CN113892644B - 一种聚电解质络合包封的原花青素纳米粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚电解质络合包封的原花青素纳米粒及其制备方法，包括，在持续搅拌条件下将浓度为0.015‑0.2％(m/v)的壳聚糖溶液滴加入等体积的浓度分别为0.025‑0.075％(m/v)和0.067‑0.5％(m/v)的原花青素‑硫酸软骨素混合溶液中，调整悬浊液的pH至2.5‑4.5，并继续搅拌2‑3小时；将得到的悬浊液进行超声时间为0.5‑4min、振幅为30‑50％的超声处理，最终得到粒径介于200‑300nmn且理化稳定好良好的包封原花青素的壳聚糖/硫酸软骨素纳米粒包封体系。本发明制备方法简单，生产成本低，制备得到的纳米粒子稳定性好，对原花青素的抗氧化性具有较好的保护作用，原花青素纳米粒可在食品加工、保健品等领域中应用。
Description
技术领域
本发明属于食品纳米技术领域，具体涉及到一种聚电解质络合包封的原花青素纳米粒及其制备方法。
背景技术
原花青素(PC)是一类存在于各种植物组织中的多酚类物质，如葡萄籽、葡萄皮等加工副产物中，由不同数量的儿茶素和表儿茶素结合而成。由于其多酚结构，PC显示出抗氧化、抗菌、抗炎等生物学功能。除作为日常摄入从而对各种慢性病具有积极治疗作用的健康成分之外，PC还可以作为天然防腐材料。然而，与其他天然提取物类似，PC中的酚羟基在加工和储存过程中极易受到环境损害，如氧气、光照、温度和pH值等，导致PC稳定性和生物活性降低，应用受到限制。
为了扩大其在食品工业中的应用，迫切需要开发一种有效且绿色的PC性能稳定系统。
纳米载体的封装可以提供抵抗环境影响的物理化学屏障，同时实现了控释效果，是稳定多酚化合物的一种有效方法。另外，纳米颗粒在制备过程中难以避免出现团聚现象，导致纳米粒物理不稳定性与生物利用率下降。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种聚电解质络合包封的原花青素纳米粒的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种聚电解质络合包封的原花青素纳米粒的制备方法，包括，
采用壳聚糖与硫酸软骨素两种生物多糖作为聚电解质络合包材，引入超声处理作为辅助手段，制备稳定性与分散性良好、粒子粒径均匀的原花青素纳米粒子。
作为本发明所述聚电解质络合包封的原花青素纳米粒的制备方法的一种优选方案，其中：包括，
将壳聚糖溶于乙酸水溶液中，搅拌使其完全溶解，得到壳聚糖溶液；
将硫酸软骨素、原花青素共溶于超纯水中，搅拌10～50min后，得到硫酸软骨素-原花青素的混合溶液；
在持续搅拌条件下，将壳聚糖溶液滴加入等体积的原花青素-硫酸软骨素混合溶液，调整悬浊液的pH，并继续搅拌2～3h；
将得到的悬浊液进行超声处理，得到包封原花青素的壳聚糖/硫酸软骨素纳米粒子悬浊液。
作为本发明所述聚电解质络合包封的原花青素纳米粒的制备方法的一种优选方案，其中：乙酸水溶液浓度为1％v/v，壳聚糖溶液浓度以质量体积比g/mL为0.015～0.2％。
作为本发明所述聚电解质络合包封的原花青素纳米粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述壳聚糖的平均分子量为150～500kDa，脱乙酰度为70～90％。
作为本发明所述聚电解质络合包封的原花青素纳米粒的制备方法的一种优选方案，其中：混合溶液中硫酸软骨素浓度为0.067～0.5％m/v，原花青素浓度为0.025～0.075％m/v。
作为本发明所述聚电解质络合包封的原花青素纳米粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述调整悬浊液的pH，用HCl 0.1mol/L或NaOH 0.1mol/L溶液将悬浊液pH调整至2.5～4.5。
