CN1138857C - 有机磷农药消解酶、其编码基因和生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有优良性质的有机磷农药消解酶，编码它的基因和生产该酶的方法。使用本发明的方法，有机磷农药消解酶的表达量可达到每毫升发酵液中5mg酶蛋白，比原始菌株的单位表达量高5000倍。重组酵母可用来大规模工业化廉价生产有机磷农药消解酶。有机磷农药消解酶可用于：新鲜蔬菜、水果等农产品上残留农药的清洗脱毒；食品加工工程中农产品原料上残留农药的脱毒；和农药污染的水体、土壤的净化。

Description

有机磷农药消解酶、其编码基因和生产方法

技术领域

本发明涉及一种有机磷农药消解酶，编码这种酶的基因，含有该基因的表达载体和生产这种酶的方法。本发明还涉及清除农产品上残留的有机磷农药的方法。

背景技术

有机磷是当今农药中的主要类别，一直在国内外大量生产和广泛使用，目前世界上的有机磷农药商品已达上百种，我国使用的有机磷农药约有30种，包括杀虫剂、除草剂、杀菌剂等，1999年的使用量为20万吨，占整个农药的57％，其中80％以上是剧毒有机磷农药如甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷、久效磷、敌敌畏等，仅甲胺磷的使用量一年就高达6.5万吨，其它大吨位的有机磷农药还有乐果、氧化乐果和辛硫磷等。根据目前状况，我国有机磷农药占据农药主导地位的局面难以在短期内改变，还将长期使用(华小梅等，环境科学进展，Vol.4，No2，p33～45，1996；张一宾等，农药，Vol38，No7，p1～3，1999)。随着人们生活质量的提高和环境意识的加强，有机磷农药的残留毒性问题越来越受到人们的关注。

有机磷农药均具有抑制人体乙酰胆碱酯酶的功能，对人均存在着程度不同的毒性，急性中毒可引起人肌肉痉挛、瞳孔收缩、呼吸困难直至死亡(陈茹玉等，有机磷农药化学，上海科学技术出版社，1995)。残留在蔬菜、水果等食品上的低剂量有机磷农药对人可产生慢性毒性，会诱导多发性神经病、中风等。

有机磷农药消解酶(Organophosphorus acid hydrolase，EC 3.1.8.2)可降解有机磷农药分子而使其脱毒。由于各种有机磷农药都有类似的结构，只是取代基不同，所以一种有机磷农药消解酶往往可降解多种有机磷农药。有机磷农药消解酶目前已被公认为是净化农药污染的最有潜力的新方法(虞云龙等，环境科学进展，Vol.4，No.3，28～36，1996)。多种微生物都能产生有机磷农药消解酶，如假单胞菌、曲霉等，但在这些微生物中含量太低，难以大量生产，生产成本高昂，到目前为止国内外均还没有商品化生产和实际应用。

早在七十年代就发现有些土壤微生物对农药具有降解作用，目前发现的农药降解微生物包括细菌(Munnecke，Appl.Microbiol.，Vol.28，No.2，p212～217，1974；Brown，Soil Biol.Biochem.，Vol.12，p105～112，1979；)、真菌(Bujacz，Appl.Environ.Microbiol.，Vol.61，No.8，p2905～2910，1995；Omar，Biodegradation，Vol.9，p327～336，1998)、放线菌和藻类，细菌中包括假单胞菌、节细菌、黄杆菌等二十余种，真菌中有曲霉、青霉、木霉等。进一步研究发现这些微生物之所以能降解有机磷农药是因为它们能分泌一种能水解磷酸酯键的酶(有机磷农药消解酶)。八十年代Munnecke等(J.Agric.Food Chem.，Vol48，No.1，p105～111，1980)发现有机磷农药消解酶比产生这类酶的微生物菌体更能忍受异常环境条件，如来源于假单胞菌的消解酶在10％的无机盐、1％的有机溶剂、50℃下都能保持高活性，而该酶的产生菌在同样的条件下却不能生长。而且，酶的降解效果远远胜于微生物本身，特别是对低浓度的农药。因此，人们的思路从应用微生物菌体净化农药污染转向利用有机磷农药消解酶。

目前有机磷农药消解酶的研究已成为世界性的研究热点之一。随着分子生物学的发展，对机磷农药消解酶的研究目前已进入到分子水平，数种微生物来源的机磷农药消解酶已得到分离纯化并进行了较深入的生理生化研究，如Munnecke等(J.Agric.Food Chem.，Vol48，No.1，p105～111，1980)分离到的机磷农药消解酶对试验用的甲基对硫磷、二嗪农、毒死蜱等7种有机磷农药均能有效降解，在22℃时降解效率比化学降解快1000～2450倍，且该酶不为农药及农药制剂中溶剂所抑制，对环境条件有较宽的忍受范围。

应用有机磷农药消解酶就必须解决一个关键性的问题一如何工业化廉价生产有机磷农药消解酶。有机磷农药消解酶在原始天然菌株中含量太低，难以大量生产、生产成本高昂。这也是目前世界上还未有商品化生产的有机磷农药消解酶产品及在生产实践上推广应用的关键原因。近年来，随着基因工程技术的飞速发展，人们意识到利用基因工程技术是解决这一问题最有效的方法，具体思路是通过基因工程的手段克隆有机磷农药消解酶编码基因，然后在重组微生物生物反应器中高效表达有机磷农药消解酶基因，使有机磷农药消解酶的单位表达量比原始天然菌株成百上千倍的提高，从而大幅度降低生产成本。

