；
图11为化合物I-1染色的HeLa宫颈癌细胞的光激活荧光照片(绿光通道：化合物I-1；红光通道：化合物I-1光激活生成的化合物II-1；放大区域为红光通道中白色虚线框区域)。图12为化合物I-1细胞内原位光激活生成的化合物II-1的细胞染色结果；(A)化合物I-1细胞内原位光激活生成的化合物II-1与商品化线粒体染料线粒体深红的共染结果；(B)图A中白色箭头上所对应的荧光强度分布图；(C)线粒体深红的荧光强度和化合物I-1细胞内原位光激活生成的化合物II-1荧光发射强度随光照(40mW/cm2)时间的比值变化图。
如图11所示，随着白光光照时间的延长，细胞内红色荧光信号逐渐增强，表明细胞内化合物I-1光激活生成的化合物II-1越来越多。从图12(A)和(B)所示的与商品化线粒体染料线粒体深红共定位的结果可知，细胞内原位生成的化合物II-1染色的为线粒体。因此，如图11中放大区域所示，细胞内原位生成的化合物II-1能够成功监测线粒体在氧化应激下从正常的丝状变化为异常的圆圈状，即线粒体发生空泡化的过程。
如图12(C)所示，商品化线粒体染料线粒体深红的荧光强度随着光照时间的延长逐渐减弱，表明线粒体深红的光稳定性。相比之下，细胞内原位生成的化合物II-1的荧光信号越来越强，一方面是由于生成的化合物II-1越来越多，另一方面表明化合物II-1的光稳定性较好。
图13为线粒体染料四甲基罗丹明乙酯(TMRE)染色的HeLa宫颈癌细胞在有无化合物I-1时随光照(40mW/cm2)时间变化的荧光照片。
如图13所示，另一个商品化线粒体染料四甲基罗丹明乙酯(TMRE)的荧光强度在化合物I-1光照下诱导的氧化应激的过程中逐渐减弱。TMRE是一种线粒体膜电势敏感的染料，在线粒体膜电势正常(线粒体结构功能正常)时发出荧光；但当线粒体因氧化应激而受损时，TMRE会从线粒体膜上脱落，从而失去荧光，因此不能监测线粒体在氧化应激过程中的结构变化。相比之下，细胞内原位生成的化合物II-1因其结构中三苯胺噻吩基团与线粒体膜强烈的疏水作用，使其能够锚定与线粒体膜上，不受线粒体膜电势的影响。因此，即使线粒体膜电势在氧化应激过程中消失，化合物II-1依然能够染色线粒体，并监测其在氧化应激过程中的结构变化。
实施例8
白光光照下，化合物I-1与其原位光激活的化合物II-1双色监测脂滴-线粒体在氧化应激过程中的相互作用：
图14为化合物I-1在光照下用于脂滴-线粒体依次成像及两者相互作用监测的荧光照片；(A)化合物I-1在白光照射后及在黑暗中继续孵育的荧光照片(区域1、2、3为叠加通道中白色虚线框放大后的图像；白色箭头所示为绿色荧光与红色荧光重叠的位置)；(B)脂滴的直径在化合物I-1光照下诱导的细胞氧化应激过程中的变化；(C)肿胀线粒体的数目在化合物I-1光照下诱导的细胞氧化应激过程中的变化。
如图14(A)所示，在白光(40mW/cm2)照射下，细胞内红色荧光信号逐渐增强、绿色荧光信号逐渐变亮且变为点状。光照结束后继续在黑暗中孵育，可以继续监测脂滴(绿色荧光)与线粒体(红色荧光)在氧化应激过程中的动态变化及相互作用。放大区域中的白色箭头所示即为绿色荧光与红色荧光重叠的部分，指示了脂滴与线粒体的相互靠近与接触。如图14(B)所示，氧化应激过程中，脂滴的直径逐渐变大，表明脂滴发生聚集、融合；如图14(C)所示，肿胀的线粒体在氧化应激过程中越来越多，表明因氧化应激而受损的线粒体数量逐渐增多，线粒体受损情况越来越严重。
图15为化合物I-1染色的HeLa宫颈癌细胞随光照(40mW/cm2)时间变化的荧光照片及细胞凋亡试剂盒Annexin/PI的染色结果；图16为化合物I-1在有无光照(40mW/cm2)条件下的细胞毒性结果。
如图15和图16所示，细胞凋亡监测试剂盒Annexin/PI和MTT法的结果表明化合物I-1在光照能够有效诱导细胞(癌细胞，HeLa细胞)发生凋亡，进而杀死细胞。
