CN113908290B - 一种多功能纳米复合物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种多功能纳米复合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113908290B CN113908290B CN202111230629.1A CN202111230629A CN113908290B CN 113908290 B CN113908290 B CN 113908290B CN 202111230629 A CN202111230629 A CN 202111230629A CN 113908290 B CN113908290 B CN 113908290B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tumor
- pasp
- cells
- imdq
- nanocomposite
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
- A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
- A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
- A61K41/0052—Thermotherapy; Hyperthermia; Magnetic induction; Induction heating therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
- A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Abstract
本发明提供一种多功能纳米复合物及其制备方法和应用,属于生物医药和分子生物学技术领域。本发明将TLR7/8激动剂IMDQ和光敏剂IR780分别通过酰胺缩合与可生物降解的聚天冬氨酸(PASP)偶联,并进一步被钙离子凝聚。IR780经激光照射后不仅可以直接杀伤肿瘤细胞并促进肿瘤相关抗原的释放,还可以诱导肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡。IMDQ作为免疫佐剂具有强大的局部免疫激活作用。体内实验结果表明,瘤内注射纳米复合物后,可促进肿瘤引流淋巴结中DC的成熟,增加肿瘤组织中CD8+T、CD4+T细胞的比例并刺激其激活,还能促进脾脏中记忆性T细胞产生,从而抑制原发性和远处肿瘤的生长,具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域,具体涉及一种多功能纳米复合物及其制备方法和应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
调节免疫反应的免疫治疗已经彻底改变了癌症治疗,并成为肿瘤学的主要治疗方式,使高度侵袭性癌症的持久控制成为可能。肿瘤疫苗是肿瘤免疫治疗的关键途径之一。尽管以T细胞为中心的肿瘤免疫已显示出良好的临床效果,但大多数适应症的应答率仍然很低。T细胞在抗肿瘤免疫中不是自主性的,而长期保护性T细胞应答的发生和发展依赖于先天性免疫应答,进而产生适应性免疫应答。抗原呈递细胞(APC)可以桥接肿瘤固有免疫和适应性免疫之间的相互作用。树突状细胞(Dendritic cells,DC)是功能最强的APC,能够有效地吸收、处理和呈递抗原。因此,许多研究集中在DC疫苗的癌症免疫治疗上。Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)作为一种重要的模式识别受体(pattern recognitionreceptors,PRRs),通过上调MHCⅡ类分子和共刺激分子CD80/86的表达,启动先天性免疫应答,促进DC成熟。其中,TLR7/8激动剂可诱导MyD88依赖的经典TLR信号通路的激活。
尽管TLR7/8激动剂全身给药在鳞状细胞癌、结肠癌、转移性黑色素瘤和胰腺癌的治疗中已被证明是有利的,但其临床转化仍存在缺陷。由于小分子TLR7/8激动剂的PK/PD谱不理想,其主要毒副作用是全身性分布,引起全身促炎性级联反应和免疫相关毒性。此外,一些报告表明,全身给药的TLR7/8激动剂导致白细胞迅速耗尽和短暂的局部免疫功能不全。为了克服这些挑战,肿瘤内注射TLR7/8激动剂作为疫苗佐剂已被研究作为一种更具临床相关性的治疗实体瘤的给药途径。
发明内容
