CN113917161A - 抗核周因子抗体免疫球蛋白g的检测方法 - Google Patents

抗核周因子抗体免疫球蛋白g的检测方法 Download PDF

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Abstract

一种抗核周因子抗体免疫球蛋白G的检测方法，一，将含有抗核周因子抗体病人样本与抗原片反应区上的核周因子进行一次反应，待样本中特异性抗核周因子抗体与抗原片上核周因子结合后，用洗涤液洗涤去除抗原片上没结合物质；二，在完成一步反应的抗原片反应区加入荧光标记物进行二次反应，产生免疫复合物；该免疫复合物为核周因子‑特异性的抗核周因子抗体‑异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G，洗涤去除未进行该次反应物质；三，在一次和二次反应后的抗原片反应区加入封片剂，盖盖玻片，在荧光显微镜下观察到粘附颊粘膜上皮细胞核周出现的核周因子荧光颗粒，完成检测；具有敏感度高、特异性强、准确性好、成本低、操作简便及适用性广的特点。

Description

抗核周因子抗体免疫球蛋白G的检测方法
技术领域
本发明涉及生物体外诊断方法，尤其涉及一种抗核周因子抗体免疫球蛋白G的检测方法。
背景技术
抗核周因子抗体的靶抗原存在于颊粘膜上皮细胞核周胞浆内，是上皮细胞的中等纤维结合蛋白或其前体，它是一种不溶性蛋白质。核周因子在荧光显微镜下呈现为胞浆内一个或多个大小不等的圆形或椭圆形颗粒，其对类风湿关节炎的特异性随血清稀释倍数的增加而增加。
抗核周因子抗体对于诊断类风湿关节炎，尤其是早期类风湿关节炎很有意义，不仅阳性率高，特异性也好，抗核周因子抗体极少见于其他风湿免疫病人。在类风湿因子阴性的类风湿关节炎中，抗核周因子抗体对于类风湿关节炎的辅助诊断价值更大，且抗核周因子抗体阳性、类风湿因子阴性的类风湿关节炎病人往往预后较差。同时抗核周因子抗体与类风湿关节炎病情活动相关，与活动期炎性指标呈明显正相关。还与类风湿关节炎疾病严重程度和活动性相关，在类风湿关节炎早期甚至临床症状出现之前即可出现。因此，它是类风湿关节炎早期诊断和预后判断的指标之一。
发明内容
本发明的主要目的是为了提供一种抗核周因子抗体免疫球蛋白G的检测方法，适用于抗核周因子抗体的检测，并用于类风湿关节炎提供早期特异的诊断指标，对疾病的判断及预后具有良好的提示作用。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明的抗核周因子抗体免疫球蛋白G(IgG)的检测方法，其包括以下步骤：
第一步：将含有抗核周因子抗体病人样本加入到核周因子抗原片的核周因子反应区上，与抗原片反应区上的核周因子进行一次反应，待该病人样本中的特异性的抗核周因子抗体与抗原片上的核周因子结合后，用洗涤液洗涤去除抗原片上没有结合的物质；
第二步，在完成第一步反应的抗原片反应区再加入荧光标记物进行二次反应，产生免疫复合物；该免疫复合物为核周因子-特异性的抗核周因子抗体-异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G(IgG)，用洗涤液洗涤去除未进行该次反应的物质；
第三步，在进行第一次和第二次反应后的抗原片反应区加入封片剂，然后盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察，观察到粘附颊粘膜上皮细胞核周出现大小数量不一的均质圆形、椭圆形的核周因子荧光颗粒，完成检测。
前述的抗核周因子抗体免疫球蛋白G的检测方法，其特征在于，所述核周因子抗原片是在载玻片上粘附颊粘膜上皮细胞溶液构成；先将载玻片采用分子量50000的体积浓度为0.1至1％的多聚左旋赖氨酸溶液浸泡，浸泡完后在40℃烤干；然后将颊粘膜上皮细胞溶液涂布载玻片上，自然干燥成型；
所述封片剂为0.05mol/L磷酸盐缓冲液加入体积浓度为70％丙三醇和5％4',6-二脒基-2-苯基吲哚组成的液体；
所述荧光标记物是在0.01至0.05mol/L磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.01至0.05％异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G(IgG)和5至10％牛血清白蛋白构成；
