CN113896932A - 多孔材料前驱体组合物、多孔材料及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多孔材料前驱体组合物，包括前驱体聚合物、致孔剂、光引发剂和光发泡剂。本发明还公开了利用上述组合物制备多孔材料的方法以及多孔材料。本发明中水凝胶内微观孔道为细胞与外界物质交换提供通道，并为细胞的增殖生长提供空间。与传统的无孔水凝胶相比本发明的多孔水凝胶可有效提高细胞增殖活性。本发明所述多孔水凝胶制备简单，可原位成型，在细胞培养及组织工程领域有广阔应用前景。

Description

多孔材料前驱体组合物、多孔材料及制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料领域，尤其是涉及一种多孔材料前驱体组合物、多孔材料及制备方法。
背景技术
水凝胶是一种富含水分的三维聚合物网络，由于其高亲水性及与细胞外基质的结构相似性，已被广泛应用于组织工程领域。
虽然水凝胶可模拟细胞外基质的三维空间结构，但其过于紧密的高分子网络会限制细胞从外界摄取营养及排出代谢废物。为了增强水凝胶内细胞与外界的物质交换，通常需要提高凝胶材料的微观孔径。目前常见的解决方案包括使用明胶微粒作为牺牲材料致孔、乳液混合、3D打印孔道结构等。这些解决方案往往存在造孔操作复杂、孔道尺寸过大、孔的贯通性差及凝胶不稳定等缺点。
公开号为CN111040199A(公开日2020.04.21)的专利文献公开了一种基于两个水相不互溶乳液的光交联多孔水凝胶，其首先制备聚氧化乙烯溶液和甲基丙烯酰化明胶溶液；其次将所述的甲基丙烯酰化明胶溶液中加入所述的聚氧化乙烯溶液，搅拌后得到乳液；最后将乳液置于模具中，在紫外光下照射后得到光交联水凝胶，将所述光交联水凝胶在1×PBS缓冲液中透析以除去聚氧化乙烯，即制备得到所述基于两个水相不互溶乳液的光交联多孔水凝胶。该专利文献所述多孔水凝胶的制备包含步骤较多，需要经过两种前驱体聚合物溶液配制、混合、固化及长时间透析去除致孔剂等过程。这在产品应用方面操作难度大且耗时长，不利于商业转化。此外，该专利使用单一的乳液相分离致孔机制，其致孔效果受到局限。
发明内容
为解决以上现有技术的不足，本发明提出一种能够制备多孔材料的多孔材料前驱体组合物，利用多孔材料前驱体组合物可快速简便的得到原位致孔的多孔材料，更有利于细胞的三维培养。
为实现上述目的，提供的技术方案如下：
一种多孔材料前驱体组合物，包括前驱体聚合物、致孔剂、光引发剂和光发泡剂。
利用本发明的多孔材料前驱体组合物制作多孔材料时，仅需要将所述多孔材料前驱体组合物与对应的缓冲溶液混合均匀，然后通过相应的固化条件即可得到对应的多孔材料。
实际使用时，为了方便保存和销售，可以直接将驱体聚合物、致孔剂、光引发剂和光发泡剂溶于溶剂(比如水中)中做成冻干材料保存。当需要获得多孔材料时，可以将所述冻干材料与对应的缓冲溶液混合均匀，然后通过相应的固化条件即可得到对应的多孔材料。当然，也可以直接将驱体聚合物、致孔剂、光引发剂、光发泡剂与对应的缓冲溶液直接混合均匀，然后经过固化得到对应的多孔材料。
制备多孔材料中，其中前驱体聚合物与致孔剂可以发生乳液相分离，在凝胶固化后致孔剂可扩散出凝胶留下孔道结构。此外，光发泡剂同时可在水凝胶中产生大量微孔结构与致孔剂具有协同作用。
作为优选，所述前驱体聚合物为水凝胶前驱体聚合物。
作为优选，所述水凝胶前驱体聚合物为明胶、胶原蛋白、壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸、葡聚糖、糊精、纤维素、硫酸软骨素及其衍生物的双键改性物中的一种或几种。所述水凝胶前驱体聚合物包括但不仅限于丙烯酰化、甲基丙烯酰化或甲基丙烯酸缩水甘油酯化的明胶、丙烯酰化、甲基丙烯酰化或甲基丙烯酸缩水甘油酯化的胶原蛋白、丙烯酰化、甲基丙烯酰化或甲基丙烯酸缩水甘油酯化的壳聚糖、丙烯酰化、甲基丙烯酰化或甲基丙烯酸缩水甘油酯化的羧甲基壳聚糖、丙烯酰化、甲基丙烯酰化或甲基丙烯酸缩水甘油酯化的羟丙基壳聚糖、丙烯酰化、甲基丙烯酰化或甲基丙烯酸缩水甘油酯化的海藻酸钠、丙烯酰化、甲基丙烯酰化或甲基丙烯酸缩水甘油酯化的透明质酸、丙烯酰化、甲基丙烯酰化或甲基丙烯酸缩水甘油酯化的葡聚糖、丙烯酰化、甲基丙烯酰化或甲基丙烯酸缩水甘油酯化的糊精、丙烯酰化、甲基丙烯酰化或甲基丙烯酸缩水甘油酯化的纤维素、丙烯酰化、甲基丙烯酰化或甲基丙烯酸缩水甘油酯化的羧甲基纤维素、丙烯酰化、甲基丙烯酰化或甲基丙烯酸缩水甘油酯化的硫酸软骨素。优选的双键改性物包括甲基丙烯酰化明胶(GelMA)、甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)、甲基丙烯酰化壳聚糖(CSMA)。
