CN113896725B - 一种吡唑并喹啉类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种吡唑并喹啉类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种具有三环结构的化合物，具体涉及一种吡唑并喹啉类化合物及其药学上可接受的盐、水合物，和以该化合物为活性成分的药物组合物，用于治疗和/或预防癌症。化合物如通式I所示，取代基详见说明书。本发明所得化合物为吡唑并喹啉类化合物，结构新颖。制备方法操作简单、条件温和。化合物均具有HDAC和BRD4的抑制活性，对多种肿瘤细胞都具有抗增殖作用，尤其是血液癌。

Description

一种吡唑并喹啉类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种具有三环结构的化合物，具体涉及一种吡唑并喹啉类化合物及其药学上可接受的盐、水合物，和以该化合物为活性成分的药物组合物，用于治疗和/或预防癌症。
背景技术
组蛋白修饰是一种共价的翻译后修饰(Post-translational modification,PTM)，它形成了一种成熟的组蛋白编码假说和一种表观遗传机制，用于调节各种疾病相关的过程。组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDAC)和组蛋白乙酰基转移酶(Histone acetyltransferases,HAT)共同调节组蛋白和非组蛋白的乙酰化水平。乙酰化水平影响细胞的多种功能，如信号转导，细胞周期，凋亡等。HDAC的过表达与癌症，炎症，神经退行性疾病，糖尿病等多种疾病有明显的关联。抑制HDAC能够影响组蛋白和非组蛋白(如肿瘤抑制因子，核因子，转录因子等)的乙酰化水平，调节DNA的转录和细胞功能，提供了治愈多种疾病的基础。
溴结构域蛋白4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)是BET(bromodomainand extraterminal domain)蛋白家族中的一员，广泛存在于哺乳动物组织细胞中，在基因转录、细胞增殖、凋亡过程中起重要调节作用。BRD4能够与cyclin T1和CDK9形成相互作用，从而募集P-TEFb到染色质引起多种靶基因的过度表达，如c-MYC,c-JUN、Mcl-1。BRD4抑制剂能够下调MYC的转录和随后MYC依赖的靶基因也会下调。基于MYC在癌症中广泛的致病作用，通过BRD4抑制MYC的表达对癌症的治疗具有很大的希望。
发明内容
一种吡唑并喹啉类化合物及其药学上可接受的盐、水合物，和以该化合物为活性成分的药物组合物，用于治疗和/或预防癌症，尤其是抗白血病活性，并表现出HDAC抑制作用和BRD4抑制作用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种吡唑并喹啉类化合物,化合物如通式I所示：
Figure GDA0003747780660000021
其中，
R1独立选自未取代或被至少一个下述基团取代的苯环、萘基、吡啶基；下述基团为C1-C6的烷基、卤素、C1-C6的卤代烷基；
R2为H或卤素；
m为5-6之间的整数；n为0-2之间的整数。
所述式I中，
R1独立选自未取代或下述基团取代的苯环、萘基、吡啶基；下述基团为C1-C3的烷基、卤素、C1-C3的卤代烷基；
R2为H、Cl或F；
m为5-6之间的整数；n为1或2。
所述化合物为
N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-2-苄基-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基-4-氟苯基)氨基]-6-氧代己基}-2-苄基-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-1-苄基-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(萘-1-基甲基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基-4-氟苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(萘-1-基甲基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-1-(萘-2-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(3-甲基苄基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基-4-氟苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(3-甲基苄基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-1-(3-甲基苄基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(吡啶-3-基甲基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基-4-氟苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(吡啶-3-基甲基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-1-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(吡啶-4-基甲基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基-4-氟苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(吡啶-4-基甲基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-1-(吡啶-4-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺。
一种所述化合物的应用，所述通式I所示化合物在制备与组蛋白去乙酰化酶和溴结构域蛋白4活性异常表达相关的疾病的药物中的应用。
所述通式I所示化合物在制备治疗和/或预防前列腺癌、结直肠癌或白血病的药物中的应用。
所述通式I所示化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
一种药物组合物，包含所述化合物，以及药学上可接受的赋型剂。
本发明包括药物组合物，该组合物含有上式I的含有喹啉并吡唑类化合物和药物上可接受的赋型剂。所述药物上可接受的赋型剂是指任何可用于药物领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。本发明的化合物可以与其他活性成分组合使用，只要它们不产生其他不利的作用，例如过敏反应等。
本发明的药物组合物可配制成若干种剂型，其中含有药物领域中常用的一些赋型剂，例如，口服制剂(如片剂，胶囊剂，溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制剂(例如软膏或溶液)。
用于本发明药物组合物的载体是药物领域中可得到的常见类型，包括：口服制剂用的粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、色素、矫味剂等；可注射制剂用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。
通过体外酶抑制试验筛选，本发明化合物可抑制组蛋白去乙酰化酶和溴结构域蛋白4，因此，本发明化合物可用于与组蛋白去乙酰化酶和溴结构域蛋白4异常表达相关的疾病中的应用，如各种癌症。
通过体外活性筛选，本发明化合物具有抗肿瘤活性，因此本发明化合物可以用于制备治疗和/或预防各种癌症的药物，如结直肠癌、前列腺癌和白血病等。
本发明活性化合物可作为唯一的抗癌药物使用，或者与一种或多种其它抗肿瘤药物联合使用。联合治疗通过将各个治疗组分同时、顺序或隔开给药来实现。
本发明的式I化合物，按照路线一的方法制得目标化合物。其他各取代基如发明内容所定义。
Figure GDA0003747780660000041
试剂与条件：(a)3-溴丙酰氯，碳酸钾，二氯甲烷，室温；(b)叔丁醇钾，N,N-二甲基甲酰胺，室温；(c)三氟甲磺酸，1,2-二氯乙烷，50℃；(d)二碳酸二叔丁酯，N,N-二异丙基乙胺，4-二甲氨基吡啶，二氯甲烷，45℃；(e)3,5-二甲基异恶唑-4-硼酸频哪醇酯，1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯，碳酸氢钠，乙二醇二甲醚，水，85℃；(f)草酸二甲酯，双三甲基硅基胺基锂，干燥四氢呋喃，室温；(g)80％水合肼，冰醋酸，100℃；(h)卤代物，碳酸铯，乙腈，70℃；(i)氢氧化钠，水，60℃；(j)6-氨基己酸甲酯盐酸盐，1-羟基苯并三唑，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，三乙胺，N,N-二甲基甲酰胺，室温；(k)氢氧化钠，水，60℃；(l)邻苯二胺，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，N,N-二异丙基乙胺，N,N-二甲基甲酰胺，室温；(m)(2-氨基-5-氟苯基)氨基甲酸叔丁酯，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，N,N-二异丙基乙胺，N,N-二甲基甲酰胺，室温；(n)三氟乙酸，二氯甲烷，室温。