所述第一步中使用的洗涤液为0.01至0.05mol/L磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.1至0.5％的聚山梨酯混合而成；
所述第二步中使用的洗涤液为0.01至0.05mol/L磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.1至0.5％的聚山梨酯混合而成。
前述的抗核周因子抗体免疫球蛋白G(IgG)的检测方法，其特征在于，所述颊粘膜上皮细胞溶液是将颊粘膜上皮细胞离心去除上清液，再用细胞清洗液重悬，振荡30S后离心去除上清液，此步骤重复1至5次；最后离心沉淀的颊粘膜上皮细胞用固定液重悬完成。
前述的抗核周因子抗体免疫球蛋白G(IgG)的检测方法，其特征在于，所述颊粘膜上皮细胞的细胞清洗液为磷酸盐缓冲液中含有体积浓度为10±5％的甲醇的混合溶液；所述固定液采用重量份数为6±1的乙醇、3±1的氯仿、1±0.5的冰醋酸混合而成；该颊粘膜上皮细胞溶液是涂抹在载玻片上。
本发明抗核周因子抗体免疫球蛋白G(IgG)的检测方法的有益效果，具有敏感度高、特异性强、准确性好、成本低、操作简便以及适用性广的特点，可以为类风湿关节炎提供早期特异的诊断指标，对疾病的判断以及预后具有良好的提示作用，使用效果理想。临床上抗核周因子作为类风湿关节炎诊断指标用于辅助诊断类风湿关节炎，可以作为类风湿关节炎早期诊断的一项辅助手段，同时也可作为判断病情发展、演变及预后的辅助诊断手段。
具体实施方式
本发明抗核周因子抗体免疫球蛋白G的检测方法，其包括以下步骤：
第一步：将含有抗核周因子抗体病人样本加入到核周因子抗原片的核周因子反应区上，与抗原片反应区上的核周因子进行一次反应，待该病人样本中的特异性的抗核周因子抗体与抗原片上的核周因子结合后，用洗涤液洗涤去除抗原片上没有结合的物质；
第二步，在完成第一步反应的抗原片反应区再加入荧光标记物进行二次反应，产生免疫复合物；该免疫复合物为核周因子-特异性的抗核周因子抗体-异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G(IgG)，用洗涤液洗涤去除未进行该次反应的物质；
第三步，在进行第一次和第二次反应后的抗原片反应区加入封片剂，然后盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察，观察到粘附颊粘膜上皮细胞核周出现大小数量不一的均质圆形、椭圆形的核周因子荧光颗粒，完成检测。
本发明抗核周因子抗体免疫球蛋白G的检测方法，其中，所述核周因子抗原片是在载玻片上粘附颊粘膜上皮细胞溶液构成；先将载玻片采用分子量50000的体积浓度为0.1至1％的多聚左旋赖氨酸溶液浸泡，浸泡完后在40℃烤干；然后将颊粘膜上皮细胞溶液涂布载玻片上，自然干燥成型；所述封片剂为0.05mol/L磷酸盐缓冲液加入体积浓度为70％丙三醇和5％4',6-二脒基-2-苯基吲哚组成的液体；所述荧光标记物是在0.01至0.05mol/L磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.01至0.05％异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G(IgG)和5至10％牛血清白蛋白构成；所述第一步中使用的洗涤液为0.01至0.05mol/L磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.1至0.5％的聚山梨酯混合而成；所述第二步中使用的洗涤液为0.01至0.05mol/L磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.1至0.5％的聚山梨酯混合而成。所述颊粘膜上皮细胞溶液是将颊粘膜上皮细胞离心去除上清液，再用细胞清洗液重悬，振荡30S后离心去除上清液，此步骤重复1至5次；最后离心沉淀的颊粘膜上皮细胞用固定液重悬完成。所述颊粘膜上皮细胞的细胞清洗液为磷酸盐缓冲液中含有体积浓度为10±5％的甲醇的混合溶液；所述的固定液采用重量份数为6±1的乙醇、3±1的氯仿、1±0.5的冰醋酸混合而成；该颊粘膜上皮细胞溶液是涂抹在载玻片上。
实施例一：
一、核周因子抗原片制备:
颊粘膜上皮细胞离心去除上清液，用0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液(含10％甲醇)重悬，振荡30S后离心去除上清液，此步骤再重复4次，最后离心沉淀的细胞用固定液(重量份数为6的乙醇、3的氯仿、1的冰醋酸混合而成)重悬；