到目前为止，仅从细菌中分离到了3个有机磷农药消解酶的编码基因，一种是来源于假单胞菌(Mcdaniel，J Bacterol.，Vol170，No.5，p2306～11，1988；Sendar，Bio/technol.，Vol.7，p1151～55，1989)或黄杆菌(Mulbry，J Bacteriol，Vol.171，No.12，p6740～46，1989)的消解酶基因opd，在这两种菌中，opd的序列是一样的(Chaudhry，Appl.Environ.Microbiol.Vol.54，No.2，p288～293，1988)。另一个是来源于节杆菌(Arthrobacter sp.)的消解酶基因oph(Ohshiro，J.Biosc.Bioeng.，Vol.57，No.4，p531～534，1999)。还有一个是来源于单胞菌(Alteromonas sp.)的有机磷农药消解酶基因oph(Cheng，Appl.Environ.Microbiol.，Vol.62，No.5，p1636～41，1996)。真菌来源的有机磷农药消解酶基因还未曾分离到。

1985年Sendar等(Bio/technol.，Vol.3，p567～568，1985)首次尝试在大肠杆菌中表达有机磷农药消解酶，表达产物虽具有生物学活性，但表达量还未到原始天然菌株的十分之一。随后Sendar等(1989)将此酶基因前的SD序列及信号肽编码序列去除后再在大肠杆菌中表达，使表达量有所提高(Sendar，Bio/technol.，Vol.7，p1151～55，1989)。九十年代许多科学家都进行了机磷农药消解酶编码基因的克隆和高效表达的工作，如Cheng等(Cheng，Appl.Environ.Microbiol.，Vol.62，No.5，p1636～41，1996)从Alteromonas sp.中克隆到一个机磷农药消解酶编码基因并在大肠杆菌中尝试表达，Ohshiro等(Ohshiro，J.Biosc.Bioeng.，Vol.57，No.4，p531～534，1999)从Arthrobacter sp.B-5中分离到机磷农药消解酶基因oph，也在大肠杆菌中进行了表达。以上的这些表达研究，从总体上看，其表达水平还较低，只比原始天然菌株高十几倍，一般都不超过100μg酶蛋白/mL发酵液，还达不到廉价生产机磷农药消解酶的要求，但却证实了利用基因工程手段来提高有机磷农药消解酶的表达、批量生产这一途径的有效性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新的有机磷农药消解酶。

本发明的另一个目的是提供一种编码本发明的消解酶的基因。

本发明的又一个目的是提供一种含有本发明的基因的表达载体。

本发明的再一个目的是提供一种生产本发明的消解酶的方法。

本发明的还一个目的是提供一种消除农产品上的有机磷农药的方法。

土样从农药生产厂的生产场地和排污口采取。以不含C、N、P的无机盐培养基为基础培养基，基础培养基中加入不同的农药，并作加入或不加入N源的组合，进行初筛，初筛出的菌株进一步在农药含量逐渐增高的培养基上连续驯化和分离。对分离出的菌株进行有机磷农药消解酶的酶活性测定，并进一步对所产酶进行生理生化性质研究，筛选出具有高活性的广谱、稳定的有机磷农药消解酶产生菌株Psedomonos sp. 92。此菌株所产生的有机磷农药消解酶具有优良的性质。这种酶的氨基酸序列如图7所示。这种有机磷农药消解酶必须在常温下对多种有机磷农药有较高的活性，即好的广谱性，同时酶本身具有很好的稳定性。本发明筛选到的假单孢菌Psedomonos sp.92所产生的有机磷农药消解酶最适pH值为8～10，最适温度为50℃，加入酶保护剂后在常温中存放6个月，其酶活性丧失不超过15％。此酶对多种有机磷农药都有降解作用，尤其是具有P-O-C键的农药，如对硫磷、敌敌畏、甲基对硫磷、亚胺硫磷、久效磷，降解率在80～98％，对具有P-S-C的农药如乐果、马拉硫磷、甲胺磷、甲拌磷、氧化乐果等降解率也在60％以上。目前国内外报道的有机磷农药消解酶一般仅能对P-O-C和P-S-C这两种键型的有机磷农药中的一种有高活性，如Serdard等(Sendar，Bio/technol.，Vol.7，p1151～55，1989)报道的来源于细菌的有机磷农药消解酶、刘玉焕等(微生物学报，Vol.40，No.4，p430～434，2000)报道的来源于真菌的有机磷农药消解酶对P-O-C键型的农药有较高活性，而对P-S-C键型的农药无活性。而另一些有机磷农药消解酶则反之，对P-S-C键型的某些农药有活性，而对P-O-C键型的农药及另一些P-S-C键型的农药则极低。我们分离到的这一有机磷农药消解酶对P-O-C和P-S-C键型的两类有机磷农药均有高活性。