本发明所具有的优点：
本发明所得化合物为吡唑并喹啉类化合物，结构新颖。制备方法操作简单、条件温和。化合物均具有HDAC和BRD4的抑制活性，对多种肿瘤细胞都具有抗增殖作用，尤其是血液癌。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些实施方式的用途和目的仅用来列举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
下面的合成路线描述了本发明的式I化合物的制备，所有的原料都是通过这些路线中描述的方法、通过有机化学领域普通技术人员熟知的方法制备的或者可商购。本发明的全部最终化合物都是通过这些路线中描述的方法或通过与其类似的方法制备的，这些方法是有机化学领域普通技术人员熟知的。这些路线中应用的全部可变因数如下文的定义或如权利要求中的定义。
实施例1：N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-2-苄基-7-(3,5-二甲基吡啶-4-基)-8-甲氧基-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺
步骤A:3-溴-N-(3-溴-4-甲氧基苯基)丙酰胺的合成
Figure GDA0003747780660000051
将2.00g(9.90mmol)3-溴-4-甲氧基苯胺和1.64g(11.88mmol)碳酸钾溶于干燥二氯甲烷中，在0℃下滴加1.2mL(11.88mmol)3-溴丙酰氯。随后将反应液移至室温搅拌5.5h。反应液倒入大量水中，二氯甲烷萃取(50mL×3)，水洗，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥。减压蒸干溶剂，得白色固体3.76g，收率：94.0％。
步骤B:1-(3-溴-4-甲氧基苯基)氮杂环丁烷-2-酮的合成
Figure GDA0003747780660000052
将3.76g(11.22mmol)3-溴-N-(3-溴-4-甲氧基苯基)丙酰胺溶于干燥N,N-二甲基甲酰胺中，在0℃下加入1.39g(12.35mmol)叔丁醇钾，搅拌10min。随后将反应液移至室温搅拌5h。反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取(50mL×3)，水洗，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥。减压蒸干溶剂，以石油醚：乙酸乙酯(V/V)＝20:1为洗脱剂硅胶柱层析，分离得到黄色固体2.02g，收率：70.2％。
步骤C:7-溴-6-甲氧基-2,3-二氢-4(1H)-喹啉酮的合成
Figure GDA0003747780660000053
用12.7mL 1,2-二氯乙烷将2g(7.84mmol)1-(3-溴-4-甲氧基苯基)氮杂环丁烷-2-酮溶解，在0℃下滴加1.53mL(17.25mmol)三氟甲磺酸，搅拌10min。随后将反应液移至室温搅拌4h。反应液用饱和碳酸氢钠洗一次，二氯甲烷萃取(50mL×3)，水洗，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥。减压蒸干溶剂，得黄色固体0.77g，收率：56.4％。
步骤D:7-溴-6-甲氧基-4-氧代叔丁基-3,4-二氢喹啉-1(2H)-羧酸盐的合成
Figure GDA0003747780660000061
将0.77g(3.01mmol)7-溴-6-甲氧基-2,3-二氢-4(1H)-喹啉酮、0.78ml(4.50mmol)N,N-二异丙基乙胺和0.12g(0.30mmol)4-二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷，滴加4.64mL(6.02mmol)二碳酸二叔丁酯，室温搅拌5h。以石油醚：乙酸乙酯(V/V)＝18:1为洗脱剂硅胶柱层析，分离得到白色固体0.72g，收率：84.6％。
步骤E:7-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-甲氧基-4-氧代-3,4-二氢喹啉-1(2H)-羧酸叔丁酯的合成
Figure GDA0003747780660000062
将0.57g(1.61mmol)7-溴-6-甲氧基-4-氧代叔丁基-3,4-二氢喹啉-1(2H)-羧酸盐，0.54g(2.41mmol)3,5-二甲基异恶唑-4-硼酸频哪醇酯，0.67g(8.03mmol)碳酸氢钠和0.12g(0.16mmol)1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯溶于20mL乙二醇二甲醚和2mL水的混合溶剂。氮气保护，升温至85℃搅拌8h。待反应液冷却至室温，抽滤滤除不溶物。滤液减压浓缩后以石油醚：乙酸乙酯(V/V)＝10:1为洗脱剂硅胶柱层析，分离得到白色固体0.35g，收率：58.6％。步骤F:7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-6-甲氧基-3-(2-甲氧基-2-氧乙酰基)-4-氧代-3,4-二氢喹啉-1(2H)-羧酸叔丁酯的合成
Figure GDA0003747780660000063
将0.35g(1.85mmol)7-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-6-甲氧基-4-氧代-3,4-二氢喹啉-1(2H)-羧酸叔丁酯和0.13g(1.12mmol)草酸二甲酯溶于20mL干燥的四氢呋喃，在0℃下滴入1.5mL双三甲基硅基氨基锂的四氢呋喃溶液(1mol/L in THF)。随后将反应液移至室温搅拌2.5h。将反应液减压浓缩得到黄色固体0.52g，收率：61.3％。
步骤G:5-叔丁基-3-甲基-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3,5(4H)-二羧酸酯的合成
Figure GDA0003747780660000071
将0.52g(1.13mmol)7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-6-甲氧基-3-(2-甲氧基-2-氧乙酰基)-4-氧代-3,4-二氢喹啉-1(2H)-羧酸叔丁酯溶于20mL乙酸，滴加0.17mL(3.40mmol)水合肼(80％)，于100℃搅拌4h。待反应液冷却至室温，将反应液倒入100mL水中，抽滤，水洗，干燥。得到白色固体0.27g，收率：52.5％。
步骤H:5-叔丁基-3-甲基-2-苄基-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3,5(4H)-二羧酸酯和5-叔丁基-3-甲基-2-苄基-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3,5(4H)-二羧酸酯的合成
Figure GDA0003747780660000072
将0.27g(0.59mmol)5-叔丁基-3-甲基-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3,5(4H)-二羧酸酯和0.16g(1.19mmol)碳酸钾溶于乙腈，滴入0.11mL(0.89mmol)溴苄，于70℃搅拌5h。反应液冷却至室温，抽滤滤除不溶物。滤液减压浓缩后以石油醚：乙酸乙酯(V/V)＝10:1为洗脱剂硅胶柱层析，分离得到白色固体1和2，收率：75.1％。
步骤I:2-苄基-5-(叔丁氧羰基)-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-4,5-二氢-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酸的合成
Figure GDA0003747780660000073
将0.24g(0.44mmol)5-叔丁基-3-甲基-2-苄基-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3,5(4H)-二羧酸酯溶于15mL四氢呋喃，滴加2mL氢氧化钠溶液(1mol/L)，于60℃搅拌2.5h。冷却至室温，减压蒸除有机溶剂，加入10mL水，用盐酸水溶液(2mol/L)调节pH至5左右。抽滤，水洗，得白色固体0.18g，收率：77.4％。
