CN113913509A - 脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种检测脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变的sgRNA、试剂盒及检测方法，属于生物检测技术领域。其中sgRNA包括：MTHFR‑677突变位点的sgRNA：序列如SEQ ID NO.1‑3所示；MTHFR‑1298突变位点的sgRNA：序列如SEQ ID NO.4‑6所示。通过对sgRNA进行筛选并结合CRISPR‑cas12b系统，可在短时间内检测待测样本中是否存在脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变，所述试剂盒及检测方法不仅操作简单、检测速度快、成本低、可多次重复检测，同时检测灵敏度和检测特异性也显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法。
背景技术
脑卒中是当前严重威胁人类健康与生命的主要疾病，根据病因和病理的不同可分为出血性卒中和缺血性卒中，出血性卒中包括脑出血和蛛网膜下腔出血；缺血性脑卒中包括动脉粥样硬化性血栓性脑梗死、脑栓塞。
脑卒中风险筛查通路中有多种酶共同参与叶酸的代谢和转运，亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate Reductase,MTHFR)和蛋氨酸合成酶还原酶(methionine synthase reductase,MTRR)为两个最为关键的酶，大量研究表明这些酶基因存在多态性，会引起酶活性的改变，造成脑卒中风险筛查异常，使活性叶酸水平降低及同型半胱氨酸(Hcy)水平升高，而血浆Hcy水平升高与Hcy与动脉粥样硬化、冠心病、脑卒中及外周血管病等血栓栓塞性疾病的发生关系密切。MTHFR是脑卒中风险筛查的关键酶。MTHFR基因第677位点及MTHFR第1298位点的突变都将引起酶活性改变，其中两个位点双突变时酶活性降到最低，因此临床上常以这些位点的突变检测结果分析脑卒中风险筛查水平。
现阶段临床一般通过定量即时聚合酶链锁反应(Quantitative real timepolymerase chain reaction，Q-PCR)、非放射性原位杂交技术(fluorescence insituhybridization，Fish)、多重引物PCR(multiplex PCR)等方式对患者进行脑卒中风险筛查相关位点的基因突变检测，然而这些检测技术均存在一次只能检测一个基因或检测成本过高等问题，导致无法应用到大规模的临床样本研究中。因此亟需提供一种温度控制简单，且灵敏度、特异性高的特异性片段检测方法。
RNA引导的成簇规则间隔短回文重复序列-CRISPR相关(CRISPR-Cas)方法由于其高可靠性和特异性而在快速核酸检测方面显示出相当大的前景。几种基于CRISPR-Cas的检测系统，已经开发了几种类型的Cas核酸酶，例如Cas12a、Cas12b和Cas13a，用于这些系统。在与Cas9、Cas12a同属2类CRISPR系统的Cas蛋白中，Cas12b蛋白比Cas9和Cas12a更小。Cas12b(C2c1)是一种双RNA引导的DNA核酸内切酶，在被单分子引导RNA(sgRNA)-目标复合物激活后显示出侧链切割活性。在这个过程中，Cas12b在单核苷酸水平识别复合物，然后其周围的非目标单链DNA(ssDNAs)被切割。基于这一特性，基于CRISPR-Cas12b的核酸检测系统，如HOLMESv2和CDetection，已显示出快速、灵敏和特异性病原体检测的强大实用潜力。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术不足，提供一种脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法，解决现有技术中一次只能检测一个基因或检测成本过高无法大规模应用的问题。针对MTHFR基因第677位点和MTHFR第1298位点设计并通过对试剂盒中使用的sgRNA进行筛选特异性更高的sgRNA，结合CRISPR-cas12b系统，以检测待测样本中是否存在脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变。
为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种用于检测脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变的sgRNA，
所述sgRNA包括：
MTHFR-677突变位点的sgRNA：其序列如SEQ ID NO.1-3任一所示；
MTHFR-1298突变位点的sgRNA：其序列如SEQ ID NO.4-6任一所示。
本发明还提供了一种用于检测脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变的sgDNA，所述sgDNA包括：
MTHFR-677突变位点的sgDNA：其序列如SEQ ID NO.7-9任一所示；
MTHFR-1298突变位点的sgDNA：其序列如SEQ ID NO.10-12任一所示。
本发明还提供了一种脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述sgDNA或sgRNA。
进一步的，所述检测试剂盒还包括cas12b蛋白和荧光探针。
进一步的，所述cas12b蛋白为Aapcas12b蛋白。
进一步的，所述荧光探针序列的5’端标记有荧光基团，3’端标记猝灭基团。
进一步的，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、和JOE中的任一种，所述猝灭基团选自BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的任一种。