本发明的分离克隆到此有机磷农药消解酶的编码基因，为此基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供优良的基因材料。通过Inverse PCR的方法分离克隆了这一有机磷农药消解酶基因opdA，DNA全序列分析结果表明，此基因全长1098个核苷酸，编码365个氨基酸，根据信号肽序列的结构规则推断及成熟蛋白N端序列的氨基酸序列测定结果，N-端的29个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在+29位的Gly之后。基因的G+C含量为50.8％。此基因与Serdar等报道的从Pseudomonasdiminuta MG中分离的有机磷农药消解酶基因(Sendar，Bio/technol.，Vol.7，p1151～55，1989)有同源性，但核苷酸同源性仅为76.5％，氨基酸同源性为仅83.6％，说明这是一个新基因。本发明的有机磷农药消解酶基因优选具有如图6所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种高效表达本发明的有机磷农药消解酶的方法，包括：使用本发明的基因构建表达载体；使用含有有机磷农药消解酶基因的表达载体转化宿主细胞；使有机磷农药消解酶基因表达并分离所表达的有机磷农药消解酶。

在对本发明的有机磷农药消解酶基因进行表达时可以对该基因进行改造。基因的改造可利用PCR技术、定点突变技术、基因设计后化学合成等技术来实现。可选择的表达系统包括低等真核表达系统如酵母、丝状真菌等；原核表达系统大肠杆菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌、杆状病毒等。例如，可以通过PCR的方法将有机磷农药消解酶基因原有的信号肽序列除掉，将改造后的有机磷农药消解酶基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达，以解决有机磷农药消解酶在原始天然菌株中产量太低、难以获得大量产品、生产成本过高的问题，使其能在实际生产实践中推广应用。别的真核表达系统如杆状病毒-昆虫表达系统、霉菌表达系统、植物表达系统等也适合于此有机磷农药消解酶基因的高效表达。

本发明提出一种新思路，即在蔬菜、水果等农产品的清洗及食品原料的净化中应用有机磷农药消解酶，使残留的农药能被降解而脱毒，避免残留农药引起的急性、慢性中毒，提高人们的生活质量；同时，也可在农药污染的水体和土壤等环境中应用有机磷农药消解酶，减轻环境的农药污染。

采用毕赤酵母(Pichia.pastoris)做为有机磷农药消解酶基因的表达受体，其优点是：1.表达量大，有机磷农药消解酶在其中的表达量可达到5mg/mL发酵液；2.发酵所需原料单一、便宜、易得，均为工业原料，碳源为工业葡萄糖，氮源为工业氨水，另只需一些微量无机盐，发酵成本低廉；3.毕赤酵母本身具有很好的安全性，曾作为单细胞蛋白广泛应用，酵母培养基中不含有毒物质和致热源；4.表达的有机磷农药消解酶在信号肽的引导下会分泌到培养基中，这使有机磷农药消解酶直接暴露出来而无需破碎酵母菌体，有利于有机磷农药消解酶的纯化及降低后加工成本。

本发明提供了重组的有机磷农药消解酶基因工程菌株的高密度发酵、酶蛋白大量产生的方法，为有机磷农药消解酶工业化发酵生产奠定基础。本发明提供的以葡萄糖为碳源、氨水为氮源(均为廉价的工业原料)的菌体高密度发酵方法，使用通用的发酵装置即可。

本发明分离到的具有优良特性的有机磷农药消解酶基因为此基因在各种生物反应器如杆状病毒表达系统、曲霉表达系统、酵母表达系统中高效表达、大量生产有机磷农药消解酶提供了优良的基因源。本发明可用来工业化廉价生产有机磷农药消解酶。

附图说明图1.Pseudomonas sp.92所产有机磷农药消解酶经纯化后的SDS-PAGE

分析

1.纯化后的酶蛋白；2.HPLC；3.标准蛋白分子量图2.有机磷农药消解酶的最适pH图3.有机磷农药消解酶的酸碱稳定性图4.有机磷农药消解酶的最适反应温度图5.有机磷农药消解酶的热稳定性图6.来源于Pseudomonas sp.92的有机磷农药消解酶结构基因核苷酸序

列图7.来源于Pseudomonas sp.92的有机磷农药消解酶的氨基酸序列图8.酵母重组转移质粒pPIC9X的物理图谱图9.在5L发酵罐中连续3批次的有机磷农药消解酶的表达积累曲线图10.重组酵母中表达的有机磷农药消解酶的SDS-PAGE分析

1.标准蛋白分子量；2-9.诱导0，12，24，48，72，96，108，120小时积累的酶蛋白

四、实施例

                  实验一

一、菌株与载体  大肠杆菌菌株E.coli DH5a、质粒pUC18等购自Promega公司，酵母菌株Pichia pastoris GS115(His^-Mut⁺)、质粒pPIC9由加拿大Alberta大学D.Luo博士惠赠。

二、酶与试剂盒限制性内切酶、连接酶、Taq酶、Mung bean酶为Boehringer公司产品。T7DNA sequence kit购于Pharmacia公司。  随机引物标记Kit和PCR Kit均购于Promega公司。

三、生化试剂  DNA合成试剂为Milipore公司产品。引物合成用ABI公司Cyclone DNA合成仪。IPTG、X-Gal、SDS为Sigma公司产品。TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。

四、培养基1.筛选培养基：

PS培养基：KCl，0.5g/L；MgSO₄.7H₂O，0.3g/L；CaCl，0.04g/L；MnCl，2mg/L；ZnCl，2mg/L；FeSO₄.7H₂O，2mg/L；pH7。培养基中各种农药的加入量为0.01％(V/V)。