针对现有技术中的不足,本发明的目的在于提供一种多功能纳米复合物及其制备方法和应用。本发明将TLR7/8激动剂IMDQ和光敏剂IR780分别通过酰胺缩合与可生物降解的聚天冬氨酸(PASP)偶联,并进一步被钙离子凝聚。IR780经激光照射后不仅可以直接杀伤肿瘤细胞并促进肿瘤相关抗原的释放,还可以诱导肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡。IMDQ作为免疫佐剂具有强大的局部免疫激活作用。体内实验结果表明,瘤内注射纳米复合物后,可促进肿瘤引流淋巴结中DC的成熟,增加肿瘤组织中CD8+T、CD4+T细胞的比例并刺激其激活,还能促进脾脏中记忆性T细胞的产生,从而抑制原发性和远处CT26肿瘤的生长。基于上述研究成果,从而完成本发明。
本发明的第一个方面,提供一种纳米复合物,所述纳米复合物是通过将TLR7/8激动剂和光敏剂分别通过酰胺缩合与聚天冬氨酸(PASP)偶联,并进一步被氯化钙凝聚获得。
其中,所述TLR7/8激动剂为1-(4-(氨基甲基)苄基)-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(IMDQ);IMDQ与多肽结合后,其固有的TLR活性可以得到很好的保留,从而实现有效地肿瘤免疫治疗。
所述光敏剂为IR780。IR780是FDA批准的吲哚青绿(ICG)的结构类似物。IR780不仅具有良好的光热转换效率,而且具有良好的光动力学特性。更重要的是,由于有机阴离子转运肽(OATPS)的作用,IR780可以优先聚集在肿瘤细胞中,从而区分肿瘤细胞和正常细胞。将IR780和IMDQ与亲水性PASP偶联,可提高其在水中的分散性和溶解性。也可以防止IR780在水溶液中聚集引起的猝灭,并增强其光疗效果。
经瘤内注射后,PASP-IR780链可发挥光热疗法和光动力疗法的作用,在808nm激光照射下可直接杀伤肿瘤。PASP-IMDQ链能促进DC的成熟,进而呈现原位肿瘤切除后产生的肿瘤相关抗原,刺激初始T细胞的增殖和分化。还能促进记忆性T细胞的产生,有效防止肿瘤的扩散和转移。
同时,钙离子具有很高的生物相容性,氯化钙是一种应用广泛的交联剂。由于PASP中含有大量的羧基,可以与氯化钙交联形成pH响应的纳米复合物,其在pH弱碱性(pH7.4)和中性环境中保持稳定,在pH弱酸性(pH 6.5)环境中因酸敏感而降解,从而有利于在肿瘤环境中将纳米复合物中活性成分的释放。
进一步的,所述纳米复合物还含有甘露糖,所述甘露糖连接到PASP-IMDQ链上,使其特异性靶向DC表面的甘露糖受体。
本发明的第二个方面,提供上述纳米复合物的制备方法,所述制备方法包括将TLR7/8激动剂和光敏剂分别通过酰胺缩合反应与聚天冬氨酸(PASP)偶联,向其中加入氯化钙即得。
其中,所述TLR7/8激动剂为IMDQ;所述光敏剂为IR780。
优选的,所述制备方法中还包括在进行偶联反应过程中加入甘露糖(Man)。
更具体的,所述制备方法包括:
S1、IR780-NH2的制备;
S2、聚L-天冬氨酸(PASP)的合成;
S3、IMDQ和甘露糖和/或IR780-NH2与PASP的偶联;
S4、向步骤S3制得产物中加入氯化钙进行凝聚反应即得。
其中,所述步骤S1,具体方法包括:
将N-Boc酪胺溶于NaOH碱液中,冷冻过夜后冷冻干燥得N-BOC酪胺钠盐;将N-BOC酪胺钠盐与IR780碘化物溶于DMSO中,加热反应纯化后即得N-BOC酪胺修饰的IR780;将N-BOC酪胺修饰的IR780溶于DCM和TFA中,解除对BOC的保护;混合物搅拌,然后加入甲苯,减压浓缩,得到双TFA盐;然后纯化后即得深绿色固体IR780-NH2;
其中,
所述N-Boc酪胺与NaOH碱液的摩尔比为1:0.5~5;优选为1:1;
所述IR780碘化物和N-BOC酪胺钠盐的摩尔比为1:1~5,优选为1:2。
所述步骤S2中,聚L-天冬氨酸可采用现有已知方法制备。在本发明的一个具体实施方式中,所述方法包括:将L-天冬氨酸和磷酸溶于均三甲苯和DMF中,在氮气气氛中回流,得到聚琥珀酰亚胺前驱体聚合物;然后通过减压蒸发除去溶剂,残渣溶解在DMF中,然后在水中沉淀;把沉淀物清洗至中性;纯化后即得聚L-天冬氨酸钠盐。
所述步骤S3中,PASP-IMDQ-Man或PASP-IR780是通过PASP主链上的羧酸基序与IMDQ和甘露糖或IR780-NH2的氨基形成酰胺键而合成的。
具体的,在磷酸盐缓冲液(PBS)中加PASP,在连续搅拌下加入缩合剂DMTMM进行反应;然后加入IMDQ(IMDQ和Man)和/或IR780-NH2;在室温下反应后,将溶液转移到透析袋中透析即得。
所述步骤S4中,为保证凝聚反应的顺利进行,CaCl2溶液采用滴加方式进行加入。
本发明的第三个方面,提供上述纳米复合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。
同时,需要说明的是,肿瘤在本发明中如本领域技术人员所知的那样加以使用,其包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤。良性肿瘤被定义为不能在体内形成侵略性、转移性肿瘤的细胞过度增殖。反之,恶性肿瘤被定义为能够形成全身性疾病(例如在远端器官中形成肿瘤转移)的具有多种细胞异常和生化异常的细胞。