步骤J:叔丁基2-苄基-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-3-[(6-甲氧基-6-氧代己基)氨基甲酰基]-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-5(4H)-羧酸酯的合成
Figure GDA0003747780660000081
将0.18g(0.34mmol)2-苄基-5-(叔丁氧羰基)-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-4,5-二氢-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-羧酸溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺，加入0.14mL(1.02mmol)三乙胺和0.06g(0.41mmol)1-羟基苯并三唑，室温搅拌10min，加入0.07g(0.41mmol)6-氨基己酸甲酯盐酸盐，继续搅拌15min，加入0.08g(0.41mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，继续搅拌12h。反应液乙酸乙酯萃取3次(50mL×3)，饱和碳酸氢钠洗，水洗，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥。减压蒸干溶剂，以石油醚：乙酸乙酯(V/V)＝3:1为洗脱剂硅胶柱层析，分离得到白色固体0.12g，收率：53.3％。
步骤K:6-[2-苄基-5-(叔丁氧羰基)-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-4,5-二氢-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-羧酰胺基]己酸的合成
Figure GDA0003747780660000082
将0.12g(0.18mmol)叔丁基2-苄基-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-3-[(6-甲氧基-6-氧代己基)氨基甲酰基]-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-5(4H)-羧酸酯溶于15mL四氢呋喃，滴加2mL氢氧化钠溶液(1mol/L)，于60℃搅拌2.5h。冷却至室温，减压蒸除有机溶剂，加入10mL水，用盐酸水溶液(2mol/L)调节pH至5左右,抽滤，水洗，得白色固体0.11g，收率：94.2％。
步骤L:3-({6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}氨基甲酰基)-2-苄基-7-(3,5-二甲基吡啶-4-基)-8-甲氧基-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-5(4H)-羧酸叔丁酯的合成
Figure GDA0003747780660000091
将0.11g(0.17mmol)6-[2-苄基-5-(叔丁氧羰基)-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-4,5-二氢-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-羧酰胺基]己酸溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺，加入0.06mL(0.34mmol)N,N-二异丙基乙胺和0.08g(0.21mmol)2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，室温搅拌30min，加入0.02g(0.21mmol)邻苯二胺，继续搅拌12h。反应液乙酸乙酯萃取3次(50mL×3)，饱和碳酸氢钠洗，水洗，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥。减压蒸干溶剂，以二氯甲烷：甲醇(V/V)＝50:1为洗脱剂硅胶柱层析，分离得到白色固体0.07g，收率：90.3％。
步骤M:N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-2-苄基-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺
Figure GDA0003747780660000092
将0.07g(0.1mmol)3-({6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}氨基甲酰基)-2-苄基-7-(3,5-二甲基吡啶-4-基)-8-甲氧基-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-5(4H)-羧酸叔丁酯溶于二氯甲烷，滴加0.24mL(3.0mmol)三氟乙酸，室温搅拌6h。减压蒸干溶剂，用乙酸乙酯复溶，饱和碳酸氢钠洗。减压蒸干溶剂，以二氯甲烷：甲醇(V/V)＝27:1为洗脱剂硅胶柱层析，分离得到白色固体0.06g，收率：84.1％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.13(m,2H),9.11(s,1H),7.93(s,1H),7.88(s,1H),7.38–7.32(m,2H),7.31–7.25(m,3H),7.17(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),6.88(td,J＝7.6,1.5Hz,1H),6.72(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),6.53(td,J＝7.6,1.5Hz,1H),5.99(s,2H),4.82(s,2H),3.99(s,3H),3.40(q,J＝6.5Hz,2H),2.36(d,J＝8.3Hz,2H),2.34(s,3H),2.14(s,3H),1.65(p,J＝7.8Hz,4H),1.41(p,J＝7.8Hz,2H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ171.54,166.47,159.59,159.08,156.45,145.48,145.17,142.34,139.08,137.19,132.79,130.06,129.09,128.36,127.99,126.13,125.76,124.05,121.48,120.53,116.62,116.34,114.63,112.92,101.98,56.40,55.42,40.53,36.19,29.11,26.67,25.51,11.86,10.85.HRMS(ESI+)m/z calcd for C36H37N7O4[M+Na]+ 654.2805 found:654.2822.
按照实施例1的制备方法，选择适当的原料，制得实施例2-15。
实施例2：N-{6-[(2-氨基-4-氟苯基)氨基]-6-氧代己基}-2-苄基-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺
按照实施例1记载的步骤，将步骤L中邻苯二胺替换为(2-氨基-5-氟苯基)氨基甲酸叔丁酯，分离得到白色固体0.22g，即得实施例2，收率：80.2％。结构如下：
Figure GDA0003747780660000101
谱图数据如下：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.13(m,2H),9.04(s,1H),7.93(s,1H),7.88(s,1H),7.35(t,J＝7.3Hz,2H),7.30(d,J＝7.2Hz,1H),7.27(d,J＝7.3Hz,2H),7.10(dd,J＝8.5,6.4Hz,1H),6.48(dd,J＝11.2,2.9Hz,1H),6.27(td,J＝8.5,2.9Hz,1H),5.99(s,2H),5.14(s,2H),3.99(s,3H),3.40(q,J＝6.6Hz,2H),2.34-2.32(m,J＝3.7Hz,5H),2.14(s,3H),1.68–1.60(m,4H),1.40(p,J＝7.7Hz,2H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ171.78,166.47,161.69,160.11,159.59,159.08,156.45,145.48,145.16,139.08,137.19,132.84,129.09,128.36,127.99,127.49,121.49,120.53,120.04,114.63,112.92,102.41,102.26,101.97,101.72,56.40,55.42,40.53,36.08,29.10,26.67,25.42,11.85,10.85.HRMS(ESI+)m/z calcd for C36H36FN7O4[M+Na]+ 672.2711 found:672.2719.