PSN培养基：PS培养基中加入0.05％的NaNO₃作N源2.大肠杆菌培养基LB

1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.03.酵母完全培养基为YPD

1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖4.酵母转化培养基RDB

18.6％山梨醇、2％葡萄糖、1.34％Yeast Nitrogen Base W/O aminoacids(YNB)、0.00004％Biotin、0.005％谷氨酸、0.005％甲硫氨酸、0.005％赖氨酸、0.005％亮氨酸、0.005％异亮氨酸、2％琼脂糖5.酵母选择培养基MM

34％YNB、0.00004％Biotin、0.5％甲醇、1.5％琼脂糖6.酵母选择培养基MD

34％YNB、0.00004％Biotin、2％葡萄糖、1.5％琼脂糖7.酵母诱导培养基BMGY

1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V)8.酵母诱导培养基BMMY

1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甲醇(V/V)9.重组酵母发酵培养基为10×Basal Salts

67％磷酸、0.093％硫酸钙、1.82％硫酸钾、1.49％硫酸镁、0.413％氢氧化钾、4％甘油或葡萄糖10.发酵中所用的微量盐溶液PTM1

0.6％硫酸铜、0.008％碘化钠、0.3％硫酸锰、0.02％钼酸钠、0.002％硼酸、0.05％氯化钴、2％氯化锌、6.5％硫酸亚铁、0.025％生物素、0.5％硫酸

                      实验二

本实施例说明产生有机磷农药消解酶的天然菌株的筛选程序。土样按常规稀释后涂布于分别含有0.01％对硫磷的PS平板，30℃培养5～10天待菌落出现，长出的菌落可分解对硫磷为菌株生长提供C、N和P源，挑取菌落在含有0.01％对硫磷的PS平板上划线分离单菌落，重复3轮，共分离到283个菌落。菌落转接到含0.01％敌敌畏的PSN平板上，30℃培养至菌落出现，长出的菌落可分解敌敌畏为菌株生长提供C和P源(敌敌畏分子中不含N)，共分离到199个菌落。接着将菌落转接到含0.01％氧化乐果的PS平板上，分离到28个菌落，进一步将这28个菌落转接到含有0.01％甲拌磷的PSN平板上，分离到7个菌落。有机磷农药主要分为P-O-C键和P-S-C键2类，对硫磷和敌敌畏属于前者，而氧化乐果和甲拌磷属于后者，按上述方法分离到的菌株能同时水解这2类键的农药。经初步鉴定，分离到的这7株菌有3株为假单胞菌，分别命名为Pseudomonas sp.90、91、92，另4株为黄杆菌，分别命名为Flavobacteriumsp.66、67、68、69。

进一步对筛选到的菌株进行驯化，将菌株在同时含上述4种农药、但浓度逐渐提高的PS平板上依次转接，每种农药浓度依次为0.0025％、0.0027％、0.003％、0.0035％、0.004％、0.005％。经驯化后，Pseudomonassp.92在含4种农药浓度分别为0.005％的PS平板上生长良好，而其余菌株只能在农药较低的平板上正常生长。Pseudomonas sp.92被用来进行进一步的研究。

挑取Pseudomonas sp.92菌株接种于5mL液体培养基PS(分别含0.004％的上述4种农药)中，30℃摇振培养3天，按1％接种量转接到50mLPS培养基(分别含0.005％的上述4种农药)中继续培养5天。离心后去上清，收集菌体，悬于含有0.1mmol/L ZnCl₂的50m mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中，超声波破碎菌体，15000g离心20分钟去细胞残渣，上清液用来进行酶活性测定。测定方法为：0.1mL的酶稀释液中加入0.005mL10mg/mL的对硫磷和0.9mL Tris-HCl缓冲液(pH8.5)，37℃保温10min，加入1mL 1％ NaCO₃显色，415nm测定水解产物对硝基酚含量。一个酶活性单位(U)定义为：在一定条件下，每分钟释放出1μmol对硝基酚所需酶量为一个酶活性单位。Pseudomonas sp.92所产的有机磷农药消解酶活性为3.2U/mL发酵液。

                        实验三

本实验说明有机磷农药消解酶的纯化程序。

Pseudomonas sp.92菌株在1000mL PS培养基(分别含0.005％的上述4种农药)中培养5天后，收集菌体，悬于100mL含有0.1mmol/L ZnCl₂的50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中，超声波破碎菌体，15000g离心20分钟去细胞残渣，上清液缓冲液中缓慢加入硫酸铵至饱和度85％，4℃过夜，9000g离心60min，弃上清液，沉淀溶于1mL含0.1mmol/L ZnCl₂的Tris-HCl(pH8.5)缓冲液中。酶蛋白进一步用HPLC纯化(KTA FPLC，Pharmacia公司)纯化。含酶的浓缩液首先用HiPrep-26/10-Desalting柱脱盐，缓冲液为20mmol/L Tris-HCl(pH7.0)，流速为5mL/min，收集洗脱峰，接着用离子交换柱Hitrip-SP-Sepharose-XL(5mL)分离，A泵为20mmol/LTris-HCl(pH7.0)，B泵为1mol/L NaCl、20mmol/L Tris-HCl(pH7.0)高盐缓冲液，流速为2mL/min，高盐缓冲液从0～100％梯度洗脱10个柱床，分部收集洗脱峰，通过酶活性测定后的洗脱峰进一步用凝胶柱Superdex-75-HR10/30纯化，缓冲液同样为20mmol/L Tris-HCl(pH7.0)，流速为0.5mL/min，收集洗脱峰得到纯蛋白。