本发明的又一具体实施方式中,本发明的药物可用于治疗恶性瘤。可用本发明的药物治疗的恶性瘤的实例包括实体瘤和血液瘤。优选为实体瘤,从而更有利实现药物的瘤内注射。实体瘤可以是乳腺、膀胱、骨、脑、中枢和外周神经系统、结肠、内分泌腺(如甲状腺和肾上腺皮质)、食道、子宫内膜、生殖细胞、头和颈、肝、肺、喉和下咽的肿瘤、间皮瘤、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、肾、小肠、软组织、睾丸、胃、皮肤(如黑色素瘤)、输尿管、阴道和外阴的肿瘤。恶性瘤包括遗传性癌症,例如视网膜母细胞瘤和肾母细胞瘤(Wilms tumor)。
此外,恶性瘤包括在所述器官中的原发性肿瘤及在远端器官中的相应继发性肿瘤(肿瘤转移)。经试验证明,瘤内注射上述药物后,可促进肿瘤引流淋巴结中DC的成熟,增加肿瘤组织中CD8+T、CD4+T细胞的比例并刺激其激活,还能促进脾脏中记忆性T细胞的产生,从而抑制原发性肿瘤和远端器官中的相应继发性肿瘤的生长。
本发明的第四个方面,提供一种肿瘤治疗药物,所述肿瘤治疗药物其活性成分包含上述纳米复合物。
根据本发明,当所述产品为药物时,所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且,根据通常的方法,可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的,本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
优选的,所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。
优选的,本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是,本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化,如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
优选的,所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物,如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
更优选的,上述纳米复合物或上述药物可作为原位癌症疫苗(或原位癌症疫苗佐剂)使用。
本发明的第五个方面,提供一种肿瘤治疗系统,所述肿瘤治疗系统包括:
(a)上述纳米复合物或上述肿瘤治疗药物;以及,
(b)光照装置。
其中,所述光照装置发射光源为近红外光源,具体的,所述光源波长可为808nm,经近红外光源辐照后,PASP-IR780链可实现光能向热能的转换,发挥光热疗法和光动力疗法的作用,从而利用光热效应杀死肿瘤细胞。
本发明的第六个方面,提供一种肿瘤治疗的方法,所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量上述纳米复合物、药物或肿瘤治疗系统。
所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物,优选指哺乳动物,最优选指人。所述“治疗有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量,该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应,这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。必须认识到,本发明所述活性成分的最佳给药剂量和间隔是由其性质和诸如给药的形式、路径和部位以及所治疗的特定哺乳动物等外部条件决定的,而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须认识到,最佳的疗程,即同时化合物在额定的时间内每日的剂量,可用本领域内公知的方法确定。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果:
上述技术方案将TLR7/8激动剂IMDQ和光敏剂IR780分别通过酰胺缩合与可生物降解的聚天冬氨酸(PASP)偶联,并进一步被钙离子凝聚。IR780经激光照射后不仅可以直接杀伤肿瘤细胞并促进肿瘤相关抗原的释放,还可以诱导肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡。IMDQ作为免疫佐剂具有强大的局部免疫激活作用。体内实验结果表明,瘤内注射纳米复合物后,可促进肿瘤引流淋巴结中DC的成熟,增加肿瘤组织中CD8+T、CD4+T细胞的比例并刺激其激活,还能促进脾脏中记忆性T细胞的产生,从而抑制原发性和远处CT26肿瘤的生长,因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中合成路线图;
图2为本发明实施例中N-BOC酪胺修饰的IR780的1H NMR;