载玻片采用分子量50000的体积浓度为1％的多聚左旋赖氨酸溶液浸泡，浸泡完后在40℃烤干；然后将颊粘膜上皮细胞溶液涂布载玻片上，自然干燥成型，密封保存；
二、荧光标记物制备：在0.05mol/L磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.02％异硫氰酸荧光素标记的羊抗人IgG和10％牛血清白蛋白；
三、封片剂制备：在0.05mol/L磷酸盐缓冲液加入体积浓度为70％丙三醇和5％4',6-二脒基-2-苯基吲哚后混合而成；
四、洗涤液制备：在0.02mol/L磷酸盐缓冲液中加入0.1％聚山梨酯。
实施例二：
采用本发明抗核周因子抗体免疫球蛋白G(IgG)的检测方法检测类风湿关节炎(类风湿)和其他某些风湿病病人的抗核周因子。
1、样本血清确定：类风湿患者83例。对照组为其他风湿免疫类疾病102例，其中系统性红斑狼疮51例。原发性干燥综合征26例，系统性硬化症25例，健康人体检60例。
2、检测样本血清：将83例类风湿患者血清和对照组病例血清分别按照以下步骤进行检测。
第一步：将含有抗核周因子抗体病人样本加入到核周因子抗原片的核周因子反应区上，与抗原片反应区上的核周因子进行一次反应，待该病人样本中的特异性的抗核周因子抗体与抗原片上的核周因子结合后，用洗涤液洗涤去除抗原片上没有结合的物质；
第二步，在完成第一步反应的抗原片反应区再加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G(IgG)进行二次反应，产生免疫复合物；该免疫复合物为核周因子-特异性的抗核周因子抗体-异硫氰酸荧光素标记的羊抗人IgG，用洗涤液洗涤去除未进行该次反应的物质；
第三步，在进行第一次和第二次反应后的抗原片反应区加入封片剂，然后盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察粘附颊粘膜上皮细胞核周出现的各种形状的核周因子荧光颗粒，完成检测。
3、检测结果说明：在83例类风湿患者中抗核周因子抗体阳性例数为59例，敏感性为71.1％；
对照组中特异性方面：51例系统性红斑狼疮患者中抗核周因子抗体阴性例数为47例，特异性为92.2％；26例原发性干燥综合征患者中抗核周因子抗体阴性例数为47例，特异性为88.5％；25例系统性硬化症患者中抗核周因子抗体阴性例数为47例，特异性92％；100例健康人体检中抗核周因子抗体阴性例数为100例，特异性100％。抗核周因子抗体主要出现于类风湿病人，其阳性检出率较高。本实验中抗核周因子抗体对类风湿患者诊断敏感性为71.1％；以系统性红斑狼疮、原发性干燥综合征、系统性硬化症及健康人体检共同作为类风湿病人的对照，则抗核周因子抗体的特异性为95.1％。
实验结果表明，⑴抗核周因子抗体与类风湿关节炎高度相关，敏感性率达到71.1％，特异性达到95.1％。⑵抗核周因子用于辅助诊断类风湿关节炎，抗核周因子极少见于其他风湿免疫病人。根据国内外文献报道抗核周因子与类风湿关节炎病情活动相关，与活动期炎性指标呈明显正相关。本发明的抗核周因子抗体IgG检测方法有助于类风湿关节炎诊断，和判断预后。
实施例三：
本发明抗核周因子抗体免疫球蛋白G(IgG)的检测方法在类风湿性关节炎和自身免疫病中早期诊断监别价值。
1、样本血清确定：类风湿关节炎患者血清79例，为风湿免疫科2014年10月至2017年11月门诊及住院类风湿关节炎患者，均符合1987年美国风湿病学会类风湿关节炎分类诊断标准。对照组61例分为两部分:其他风湿免疫病人，包括系统性红斑狼疮35例、干燥综合症9例、强直性脊柱10例、混合性结缔组织病7例。正常人10例。
2、检测样本血清：将79例类风湿患者血清和对照组病例血清分别按照以下步骤进行检测。
第一步：将含有抗核周因子抗体病人样本加入到核周因子抗原片的核周因子反应区上，与抗原片反应区上的核周因子进行一次反应，待该病人样本中的特异性的抗核周因子抗体与抗原片上的核周因子结合后，用洗涤液洗涤去除抗原片上没有结合的物质；
第二步，在完成第一步反应的抗原片反应区再加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗人IgG进行二次反应，产生免疫复合物；该免疫复合物为核周因子-特异性的抗核周因子抗体-异硫氰酸荧光素标记的羊抗人IgG，用洗涤液洗涤去除未进行该次反应的物质；