在纯化过程中的85％硫酸铵沉淀、HPLC纯化等各步骤中进行酶活性测定，结果(表1)表明酶蛋白的回收率分别为65.5％、22.5％。纯化完成后酶蛋白的含量为1440U/mL，比活性为3200U/mg。SDS-PAGE结果(图1)表明，纯化后的有机磷农药消解酶蛋白仅有一条单一的条带，酶的分子量约为38KD。

                    表1纯化有机磷农药消解酶的比活性

酶样品	体积/mL	蛋白质浓度/mg/mL	比活性/U/mg	总酶性/％	回收率/％
						细胞破碎液	100	0.37	85.5	3200	100
85％(NH4)2S04沉淀后	2	9.25	113.5	2100	65.6
						HPLC	0.5	0.45	3200	720	22.5

                        实验四本实验说明有机磷农药消解酶的酶学性质的测定方法。

最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

经纯化的有机磷农药消解酶在不同的pH值下进行酶促反应以测定其最适pH。酶促反应的缓冲液为不同pH的含0.1mmol/L ZnCl₂的50mmol/L缓冲液(pH2.0为HCl-KCl缓冲液；pH3.0为HCl-甘氨酸；pH4.0、5.0为HAc-NaAc缓冲液；pH6.0为Tris-Maleate缓冲液；pH7.0、7.5、8.0、8.3、8.5、8.8、9.0为Tris-HCl缓冲液；pH9.5、10、11、12为甘氨酸-NaOH缓冲液)，37℃测定酶活性。有机磷农药消解酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理30min，再在Tris-HCl(pH8.5)缓冲液体系中37℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。纯化的有机磷农药消解酶在不同pH的缓冲体系37℃下测定的pH适性结果(图2)表明，最适pH峰宽且平，为8～10；酶在一系列不同pH缓冲液中37℃处理30min后，再在标准条件下测定其酶活性，结果表明(图3)，在pH4～12的范围内，剩余酶活性维持在80％以上，这说明此酶具有很好的耐酸碱性。

有机磷农药消解酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

最适温度的测定为在Tris-HCl(pH8.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为酶在不同温度下处理60min和120min，再在37℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明，其最适温度为50℃。酶的热稳定性性试验表明(图5)，70℃处理30min和60min后，剩余酶活还分别有80％和50％以上，60℃下处理60min后，剩余酶活还有70％以上，说明此酶具有较好的热稳定性。

有机磷农药消解酶的K_m值测定方法如下：

用不同的对硫磷底物浓度，在Tris-HCl(pH8.5)缓冲液体系中，37℃下测定酶活性，计算出其在37℃下的k_m值。经测定，此酶在37℃下以对硫磷为底物的k_m之为0.24mmol/L。

有机磷农药消解酶对不同农药的降解率测定如下：

以1％不同的有机磷农药作为底物，37℃下酶水解1小时，测定农药被降解的量。结果见表2，结果表明，其对占有机磷农药主体的P-O-C键型的有机磷农药如对硫磷、DDV、甲基对硫磷、亚胺硫磷等降解率可高达80～98％，对P-S-C键型的农药也有60～72％的降解率。研究结果说明此酶有很好的广谱性，可降解多种有机磷农药。

                    表2.有机磷农药消解酶对不同农药的降解率

底物	对硫磷	DDV	甲基对硫磷	亚胺硫磷	甲胺磷	氧化乐果	乐果	马拉硫磷	甲拌磷	辛硫磷
											相对酶活性/％	98	92	96	82	82	65	71	70	74	66

阳离子和化学试剂对有机磷农药消解酶活性的影响测定方法为：在酶促反应体系中加入不同的阳离子或化学试剂，研究它们对酶活性的影响。酶反应体系中加入不同浓度的Zn²⁺，结果表明，反应体系中无Zn²⁺时，酶活性极低，随着Zn²⁺浓度的提高，酶活性逐步提高，Zn²⁺浓度达到1mmol/L时，酶活性达到最高值，此时酶活性提高了约30倍，再增加Zn²⁺浓度，酶活性无显著变化。这一结果说明此酶的生物学活性依赖Zn²⁺存在。

在含有Zn²⁺存在的情况下，再加入别的金属离子和试剂，其结果表明(表3)，金属离子对酶活性没有显著影响，而金属离子螯合剂可使酶活性急剧下降，暗示此酶是一种金属蛋白。表面活性剂SDS对酶活性基本没有影响。

           表3.各种金属离子和化学试剂对有机磷农药消解酶活性的影响

试剂(2mmol/L)	Zn2 +	Ca2+	Cd2+	Co2+	Mn2+	Mg2+	Fe2+	EDTA	SDS
										相对酶活性/％	100	100	98	98	95	95	95	21	95

有机磷农药消解酶蛋白的N端氨基酸序列经氨基酸序列测定，纯化后的有机磷农药消解酶蛋白的N端氨基酸序列为：Ser-Ile-Gly-Thr-Gly-Asp-Arg-Ile-Asn。通过酶解将酶蛋白水解，对其一条内肽的N端序列测定结果为：Asp-Asp-Thr-Asp-Asp-Leu。