作为优选，所述致孔剂为透明质酸(HA)、聚氧化乙烯(PEO)、明胶(Gelatin)中的一种或几种。
作为优选，所述光引发剂为2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I2959)、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)中的一种，优选为LAP。
作为优选，所述光发泡剂为偶氮类水溶性光引发剂为偶氮二N,N’环丁基异丁基脒水合物(VA-067)、偶氮二N-羟基异丁基脒水合物(VA-057)、2,2'-偶氮(2-甲基-N-(2-羟基乙基)丙酰胺)(VA-086)、偶氮二异丁基脒盐酸盐(V-50)、偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐(VA-044)中的一种。
作为优选，所述水凝胶前驱体聚合物为甲基丙烯酰化透明质酸时，致孔剂为明胶；所述水凝胶前驱体聚合物为甲基丙烯酰化明胶(GelMA)时，致孔剂为PEO或透明质酸；所述致孔剂为PEO时，其分子量为100-1000kDa，优选为500kDa；光引发剂优选为LAP。
作为优选，所述多孔材料前驱体组合物中：所述前驱体聚合物、致孔剂、光引发剂、光发泡剂质量比为：2～15:0.2～10:0.25～0.5:0.2～1。作为进一步优选，2～15:0.2～1.8:0.25～0.5:0.2～1。
或者按照重量百分比，所述多孔材料前驱体组合物包括：
Figure BDA0002570497910000031
作为一种优选方案，所述组合物中还包括磷酸缓冲盐溶液，加入量保证前驱体聚合物质量百分比浓度为2％-15％。采用该技术方案时，使用时，可以直接将驱体聚合物、致孔剂、光引发剂、光发泡剂与对应的缓冲溶液溶解混合均匀，然后固化得到对应的多孔材料。
本发明还提供了一种包含上述任一项所述的多孔材料前驱体组合物的冻干粉。所述冻干粉可以由下述方法制备得到：将驱体聚合物、致孔剂、光引发剂、光发泡剂溶解在适于冻干的溶剂中(比如水，或者水与其他水溶性溶剂的混合物)，然后经过冻干得到所述的冻干粉。采用该技术方案，不仅方便了所述多孔材料前驱体组合物的保存和运输，同时也能保证冻干粉中，组合物各成分之间的混合均匀性，保证后最终多孔材料的结构和性能的稳定性。
本发明还提供了一种多孔材料的制备方法，由上述任一项所述多孔材料前驱体组合物制备得到。
一种多孔材料的制备方法，包括如下步骤：
(1-1)将前驱体聚合物、致孔剂、光引发剂、光发泡剂和磷酸缓冲盐溶液混合均匀，得到多孔材料前驱体溶液；
(1-2)固化，得到所述多孔材料；
或者，
(2-1)将前驱体聚合物、致孔剂、光引发剂、光发泡剂溶解到水中；
(2-2)冻干，得到冻干多孔水凝胶前驱体；
(2-3)将冻干多孔水凝胶前驱体溶于磷酸缓冲盐溶液，混合均匀；
(2-4)固化，得到所述多孔材料。
作为优选，在步骤(1-2)或步骤(2-4)前，进行灭菌，并与所需细胞重悬，最终得到负载有待培养细胞的多孔材料。采用该技术方案，可以直接制备得到具有目标细胞的多孔材料，可以直接对目标细胞进行培养。当然，也可以采用本发明的方法制备好不含细胞的多孔材料后，再进行细胞的吸附和培养。
作为优选，步骤(1-2)或步骤(2-4)中的固化条件为光固化或者离子固化；其中光固化采用的光源波长为365nm～450nm。优选为405nm。
作为优选，步骤(2-1)中，避光加热搅拌溶解，加热温度为35～60；作为进一步优选，所述加热温度为37～60℃，作为更进一步优选，所述加热温度为50℃。