作为本发明所述聚电解质络合包封的原花青素纳米粒的制备方法的一种优选方案，其中：悬浊液搅拌的转速为200～1000rpm/min。
作为本发明所述聚电解质络合包封的原花青素纳米粒的制备方法的一种优选方案，其中：超声条件为超声时间0.5～4min、振幅30～50％，超声功率为1200W，频率为20kHz。
本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种聚电解质络合包封的原花青素纳米粒的制备方法制得的产品，所述产品中原花青素包封率介于30～50％，负载率介于10～15％，纳米粒粒径介于200～500nm，Zeta电位介于-20～-30mV。
本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种聚电解质络合包封的原花青素纳米粒在食品加工中的应用。
本发明有益效果：
本发明采用聚电解质络合和超声结合的方法，制备了有效包封原花青素的纳米粒子，本发明制备的原花青素纳米粒子成球形，均匀性与分散性好、包封率和负载率较高，壳聚糖/硫酸软骨素纳米载体有效提高了原花青素在储存过程中的抗氧化稳定性，并具有缓释特征。
本发明的制备方法简单，重现性好，所制备的原花青素活性纳米粒子具有广泛的潜在应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明实施例1的SEM和TEM图像。
图2为本发明对比例和实施例1,2的纳米粒子的AFM图像。
图3为本发明实施例6的包材浓度对纳米粒子包封率、粒径、Zeta电位的影响。
图4为本发明实施例7的pH对纳米粒子包封率、粒径、Zeta电位的影响。
图5为本发明实施例8的DPPH自由基清除率。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
将壳聚糖(200kDa)溶于1％(v/v，ml/ml)的乙酸水溶液中，搅拌使其完全溶解，得到壳聚糖浓度为0.075％(m/v，g/ml)的溶液，将硫酸软骨素、原花青素共溶于超纯水中，搅拌30min，得到硫酸软骨素浓度为0.225％(m/v，g/ml)、原花青素浓度为0.05％(m/v，g/ml)的溶液，在持续搅拌下，将30mL的壳聚糖溶液滴加入30mL的硫酸软骨素-原花青素溶液中，用HCl(0.1mol/L)溶液将混合悬浊液pH调整为3.25，磁力搅拌速率为700rpm/min，持续搅拌2小时，在50mL的离心管中装入20mL搅拌得到的悬浊液，在冰浴条件下以30％的振幅超声1min(超声功率为1200W，频率为20kHz)，得到包封原花青素的壳聚糖/硫酸软骨素纳米粒子悬浊液。
对比例
将壳聚糖(200kDa)溶于1％(v/v，ml/ml)的乙酸水溶液中，搅拌使其完全溶解，得到壳聚糖浓度为0.075％(m/v，g/ml)的溶液，将硫酸软骨素、原花青素共溶于超纯水中，搅拌30min，得到硫酸软骨素浓度为0.225％(m/v，g/ml)、原花青素浓度为0.05％(m/v，g/ml)的溶液，在持续搅拌下，将30mL的壳聚糖溶液滴加入30mL的硫酸软骨素-原花青素溶液中，用HCl(0.1mol/L)溶液将混合悬浊液pH调整为3.25，磁力搅拌速率为700rpm/min，持续搅拌2小时，得到包封原花青素的壳聚糖/硫酸软骨素纳米粒子悬浊液。
表1对比例和实施例1的DSC数据
| 实施例 | 起始温度(℃) | 终止温度(℃) | 峰值温度(℃) | ΔH<sub>d</sub>(mW/g) |
| 对比例 | 126.26±3.15 | 162.65±9.37 | 139.26±3.48 | 246.74±4.39 |
| 实施例1 | 146.09±0.18 | 183.81±2.14 | 159.57±0.13 | 363.08±16.73 |