                        实验五

本实施例说明从中克隆有机磷农药消解酶基因opdA的程序。

首先进行质粒消除实验，以确定有机磷农药消解酶基因是在Pseudomonos sp.92的染色体上还是质粒上。将菌株接种到LB培养基上30℃培养过夜，按10％接种量转接到含有30μg/mL丝裂霉素C的培养基中培养36小时，稀释后涂布于LB平板上培养至菌落出现。挑取单菌落培养进行有机磷农药消解酶酶活性检测。结果表明，质粒消除后，检测不到酶活性，说明有机磷农药消解酶基因是由质粒携带的。

携带有机磷农药消解酶基因的质粒提取按以下方法进行。菌株培养后取1mL菌液离心收集菌体，加入200μL 25mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)(内含50mM葡萄糖，10mM EDTA，2mg/mL溶菌酶)，28℃下保温30分钟，加0.2mL裂解液(0.2N NaOH、2％SDS)，摇动5分钟，用等体积的酚、酚-氯仿、氯仿依次抽提，乙醇沉淀后溶于双蒸水中备用。

有机磷农药消解酶基因的分离克隆采用Inverse PCR的方法。根据酶成熟蛋白N端氨基酸序列和蛋白内肽N端的氨基酸序列，合成一对引物：

P1：5’ATTGGTACTGGTGATAGA 3’

P2：5’CAAGTCGTCAGTATCGTC 3’以质粒DNA为模板，PCR出来一条约600bp的条带，并进行序列测定。这600bp为有机磷农药消解酶基因的部分序列，在其上336bp处发现一单一酶切点BglII。根据酶切点BglII前的已测定序列合成一对分别向两端扩增的引物：

P3：5’GCTGCTGGTGTTAGAACTATT 3’

P4：5’TCTAGCTCTTCTCAATCCTCT 3’同样，根据酶切点BglII后的已测定序列合成一对分别向两端扩增的引物：

P5：5’GAGCAGCAAGCCGCCATTTTC 3’

P6：5’GTCTCTTTGAGAGGCAGCAGT 3’质粒DNA经BglII酶切后进行连接环化，以此为模板，分别用上两对引物进行扩增。P3、P4引物扩增出的是酶前段的部分基因，P5、P6扩增出的是后段的部分基因。进行序列测定后即可拼接出完整的基因序列，再根据此完整序列的两端设计引物，分离出完整的有机磷农药消解酶基因。

分离克隆到的有机磷农药消解酶结构基因opdA(核苷酸序列见图6，氨基酸序列见图7)全长1098个核苷酸，编码365个氨基酸，根据信号肽序列的结构规则推断及成熟蛋白N端序列的氨基酸序列测定结果，N端的29个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在+29位的Gly之后。基因的G+C含量为48.2％。此基因与Serdar等报道的从Pseudomonas diminutaMG中分离的有机磷农药消解酶基因有同源性，但核苷酸同源性为仅76.5％，氨基酸同源性仅为83.6％。

                      实验六

本实施例说有机磷农药消解酶结构基因opdA的改造程序。为了使opdA能在酵母中顺利异源表达，我们去掉了opdA中信号肽编码序列，具体方法为，参照信号肽编码序列之后的核苷酸序列合成一个22个碱基的寡聚核苷酸片断引物，另一引物参照opdA的3’端序列合成。用这对引物通过PCR的方法扩增到的opdA基因就是除去信号肽编码序列后的完整有机磷农药消解酶结构基因编码序列。

                      实验七

本实施说明opdA在酵母表达载体上的构建过程。用于构建酵母表达载体的质粒是pPIC9(带有α-因子分泌信号)。首先将opdA基因插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，然后通过载体与酵母P.pastoris染色体基因组之间的同源重组事件使目的基因稳定整合到酵母染色体上。具体的过程是：将改造后的opdA通过EcoRI位点插入到载体pPIC9上的EcoRI位点，得到了一个用于酵母转化的表达载体—pPIC9X(图8)。这样就将带有分泌信号的目的基因克隆到了AOX启动子下游。

                      实验八

本实施例的目的是说明酵母转化及筛选重组酵母株系的过程。质粒pPIC9X的DNA经电击转化酵母细胞后，通过体内重组，目的基因可以整合到受体酵母基因组中。在外源诱导物存在的条件下，AOX1启动子可以启动其下游基因的表达，并且信号肽可以指导表达产物进入酵母的分泌途径，经过切割，外源蛋白产物最终分泌至胞外，所产生的有机磷农药消解酶的氨基酸序列与天然存在的成熟有机磷农药消解酶完全相同。外源蛋白经过这样的代谢途径，可以进行翻译后修饰，例如糖基化、形成二硫键等，从而得到具有生物活性的蛋白产物。

首先用2～3倍过量的内切酶DraI消化质粒pPIC9X的DNA(经PEG法纯化)，使之线性化，电泳检测酶切是否完全。用酚抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗两次，冷冻干燥，无菌水溶解，-20℃保存备用。