第三步，在进行第一次和第二次反应后的抗原片反应区加入封片剂，然后盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察粘附颊粘膜上皮细胞核周出现的各种形状的核周因子荧光颗粒，完成检测。
3、检测结果说明：抗核周因子抗体对类风湿关节炎的诊断敏感性为70.9％，对照组中特异性为90.1％。此研究与国内文献报导文献基本相符，而抗核周因子抗体又极少见于其它风湿免疫病人，
本实验的正常人群中未见核周因子阳性病例。故可见核周因子的补充诊断价值，从而可以提高诊断的准确性，是诊断类风湿关节炎的有效指标之一。
本实施例中未将进行说明的内容为现有技术，故，不再进行赘述。
本发明抗核周因子抗体免疫球蛋白G(IgG)的检测方法的优点是，具有敏感度高、特异性强、准确性好、成本低、操作简便以及适用性广的特点，可以为类风湿关节炎提供诊断指标。
本发明方法制备的抗原片细胞结构完整，没有细胞自溶现象，而且抗核周因子荧光颗粒与细胞胞浆分界清楚，结果容易观察。因为抗核周因子荧光颗粒亮度强，而且与其它非特异性荧光形状差异明显，所以敏感度高、特异性强。试验步骤可以在室温条件下手工操作简便，适应性广。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1.一种抗核周因子抗体免疫球蛋白G的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步：将含有抗核周因子抗体病人样本加入到核周因子抗原片的核周因子反应区上，与抗原片反应区上的核周因子进行一次反应，待该病人样本中的特异性的抗核周因子抗体与抗原片上的核周因子结合后，用洗涤液洗涤去除抗原片上没有结合的物质；
第二步，在完成第一步反应的抗原片反应区再加入荧光标记物进行二次反应，产生免疫复合物；该免疫复合物为核周因子-特异性的抗核周因子抗体-异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G，用洗涤液洗涤去除未进行该次反应的物质；
第三步，在进行第一次和第二次反应后的抗原片反应区加入封片剂，然后盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察，观察到粘附颊粘膜上皮细胞核周出现大小数量不一的均质圆形、椭圆形的核周因子荧光颗粒，完成检测。
2.根据权利要求1所述的抗核周因子抗体免疫球蛋白G的检测方法，其特征在于，所述核周因子抗原片是在载玻片上粘附颊粘膜上皮细胞溶液构成；先将载玻片采用分子量50000的体积浓度为0.1至1％的多聚左旋赖氨酸溶液浸泡，浸泡完后在40℃烤干；然后将颊粘膜上皮细胞溶液涂布载玻片上，自然干燥成型；
所述封片剂为0.05mol/L磷酸盐缓冲液加入体积浓度为70％丙三醇和5％4',6-二脒基-2-苯基吲哚组成的液体；
所述荧光标记物是在0.01至0.05mol/L磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.01至0.05％异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G(IgG)和5至10％牛血清白蛋白构成；
所述第一步中使用的洗涤液为0.01至0.05mol/L磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.1至0.5％的聚山梨酯混合而成；
所述第二步中使用的洗涤液为0.01至0.05mol/L磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.1至0.5％的聚山梨酯混合而成。
3.根据权利要求2所述的抗核周因子抗体免疫球蛋白G的检测方法，其特征在于，所述颊粘膜上皮细胞溶液是将颊粘膜上皮细胞离心去除上清液，再用细胞清洗液重悬，振荡30S后离心去除上清液，此步骤重复1至5次；最后离心沉淀的颊粘膜上皮细胞用固定液重悬完成。
4.根据权利要求3所述的抗核周因子抗体免疫球蛋白G的检测方法，其特征在于，所述颊粘膜上皮细胞的细胞清洗液为磷酸盐缓冲液中含有体积浓度为10±5％的甲醇的混合溶液；所述固定液采用重量份数为6±1的乙醇、3±1的氯仿、1±0.5的冰醋酸混合而成；该颊粘膜上皮细胞溶液是涂抹在载玻片上。
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