实施例3：N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-1-苄基-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺
按照实施例1记载的步骤，将步骤H中的结构1替换为同分异构体2，分离得到白色固体0.18g，即得实施例3，收率：76.2％。结构如下：
Figure GDA0003747780660000102
谱图数据如下：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.54(s,1H),9.11(s,1H),8.76(t,J＝5.7Hz,1H),8.06(s,1H),8.02(s,1H),7.36(t,J＝7.5Hz,2H),7.30(t,J＝7.3Hz,1H),7.21(d,J＝7.5Hz,2H),7.15(d,J＝7.5Hz,1H),6.87(t,J＝7.5Hz,1H),6.70(d,J＝7.5Hz,1H),6.50(t,J＝7.2Hz,1H),6.29(s,2H),4.82(s,2H),3.76(s,3H),3.38(q,J＝6.7Hz,2H),2.35(t,J＝7.4Hz,2H),2.28(s,3H),2.08(s,3H),1.69-1.66(m,4H),1.44-1.39(m,2H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ171.60,166.71,165.23,161.40,159.49,155.86,144.88,142.35,140.44,139.62,139.43,136.97,133.99,133.03,130.06,129.60,128.41,126.48,126.12,125.74,124.05,122.36,117.76,116.59,116.33,112.48,102.85,56.37,56.02,39.06,36.22,29.58,26.72,25.60,11.82,10.82.HRMS(ESI+)m/z calcd for C36H37N7O4[M+Na]+ 654.2805found:654.2827.
实施例4：N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(萘-1-基甲基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺
按照实施例1记载的步骤，将步骤H中的溴苄替换为1-溴甲基萘，分离得到白色固体0.15g，即得实施例4，收率：62.0％。结构如下：
Figure GDA0003747780660000111
谱图数据如下：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.19(s,1H),9.57(s,1H),9.46(t,J＝4.8Hz,1H),8.34(d,J＝8.5Hz,1H),8.25(s,1H),8.00(d,J＝8.2Hz,1H),7.95(s,1H),7.93(d,J＝8.2Hz,1H),7.64(t,J＝7.2Hz,1H),7.59(t,J＝7.2Hz,1H),7.42-7.45(m,2H),7.31(s,1H),7.20(d,J＝7.2Hz,2H),7.02(d,J＝7.2Hz,1H),6.56(s,2H),4.02(s,3H),3.72(q,J＝7.4Hz,2H),2.39(t,J＝7.5Hz,2H),2.36(s,3H),2.16(s,3H),1.64(q,J＝7.4Hz,2H),1.58(t,J＝7.6Hz,2H),1.36(d,J＝8.8Hz,2H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ165.90,158.37,156.93,156.56,153.49,144.23,143.59,132.58,131.29,130.91,130.06(2C),129.67,128.04,128.02,127.98,126.17,125.56,124.89,124.82(2C),122.51,119.66,113.04(2C),111.27,101.51,55.67,53.02,39.43,27.39,25.31,25.26,25.07,10.82,9.75.HRMS(ESI+)m/z calcd for C40H39N7O4[M+Na]+ 704.2961 found:704.2973.
实施例5：N-{6-[(2-氨基-4-氟苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(萘-1-基甲基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺
按照实施例1记载的步骤，将步骤H中的溴苄替换为1-溴甲基萘；步骤L中邻苯二胺替换为(2-氨基-5-氟苯基)氨基甲酸叔丁酯，分离得到类白色固体0.18g，即得实施例5，收率：59.6％。结构如下：
Figure GDA0003747780660000112
谱图数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.14(s,1H),9.12(d,J＝5.8Hz,1H),9.00(s,1H),8.35(d,J＝8.4,1H),7.98(dd,J＝8.4,1.5Hz,1H),7.94(s,1H),7.90(d,J＝8.4Hz,1H),7.86(s,1H),7.63(dd,J＝8.4,6.8,1.5Hz,1H),7.57(dd,J＝8.0,6.8,1.5Hz,1H),7.42(dd,J＝8.4,7.2Hz,1H),7.09(dd,J＝8.7,6.3Hz,1H),6.94(dd,J＝7.2,1.5Hz,1H),6.50(s,2H),6.46(dd,J＝8.5,2.9Hz,1H),6.27(td,J＝8.5,2.9Hz,1H),5.12(s,2H),3.97(s,3H),3.34(dd,J＝7.2Hz,2H),2.34(s,3H),2.29(t,J＝7.4Hz,2H),2.14(s,3H),1.58(dp,J＝7.3Hz,4H),1.31-1.38(m,2H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ171.77,166.48,159.59,159.10,156.48,145.41,145.18,144.72,139.10,133.67,133.35,133.08,132.82,130.82,129.08,128.82,127.50,127.15,126.61,125.90,125.70,123.68,121.53,120.53,120.04,114.68,112.91,102.42,102.27,101.98,101.73,56.38,53.55,40.54,36.05,29.06,26.64,25.39,11.86,10.85.HRMS(ESI+)m/z calcd for C40H38FN7O4[M+Na]+722.2867 found:722.2892.