酵母菌株GS115接种于5mLYPD中30℃培养过夜，取0.SmL接种于500mLYPD中30℃培养使O.D.₆₀₀＝1.3～1.5，1500×g离心5分钟，用500mL冰预冷的无菌水洗涤沉淀，如上离心，以20mL冰预冷的1mol/l山梨醇悬浮沉淀，如上离心，以0.5mL冰预冷的1mol/l山梨醇悬浮沉淀。取40μl酵母细胞液加入线性化DNA1～5μg，转移到冰预冷的无菌电击杯中冰浴5分钟。在国产电击仪LN-101上进行电击转化酵母受体菌hisGS115，电击参数为0.8kv，11.5μF。电击后立即向电击杯中加入0.5mL冰预冷的1mol/l山梨醇，然后将电击杯中的溶液转移到无菌的Eppendorf管中在RDB固体培养基上涂板，每板涂0.1mL，将培养皿倒置30℃培养至转化子出现。转化子可在基本培养基(不含His)生长，由于载体中没有酵母复制子，所以his4基因必须整合进酵母基因组中才能表达。另外，由于转化的酵母细胞中AOX1基因受到破坏，所以它就不能再利用甲醇作为碳源。这样，在以甲醇作为唯一碳源的培养基上转化子就不会生长(或者生长极缓慢)，表现为甲醇利用缺陷型(Mut^-)。

用无菌牙签从转化平板上挑取His⁺重组子，首先接种到MM固体培养基上，在接种到MD固体培养基上，如此挑取His⁺重组子，30℃培养2天。寻找在MD平板上生长正常但在MM平板上有一点生长或完全不生长的克隆子。

为了筛选得到高表达的重组酵母菌株，直接检测诱导培养基中有机磷农药消解酶的表达情况。将His⁺Mut^-转化子首先在BMGY培养基(以甘油为碳源)中培养，待其生长至饱和状态，移去BMGY，换入诱导培养基BMMY(以甲醇作为诱导物)，在诱导培养36小时后取上清液进行酶活性分析。通过表达酶的酶活性测定，筛选到3株高水平表达有机磷农药消解酶的重组子，分别定名为P.Pastoris pPIC9X-12，67，99。其中P.Pastoris pPIC9X-99的表达量最高，用来进一步进行5L发酵罐中的产酶研究。

                        实验九

本实施例是说明重组酵母在5升发酵罐中高密度发酵生产有机磷农药消解酶的程序。

优化后的重组酵母发酵方法如下：

              5％接种Basal Salts培养基

                  C源：4％葡萄糖

                                              菌体生长阶段

                     N源：氨水

                      无机盐

                      ↓24h

                  流加25％葡萄糖               碳源饲喂阶段

                  流量：36mL/h/L

                      ↓4h

                                               碳源—诱导剂

          流加25％葡萄糖∶诱导剂(8∶1)，

                                               混合饲喂阶段

                  流量：9ml/h/L

                      ↓4h

                       诱导                    诱导表达阶段

          (诱导剂维持终浓度为0.3％左右)

发酵过程分为四个阶段。具体如下：1)菌株培养阶段。发酵培养基10×Basal Salts接种前先加入28％氨水使培养基的pH达到5.0(氨水同时也做为菌株生长的氮源)，再按每升培养基加入4.37mL PTM1，5-10％接种种子液，通气搅拌培养18～24h，在培养过程中随着菌株的生长，培养基中的溶氧量由100％逐渐降低，当碳源消耗完后溶氧量将再度升高至80％以上，此时菌体湿重达到90～110g/L。2)碳源饲喂阶段。流加25％葡萄糖(每升中含12mL PTM1)，流加量为36mL/h/L，培养4h。调整通气量使溶氧量始终大于20％。此步结束时菌体湿重达到180～220g/L。3)碳源-诱导剂混合饲喂阶段。流加50％葡萄糖∶诱导剂(8∶1)培养4h，流加量为9mL/h/L，控制溶氧量始终大于20％。4)诱导表达阶段。加入诱导剂(每升中含12mLPTM1)，使诱导剂终浓度维持在0.3％，溶氧量始终大于20％。在诱导过程中每12h取样一次测定表达的有机磷农药消解酶的积累量并进行表达蛋白的SDS-PAGE。

从连续3批次的诱导时间与表达产物积累量的关系(图9)来看，随着诱导时间的增加，单位体积发酵液中的酶的活性随之增加，直到直到诱导120小时左右达到高峰，此时酶活性达到1.5～1.8×10⁴U/mL发酵液，随后产物积累量不再随诱导时间的增加而显著增加。三批次发酵之间，表达产物随时间积累的曲线基本一致，说明酶的表达具有很好的稳定性和可重复性。随诱导时间增加发酵液中表达积累的有机磷农药消解酶的SDS-PAGE分析见图10。结果表明，表达的有机磷农药消解酶分子量大小约为38kD，与酶的理论分子量大小相当，这证明有机磷农药消解酶基因得到了表达、有效分泌。酶积累高峰时的表达量约为5～6mg/mL。

在重组P.pastoris生长、诱导表达的一个发酵周期结束后，直接取这种经诱导表达后的菌液做为种子液(接种量为1％)进行下一轮的发酵过程，累计共进行5轮，在每轮中均对菌株生长的生物量和酶表达量进行测定。另外，取每轮发酵完的菌体铺完全培养基平板，挑取10个单菌落提取基因组DNA进行opdA的PCR检测。结果表明(表1)，菌株生长的生物量、速度及酶的表达量在各轮中基本保持稳定。PCR的结果也证明，经过5轮的连续培养，opdA3依然稳定整合在P.pastoris基因组中，这些结果证明重组P.pastoris不仅具有良好的遗传稳定性而且具有良好的酶表达的稳定性。

       表1.重组毕赤酵母的遗传稳定性及酶表达的稳定性

传种代数	PCR阳性率	生长24h的生物量(菌体湿重g/L)	诱导120h酶表达量(U/mL)
				1	100％	98.2	1.72×104
2	100％	110.1	1.65×104
				3	100％	107.5	1.80×104
4	100％	104.0	1.57×104
				5	100％	115.3	1.74×104

Claims (9)

1.一种有机磷农药消解酶，它具有如下所示的氨基酸序列：1 M Q R R R D V R K S A G A A A T L H G G L A G S A S V A G S31 I G T G D R S N I V I G P I S I S V A G F T R T H E Y L C G61 S S A G Y W R A W P K F I G S L E A L A G K A D R G L R R A91 R A A G V R T I V D D S S Y D I G R D V S L L A E V S R A A121 D V H I V A A T G L W F H P P H S M R L R S V E E L T Q Y F151 R R G I Q D G S E D T G I R A G I I K V A T T G K A T P F R181 G L V L K D A A K A S L A T G V P D T T D T A A S Q R D G E211 Q Q A A I F E C G G L S P S R V C I G H S D D T D D L S Y L241 T A L A A R G Y L I G L D H I P R S A I G L E D N A S A S A271 L L G S R Y W R S R A L S I R A L I D Q G Y M K Q I L V S N301 D W L F G F S S Y V T N I M D V M D R V N P G A K A F I P L331 R V N P F L R E K G D P R V S Q A A I T V T N Q V R F L S P361 T L R A S

2.一种编码权利要求1所述的有机磷农药消解酶的基因。

3.按照权利要求2所述的基因，它具有如下所示的核苷酸序列。1 ATGCAAAGGA GAAGGGATGT GCGCAAGTCT GCGGGCGCCG CAGCAACTCT GCACGGCGGC61 CTGGCTGGGT CGGCGAGCGT GGCTGGATCC ATTGGTACTG GTGATAGAAG TAACATCGTT121 ATAGGTGGTA TCAGCATCTC TGTAGCTGGT TTCACTCGGA CTCACGAGTA CCTCTGTGGT181 TCTTCCGCTG GATACTGGCG TGCTTGGCCA AAGTTCATCG GTTCTCTTGA AGCCTTGGCT241 GGAAAGGCTG ATAGAGGATT GAGAAGAGCT AGAGCTGCTG GTGTTAGAAC TATTGTTGAC301 GATTCCAGTT ACGACATTGG TAGAGACGTC TCCTTGTTGG CCGAGGTCTC CAGAGCTGCC361 GACGTTCATA TCGTTGCTGC TACCGGATTG TGGTTTCACC CTCCACATTC CATGAGATTG421 AGATCTGTTG AGGAACTTAC TCAATACTTC CGTCGTGGGA TTCAAGACGG TAGTGAAGAC481 ACCGGAATTA GAGCTGGTAT TATCAAGGTC GCTACCACTG GTAAGGCTAC CCCATTTCGA541 GGGTTGGTCT TGAAGGATGC CGCTAAAGCC TCCTTGGCCA CCGGTGTTCC TGATACCACT601 GACACTGCTG CCTCTCAAAG AGACGGTGAG CAGCAAGCCG CCATTTTCGA GTGTGGAGGT661 TTGTCTCCAT CCAGAGTTTG TATTGGTCAC TCTGACGATA CTGACGACTT GTCCTACTTG721 ACCGCCTTGG CTGCTAGAGG ATACTTGATC GGTCTTGATC ACATCCCACG CTCTGCTATT781 GGTCTTGAAG ACAACGCTTC TGCTTCTGCC CTTCTGGGTA GCCGTTACTG GCGAAGTAGA841 GCTTTGTCGA TTAGGGCTTT GATCGACCAA GGTTACATGA AGCAAATCTT GGTTTCCAAC901 GACTGGTTGT TCGGTTTCTC TTCCTACGTC ACCAACATCA TGGACGTCAT GGATAGAGTT961 AACCCTGGCG CTAAGGCCTT CATTCCACTG AGAGTCAACC CATTCTTGAG AGAGAAGGGT1021 GACCCACGGG TAAGTCAGGC AGCTATCACT GTTACTAACC AAGTTAGATT CTTGTCTCCA1081 ACCTTGAGAG CTTCCTAG

4.一种表达载体，它含有权利要求2或3所述的基因。

5.一种生产权利要求1所述的有机磷农药消解酶的方法，包括：

a.使用权利要求2或3所述的基因构建表达载体；

b.使用含有有机磷农药消解酶基因的表达载体转化宿主细胞；

c.使有机磷农药消解酶基因表达并分离所表达的有机磷农药消解酶。

6.按照权利要求5所述的方法，其中所述的表达载体是pPIC9，所述的宿主细胞是酵母细胞。

7.按照权利要求6所述的方法，其中，有机磷农药消解酶基因的表达是在酵母的高密度发酵条件下进行的。

8.按照权利要求6或7所述的方法，其中，所述的酵母为毕赤酵母。

9.一种清除农产品上有机磷农药的方法，包括使用权利要求1所述的有机磷农药消解酶的步骤。

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