图3为本发明实施例中IR780-NH2的1H NMR;
图4为本发明实施例中制备产物的紫外吸收图;
图5为本发明实施例中pH 7.4以及pH6.5的PBS中nanocomplex的TEM观察结果图;其中,左侧为pH 7.4环境,右侧为pH 6.5环境;
图6为本发明实施例中制备产物光热效果图;
图7为本发明实施例中IR780-nanocomplex的光动效果图;
图8为本发明实施例中不同处理后不同时间点CT26细胞摄取的流式结果图;
图9为本发明实施例中808nm近红外激光照射后的细胞毒性结果图;
图10为本发明实施例中用流式细胞仪分析光热治疗后CT26细胞中CRT的暴露图;
图11为本发明实施例中用荧光倒置显微镜分析光热治疗后CT26细胞中CRT的暴露;刻度为200μm;
图12为本发明实施例中流式细胞术分析甘露糖修饰前后不同时间点BMDC摄取TAMRA的情况;
图13为本发明实施例中流式细胞术分析甘露糖修饰前后PASP-IMDQ对BMDC成熟的影响;
图14为本发明实施例中小鼠注射IR780或IR780-nanocomplex后在不同时间间隔的活体光谱成像;
图15为本发明实施例中荷瘤小鼠瘤内注射1#)PBS、2#)PBS+L、3#)IR780+L、4#)PASP-IR780+L、5#)PASP-IMDQ、6#)PASP-IR780-IMDQ+L、7#)IR780-IMDQ-nanocomplex+L后的近端肿瘤生长曲线。
图16为本发明实施例中荷瘤小鼠瘤内注射1#)PBS、2#)PBS+L、3#)IR780+L、4#)PASP-IR780+L、5#)PASP-IMDQ、6#)PASP-IR780-IMDQ+L、7#)IR780-IMDQ-nanocomplex+L后的远端肿瘤生长曲线。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明,以下实例仅是为了解释本发明,并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件,通常按照常规条件,或按照试剂公司所推荐的条件;下述实施例中所用的试剂、耗材等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明,但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法,通常按照常规条件进行。
实施例
方法:
IR780-NH2的制备:
N-BOC酪胺钠盐:N-Boc酪胺(1.0g,4.2mmol)溶于含有1eq NaOH(4.2mmol)的20mL水中。溶液在-80℃冷冻过夜,然后冷冻干燥,得到白色固体。
N-BOC酪胺修饰的IR780:将IR780碘化物(100mg,0.15mmol)和N-BOC酪胺钠盐(78mg,0.3mmol)溶解于2mL无水DMSO中,在65℃微波加热下搅拌30分钟。然后用乙酸乙酯稀释,用水洗5-10次,然后用盐水洗净,用无水Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩。柱层析(DCM/甲醇-甲醇梯度为5~10%)纯化得到55.3mg(50%)的绿色固体。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.87(d,J=14.3Hz,2H),7.34–7.29(m,2H),7.23(d,J=6.8Hz,2H),7.18(d,J=7.8Hz,2H),7.14(d,J=7.5Hz,2H),7.07(d,J=7.9Hz,2H),6.96(d,J=8.5Hz,2H),6.05(d,J=14.1Hz,2H),4.67(s,1H),4.03(t,J=7.3Hz,4H),3.24(s,2H),2.73(d,J=7.9Hz,2H),2.70(s,4H),2.07–1.99(m,2H),1.84(h,J=7.3Hz,4H),1.33(s,9H),1.31(s,12H),1.01(t,J=7.4Hz,6H).ESI-MS:m/z=740.435[M+H]+。
IR780-NH2:将所得固体溶于5mL DCM和5mL TFA中,解除对BOC的保护。混合物搅拌3小时,然后加入甲苯,减压浓缩,得到58.9mg的双TFA盐。然后用DCM稀释,用饱和碳酸氢钠洗三次后用水洗三次,然后用无水Na2SO4干燥,过滤,减压浓缩,最终得深绿色固体IR780-NH2。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.14(s,3H),7.82(s,2H),7.31–6.81(m,14H),5.87(s,2H),3.71(d,J=103.4Hz,4H),3.01(s,2H),2.90(d,J=10.1Hz,2H),1.95(s,2H),1.75(h,J=7.3Hz,4H),1.23(s,12H),0.93(t,J=7.4Hz,6H).ESI-MS:m/z=640.394[M+H]+.