根据表1可得，实施例1的DSC吸热峰对应的温度比对比例高，且焓变值远高于对比例，说明超声处理提高了纳米粒子的热稳定性。超声作为一种辅助手段被引入壳聚糖/硫酸软骨素纳米粒子的制备是有效的。
实施例2
将壳聚糖(200kDa)溶于1％(v/v，ml/ml)的乙酸水溶液中，搅拌使其完全溶解，得到壳聚糖浓度为0.075％(m/v，g/ml)的溶液，将硫酸软骨素、原花青素共溶于超纯水中，搅拌30min，得到硫酸软骨素浓度为0.225％(m/v，g/ml)、原花青素浓度为0.05％(m/v，g/ml)的溶液，在持续搅拌下，将30mL的壳聚糖溶液滴加入30mL的硫酸软骨素-原花青素溶液中，用HCl(0.1mol/L)溶液将混合悬浊液pH调整为3.25，磁力搅拌速率为700rpm/min，持续搅拌2小时，在50mL的离心管中装入20mL搅拌得到的悬浊液，在冰浴条件下以30％的振幅超声4min(超声功率为1200W，频率为20kHz)，得到包封原花青素的壳聚糖/硫酸软骨素纳米粒子悬浊液。
如图2所示，未超声处理的对比例样品的尺寸在微米级别，而超声处理的实施例1和2的样品尺寸在纳米级别。超声处理有效将聚合物破碎成更小的纳米颗粒，防止纳米颗粒悬浊液在储存过程中的聚集与沉淀。其中实施例1的样品对比实施例2，颗粒更小、分散更均匀，说明随着超声时间的延长，可能出现了“过度处理”，对纳米粒子的结构产生了不利影响。
实施例3
将壳聚糖(200kDa)溶于1％(v/v，ml/ml)的乙酸水溶液中，搅拌使其完全溶解，得到壳聚糖浓度为0.025％(m/v，g/ml)的溶液，将硫酸软骨素、原花青素共溶于超纯水中，搅拌30min，得到硫酸软骨素浓度为0.075％(m/v，g/ml)、原花青素浓度为0.05％(m/v，g/ml)的溶液，在持续搅拌下，将30mL的壳聚糖溶液滴加入30mL的硫酸软骨素-原花青素溶液中，用HCl(0.1mol/L)溶液将混合悬浊液pH调整为3.25，磁力搅拌速率为700rpm/min，持续搅拌2小时，在50mL的离心管中装入20mL搅拌得到的悬浊液，在冰浴条件下以30％的振幅超声1min(超声功率为1200W，频率为20kHz)，得到包封原花青素的壳聚糖/硫酸软骨素纳米粒子悬浊液。
实施例4
将壳聚糖(200kDa)溶于1％(v/v，ml/ml)的乙酸水溶液中，搅拌使其完全溶解，得到壳聚糖浓度为0.075％(m/v，g/ml)的溶液，将硫酸软骨素、原花青素共溶于超纯水中，搅拌30min，得到硫酸软骨素浓度为0.225％(m/v，g/ml)、原花青素浓度为0.025％(m/v，g/ml)的溶液，在持续搅拌下，将30mL的壳聚糖溶液滴加入30mL的硫酸软骨素-原花青素溶液中，用HCl(0.1mol/L)溶液将混合悬浊液pH调整为3.25，磁力搅拌速率为700rpm/min，持续搅拌2小时，在50mL的离心管中装入20mL搅拌得到的悬浊液，在冰浴条件下以30％的振幅超声1min(超声功率为1200W，频率为20kHz)，得到包封原花青素的壳聚糖/硫酸软骨素纳米粒子悬浊液。
实施例5
将壳聚糖(200kDa)溶于1％(v/v，ml/ml)的乙酸水溶液中，搅拌使其完全溶解，得到壳聚糖浓度为0.075％(m/v，g/ml)的溶液，将硫酸软骨素、原花青素共溶于超纯水中，搅拌30min，得到硫酸软骨素浓度为0.225％(m/v，g/ml)、原花青素浓度为0.05％(m/v，g/ml)的溶液，在持续搅拌下，将30mL的壳聚糖溶液滴加入30mL的硫酸软骨素-原花青素溶液中，用HCl(0.1mol/L)溶液将混合悬浊液pH调整为4.5，磁力搅拌速率为700rpm/min，持续搅拌2小时，在50mL的离心管中装入20mL搅拌得到的悬浊液，在冰浴条件下以30％的振幅超声1min(超声功率为1200W，频率为20kHz)，得到包封原花青素的壳聚糖/硫酸软骨素纳米粒子悬浊液。