作为优选，步骤(2-3)将冻干多孔水凝胶前驱体避光加热溶解于磷酸缓冲盐溶液中，加热溶解温度为35～50℃。作为进一步优选，所述加热温度为37～50℃，作为更进一步优选，所述加热温度为37℃。
步骤(1-1)或者步骤(2-3)中，加入使用的PBS的量需要使水凝胶前驱体聚合物浓度为2％-15％。
作为一种优选的实施方案，一种多孔材料的制备方法和应用，包括以下步骤：
1)将水凝胶前驱体聚合物、致孔剂、光引发剂、光发泡剂投入去离子水中，避光加热搅拌溶解；
2)将上述多孔水凝胶前驱体溶液冻干；
3)将步骤2)制备的冻干多孔水凝胶前驱体以一定量PBS避光加热溶解；
4)将步骤3)所制得凝胶前驱体溶液过滤灭菌；
5)将实验所需细胞消化离心并用步骤4)所得无菌凝胶前驱体溶液重悬；
6)将含有细胞的水凝胶前驱体注入培养模具，以405nm光源辐照固化。
本发明还提供了一种由上述任一项技术方案所述的多孔材料的制备方法制备得到的多孔材料。
作为优选，所述前驱体聚合物为水凝胶前驱体聚合物，所述多孔材料为多孔水凝胶材料。
本发明还提供了一种上述任一技术方案所述的多孔材料作为生物材料的应用。作为优选，一种上述任一技术方案所述的多孔材料作为细胞培养材料或引导组织再生等生物材料领域的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下优点与有益效果：
本发明提供了一种制备多孔水凝胶的新思路：发泡-相分离协同致孔。水凝胶前驱体直接负载细胞并原位固化成型。致孔剂快速扩散出水凝胶，留下孔道结构，发泡剂产生的氮气进一步使水凝胶疏松多孔。
制备的多孔水凝胶材料不仅保有原本材料的性质，还具有相互联通的孔隙结构，为支架内部营养运输及废物排出提供通道，具有良好的生物相容性，在细胞三维培养及引导组织再生等生物材料领域具有广阔应用前景。
附图说明
图1为MC3T3-E1在多孔HAMA上三维培养第14天的F-actin的共聚焦图；
图2为BMSC在多孔GelMA上三维培养图；
图3为GFP-HUVEC在多孔材料三维培养的增殖情况图；
图4为GFP-HUVEC在多孔GelMA上三维培养第6天的共聚焦图；
图5为BMSC在多孔水凝胶上三维培养第5天活死染色图；
图6为实施例6～14所制备水凝胶的激光共聚焦照片图。
具体实施方式
为了使得本发明更容易理解，本发明结合下面附图和实施例对本发明做进一步说明：
实施例1
将水凝胶前驱体聚合物、致孔剂、光引发剂、光发泡剂按照表1中实施例1各组的物料和物料量投入10mL去离子水(表1中的重量体积百分比是以去离子水的体积为基准计算得到)中，避光50℃加热搅拌溶解；将上述水凝胶前驱体溶液冻干；将冻干水凝胶前驱体以10mL PBS为溶剂37℃避光加热搅拌，溶解成水凝胶前驱体溶液后过滤除菌，与消化离心的MC3T3-E1细胞(以得到凝胶体积计，最终种植密度为5*106/mL)混合均匀配制成含细胞的水凝胶前驱体溶液，取其注入培养器皿，以405nm光源辐照固化，分别得到支架1-5(按照1-5组物料比得到)和支架1-18+5(按照1-18+5组物料比得到，其他实施例同)。
加入培养基培养，每2天换新的培养基；将支架培养至第14天取出，固定，并进行F-actin染色。5wt％HAMA支架(支架1-5)和5wt％HAMA-1.8wt％Gelatin支架(支架1-18+5)的F-actin染色的截面共聚焦图片如图1所示。
如图1所示，培养至第14天后的，没有添加致孔剂的支架1-5出现中空，而且支架中间的细胞多圆球状，而支架1-18+5中的MC3T3-E1伸展、增殖状态均比支架1-5更好。这是因为发泡-相分离协同致孔的HAMA(支架1-18+5)具有良好的孔隙结构，有利于营养渗透及废物排出。因此，多孔HAMA(支架1-18+5)更利于细胞的三维生长。
实施例2
按照如表1中实施例2中各组的物料和物料比，参照实施例1中的步骤，分别制备得到支架2-5、支架2-14+5、支架2-14+5+3；
按照实施例1的方法进行培养，利用光学倒置显微镜在第1、4天进行拍照；