实施例6：N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-1-(萘-2-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺
按照实施例1记载的步骤，将步骤H中的溴苄替换为1-溴甲基萘，分离得到白色固体0.22g，即得实施例6，收率：58.6％。结构如下：
Figure GDA0003747780660000121
谱图数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.59(s,1H),9.09(s,1H),8.80(t,J＝5.9Hz,1H),8.48(d,J＝8.4Hz,1H),8.05(dd,J＝8.3,1.4Hz,1H),8.00(s,1H),7.90(d,J＝8.3Hz,1H),7.74(t,J＝7.6Hz,1H),7.68(t,J＝7.6Hz,1H),7.31(t,J＝7.6Hz,1H),7.15(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.12(s,1H),6.87(td,J＝7.6,1.6Hz,1H),6.77(s,2H),6.70(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),6.53(d,J＝8.0Hz,1H),6.49(dd,J＝7.6,1.4Hz,1H),4.81(s,2H),3.40(q,J＝6.8Hz,2H),2.88(s,3H),2.35(t,J＝7.4Hz,2H),2.22(s,3H),2.00(s,3H),1.67(t,J＝7.5Hz,4H),1.47-1.37(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ171.60,166.66,161.41,159.41,155.58,144.99,142.33,140.40,139.90,139.70,133.81,132.98,132.51,130.08,129.27,128.66,127.38,127.03,126.33,126.14,125.76,124.05,123.46,123.21,122.28,117.82,116.62,116.35,116.26,112.34,102.43,55.00,53.87,40.63,36.22,29.58,26.72,25.60,11.75,10.74.HRMS(ESI+)m/z calcd for C40H39N7O4[M+Na]+ 704.2961 found:704.2984.
实施例7：N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(3-甲基苄基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺
按照实施例1记载的步骤，将步骤H中的溴苄替换为间甲基溴苄，分离得到白色固体0.21g，即得实施例7，收率：78.5％。结构如下：
Figure GDA0003747780660000131
谱图数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.11-9.15(m,2H),9.09(s,1H),7.93(s,1H),7.87(s,1H),7.22(t,J＝7.9Hz,1H),7.16(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H),7.10(d,J＝11.2Hz,2H),7.05(d,J＝7.7Hz,1H),6.88(td,J＝7.7,1.5Hz,1H),6.71(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),6.52(td,J＝7.6,1.5Hz,1H),5.95(s,2H),4.82(s,2H),3.99(s,3H),3.40(q,J＝6.5Hz,2H),2.32-2.36(m,5H),2.26(s,3H),2.14(s,3H),1.64(h,J＝7.5Hz,4H),1.41(q,J＝8.0Hz,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ171.53,166.47,159.58,159.12,156.45,145.43,145.18,142.33,139.08,138.28,137.09,132.84,132.79,129.00(2C),128.48,126.14,125.76,125.09,124.06,121.47,120.55,116.64,116.36,114.63,112.92,101.99,56.41,55.40,40.64,36.18,29.14,26.67,25.50,21.45,11.86,10.85.HRMS(ESI+)m/z calcd forC37H39N7O4[M+Na]+ 668.2961 found:668.2982.
实施例8：N-{6-[(2-氨基-4-氟苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(3-甲基苄基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺
按照实施例1记载的步骤，将步骤H中的溴苄替换为间甲基溴苄；步骤L中邻苯二胺替换为(2-氨基-5-氟苯基)氨基甲酸叔丁酯，分离得到类白色固体0.17g，即得实施例8，收率：69.3％。结构如下：
Figure GDA0003747780660000132
谱图数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.14(t,J＝5.5Hz,1H),9.12(s,1H),9.03(s,1H),7.93(s,1H),7.87(s,1H),7.23(t,J＝7.5Hz,1H),7.13–7.06(m,3H),7.05(d,J＝7.7Hz,1H),6.48(dd,J＝11.2,2.9Hz,1H),6.27(td,J＝8.5,2.9Hz,1H),5.95(s,1H),5.14(s,2H),3.99(s,3H),3.39(q,J＝6.5Hz,2H),2.34(s,3H),2.31(d,J＝7.6Hz,2H),2.26(s,3H),2.14(s,3H),1.63(h,J＝7.6Hz,4H),1.39(p,J＝7.6Hz,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ171.77,166.46,159.58,159.12,156.45,145.43,145.17,144.73,144.62,139.09,138.28,137.09,132.83,129.00,128.48,127.58,127.48,125.09,121.48,120.55,120.04,114.64,112.92,102.46,102.24,101.99,101.69,56.41,55.40,40.64,36.07,29.13,26.67,25.42,21.45,11.85,10.84.HRMS(ESI+)m/z calcd for C37H38FN7O4[M+Na]+686.2867 found:686.2883.
实施例9：N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-1-(3-甲基苄基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺
按照实施例1记载的步骤，将步骤H中的溴苄替换为间甲基溴苄，分离得到白色固体0.19g，即得实施例9，收率：66.3％。结构如下：
Figure GDA0003747780660000141
谱图数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.54(s,1H),9.09(s,1H),8.76(t,J＝5.6Hz,2H),8.02(s,1H),7.56(s,1H),7.23(t,J＝7.5Hz,1H),7.19–7.08(m,3H),6.95(d,J＝7.8Hz,1H),6.87(t,J＝7.8Hz,1H),6.70(d,J＝7.8Hz,1H),6.50(t,J＝7.4Hz,1H),6.23(s,2H),4.81(s,2H),3.78(s,3H),3.43–3.35(m,2H),2.35(t,J＝7.2Hz,3H),2.29(s,3H),2.24(s,3H),2.08(s,3H),1.72–1.61(m,4H),1.38-1.46(m,2H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ171.61,166.72,161.43,159.51,155.87,144.89,142.37,140.42,139.54,139.40,138.84,136.99,133.03,129.58,129.11,127.14,126.14,125.76,124.04,123.58,122.35,117.76,116.61,116.34,116.33,112.49,102.96,56.33,56.03,39.07,36.22,29.59,26.73,25.60,21.39,11.83,10.83.HRMS(ESI+)m/z calcd for C37H39N7O4[M+Na]+ 668.2961 found:668.2959.