表2对比例和实施例1～5的纳米粒子粒径、电位、包封率和负载率
| 实施例 | 粒径(nm) | Zeta电位(mV) | 包封率(％) | 负载率(％) |
| 对比例 | 2302.0 | -23.1 | 38.1％ | 11.3％ |
| 实施例1 | 300.4 | -23.3 | 37.5％ | 11.1％ |
| 实施例2 | 361.3 | -22.6 | 32.1％ | 9.7％ |
| 实施例3 | 224.7 | -18.0 | 16.8％ | 14.4％ |
| 实施例4 | 270.3 | -21.8 | 44.8％ | 6.9％ |
| 实施例5 | 582.0 | -26.9 | 33.2％ | 10.0％ |
从表2可以看出，纳米粒子的制备参数，如壳聚糖和硫酸软骨素浓度、原花青素浓度和体系pH，对纳米粒子的性质有很大影响。壳聚糖和硫酸软骨素浓度的减少可以降低纳米粒子的粒径，但同时对原花青素的包封率也相应降低，电位的绝对值也有所减小；降低原花青素的浓度可以显著提高包封率以及减小粒径，但纳米粒子的负载量明显降低；而体系pH升高使得粒径显著增大，电位绝对值也有所增加。为得到粒径最小、包封率和负载率相对较高的纳米粒子，确定了制备条件为壳聚糖浓度0.075％、硫酸软骨素浓度0.225％、原花青素浓度0.05％、pH3.25。
实施例6
将壳聚糖(200kDa)溶于1％(v/v，ml/ml)的乙酸水溶液中，搅拌使其完全溶解，得到壳聚糖浓度分别为0.025％、0.05％、0.075％、0.1％、0.125％、0.15％(m/v，g/ml)的溶液，将硫酸软骨素、原花青素共溶于超纯水中，搅拌30min，得到硫酸软骨素浓度分别为0.075％、0.15％、0.225％、0.3％、0.375％、0.45％(m/v，g/ml)、原花青素浓度为0.05％(m/v，g/ml)的溶液，在持续搅拌下，将30mL的壳聚糖溶液滴加入30mL的硫酸软骨素-原花青素溶液中，分别得到包材浓度为0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％(m/v，g/ml)的悬浊液，用HCl(0.1mol/L)溶液将混合悬浊液pH调整为3.25，磁力搅拌速率为700rpm/min，持续搅拌2小时，在50mL的离心管中装入20mL搅拌得到的悬浊液，在冰浴条件下以30％的振幅超声1min(超声功率为1200W，频率为20kHz)，得到包封原花青素的壳聚糖/硫酸软骨素纳米粒子悬浊液。
如图3所示，随着壳聚糖和硫酸软骨素的浓度增加，纳米粒子的粒径显著增大，这是由于聚合物的缔合引起的，同时包材浓度增加即相互作用位点增加，导致纳米粒子的数量增加，使得原花青素更多得被包封进入纳米粒子中，即带来了更高得包封率。考虑到相对较小的粒径和较高的包封率，确定了壳聚糖的浓度为0.075％、硫酸软骨素浓度为0.225％，即包材浓度为0.15％。
实施例7
将壳聚糖(200kDa)溶于1％(v/v，ml/ml)的乙酸水溶液中，搅拌使其完全溶解，得到壳聚糖浓度为0.075％(m/v，g/ml)的溶液，将硫酸软骨素、原花青素共溶于超纯水中，搅拌30min，得到硫酸软骨素浓度为0.225％(m/v，g/ml)、原花青素浓度为0.05％(m/v，g/ml)的溶液，在持续搅拌下，将30mL的壳聚糖溶液滴加入30mL的硫酸软骨素-原花青素溶液中，用HCl(0.1mol/L)溶液将混合悬浊液pH分别调整为2.5、3.0、3.25、3.5、4.0、4.5，磁力搅拌速率为700rpm/min，持续搅拌2小时，在50mL的离心管中装入20mL搅拌得到的悬浊液，在冰浴条件下以30％的振幅超声1min(超声功率为1200W，频率为20kHz)，得到包封原花青素的壳聚糖/硫酸软骨素纳米粒子悬浊液。