如图2所示，2-14+5组和2-14+5+3组得到的支架在第1天表现出明显伸展，而支架2-5(仅加入5wt％GelMA和光引发剂)伸展较少；在第4天时，三组均有增殖及伸展，而2-14+5+3组得到的支架2-14+5+3最明显，由于多孔结构促进营养传输及废物排出，因此，相比于不加致孔剂和光发泡剂或者仅加入致孔剂不加光发泡剂的支架，细胞在相分离结合发泡法制备的多孔GelMA(支架2-14+5+3)中增殖和伸展的作用更明显，更有利于细胞的三维培养。
实施例3
按照如表1中实施例3中各组的物料和物料比，参照实施例1中步骤，分别制备得到支架3-5、支架3-8+5+3、支架3-14+5+3；
按照实施例1的培养方法，对培养到1，4，7天的支架进行CCK-8检测，用酶标仪测定CCK-8工作液的吸光度，以定量分析细胞在支架上的增殖情况。细胞第4、7天的增殖情况见图3。
由图3可以看出，在培养到第4天的时候，5wt％的组(即3-5组得到的支架3-5)略微增殖，其它两组均增殖更为明显。在培养到第7天的时候，3-8+5+3组得到的支架3-8+5+3高于空白水凝胶组(即3-5组)，3-14+5+3组得到的支架3-14+5+3增殖最明显，由此可知相分离结合发泡法制备的多孔材料促进细胞增殖的作用更加明显。
实施例4
按照如表1中实施例4中各组的物料和物料比，参照实施例1中步骤，分别制备得到支架4-5、支架4-14+5+3、支架4-14+5+10；
按照实施例1相同的培养条件，将支架培养至第6天取出并固定。5wt％GelMA支架(即支架4-5)和两种5wt％GelMA-1.4wt％PEO支架(支架4-14+5+3和支架4-14+5+10)的截面共聚焦图片如图4所示。
如图4所示，4-14+5+10组、4-14+5+3组比4-5组得到的支架细胞增殖、伸展更为明显，发泡协同相分离制备的多孔GelMA比5wt％GelMA具有较好的孔隙结构，有利于营养渗透及废物排出，更有利于细胞的三维培养；且可以进一步得知：相比于4-14+5+3组得到的支架，4-14+5+10组得到的支架中细胞增值、伸展更好。
实施例5
按照如表1中实施例5中各组的物料和物料比，参照实施例1的步骤，分别得到支架5-HA、支架5-HA/GEL、支架5-GM、支架5-GM/HA；
按照实施例1相同的培养条件，将得到的支架培养至第7天，进行活死染色并进行共聚焦拍摄，如图5所示；
如图5所示，细胞进行活死染色染色后细胞活性高，尤其是多孔水凝胶细胞增殖及伸展明显，说明发泡协同相分离制备的多孔水凝胶具有较好的孔隙结构，有利于营养渗透及废物排出。此种方法生物相容性好，利于细胞的三维培养。
表1：实施例1～5水凝胶体系各成分的含量
Figure BDA0002570497910000081
Figure BDA0002570497910000091
由上述分析可知，本发明通过高分子溶液相分离及光辐照发泡协同方式在水凝胶内部产生微观小孔。与传统的无孔水凝胶相比本发明的多孔水凝胶可有效提高细胞增殖活性。
实施例6～10
将水凝胶前驱体聚合物、致孔剂、光引发剂、光发泡剂按照表2中实施例6～10各组的物料和物料量投入10mL去离子水(表2中的重量体积百分比是以去离子水的体积为基准计算得到)中，避光50℃加热搅拌溶解；将上述水凝胶前驱体溶液冻干；将冻干水凝胶前驱体以10mL PBS为溶剂37℃避光加热搅拌，溶解成水凝胶前驱体溶液后，以405nm光源辐照固化得多孔水凝胶。
表2.实施例6～10水凝胶体系各成分的含量
Figure BDA0002570497910000092
Figure BDA0002570497910000101
实施例11～14
将水凝胶前驱体聚合物、致孔剂、光引发剂、光发泡剂按照表3中实施例11～14各组的物料和物料量投入10mL PBS(表3中的重量体积百分比是以PBS的体积为基准计算得到)中，37℃避光加热搅拌，溶解成水凝胶前驱体溶液后，以405nm光源辐照固化得多孔水凝胶。
表3.实施例11～14水凝胶体系各成分的含量
Figure BDA0002570497910000102
将实施例例6～14制备得到的多孔水凝胶进行激光共聚焦显微镜检测，检测结果表明，相比于单独添加致孔剂、或者单独添加光发泡剂制备得到的水凝胶相比，实施例6～14制备得到的多孔水凝胶具有更为发达的相互联通的孔隙结构。