聚L-天冬氨酸(PASP)的合成:PASP是由聚琥珀酰亚胺(PSI)合成的一种可生物降解的多肽。反应步骤与之前文献相同。首先,将L-天冬氨酸(25g,0.188mol)和磷酸(1.862g,0.019mol)溶解在56mL均三甲苯和24mL DMF中,在氮气气氛中回流24小时,得到聚琥珀酰亚胺前驱体聚合物。然后通过减压蒸发除去溶剂,残渣溶解在DMF中,然后在水中沉淀。把沉淀物洗几次,直到它变成中性。最终产品在80℃真空中干燥24小时。将PSI加入0.2M NaOH水溶液中,室温搅拌24小时,加入0.1M HCl水溶液中和pH,然后用分子量为3.5KDa的水透析。采用冷冻干燥法制备了聚L-天冬氨酸钠盐。
IMDQ和甘露糖或IR780-NH2与PASP的偶联(PASP-IMDQ-Man或PASP-IR780):PASP-IMDQ-Man或PASP-IR780是通过PASP主链上的羧酸基序与IMDQ和甘露糖或IR780-NH2的氨基形成酰胺键而合成的。简而言之,在5ml磷酸盐缓冲液(PBS)中加入50mg的PASP,在连续搅拌下加入1.5M过量的DMTMM,反应10分钟。然后加入1mL的IMDQ或IR780-NH2(溶解在DMSO中,10mg/mL)。在室温下反应三天后,将溶液转移到分子量为3.5KDa的透析袋中透析一天。冷冻干燥后,得到干粉PASP-IMDQ或PASP-IR780。同样的方法用DMTMM再次激活PASP-IMDQ的羧基,与甘露糖反应得到mpIM。扫描250-450nm的紫外-可见光谱,可计算接枝的IMDQ的量。扫描500-900nm的紫外-可见光谱,可计算接枝的IR780的量。
nanocomplex的制备:在搅拌状态下,将10mg/ml的CaCl2溶液缓慢滴加到同体积10mg/ml的PASP溶液中,混合物在室温条件下搅拌10小时。15000rpm离心5分钟,以去除多余的离子和聚合物,得到PASP纳米复合物。
nanocomplex的表征:通过透射电子显微镜(TEM)对纳米颗粒的形态进行了表征。通过DLS测量粒径和zeta电位。
体外光热能力:为了考察IR780的光热性能,采用近红外激光对不同样品进行照射。简而言之,将IR780稀释至10μM,用808nm近红外激光器(1W cm-2)照射。用热敏相机和热像仪记录不同时间的温度。
活性氧测定:用基于1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)的光谱方法研究了近红外激光照射下活性氧的产生。将IR780稀释至10μM,各组分别加入3μL DPBF(溶解于二甲基亚砜,5mg mL-1)。然后,各组接受808nm近红外激光(1W cm-2)照射不同时间,并用紫外-可见分光光度计扫描300~500nm的波长。
结果:
本发明合成的IR780-NH2以及制备
PASP-IR780/PASP-IMDQ-Mannose相关的合成路线如图所示(图1)。用1H NMR证实了IR780-NH2的结构(图2、图3),证明IR780-NH2已成功合成。本发明发现IR780的最大的紫外-可见吸收波长在796nm处,而IR780-NH2的在782nm处(图4)。然后用DMTMM活化PASP的羧基,通过酰胺反应将IR780-NH2或IMDQ和Mannose连接到PASP上。最后,以CaCl2作为交联剂,与PASP链室温搅拌,制备出pH敏感的nanocomplex。TEM观察结果显示,pH 7.4的PBS中的nanocomplex呈球形形貌,直径约为40-80nmnm,而nanocomplex在pH 6.5的环境中由于酸敏感而降解(图5)。
为了了解IR780-nanocomplex的光热活性,利用热敏相机研究了808nm近红外激光照射下溶液的温度变化(图6)。与空白对照相比,IR780、IR780-NH2、PASP-IR780以及IR780-nanocomplex的温度随照射时间的延长而升高。然而,由于将IR780修饰后,IR780-NH2的紫外吸收峰蓝移,因此修饰后的光热活性与游离IR780(溶解在DMSO中)相比有所下降。但将IR780溶解在水(含1%DMSO)中时,其光热性能大大降低。这是由于IR780在水中的溶解度不佳并团聚体所致。因此,本发明的nanocomplex在生理环境下会具有更好的光热活性。
进一步,本发明使用1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)探针研究了IR780-nanocomplex的光动力效应(图7)。结果显示,在808nm近红外激光以1w/cm2强度照射下,IR780-nanocomplex的DPBF均持续消耗,表明经激光照射后可以产生大量的ROS。
方法:
细胞培养:用含10%胎牛血清和2%青霉素-链霉素的商品化RPMI1640细胞培养液,在37℃、5%二氧化碳条件下按标准细胞培养程序培养小鼠结肠癌细胞。
体外细胞摄取试验:CT26细胞接种于24孔板(2×105个/孔),分别与含游离IR780、PASP-IR780或IR780-nanocomplex(IR780,5μM)的培养基孵育4,12,24小时。孵育后收集细胞,用BD FACSCalibur流式细胞仪检测。
体外细胞毒性试验:CT26细胞接种于96孔板(5×103个/孔),37℃培养12小时。去除原培养基,分别加入不同浓度的PBS、IR780、PASP-IR780或IR780-nanocomplex继续培养24小时。之后,用预冷的PBS洗涤细胞,并加入新鲜培养液。然后,用808nm近红外激光(1Wcm-2)照射细胞3分钟。照射后用CCK-8比色法测定细胞相对存活率。