如图4所示，随着pH的增大，粒径呈现先减小后增大的趋势，包封率逐渐减小，电位绝对值逐渐增大。这是因为随着pH增大，硫酸软骨素的硫酸基团(pKa≈2.6)电离程度增大，壳聚糖的氨基(pKa≈6.5)质子化程度减小，考虑到最小的粒径和相对较高的包封率，确定了pH＝3.25。
实施例8
本发明纳米载体对原花青素的抗氧化效果维持检测
将实施例1制得的包封原花青素的纳米粒子悬浊液作为实验组；将与实施例1含有相同原花青素浓度的原花青素水溶液作为对照组。
将新制备的实验组和对照组一同在光照强度为10klx的培养箱中储存10天后，通过DPPH自由基清除实验测定其储存前后的抗氧化性。将样品溶液用超纯水稀释10倍，与等体积的DPPH溶液(0.2mmol/L溶于乙醇)混合，分别在37℃的黑暗条件下孵育0.5,1,2,12和24小时，然后用酶标仪测定混合溶液在517nm时的吸光度，通过以下公式计算自由基清除率:
DPPH自由基清除率(％)＝[1–(Ai–Aj)/A0]×100％
其中，Ai为样品溶液与DPPH试剂反应测得的吸光度，Aj为样品溶液与等体积乙醇混合测得的吸光度，A0为超纯水和等体积DPPH溶液混合测得的吸光度。
结果发现，储存后的原花青素水溶液的自由基清除率在0.5小时和24小时的孵育下分别表现为45.01±2.57％和83.72±2.48％，而同样条件下包封原花青素的纳米粒子悬浮液的自由基清除率分别为55.50±3.14％和94.38±1.21％。
上述结果说明：与对照组相比，壳聚糖/硫酸软骨素的纳米载体包封使得原花青素在储存过程中能更好得维持其高得自由基清除率，即能够维持较好的抗氧化效果。
本发明原花青素的纳米粒子，需要引入辅助技术来提高纳米颗粒的稳定性，高频超声具有空化效应，有利于实现抑制聚合物纳米颗粒的团聚、提高稳定性、减小粒径尺寸和多分散性等效果。发明人发明和设计了一种基于聚电解质络合包封(壳聚糖和硫酸软骨素)结合超声辅助策略制备原花青素纳米粒子的方法。
综上，本发明采用聚电解质络合和超声结合的方法，制备了有效包封原花青素的纳米粒子，本发明制备的原花青素纳米粒子成球形，均匀性与分散性好、包封率和负载率较高，壳聚糖/硫酸软骨素纳米载体有效提高了原花青素在储存过程中的抗氧化稳定性，并具有缓释特征。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (4)
1.一种聚电解质络合包封的原花青素纳米粒的制备方法，其特征在于：包括，
将壳聚糖溶于乙酸水溶液中，搅拌使其完全溶解，得到壳聚糖溶液，其中，所述壳聚糖的平均分子量为150~500 kDa，脱乙酰度为70~90%，乙酸水溶液浓度为1%v/v，壳聚糖溶液浓度以质量体积比g/mL为0.015~0.2%；
将硫酸软骨素、原花青素共溶于超纯水中，搅拌10~50min后，得到硫酸软骨素-原花青素的混合溶液，混合溶液中硫酸软骨素浓度为0.067~0.5% m/v，原花青素浓度为0.025~0.05% m/v；
在持续搅拌条件下，将壳聚糖溶液滴加入等体积的原花青素-硫酸软骨素混合溶液，用HCl 0.1mol/L或NaOH 0.1mol/L溶液将悬浊液pH调整至3.25，并继续搅拌2~3h；
将得到的悬浊液进行超声处理，得到包封原花青素的壳聚糖/硫酸软骨素纳米粒子悬浊液，其中，超声时间1min、振幅30~50%，超声功率为1200W，频率为20kHz。
2.如权利要求1所述聚电解质络合包封的原花青素纳米粒的制备方法，其特征在于：悬浊液搅拌的转速为200~1000 rpm。
3.权利要求1或2所述聚电解质络合包封的原花青素纳米粒的制备方法制得的产品，其特征在于：所述产品中原花青素包封率介于30~50%，负载率介于10~15%，纳米粒粒径介于200~500 nm，Zeta电位介于-20~-30mV。
4.如权利要求3所述产品在食品加工中的应用。
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