Claims (18)

1.一种多孔材料前驱体组合物，其特征在于，包括前驱体聚合物、致孔剂、光引发剂和光发泡剂。
2.根据权利要求1所述的多孔材料前驱体组合物，其特征在于，所述多孔材料前驱体组合物中：所述前驱体聚合物、致孔剂、光引发剂、光发泡剂质量比为：2～15:0.2～10:0.25～0.5:0.2～1。
3.根据权利要求1所述的多孔材料前驱体组合物，其特征在于，还包括磷酸缓冲盐溶液，加入量保证前驱体聚合物质量百分比浓度为2％-15％。
4.根据权利要求1所述的多孔材料前驱体组合物，其特征在于，所述前驱体聚合物为水凝胶前驱体聚合物。
5.根据权利要求4所述的多孔材料前驱体组合物，其特征在于，所述水凝胶前驱体聚合物为明胶、胶原蛋白、壳聚糖、透明质酸、葡聚糖、海藻酸钠、糊精、纤维素、硫酸软骨素及其衍生物的双键改性物中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的多孔材料前驱体组合物，其特征在于，所述致孔剂为透明质酸、聚氧化乙烯、明胶中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的多孔材料前驱体组合物，其特征在于，所述光引发剂为2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂中的一种。
8.根据权利要求1所述的多孔材料前驱体组合物，其特征在于，所述光发泡剂为偶氮类水溶性光引发剂，选自偶氮二N,N’环丁基异丁基脒水合物、偶氮二N-羟基异丁基脒水合物、2,2'-偶氮(2-甲基-N-(2-羟基乙基)丙酰胺)、偶氮二异丁基脒盐酸盐(V-50)、偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐中的一种或多种。
9.根据权利要求4所述的多孔材料前驱体组合物，其特征在于，所述水凝胶前驱体聚合物为甲基丙烯酰化透明质酸时，致孔剂为明胶；所述水凝胶前驱体聚合物为甲基丙烯酰化明胶时，致孔剂为PEO或透明质酸；所述致孔剂为PEO时，其分子量为100-1000kDa；光引发剂优选为LAP。
10.一种包含权利要求1～2、4～9任一项所述的多孔材料前驱体组合物的冻干粉。
11.一种多孔材料的制备方法，其特征在有，由权利要求1～9任一项所述多孔材料前驱体组合物制备得到。
12.根据权利要求11所述的多孔材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1-1)将前驱体聚合物、致孔剂、光引发剂、光发泡剂和磷酸缓冲盐溶液混合均匀，得到多孔材料前驱体溶液；
(1-2)固化，得到所述多孔材料；
或者，
(2-1)将前驱体聚合物、致孔剂、光引发剂、光发泡剂溶解到水中；
(2-2)冻干，得到冻干多孔水凝胶前驱体；
(2-3)将冻干多孔水凝胶前驱体溶于磷酸缓冲盐溶液，混合均匀；
(2-4)固化，得到所述多孔材料。
13.根据权利要求12所述的多孔材料的制备方法，其特征在于，在步骤(1-2)或步骤(2-4)前，进行灭菌，并与所需细胞重悬，最终制备得到负载有细胞的多孔材料。
14.根据权利要求12所述的多孔材料的制备方法，其特征在于，步骤(1-2)或步骤(2-4)中的固化条件为光固化或者离子固化；其中光固化采用的光源波长为365nm～450nm。
15.根据权利要求12所述的多孔材料的制备方法，其特征在于，步骤(2-1)中，避光加热搅拌溶解，加热温度为35～60；步骤(2-3)将冻干多孔水凝胶前驱体避光加热溶解于磷酸缓冲盐溶液中，加热溶解温度为35～50℃。
16.一种由权利要求11～15任一项所述的多孔材料的制备方法制备得到的多孔材料。
17.根据权利要求16所述的多孔材料，其特征在于，所述前驱体聚合物为水凝胶前驱体聚合物，所述多孔材料为多孔水凝胶材料。
18.一种权利要求16所述的多孔材料在生物材料中的应用。
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