进一步的，所述检测试剂盒中还包括DNA酶抑制剂。
上述检测试剂盒在检测脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变上应用，是通过荧光检测仪实现扩增产物的检测，荧光检测仪具有快速升降温及荧光检测功能。
具体的，荧光检测仪为8通量便携式设备，相比32通量或96通量的检测仪体积更为小巧，便于移动。
本发明还提供了一种脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变的非疾病诊断和治疗目的的检测方法，所述方法包括如下步骤：
S1、扩增待测样本的核酸得到扩增产物；
S2、将所述的扩增产物、上述sgRNA、cas12b蛋白、荧光探针和无酶水构成的检测体系进行检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
本发明提供了一种用于检测脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变的sgDNA、sgRNA及包含所述sgDNA或sgRNA的检测试剂盒及检测方法。本发明基于脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变位点设计相应的sgRNA，并对sgRNA进行筛选验证，同时结合CRISPR-cas12b系统，可在短时间内通过荧光信号的变化，检测待测样本中是否存在相应的脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变。所述试剂盒及检测方法不仅操作简单、检测速度快、成本低、可多次重复检测，同时检测灵敏度和检测特异性也显著提高，结果可直观分析，正确率高达96.7％等优点，且成本低，无需特殊装置，非常适用于临床样本检测。
附图说明
图1为本发明实施例3中6个sgRNA的筛选检测结果；
图2为本发明实施例4中MTHFR-677的Sanger测序结果；
图3为本发明实施例4中MTHFR-1298的Sanger测序结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1靶向基因突变位点sgRNA的的设计及获得
1、基于CRISPR-cas12b系统的脑卒中风险筛查检测位点的发现
根据基因序列及大量临床检测数据确定脑卒中相关突变基因常见突变位点序列，针对MTHFR-677、MTHFR-1298这些不同区域设计sgRNA并构建CRISPR-cas12b系统进行研究。结果表明，以表1的SEQ ID NO.13-14所示区域的序列为基于CRISPR-cas12b系统的脑卒中风险筛查突变的靶向序列，具有很好的检测效果。
表1脑卒中风险筛查突变的靶向序列
2、靶向基因突变位点sgRNA的设计
(1)sgDNA序列的选择
本发明中选用的cas12b蛋白为Aapcas12b，所述sgRNA向导序列根据上述SEQ IDNO.13-14所示序列设计，每个突变位点设计了三个相应的sgDNA，其序列具体为：
MTHFR-677突变位点的sgDNA：其序列如SEQ ID NO.7-9任一所示；
MTHFR-1298突变位点的sgDNA：其序列如SEQ ID NO.10-12任一所示；
(2)sgRNA的获得
使用T7高产量转录试剂盒(NEB)将sgDNA用作sgRNA生物合成的模板。通过T7-sgRNA-F(其序列如SEQ ID NO.15任一所示)在37℃下孵育12小时后，将DNase I添加到反应溶液中，并在37℃下孵育30分钟以消化剩余的DNA片段。使用RNA纯化试剂盒纯化转录的sgRNA，并储存在-80℃。
表2转录反应体系
所得sgRNA为：
MTHFR-677突变位点的sgRNA：其序列如SEQ ID NO.1-3任一所示；
MTHFR-1298突变位点的sgRNA：其序列如SEQ ID NO.4-6任一所示。
实施例2脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变的检测试剂盒及检测方法
1、试剂盒的组成
本试剂盒包括脑卒中风险筛查检测的6个sgRNA(2个突变位点对应的sgRNA如实施例1所示获得)或者6个sgDNA(当试剂盒中为sgDNA时，需要操作者先将sgDNA片段分别在T7RNA聚合酶作用下生成RNA，回收纯化得到sgRNA，具体见实施例1)、一条特异性荧光探针(如表3所示)、cas12b蛋白(本实施例采用的是Aapcas12b)、无酶水、DNA酶抑制剂；
表3荧光探针序列
进一步的，所述试剂盒中还可包括扩增体系，所述扩增体系包括扩增引物对，各突变位点的引物对具体为：
MTHFR-677突变位点的扩增引物对序列如SEQ ID NO.16-17所示；
MTHFR-1298突变位点的扩增引物对序列如SEQ ID NO.18-19所示。
2、脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变的检测方法
(1)取50-100ng待测样本DNA，加入扩增体系中，扩增体系如表4所示，其中所述引物为如上所示的对应的扩增引物对。
表4扩增体系
(2)将所述得到的扩增产物加入检测混合液(混合液中包含250-500nM纯化的cas12b，250-500nM sgRNA，1-5μL合成的荧光探针，2μL DNA酶抑制剂和无酶水)
表5检测体系
将所述检测体系孵育后利用荧光检测仪60℃下持续测定荧光值，同时设立阴性对照组(将扩增产物替换为无酶水)，统计分析0.5-1h内反应前后荧光值的变化情况，以判断待测待测样本DNA中是否存在相应的脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变。
实施例3 sgRNA对野生型和突变型序列的特异性检测