本发明构建了一种具有脂滴-线粒体依次成像功能的光激活荧光探针并将其应用于氧化应激过程中脂滴与线粒体的双色荧光监测中。以三苯胺噻吩-π-四氢吡啶为光响应基团，成功构建了光激活荧光探针I-1。该探针在光激活的过程中，不仅可以在细胞内原位生成发光显著红移的化合物II-1，还可以利用其光动力活性有效诱导氧化应激。一方面，化合物I-1具有ICT性质，其发光性质受极性影响，随极性减小而发光增强且蓝移；与现有的商品化脂滴染料尼罗红相比，化合物I-1能够特异性点亮氧化应激状态下的脂滴；另一方面，与现有的商品化线粒体染料相比，化合物I-1在细胞内原位光激活生成的化合物II-1具有光稳定性好和线粒体驻留能力强的优点，能够长期监测线粒体在氧化应激过程中的形态变化。在利用光照实现脂滴-线粒体依次成像后，由于化合物I-1与化合物II-1的发射光谱几乎没有重叠，化合物I-1在光照下与光激活生成的化合物II-1可监测脂滴-线粒体在氧化应激过程中的相互作用。
在细胞内化合物II-1更倾向于染色线粒体，并不能染色脂滴。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有细胞器依次成像和双色成像功能的光激活荧光探针，其特征在于：其结构为式I：
Figure FDA0003305918570000011
其中，R1、R2、R3、R4为独立的氢；
R5为-亚烷基羧基、-亚烷基酯基、亚烷基铵盐基；
所述亚烷基羧基：-R-COOH，R为亚烷基；
所述亚烷基酯基：-R-COO-R′，R为亚烷基，R′为烷基；
所述亚烷基铵盐基：-R-N(R′)3X′，R为亚烷基，R′为烷基，X′为阴离子。
2.根据权利要求1所述具有细胞器依次成像和双色成像功能的光激活荧光探针，其特征在于：R5中所述亚烷基各自为C1-10亚烷基；
所述亚烷基酯基中烷基为C1-10烷基；
所述亚烷基铵盐基中烷基为C1-10烷基。
3.根据权利要求2所述具有细胞器依次成像和双色成像功能的光激活荧光探针，其特征在于：所述R5为亚烷基铵盐基，亚烷基铵盐基结构式：-R-N(R′)3X，R为C1-10亚烷基，R′为C1-5烷基，X为阴离子，阴离子为卤素。
4.根据权利要求3所述具有细胞器依次成像和双色成像功能的光激活荧光探针，其特征在于：所述R5为亚烷基铵盐基，亚烷基铵盐基结构式：-R-N(R′)3X，R为C1-10亚烷基，R′为甲基，X为阴离子，阴离子为溴离子。
5.根据权利要求1～4任一项所述具有细胞器依次成像和双色成像功能的光激活荧光探针在脂滴与线粒体荧光成像中的应用，其特征在于：所述具有细胞器依次成像和双色成像功能的光激活荧光探针通过光激活实现脂滴和线粒体的双色成像；光激活的条件为光照和有氧的条件，光照为白光或405nm激光；光照的强度为1-40mW/cm2。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述脂滴与线粒体荧光成像是指细胞内脂滴与线粒体荧光成像，通过光激活实现细胞内脂滴和线粒体的依次成像和双色成像。
7.根据权利要求1～4任一项所述具有细胞器依次成像和双色成像功能的光激活荧光探针的应用，其特征在于：所述光激活荧光探针用于区分氧化应激状态的脂滴和非氧化应激状态的脂滴。
8.根据权利要求1～4任一项所述具有细胞器依次成像和双色成像功能的光激活荧光探针的应用，其特征在于：所述光激活荧光探针用于监测脂滴和线粒体在氧化应激下的相互作用以及监测脂滴和/或线粒体在氧化应激下形态变化。
9.一种利用权利要求1～4任一项所述具有细胞器依次成像和双色成像功能的光激活荧光探针制备荧光成像剂的方法，其特征在于：包括以下步骤：将具有细胞器依次成像和双色成像功能的光激活荧光探针在光照和有氧的条件下进行脱氢反应，获得荧光成像剂；
所述光照为白光或405nm激光；光照的强度为1-40mW/cm2；
所述荧光成像剂为式II：
Figure FDA0003305918570000021
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：
所述反应在介质中进行，所述介质是指在光照氧化脱氢时，能够提供一价阴离子的介质；
式II中，X-为介质提供的一价阴离子；
式II的荧光成像剂为线粒体荧光成像剂。
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