ICD测定:用钙网蛋白抗体通过流式细胞术和荧光倒置显微镜检测CRT。CT26细胞以每孔8×104细胞的密度接种于48孔培养板中,并在37℃培养12小时。然后,用PBS、IR780、PASP-IR780或IR780-nanocomplex(IR780,5μM)处理细胞,并进一步培养24小时。然后,用预冷PBS洗涤细胞并添加新鲜培养基。接下来,细胞接受808nm近红外激光(1W cm-2)3分钟。细胞与3%BSA孵育30分钟以阻断非特异性结合位点。然后分别添加钙网蛋白兔单克隆抗体和结合Alexa-Fluor 488的二级抗体30分钟。最后,用流式细胞仪对细胞进行分析。对于荧光倒置显微镜检测,将CT26细胞以每孔4×104个细胞的密度接种在48孔板中。经不同处理后,将细胞分别与4%多聚甲醛、3%牛血清白蛋白、钙卫蛋白抗体、结合Alexa Fluor 488和DAPI的二级抗体孵育,并用荧光倒置显微镜观察。
结果:
通过流式细胞术检测CT26肿瘤细胞的细胞摄取(图8)。流式细胞术结果显示,PASP-IR780组和IR780-nanocomplex组的荧光强度随时间增加而增加,且IR780-nanocomplex组内的摄取量更高。而游离IR780摄取从4小时到12小时增加,但24小时的摄取减少下降。
然后,本发明测试了IR780-nanocomplex对CT26细胞的杀死能力。在808nm激光照射后对CT26肿瘤细胞表现出剂量依赖的细胞毒性(图9)。这与先前对光热效应的表征一致,表明nanocomplex显著增加了IR780对CT26细胞的光治疗效果。
为了研究IR780在CT26肿瘤细胞中诱导ICD的可能性,本发明测定了细胞表面钙网蛋白(CRT)的暴露情况。流式细胞术的定量分析表明,激光照射后IR780有效地促进了CRT的流出,且IR780-nanocomplex的信号最强(图10)。荧光倒置显微镜与流式细胞术结果一致(图11)。
方法:
体外BMDC的摄取:将收集的BMDC离心后转移到48孔板中,继续培养12小时。用荧光染料TAMRA代替IMDQ。然后用PBS、PASP-TAMRA和PASP-TAMRA-Man培养基代替原培养基。培养12/24小时后,收集细胞,流式细胞仪检测。
体外BMDC成熟:BMDC转移到48孔板中,继续培养12小时。用不同制剂处理24小时后,收集细胞。将细胞与大鼠血清孵育30分钟以阻断非特异性结合位点。然后,用固定活性染料、抗CD11c-APC、抗CD86-BV650、抗CD40-PerCP-CY5.5和抗MHC-II-BV786抗体进行染色后,通过流式细胞仪测定DC细胞的成熟度。
结果:
树突状细胞(dendriticcells,DCs)作为最重要的抗原提呈细胞,在启动抗肿瘤免疫应答中发挥着重要作用。其激活是诱导适应性抗肿瘤免疫的关键。本发明在PASP-IMDQ链上修饰了具有DC靶向能力的甘露糖,以提高DC的摄取和活化。在研究摄取能力时,用荧光染料TAMRA代替IMDQ,以便观察。首先从C57BL/6小鼠提取BMDC,进行了体外研究,研究发现,甘露糖修饰后PASP链的摄取量显著增加(图12)。接下来,本发明对比了甘露糖修饰前后PASP-IMDQ对DC的活化能力。结果表明,甘露糖修饰后PASP-IMDQ具有更好的活化能力(图13)。
方法:
体内IVIS光谱成像:为建立小鼠原发性肿瘤模型,3~5周龄雄性BALB/c小鼠皮下注射8×105个CT26细胞。待肿瘤长到200mm3时,平均分成三组,分别给予游离IR780、PASP-IR780、IR780-nanocomplex。在预定时间使用活体成像系统对小鼠进行成像。48小时后处死小鼠。流式细胞术分析从荷瘤小鼠中提取的肿瘤细胞中IR780的摄取。
结果:使用IVIS成像系统来跟踪IR780在CT26荷瘤小鼠体内模型上的生物分布。结果显示,与游离IR780相比,IR780-nanocomplex在肿瘤区域的保留时间更长,而游离IR780被迅速清除。在48小时内,各组没有明显的全身分布迹象(图14)。
方法:
体内抗肿瘤作用:为研究体内抗肿瘤效果,本发明制备了小鼠的近端瘤和远端瘤模型,用来模拟原发肿瘤和转移瘤。第一次肿瘤接种时,将CT26细胞(7×105)皮下注射到每只雄性BALB/c小鼠的右后侧,作为近端肿瘤。3天后进行第二次肿瘤接种,将CT26细胞(7×105)皮下注射到每只雄性BALB/c小鼠的左后侧,作为远处肿瘤。将小鼠随机分为7组(n=6)。当近端肿瘤生长至100mm3时,分别向小鼠瘤内注射(1)PBS,(2)PBS+L,(3)IR780+L,(4)PASP-IR780+L,(5)PASP-IMDQ,(6)PASP-IR780-IMDQ+L,(7)IR780-IMDQ-nanocomplex+L(“L”代表激光照射:808nm,1W cm-2,2分钟;IR780:1.5mg/kg;IMDQ:0.5mg/kg)。第一组和第五组不使用激光治疗,第二组、第三组、第四组、第六组和第七组在给药后第二天使用激光治疗。小鼠每四天治疗一次,共四次。远端肿瘤不予治疗。每两天测量一次肿瘤的长度、宽度和体重,共22天,第23天处死。对近端肿瘤进行称重。
结果:
首先,本发明观察了近端肿瘤的抑制作用(图15)。nanocomplex组的肿瘤生长受到明显抑制。与nanocomplex相比,PASP-IR780-IMDQ组由于较低的摄取率和较短的肿瘤保留时间而具有较低的肿瘤抑制作用。然而,由于两种药物的联合,PASP-IR780-IMDQ组仍然具有良好的抗肿瘤作用。
对于远端肿瘤,nanocomplex组具有最强的抑制作用(图16)。与前两组相比,PASP-IMDQ和PASP-IR780-IMDQ也有较好的抑制作用,这主要是由于IMDQ具有较强的免疫调节作用。
本发明未尽事宜为公知技术。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
3.如权利要求2所述的纳米复合物,其特征在于,
所述步骤S1,具体方法包括:
将N-Boc酪胺溶于NaOH碱液中,冷冻过夜后冷冻干燥得N-BOC酪胺钠盐;将N-BOC酪胺钠盐与IR780碘化物溶于DMSO中,加热反应纯化后即得N-BOC酪胺修饰的IR780;将N-BOC酪胺修饰的IR780溶于DCM和TFA中,解除对BOC的保护;混合物搅拌,然后加入甲苯,减压浓缩,得到双TFA盐;然后纯化后即得深绿色固体IR780-NH2;
其中,
所述N-Boc酪胺与NaOH碱液的摩尔比为1:0.5~5;
所述IR780碘化物和N-BOC酪胺钠盐的摩尔比为1:1~5;
所述步骤S2中,聚L-天冬氨酸的合成方法包括:将L-天冬氨酸和磷酸溶于均三甲苯和DMF中,在氮气气氛中回流,得到聚琥珀酰亚胺前驱体聚合物;然后通过减压蒸发除去溶剂,残渣溶解在DMF中,然后在水中沉淀;把沉淀物清洗至中性;纯化后即得聚L-天冬氨酸钠盐;
所述步骤S3中,PASP-IMDQ-Man是通过PASP主链上的羧酸基序与IMDQ和Man的氨基形成酰胺键而合成;
PASP-IR780是通过PASP主链上的羧酸基序与IR780-NH2的氨基形成酰胺键而合成;
所述步骤S4中,CaCl2溶液采用滴加方式进行加入。
4.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于,
所述N-Boc酪胺与NaOH碱液的摩尔比为1:1;
所述IR780碘化物和N-BOC酪胺钠盐的摩尔比为1:2;
所述步骤S3中,在磷酸盐缓冲液中加PASP,在连续搅拌下加入缩合剂DMTMM进行反应;然后加入IMDQ和Man或加入IR780-NH2;在室温下反应后,将溶液转移到透析袋中透析即得。
5.权利要求1-2任一项所述纳米复合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。
6.一种肿瘤治疗药物,其特征在于,所述肿瘤治疗药物其活性成分包含权利要求1-2任一项所述纳米复合物。
7.一种肿瘤治疗系统,其特征在于,所述肿瘤治疗系统包括:
(a)权利要求1-2任一项所述纳米复合物或权利要求6所述肿瘤治疗药物;以及,
(b)光照装置。
8.如权利要求7所述一种肿瘤治疗系统,其特征在于,所述光照装置发射光源为近红外光源。
9.如权利要求8所述一种肿瘤治疗系统,其特征在于,光源波长为808 nm。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111230629.1A CN113908290B (zh) | 2021-10-22 | 2021-10-22 | 一种多功能纳米复合物及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111230629.1A CN113908290B (zh) | 2021-10-22 | 2021-10-22 | 一种多功能纳米复合物及其制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113908290A CN113908290A (zh) | 2022-01-11 |
CN113908290B true CN113908290B (zh) | 2023-06-02 |
Family
ID=79242245
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111230629.1A Active CN113908290B (zh) | 2021-10-22 | 2021-10-22 | 一种多功能纳米复合物及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113908290B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116327782A (zh) * | 2023-03-27 | 2023-06-27 | 山东大学 | 一种骨靶向共递送硼替佐米和泊马度胺纳米复合物及其制备方法和应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112006983A (zh) * | 2020-09-04 | 2020-12-01 | 东南大学 | 一种纳米自组装体及其制备方法与应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100528933C (zh) * | 2006-07-04 | 2009-08-19 | 北京联合大学 | 聚天冬氨酸钙及其制备方法 |