合成野生株(WT)和突变株(MUT)的靶序列，分别利用实施例1设计的6个sgRNA构建检测体系进行检测筛选，检测结果如图1所示，其中677-sgRNA1为SEQ ID NO.1所示序列，677-sgRNA2为SEQ ID NO.2所示序列,677-sgRNA3为SEQ ID NO.3所示序列；1298-sgRNA1为SEQ ID NO.4所示序列，1298-sgRNA2为SEQ ID NO.5所示序列，1298-sgRNA3为SEQ ID NO.6所示序列。根据检测结果，选取相较于野生株在突变株中荧光值变化更显著，即灵敏度更高，效果更优异的sgRNA，分别为SEQ ID NO.1所示的677-sgRNA1，SEQ ID NO.4所示的1298-sgRNA1。
通过上述筛选得到效果相对较优的sgRNA，用于构建sgISPR-cas12b系统，并在体外进行切割有效性验证，具体为：
用250-500nM纯化的cas12b，250-500nM sgRNA，1-5μL合成的荧光探针，2μL DNA酶抑制剂，不同稀释浓度的目的DNA，在检测缓冲液(NEBuffer 2.1)中60℃预孵0.1小时。几组反应混合物同时在荧光检测仪中反应(温度设置为60℃，共1个小时)，检测体系的荧光信号变化。
综上，结果显示本发明设计的sgRNA检测靶标DNA的体系荧光值变化趋势均显著高于阴性对照，即本发明所述的用于检测脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变的2个sgRNA可以分别特异性地检测出对应的突变序列。
实施例4 sgRNA在临床样本中的检测
根据实施例3筛选得到的效果相对较优的2个sgRNA，选择15例临床样本检测MTHFR基因C677T和A1298C位点突变进行验证同时通过Sanger测序检测C677T位点C是否突变成T出现明显的套峰如图2所示，A1298C位点A是否C并出现明显的套峰如图3所示，并对结果进行汇总比对。
一、检测方法
1、利用DNA提取试剂盒提取患者血液样本的DNA，操作步骤严格按照说明书进行；
2、按实施例2所述的检测方法进行扩增及检测反应，最后通过荧光值判断检测结果；
3、可同时按实施例2所述的扩增方法扩增产物，可将产物进行sanger测序判断突变情况。
二、检测结果
检测结果如表1所示：
表1 15例样本检测结果
由上述结果可知，本发明实施例提供的试剂盒能有效实现脑卒中风险基因的筛查检测，判断标本是否存在待检基因突变。且检测结果与临床诊断结果完全一致，正确率高达96.7％。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏博嘉生物医学科技有限公司
<120> 脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法
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Claims (10)
1.一种用于检测脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括：
MTHFR-677突变位点的sgRNA：其序列如SEQ ID NO.1-3任一所示；
MTHFR-1298突变位点的sgRNA：其序列如SEQ ID NO.4-6任一所示。
2.一种用于检测脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变的sgDNA，其特征在于，所述sgDNA包括：
MTHFR-677突变位点的sgDNA：其序列如SEQ ID NO.7-9任一所示；
MTHFR-1298突变位点的sgDNA：其序列如SEQ ID NO.10-12任一所示。
3.一种脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的sgDNA。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括cas12b蛋白和荧光探针。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述cas12b蛋白为Aapcas12b蛋白。
6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针序列的5’端标记有荧光基团，3’端标记有猝灭基团。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX和JOE中的任一种，所述猝灭基团选自BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的任一种。
8.如权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的sgDNA或权利要求3-7任一项所述的检测试剂盒在检测脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变上应用，其特征在于，通过荧光检测仪实现扩增产物的检测。
9.根据权利要求8所述检测试剂盒在检测脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变上应用，其特征在于，所述荧光检测仪为8通量可进行快速升降温的便携式设备。
10.一种脑卒中风险筛查相关分子标志物基因突变的非疾病诊断和治疗目的的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、扩增待测样本的核酸得到扩增产物；
S2、将所述的扩增产物、权利要求1所述的sgRNA、cas12b蛋白、荧光探针和无酶水构成的检测体系进行检测。
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