实施例10：N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(吡啶-3-基甲基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺
按照实施例1记载的步骤，将步骤H中的溴苄替换为间3-溴甲基吡啶，分离得到白色固体0.14g，即得实施例10，收率：54.6％。结构如下：
Figure GDA0003747780660000142
谱图数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.16(t,J＝5.6Hz,1H),9.13(s,1H),9.12(s,1H),8.56(d,J＝1.8Hz,1H),8.51(dd,J＝4.7,1.8Hz,1H),7.93(s,1H),7.87(s,1H),7.69(dt,J＝8.0,1.8Hz,1H),7.38(dd,J＝7.8,4.7Hz,1H),7.16(dd,J＝7.9,1.4Hz,1H),6.87(td,J＝8.0,1.4Hz,1H),6.71(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),6.51(td,J＝7.7,1.4Hz,1H),6.01(s,2H),4.83(s,2H),3.99(s,3H),3.40(q,J＝6.6Hz,2H),2.36(t,J＝7.5Hz,2H),2.33(s,3H),2.14(s,3H),1.65(h,J＝7.5Hz,4H),1.40(p,J＝7.5Hz,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ171.55,166.48,159.58,158.99,156.48,149.63,149.32,145.68,145.16,142.34,139.10,135.91,132.92,132.86,132.80,126.13,125.76,124.20,124.04,121.58,120.45,116.62,116.34,114.54,112.90,102.00,56.41,46.12,39.37,36.19,29.10,26.67,25.51,11.86,10.85.HRMS(ESI+)m/z calcd for C35H36N8O4[M+Na]+ 655.2757 found:655.2781.
实施例11：N-{6-[(2-氨基-4-氟苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(吡啶-3-基甲基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺
按照实施例1记载的步骤，将步骤H中的溴苄替换为间3-溴甲基吡啶；步骤L中邻苯二胺替换为(2-氨基-5-氟苯基)氨基甲酸叔丁酯，分离得到类白色固体0.15g，即得实施例11，收率：53.4％。结构如下：
Figure GDA0003747780660000151
谱图数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.16(t,J＝5.8Hz,1H),9.13(s,1H),9.08(s,1H),8.56(d,J＝1.8Hz,1H),8.51(dd,J＝4.7,1.8Hz,2H),7.93(s,1H),7.87(s,1H),7.69(dt,J＝7.9,1.8Hz,2H),7.38(dd,J＝7.9,4.7Hz,1H),7.10(dd,J＝8.6,6.4Hz,1H),6.47(dd,J＝11.2,2.9Hz,1H),6.26(td,J＝8.6,2.9Hz,1H),6.01(s,2H),5.16(s,2H),3.99(s,3H),3.40(q,J＝7.0Hz,4H),2.36-2.30(m,5H),2.14(s,3H),1.64(h,J＝7.0Hz,4H),1.44-1.37(m,2H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ167.00,159.46,158.03,157.65,154.59,145.32,144.69,133.67,132.39,131.16,130.77,129.13,129.11,129.08,127.26,126.66,125.99,125.92(2C),125.90,123.60,120.75,114.14(2C),112.37,102.60,56.76,54.11,40.52,28.49,26.41,26.36,26.17,11.91,10.85.HRMS(ESI+)m/z calcd for C35H35FN8O4[M+Na]+ 673.2663 found:673.2654.
实施例12：N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-1-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺
按照实施例1记载的步骤，将步骤H中的溴苄替换为间3-溴甲基吡啶，分离得到白色固体0.18g，即得实施例12，收率：60.3％。结构如下：
Figure GDA0003747780660000161
谱图数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.54(s,1H),9.12(s,1H),8.76(t,J＝5.9Hz,1H),8.61(d,J＝1.7Hz,1H),8.52(dd,J＝4.8,1.4Hz,1H),8.04(s,1H),7.54(s,1H),7.51(d,J＝8.1Hz,1H),7.36(dd,J＝7.8,4.8Hz,1H),7.15(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),6.89–6.84(m,1H),6.70(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),6.50(td,J＝7.8,1.2Hz,1H),6.36(s,2H),4.83(s,2H),3.80(s,3H),3.38(q,J＝6.9Hz,2H),2.35(t,J＝7.3Hz,3H),2.29(s,3H),2.09(s,3H),1.68-1.62(m,4H),1.46–1.38(m,2H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ171.61,166.76,161.34,159.51,155.98,149.78,148.17,144.89,142.37,140.50,139.96,139.42,134.54,133.17,132.75,126.15,125.77,124.63,124.03,122.54,117.80,116.61,116.34,116.19,112.45,102.48,56.35,53.79,39.07,36.21,29.56,26.71,25.59,11.83,10.82.HRMS(ESI+)m/zcalcd for C35H36N8O4[M+Na]+ 655.2757 found:655.2782.
实施例13：N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(吡啶-4-基甲基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺
按照实施例1记载的步骤，将步骤H中的溴苄替换为间4-溴甲基吡啶，分离得到白色固体0.13g，即得实施例13，收率：48.9％。结构如下：
Figure GDA0003747780660000162
谱图数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.17(s,1H),9.15(t,J＝5.9Hz,1H),9.12(s,1H),8.53(d,J＝5.3Hz,2H),7.95(s,1H),7.87(s,1H),7.20–7.07(m,3H),6.87(t,J＝7.4Hz,1H),6.71(d,J＝7.8Hz,1H),6.51(t,J＝7.4Hz,1H),6.03(s,2H),4.88(s,2H),3.98(s,3H),3.38(q,J＝6.9Hz,2H),2.39-2.31(m,5H),2.14(s,3H),1.70–1.55(m,4H),1.43-1.35(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ171.54,166.50,159.58,158.86,156.52,150.34(2C),146.10,145.78,145.21,142.31,139.12,133.23,132.82,126.12,125.75,124.06,122.41(2C),121.65,120.45,116.63,116.35,114.48,112.89,102.04,56.41,46.04,36.18,29.08,26.64,25.48,11.86,10.85,9.02.HRMS(ESI+)m/z calcd for C35H36N8O4[M+Na]+ 655.2757 found:655.2773.
实施例14：N-{6-[(2-氨基-4-氟苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(吡啶-4-基甲基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺
按照实施例1记载的步骤，将步骤H中的溴苄替换为间4-溴甲基吡啶；步骤L中邻苯二胺替换为(2-氨基-5-氟苯基)氨基甲酸叔丁酯，分离得到类白色固体0.15g，即得实施例14，收率：54.2％。结构如下：
Figure GDA0003747780660000171
谱图数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.17(s,1H),9.14(t,J＝5.6Hz,1H),9.06(s,1H),8.53(d,J＝5.6Hz,2H),7.94(s,1H),7.87(s,1H),7.13(d,J＝5.6Hz,2H),7.10(dd,J＝8.2,4.8Hz,1H),6.47(dd,J＝11.2,2.8Hz,1H),6.26(td,J＝8.2,2.8Hz,1H),6.03(s,2H),5.16(s,2H),3.98(s,3H),3.40-3.35(m,2H),2.34(s,3H),2.31(dt,J＝7.4Hz,2H),2.14(s,3H),1.62(h,J＝6.9Hz,4H),1.43–1.32(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ171.78,166.49,159.57,158.87,156.54,150.31(2C),146.12,145.78,145.19,139.12,133.23,132.81,127.57,127.47,122.42(2C),121.67,120.46,114.49,112.90,102.46,102.23,102.06,101.95,101.70,56.42,54.56,39.41,36.07,29.07,26.64,25.39,11.85,10.83.HRMS(ESI+)m/z calcd for C35H36FN8O4[M+Na]+ 673.2663 found:673.2684.
实施例15：N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-1-(吡啶-4-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺
按照实施例1记载的步骤，将步骤H中的溴苄替换为间4-溴甲基吡啶，分离得到白色固体0.12g，即得实施例15，收率：48.3％。结构如下：
Figure GDA0003747780660000172
谱图数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.55(s,1H),9.13(s,1H),8.75(t,J＝5.7Hz,2H),8.54(d,J＝5.1Hz,2H),8.04(s,1H),7.43(s,1H),7.18(d,J＝5.1Hz,2H),7.15(d,J＝7.8Hz,1H),6.86(t,J＝7.4Hz,1H),6.70(d,J＝7.8Hz,1H),6.49(t,J＝7.4Hz,1H),6.35(s,2H),4.84(s,2H),3.74(s,3H),3.38(q,J＝6.8Hz,2H),2.35(t,J＝7.3Hz,2H),2.29(s,3H),2.08(s,3H),1.72–1.59(m,4H),1.47–1.35(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ171.60,166.74,161.31,159.48,155.95,150.84(2C),146.07,144.90,142.35,140.52,140.06,139.64,133.16,126.13,125.75,124.07,122.57,121.60(2C),117.77,116.61,116.35,116.16,112.44,102.43,56.33,55.02,39.08,36.22,29.55,26.71,25.59,11.82,10.81.HRMS(ESI+)m/z calcd for C35H36N8O4[M+Na]+ 655.2757 found:655.2775.
实施例16：本发明产物药理作用研究
实验设空白对照组(不加药)和阳性对照组(伏立诺他和RGFP966)。室温下将5μL上述各实施例制备获得化合物采用缓冲液(a缓冲盐溶液)配置不同浓度(2μM、0.5μM、0.125μM、0.031μM、0.008μM、0.002μM)的溶液和市购的重组人源蛋白(0.05μg/μL)孵育15min，加入5μL荧光底物Boc–Lys(Ac)–AMC(0.25mM/L)。37℃下培养60min后，加入25μL终止缓冲液(包含2μM SAHA和0.67mM Trypsin的缓冲盐溶液)终止反应。15min后，应用全波长多功能酶标仪在激发和发射波长分别为355nm和460nm时检测荧光强度，计算抑制率。实施例对HDACs酶抑制活性见表1。
Figure GDA0003747780660000181
表1.实施例1-15和对照化合物伏立诺他、RGFP966的HDAC酶抑制活性a.
Figure GDA0003747780660000182
a缓冲盐溶液(pH＝8.0)包含25mmol·L-1 Tris/HCl、137mmol·L-1氯化钠、2.7mmol·L-1氯化钾、1mmol·L-1氯化镁、0.1mg·mL-1牛血清白蛋
b阳性对照化合物伏立诺他和RGFP966
cn.d.代表未测试
由上述表1中可见实施例1-15对HDAC1、2和3都具有抑制活性，部分实施例对HDAC3有一定的选择性。实施例12-15对HDAC3具有较好的抑制活性，IC50值为0.013μM～0.079μM，其中，实施例15对HDAC1、2和3都表现出很好的抑制活性，优于对照化合物伏立诺他和RGFP966。
选择HTRF和TSA两种检测方法分别对上述实施例制备获得化合物进行活性筛选，具体结果见表2。
HTRF实验
目的蛋白GST-BRD4 20nM；实验缓冲液(Cisbio Bioassays,USA)；底物肽段，[Lys(5,8,12,16)Ac]H4(1-21)biotinylated peptide 20nM；HTRF检测试剂，GST抗体-Tb2+配位复合物(供体)2nM，链霉亲和素-XL665复合物(受体)2nM。反应体系中：蛋白4μL，实验缓冲液2μL，底物Peptide 4μL，受体5μL，供体5μL，上述实施例制备获得小分子化合物2μL。按上述体积将小分子化合物和各组分加入到Greiner 384孔白色板中，室温避光孵育3h。多功能酶标仪检测665nm和620nm波长下荧光强度，计算获得IC50。
TSA实验
目的蛋白BRD4 10μM；实施例制备化合物200μM；实验缓冲液HEPES(10mM)，NaCl(150mM)，甘油5％，pH＝7.5；染料，SYPRO○ROrange(SIGMA)(5000×)；反应体系中：蛋白2μL，染料2μL，上述实施例制备获得小分子化合物10μL，实验缓冲液2μL，去离子水4μL。按上述体积将各组分加入到BIO-RAD96孔黑色PCR板，冰上避光孵育30min，用CFX-96荧光定量PCR仪进行检测。程序为溶解曲线，30-75℃，每升高0.3℃读数一次，最终测得温度变化值。
表2.实施例1-15和对照化合物I-BET151的BRD4酶抑制活性.
Figure GDA0003747780660000191
a阳性对照化合物I-BET151
b n.d.代表未测试
由上述表2中可见大部分实施例对BRD4具有结合能力ΔT≥5℃。此外，我们利用HTRF方法测试结合能力强的实施例对BRD4的抑制活性，以I-BET151为阳性对照化合物，实施例9和15对BRD4的具有较好的抑制活性，IC50值为0.287μM和0.204μM。
抗细胞增殖的体外抑制活性试验
1.细胞复苏
从液氮中小心取出前列腺癌细胞PC-3、结直肠癌细胞HCT116和白血病细胞Molm13(冻存管)在37～40℃水浴中迅速全部融化，使细胞迅速越过极易受损的0～5℃温度范围。在无菌条件下用移液枪吸出细胞放入离心管中，在1300r/min下离心3min，轻轻弃去上清液后加入培养液，吹打混匀细胞，移入培养瓶中放入二氧化碳培养箱中培养，4h后换液一次。
2.细胞传代
细胞复苏后需培养传代2-3次待其稳定后方可进行实验，每次传代以细胞贴满培养瓶底部90％为准。
3.细胞埋板
细胞生长贴满培养瓶底部时用胰蛋白酶溶液(0.25％)使其从培养瓶底部消化下来。轻轻弃去上胰蛋白酶溶液后加入10mL培养液，吹打混匀细胞，吸取10μL细胞混悬液加入细胞计数板中计数，调整细胞浓度为3.5×104个/孔。96孔板中除A1孔为空白孔不加细胞外，其余皆加入100uL细胞混悬液。将96孔板放入培养箱中培养24h。
4.细胞加药
先用50μL DMSO溶解药物。而后加入适量培养液，使药物溶解成2mmol/mL药液。然后在96孔板中将药物溶解成100,50,25,12.5,6.25μmol/mL。每个浓度加入3孔，其中周围两行两列细胞长势受环境影响较大，只作为空白细胞孔使用。将96孔板放入培养箱中培养24h。
MTT试验测定方法
将细胞按1.5～3×104细胞密度埋96孔板，每孔100uL，细胞贴壁24h加入不同浓度的药物(100μL/孔)，药物与细胞孵育96h后加入MTT，放入培养箱中4h后，弃去MTT(四氮唑)溶液，加入DMSO 200uL。在磁力振荡器上振荡使存活细胞与MTT反应产物甲臜充分溶解，放入酶标仪中在570nm波长处读出OD值。按下式计算抑制率：
Figure GDA0003747780660000201
细胞生长抑制实验
采用细胞计数法考察化合物对Molm13的生长抑制作用。将一定密度(1×105个/mL)的细胞悬浮液接种于24孔培养板，2mL/孔，然后加入不同浓度药物共同孵育72小时，加入台盼蓝并于显微镜下计数，依以下公式求得细胞生长抑制率，求得半数生长抑制浓度GI50(使细胞生长抑制率达50％时的药物浓度)。
抑制率(％)＝[(N对照-N加药)/N对照]×100
以Vorinostat和I-BET151为阳性对照药，对实施例进行抗细胞增殖的体外抑制活性试验。试验结果见表3。
表3 实施例1-15和对照化合物伏立诺他、I-BET151对前列腺癌细胞PC-3、结直肠癌细胞HCT116和白血病细胞Molm13的抗增殖活性a.
Figure GDA0003747780660000211
a阳性对照化合物伏立诺他和I-BET151
b.n.d.代表未测试
由上述表3中可见实施例1-15对前列腺癌细胞PC-3、结直肠癌细胞HCT116和白血病细胞Molm13都具有明显的抗增殖活性，对Molm13细胞的抗增殖活性在0.28μM～4.35μM；对PC-3细胞和HCT116细胞的抗增殖活性分别为0.56μM～12.13μM和1.34μM～11.30μM。在Molm13细胞中，实施例3、6、9和12的抗增殖活性较优，均小于1μM。在PC-3和HCT116细胞中，实施例9的抗增殖活性优于同类其他化合物，GI50值分别为0.56μM和1.34μM，也优于对照化合物伏立诺他和I-BET151。
上述试验结果表明，本发明要保护的通式的化合物具有良好的酶水平抑制活性，对多种细胞株具有较好的抗增殖活性。实施例15表现出了对HDAC3较好的抑制活性(IC50＝0.013μM)，并对BRD4也表现出较好的抑制活性(IC50＝0.204μM)。实施例9表现出了较好的抗增殖活性，对前列腺癌PC-3、结直肠癌HCT-116和急性髓性白血病细胞Molm13表现出较好的抗增殖活性，GI50值分别为0.56μM、1.34μM和0.24μM，均优于对照化合物伏立诺他和I-BET151。本发明的化合物具有很好的应用前景。

Claims (8)

1.一种吡唑并喹啉类化合物,其特征在于：化合物如通式I所示：
Figure FDA0003745874520000011
其中，
R1独立选自未取代或被至少一个下述基团取代的苯环、萘基、吡啶基；下述基团为C1-C6的烷基、卤素、C1-C6的卤代烷基；
R2为H或卤素；
m为5-6之间的整数；n为1或2。
2.按权利要求1所述的吡唑并喹啉类化合物,其特征在于：所述式I中，
R1独立选自未取代或下述基团取代的苯环、萘基、吡啶基；下述基团为C1-C3的烷基、卤素、C1-C3的卤代烷基；
R2为H、Cl或F；
m为5-6之间的整数；n为1或2。
3.按权利要求1所述的吡唑并喹啉类化合物,其特征在于：所述化合物为N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-2-苄基-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基-4-氟苯基)氨基]-6-氧代己基}-2-苄基-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-1-苄基-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(萘-1-基甲基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基-4-氟苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(萘-1-基甲基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-1-(萘-2-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(3-甲基苄基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基-4-氟苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(3-甲基苄基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-1-(3-甲基苄基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(吡啶-3-基甲基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基-4-氟苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(吡啶-3-基甲基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-1-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(吡啶-4-基甲基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基-4-氟苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-2-(吡啶-4-基甲基)-2H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺；
N-{6-[(2-氨基苯基)氨基]-6-氧代己基}-7-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-8-甲氧基-1-(吡啶-4-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-甲酰胺。
4.一种权利要求1所述化合物的应用，其特征在于：所述通式I所示化合物在制备与组蛋白去乙酰化酶和溴结构域蛋白4活性异常表达相关的疾病的药物中的应用。
5.按权利要求4所述化合物的应用，其特征在于：所述通式I所示化合物在制备治疗和/或预防前列腺癌、结直肠癌或白血病的药物中的应用。
6.按权利要求4所述化合物的应用，其特征在于：所述通式I所示化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.一种药物组合物，其特征在于：包含权利要求1-3中任何一项的化合物，以及药学上可接受的赋型剂。
8.一种权利要求7所述组合物在制备与组蛋白去乙酰化酶和溴结构域蛋白4活性异常表达相关的疾病的药物中的应用。
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