AU2013202682B2 (en) * | 2006-09-21 | 2015-07-16 | Société des Produits Nestlé S.A. | Antibody-based arrays for detecting multiple signal transducers in rare circulating cells |
-
2021
- 2021-10-22 CN CN202111230629.1A patent/CN113908290B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112006983A (zh) * | 2020-09-04 | 2020-12-01 | 东南大学 | 一种纳米自组装体及其制备方法与应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113908290A (zh) | 2022-01-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wu et al. | Highly efficient cascading synergy of cancer photo-immunotherapy enabled by engineered graphene quantum dots/photosensitizer/CpG oligonucleotides hybrid nanotheranostics | |
Oh et al. | Electrostatic charge conversion processes in engineered tumor-identifying polypeptides for targeted chemotherapy | |
KR102269861B1 (ko) | 광감제 및 키토산의 컨쥬게이트, 및 이의 용도 | |
CN110981870B (zh) | 基于pH和GSH双重响应的β-咔啉-环烯酮衍生物及其用途 | |
WO2005095494A1 (ja) | 新規水溶性フラーレン、その製造方法およびそれを含む活性酸素発生剤 | |
JP2016531591A (ja) | 腫瘍を診断および処置するためのウイルス様粒子結合体 | |
JP2011518890A (ja) | 新規のクロリンe6−葉酸結合化合物、その製造方法、およびそれを含有する癌治療用薬学的組成物 | |
US11718625B2 (en) | Near-infrared fluorescent molecule active targeting folate receptor and preparation method thereof | |
JP2014185333A (ja) | 近赤外色素結合ヒアルロン酸誘導体およびそれを有する光イメージング用造影剤 | |
Liang et al. | Biocompatible tumor-targeting nanocomposites based on CuS for tumor imaging and photothermal therapy | |
KR101250150B1 (ko) | 광역학치료를 위한 고분자-광응답제 접합체 및 이의 제조방법 | |
KR20130030229A (ko) | 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 블록공중합체와 광감작제가 공유 결합된 광역학 치료용 복합체 | |
CN111001012A (zh) | 一种亲水碳酸酯型抗体偶联药物 | |
Villaverde et al. | Targeted Chemo‐Photothermal Therapy: A Nanomedicine Approximation to Selective Melanoma Treatment | |
CN113908290B (zh) | 一种多功能纳米复合物及其制备方法和应用 | |
US20170189550A1 (en) | Silicon particles targeting tumor cells | |
US10561730B2 (en) | Plant virus particles for delivery of photosensitive agents | |
CN105582541B (zh) | 聚乙二醇化的氧化石墨烯-卟啉二聚体盐复合物及其用途 | |
CN113967256B (zh) | 一种具有光热-化疗-免疫功能的纳米粒及其制备方法和应用 | |
CN113797350B (zh) | 一种糖基聚合物及其制备方法和用途 | |
JP2011518891A (ja) | クロリンe6−葉酸結合化合物およびキトサンを含有する癌治療用薬学的組成物 | |
CN113786492A (zh) | 一种可用于光动力治疗的聚合物载体及其制备方法和用途 | |
CN116407647A (zh) | 一种具有三联光-免疫功能的偶联物及其制备方法和应用 | |
CN114605367B (zh) | 含香豆素的连接子及含该连接子的抗体偶联药物 | |
CN113425840B (zh) | 一种纳米佐剂及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |