CN113881636B - 一种游离细胞标记及分离探针及其相关产品和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种游离细胞标记及分离探针及其相关产品和用途，尤其是针对胎儿滋养层细胞或上皮组织来源肿瘤细胞。所述游离细胞捕获探针包括：人乳头瘤病毒病毒样颗粒和其携带的报告基因和/或用于分离目的细胞的蛋白标签表达基因。利用人乳头瘤病毒病毒样颗粒对胎盘滋养层细胞的选择性感染的特性可以有效的检测受试者血液样品中是否含有胎儿滋养层细胞，优化后可达到分离胎儿滋养层细胞的目的。利用该探针的嗜上皮特性同样也可用于识别或分离样本中上皮组织来源细胞如上皮组织来源的肿瘤细胞。本方法构思巧妙，安全可靠，具有很高的灵敏性和特异性。

Description

一种游离细胞标记及分离探针及其相关产品和用途
技术领域
本发明涉及一种生物医学领域，特别是涉及一种游离细胞标记及分离探针及其相关产品和用途。
背景技术
妊娠早期进行产前诊断以检测胎儿的基因或者染色体异常等遗传缺陷非常重要。目前，广泛使用的三种产前筛查检测方法主要为：羊水穿刺术、绒毛膜绒毛取样术以及胎儿游离DNA(cfDNA)检测。但是，目前的这三种技术都存在着一定的局限性。羊膜穿刺术：专业技术人员将针头插入胎儿羊膜囊，取羊水20-30ml，然后对其中的胎儿细胞进行细胞遗传学检验，通常在妊娠16周进行；绒毛膜取样：专业技术人员获取胎盘的少量生物活检样本并进行遗传学检测分析，通常在8-12周进行。这两种检测手段能为临床决策提供准确的信息，但这些检测手段为侵入性检测手段，存在增加流产风险(0.6～2％)、给孕妇造成创伤等不利因素。
在无创产前诊断的方法中，血浆游离胎儿DNA的检测被证明在胎儿非整倍体疾病(21-三体、18-三体、13-三体)诊断中具有良好的灵敏性。近10年兴起的二代无创产前技术(Non-invasive Prenatal Testing)NIPT，基于孕妇外周血中存在少量的胎儿碎片DNA的原理,采用二代测序技术依赖统计方法排除母体DNA的干扰，检测胎儿是否有21三体或13，18三体。对21三体即唐氏综合征诊断的灵敏度90％，特异性96％，对13三体和18三体的灵敏度及特异性均为90％左右。
然而，根据研究分析，在妊娠的早期和妊娠晚期，cfDNA分别仅占总血浆DNA的大约3.4％和6.2％，而且，其含量受到孕妇的年龄，体重，怀孕的时间影响，通常必须到孕周10-12周以后cfDNA才能够达到外周血浆5％的比例，才能够进行检测。以上种种因素限制了它用于其他遗传性疾病如微缺失、微重复及点突变等的诊断，这对精确的分析来说是很大的挑战，使血浆游离胎儿DNA的检测成为一种筛查手段，而不是一种诊断手段。
高度碎片化的胎儿游离DNA和占据测序样本中绝大多数的母体DNA限制了NIPT进一步提高准确率，也限制了该方法检测数以万计的其他遗传疾病。目前NIPT检测几乎只针对唐氏综合征一个疾病。我国目前每年有80-120万左右的出生缺陷患儿出生，其中唐氏综合征只占约2％，还有98％的新生儿缺陷完全没有覆盖。
从母体血液中分离胎儿细胞检测是非常有利的方法。母体血液中的胎儿细胞主要有，胎儿有核红细胞和胎儿滋养层细胞两种。但胎儿有核红细胞在血液中的含量非常稀少，在106～107的母体细胞中可能只含有1个胎儿的有核红细胞，其细胞特性与血细胞基本一致，这对于分离来说，是非常困难，而且这些方法只能在孕期较晚时间(12～26周)才能检测，存在局限性。滋养层细胞是在胚胎发育成桑椹胚后，桑椹胚进一步发育，细胞开始出现分化并沿透明带内壁扩展和排列的较小个体细胞，将来发育成胎膜和胎盘。早期就有研究表明，从怀孕5周开始孕妇血液中就存在胎儿滋养层细胞，虽然这些胎儿滋养层细胞数量会随着孕周有所增加，但是增幅并不明显。因此，对胎儿滋养层细胞实现有效分离并获取胎儿DNA，对于最早期的产前筛查和诊断具有重大意义。
据报道，在怀孕5周-26周的孕妇血液中，每10ml血液就有100-380个胎儿滋养层细胞。目前报道的从母体血液中检测胎儿滋养层细胞的方法虽然多种多样，有采用微流控法，根据胎儿细胞和母体血液细胞的尺寸差异，或者胎儿细胞表面表达的某些受体，但是，由于检测方法的灵敏度和特异性不够高，操作复杂，稳定性差，没法在临床上使用。胎儿滋养层细胞在母体血细胞中的比例又特别低，目前没有方法能够在大量的母体血细胞中准确标出胎儿滋养层细胞，将其从母体血细胞中准确分离出更是难上加难。目前所报道的所有方法基本都是：在每1ml母体血液中只能检测到1-2个胎儿滋养层细胞，远远低于330-380个。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，临床上亟需一种能够选择性和特异性都较高，且操作相对简便的方法。人乳头瘤病毒(HPV)是一种特异性的嗜上皮病毒，在感染HPV的孕妇中发现HPV不仅感染孕妇宫颈等上皮组织来源的细胞，也会感染胎盘主要是胎儿滋养层细胞。本发明巧妙的发现由于人乳头瘤病毒(HPV)能够选择性感染上皮组织来源的细胞，而在母体血液中，HPV只能感染胎儿滋养层细胞，但不会感染正常母体血液中的血液细胞如红细胞，白细胞或内皮细胞。本发明巧妙的利用两个特点：1.HPV特异性的感染上皮细胞和胎儿滋养层细胞；2.在正常母体外周血中不存在上皮组织来源细胞，孕妇母体外周血中来自于胎儿的滋养层细胞是唯一能够被HPV感染的细胞类型，而外周血液中的血液细胞如红细胞，白细胞或少量内皮细胞均不会被HPV感染。因此当采用HPV感染孕妇外周血时，HPV唯一能够感染的细胞类型是来自于胎儿的滋养层细胞。除了胎儿滋养层细胞，由于HPV还具有嗜上皮细胞的特性，这个方法也同样适用于上皮组织来源的恶性肿瘤患者(非孕妇)的外周血中特异性的识别和分离循环肿瘤细胞。
最近的研究发现HPV不仅具有嗜上皮特性，还能够感染胎盘中的胎儿滋养层细胞。HPV特异性的嗜上皮特性和嗜胎儿滋养层细胞特性都来自于其衣壳蛋白。HPV有两种衣壳蛋白，主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。在天然HPV病毒颗粒形成过程中，衣壳蛋白包装病毒DNA形成成熟的病毒颗粒。研究表明，在许多表达体系如哺乳动物细胞、酵母和细菌中，L1和L2共表达后可自行组装成不含病毒DNA的病毒样颗粒，以HPV的衣壳蛋白为主构建的病毒样颗粒是由HPV衣壳蛋白自主包装形成的空衣壳结构，在形态和结构上与真正的HPV病毒粒子相同，因其保留了天然HPV病毒颗粒的空间构象和构象表位，但因其不含有病毒的核酸，不能进行复制，不具有传染性。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明的一方面提供了人乳头瘤病毒病毒样颗粒在制备用于识别和/或分离人乳头瘤病毒易感细胞产品中的用途。
其中，人乳头瘤病毒病毒样颗粒是指HPV病毒中的L1和L2共表达后可自行组装成不含病毒DNA的病毒样颗粒。
进一步地，所述人乳头瘤病毒易感细胞选自胎儿滋养层细胞或上皮组织来源肿瘤细胞。
进一步地，所述产品用于分离血液样品中的人乳头瘤易感细胞。
进一步地，所述血液样品为外周血样品。
进一步地，血液样品可以是哺乳动物来源的，所述哺乳动物可以为人，如孕妇，也可以是肿瘤/疑似肿瘤患者。
进一步地，所述人乳头瘤病毒病毒样颗粒携带有报告基因和/或用于分离目的细胞的蛋白标签表达基因。
进一步地，所述报告基因/或蛋白标签表达基因位于表达载体中，所述人乳头瘤病毒病毒样颗粒携带有所述表达载体。
进一步地，所述报告基因选自荧光蛋白、荧光素酶、抗生素抗性蛋白或者特异性膜蛋白受体的基因中任一。
一般情况下，可透过报告基因所表达的报告蛋白来识别目的细胞是否存在。
另外一种实施方式中，所述报告基因还可跨过细胞膜锚定在目的细胞的细胞膜外表面表达报告蛋白。
进一步地，使用者可用能够与所述报告蛋白进行特异性结合的抗体，与所述报告蛋白通过抗原抗体反应，从而将目的细胞分离。
进一步地，所述蛋白标签选自HA-tag、Flag、His、GST、MBP、His-MBP、Myc、His-Myc、sumo、His-sumo、SNAP-tag、halo-tag、可被生物素化标签、可被亲和素化标签或可被链霉亲和素化标签中任一。
进一步地，所述蛋白标签表达基因选自可被生物素化标签表达基因，所述人乳头瘤病毒病毒样颗粒还携带有生物素连接酶(Biotin Protein Ligase，简称BirA)表达基因和共表达序列，所述可被生物素化标签表达基因与生物素连接酶表达基因通过共表达序列在目的细胞中共表达。
进一步地，所述生物素连接酶用于催化生物素化反应，将生物素连接到可被生物素化标签上。一种实施方式中，所述生物素连接酶表达基因的序列如SEQ ID NO.21所示。
一种实施方式中，所述共表达序列为IRES(内部核糖体进入位点序列)。
一种实施方式中，所述可被生物素化标签为Avi-tag。
进一步地，所述表达载体中还含有表达跨膜蛋白的跨膜蛋白表达基因，以将所述报告基因和/或蛋白标签表达基因跨过细胞膜锚定在目的细胞的细胞膜外表面。
进一步地，所述表达载体上还含有表达具有膜定位功能蛋白的DNA片段，用于识别定位目的细胞的细胞膜。例如信号肽序列。一般地，所述蛋白标签表达基因位于跨膜蛋白的CDS区和其信号肽之间。
一种实施方式中，所述人乳头瘤病毒病毒样颗粒同时携带有报告基因和蛋白标签表达基因。例如所述人乳头瘤病毒病毒样颗粒携带的表达载体含有如SEQ ID NO.11所示。或所述表达载体同时含有SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示序列。
本发明另一方面提供一种特异性识别和/或分离人乳头瘤病毒易感细胞的游离细胞捕获探针，所述游离细胞捕获探针包括：人乳头瘤病毒病毒样颗粒，所述人乳头瘤病毒病毒样颗粒携带有报告基因和/或用于分离目的细胞的蛋白标签表达基因。所述报告基因表达的目的蛋白具有向使用者提供识别信号的能力。
由于病毒样颗粒保留了天然HPV病毒颗粒的空间构象和构象表位，具有特异性的嗜上皮特性和嗜胎儿滋养层细胞特性，因此使用安全，不具有传染性。利用上述游离细胞捕获探针可以特异性的结合胎儿滋养层细胞，通过对滋养层细胞染色体和DNA分析检测，实现产前的筛查和诊断。可以特异性的靶向感染外周血中的胎儿滋养层细胞；可以通过把HPV的L1和L2蛋白的编码基因克隆在任何一个可以高效表达克隆基因的载体。构建表达HPV的L1和L2蛋白的载体为常规的现有技术，如“王文颖等，人乳头状瘤病毒16型结构蛋白L1和L2在大肠埃希菌中的高效表达《中华实验和临床病毒学杂志》1999年13卷4期358页”；“王双，人乳头瘤病毒58型L1和L2壳蛋白的病毒样颗粒自组装研究《吉林大学》2008年R373”；CN201210328584.6。其表达载体可以选择任何一个可以高效表达克隆基因的载体，如pFastBacTM1(Invitrogen公司)、pFastBacTMHTA(Invitrogen公司)、pFastBacTMHTB(Invitrogen公司)、pFastBacTMHTC(Invitrogen公司)、pFastBacTMDual(Invitrogen公司)、pRSETB，把HPV的L1和L2蛋白的编码基因克隆在表达载体的重组表达载体技术均可按照常规分子克隆方法构建。也可以商业化买到现成的表达HPV的L1和L2蛋白的载体，如质粒p16L1L2、p18sheLL(Addgene)，pVITRO-HPV16L1L2质粒载体。
进一步地，所述人乳头瘤病毒易感细胞选自胎儿滋养层细胞或上皮组织来源肿瘤细胞
进一步地，所述报告基因和/或蛋白标签表达基因位于表达载体上，人乳头瘤病毒病毒样颗粒携带有所述表达载体。所述表达载体可以是任何适合报告基因表达的载体，例如，所述表达载体为细菌质粒或病毒基因组。于一实施例中，所述表达载体包裹于病毒样颗粒中。
进一步地，所述表达载体还包含有适用于在哺乳动物细胞表达的启动子。
较佳地，所述启动子选自CMV，SV40，EF1a，PGK1，Ubc，human beta actin，CAG中任一，更优选为CMV或SV40。
进一步地，所述报告基因为可以表达各类荧光蛋白、荧光素酶、抗生素抗性蛋白或者各种特异性膜蛋白受体的基因。所述报告基因的主要作用是为了向检测者提供信号，因此只要是具备此种功能的基因都可。
进一步地，所述蛋白标签选自HA-tag、Flag、His、GST、MBP、His-MBP、Myc、His-Myc、sumo、His-sumo、SNAP-tag、halo-tag、可被生物素化标签、可被亲和素化标签或可被链霉亲和素化标签中任一。
进一步地，所述蛋白标签表达基因选自可被生物素化标签表达基因，所述可被生物素化标签表达基因与生物素连接酶表达基因通过共表达序列在目的细胞中共表达。
进一步地，所述生物素连接酶(Biotin Protein Ligase，简称BirA)用于催化生物素化反应，将生物素连接到可被生物素化标签上。一种实施方式中，所述生物素连接酶表达基因的序列如SEQ ID NO.21所示。
一种实施方式中，所述共表达序列为IRES(内部核糖体进入位点序列)。
一种实施方式中，所述可被生物素化标签为Avi-tag。
其主要目的是为了方便检测者分离目的细胞。本领域技术人员可以根据现有技术可以设计合适的基因片段，如Irwin Chen等，利用生物素连接酶用生物物理探针标记细胞表面蛋白：《自然方法》2005年2期2卷99-104页。
进一步地，所述表达载体中还含有表达跨膜蛋白的跨膜蛋白表达基因，所述跨膜蛋白表达基因与所述报告基因和/或蛋白标签表达基因融合表达，以将所述报告基因和/或蛋白标签表达基因跨过细胞膜在目的细胞的细胞膜外表面表达。
较佳地，所述表达载体上含有表达具有膜定位功能DNA片段。用于识别定位目的细胞的细胞膜位置。例如信号肽，具有把蛋白质引导到细胞含不同膜结构的亚细胞器内的功能。本领域技术人员根据现有技术可以设计合适的目的基因。如“Linsley PS等，B细胞活化抗原B7与CD28结合可促进T细胞增殖和白细胞介素2mRNA的积累：《实验医学期刊》”1991年第173期第3卷721-730页。
进一步地，人乳头瘤病毒病毒样颗粒携带的表达载体含有如SEQ ID NO.11所示序列。或所述表达载体同时含有SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示序列。
进一步地，所述游离细胞捕获探针用于识别和/或分离血液样品中的人乳头瘤病毒易感细胞。
进一步地，所述血液样品为外周血样品。
进一步地，血液样品可以是哺乳动物来源的，所述哺乳动物可以为人，如孕妇，也可以是肿瘤/疑似肿瘤患者。
本发明的另一方面提供了一种用于识别和/或分离人乳头瘤病毒易感细胞的产品，所述产品含有上述游离细胞捕获探针。
进一步地，所述人乳头瘤病毒易感细胞选自胎儿滋养层细胞或上皮组织来源肿瘤细胞。
本发明的另一方面提供了上述游离细胞捕获探针在制备用于识别和/或分离人乳头瘤病毒易感细胞产品中的用途。
进一步地，所述人乳头瘤病毒易感细胞选自胎儿滋养层细胞或上皮组织来源肿瘤细胞。
本发明的另一方面提供了一种检测人乳头瘤病毒易感细胞的方法，所述方法包括：
1)用上述游离细胞捕获探针转染含有待检测细胞的样品；
2)继续培养，检测报告基因释放的信号。
本领域技术人员可根据检查的信号进而判断样品中是否含有胎儿滋养层细胞或上皮组织来源肿瘤细胞。
进一步地，所述人乳头瘤病毒易感细胞选自胎儿滋养层细胞或上皮组织来源肿瘤细胞。
本发明的另一方提供了一种分离人乳头瘤病毒易感细胞的方法,所述方法包括：
1)用上述游离细胞捕获探针转染含有待检测细胞的样品；
2)继续培养，
3)分离目的细胞。
进一步地，所述人乳头瘤病毒易感细胞选自胎儿滋养层细胞或上皮组织来源肿瘤细胞。
采用适当的方法是指根据报告基因的形式不同而采取适合的分离方法，达到有效的分离目的。本领域技术人员知晓关于不同报告基因的分离方法。
较佳地，所述步骤1)中待检测样品为经过预处理的血样样品，所述预处理是指去除样品中绝大部分血细胞。
进一步地，所述游离细胞捕获探针转染至目的细胞后，在目的细胞的细胞膜外表面表达蛋白标签，通过蛋白标签分离目的细胞或者通过能与报告蛋白结合的抗体分离目的细胞。
进一步地，所述蛋白标签选自可被生物素化标签，所述游离细胞捕获探针在目的细胞的细胞膜外表面和细胞内共表达可被生物素化标签和生物素连接酶。
进一步地，步骤(3)中添加生物素，通过亲和素或亲和链霉素免疫磁珠分离目的细胞。
如上所述，本发明的特异性标记孕妇血液中胎儿滋养层细胞的游离细胞捕获探针，具有以下有益效果：
由于游离细胞捕获探针对外周血中的胎儿滋养层细胞可以特异性结合，而不与其他血细胞结合，采用本申请中的游离细胞捕获探针，可以有效的捕获孕妇血液内的胎儿滋养层细胞。因此，可以对胎儿滋养层细胞进行有效的标记和进一步的分离。
同样，利用HPV的嗜上皮组织来源细胞的特性，对肿瘤患者，如果是上皮组织来源的恶性肿瘤(绝大多数的恶性肿瘤均为上皮组织来源)，本发明的游离细胞捕获探针同样具有特异性的识别能力，通过对检测者外周血液中循环肿瘤细胞的检测分析，可以对其疾病进行有效的检测和评估。
附图说明
图1显示为本发明中的游离细胞捕获探针的基本结构示意图。
图2显示为本发明中的表达载体的结构示意图。
图3显示为本发明中游离细胞捕获探针在细胞膜上表达的局部结构示意图。
图4显示为实施例2中用聚焦显微镜对转染后的细胞拍照图片。
图5显示为实施例3中用聚焦显微镜拍摄的经处理后5位怀男婴的孕妇血液中滋养层细胞的照片。
图6显示为实施例4中母体血液中胎儿滋养层细胞的捕获数量与孕周关系图。
图7显示为实施例4中母体血液中胎儿滋养层细胞的捕获数量与孕妇怀孕次数关系图。
图8显示为实施例4中母体血液中胎儿滋养层细胞的捕获数量与生育史关系图。
图9显示为实施例5中生物素标记的三代游离细胞捕获探针中表达载体结构图。
图10显示为实施例5中生物素标记的三代游离细胞捕获探针与其在目的细胞膜上表达的局部结构示意图。
图11显示为通过固定染色后，画出的该受试者的分离出来的胎儿滋养层细胞的核型图
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1制备具有显示绿色荧光蛋白功能的游离细胞捕获探针
1.向27ml的DMEM-10培养基(含10％的胎牛血清的DMEM培养基)中加入3ml的胎牛血清(FBS)；使其变成DMEM-20培养基，加入到225cm2的玻璃培养瓶(flask)中。
2.把加入培养基的flask松盖后，放在37℃细胞培养箱中平衡15min；把冻存的293FT细胞(上海匹拓生物科技有限公司)在37℃水浴锅中迅速解冻。
3.把解冻好的293FT细胞，加入到步骤2中平衡好培养基的flask中，培养2-3天待细胞长满。
4.用1-2ml的胰酶洗细胞1次，再加入1-2ml的胰酶放回37℃细胞培养箱放置7min，用9ml的DMEM-10中和胰酶。
5.2-5×106个细胞分管冻存，按长满flask细胞的1:15传代，每2天传代一次继续培养。
6.以7.5×106个细胞加20ml的DMEM-20铺在新的flask中，培养过夜。
7.分别取2支5ml的硅化管，一支加80μl的lip2000和2ml的optiMEM培养基，轻轻吹打使其混合均匀；另一支加19μl的P16L1L2(addgene，Schiller Lab，USA NCI；ChristopherB.Buck et al.，J.Virol.82(11)：5190-5197(2008))，P18sheLL(addgene，Roberts JN,NatMed.2007Jul；13(7):857-61.)和19μl的pClneoEGFP质粒(addgene，Buck CB,ThompsonCD.Curr Protoc Cell Biol.2007Dec；Chapter 26:Unit 26.1.))，再加2ml的optiMEM培养基，轻轻吹打使其混合均匀；两支管同时静置15min。
8.把静置后的两支管中液体混合后，轻轻吹打使其混合均匀，再放置25min。
9.把步骤8静置后的混合质粒加入到步骤6的细胞中后，继续放回细胞培养箱培养6h。
10.去除上清，加20ml预热后的DMEM-10培养基，继续培养2d。
11.用4ml的DMEM-10培养基清洗15ml的离心管(硅化管)；用胰酶消化细胞7min，因细胞飘的有些多，把培养液一起收集到离心管中。
12.把细胞收集到15ml的离心管中，4℃离心200g×10min。
13.用0.5ml的DPBS-Mg清洗1.5ml的离心管后(硅化管)，弃步骤12离心后的上清，用DPBS-Mg重悬细胞。把重悬液转移到1.5ml的离心管中，4℃离心200g×10min。
14.步骤13重复一次后去除上清。
15.把另一个相同的离心管中加入与细胞球高度相同的培养液，测量培养液的体积预估细胞球的体积(225cm2的培养瓶一般可收集60-80μl的细胞球)。
16.得到约80μl的细胞，加120μl的DPBS-Mg重新悬浮细胞，使细胞重悬液的浓度为100×106个细胞/ml(较低浓度的细胞会降低衣壳蛋白的纯度)。
17.向步骤16的细胞重悬液中加入7μl的10％的Brij-58，使Brij-58的终浓度≈0.035％。
18.加入1μl的Rnase A/T(5Rnase A nuits)到步骤17的混合液中。
19.把步骤18的混合液放在37℃细胞培养箱24h，使衣壳蛋白成熟。
20.待衣壳蛋白成熟以后，冰上放置10min预冷后，4℃离心500g×10min。
21.离心后的上清即为制备好的游离细胞捕获探针，以20μl每管分管后，放到-80℃冰箱冻存待用。
如图1所示，为我们构建的一代游离细胞捕获探针的示意图，在母体血细胞中，HPV病毒的L1L2的衣壳蛋白，可以靶向带领探针精确地找到胎儿滋养层细胞；携带有报告基因的表达质粒，可以把被感染的细胞标识出来。
实施例2制备具有细胞表面定位功能的绿色荧光蛋白游离细胞捕获探针1.以质粒以人肝细胞cDNA为模板，以表1中的引物1为引物，以表2，表3为反应体系和反应程序，通过PCR反应扩增出SMIM1基因除去胞内部分1-40号氨基酸残基加N端信号肽的DNA序列。
表1
表2
混合引物 1μl
2×SYBR mix 10μl
人肝脏cDNA 1μl
灭菌水 8μl
表3
2.以质粒pClneoEGFP为模板，以表1中的引物2为引物，以表4，表5为反应体系和反应程序，通过PCR反应扩增出EGFP基因去终止密码子的DNA序列。
表4
混合引物 1μl
2×SYBR mix 10μl
PclneoEGFP质粒 0.5μl
灭菌水 8.5μl
表5
EGFP(SEQ ID NO.7)：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
3.以步骤1和2的PCR产物为模板，表1中的引物3为引物，以表6，表7为反应体系和反应程序，通过PCR反应扩增出EGFP-SMIM1的融合序列。
表6
表7
EGFP-SMIM1(SEQ ID NO.8):
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGCTGTGCACGGGCAAGCTGGGCATCGCCATGAAGGTGCTGGGCGGCGTGGCCCTCTTCTGGATCATCTTCATCCTGGGCTACCTCACAGGCTACTATGTGCACAAGTGCAAATAA
4.分别使用NheI和EcoRI限制性内切酶把质粒PclneoEGFP和步骤3扩增出的融合片段切出粘末端，再通过T4连接酶将两个片段链接。
5.转染大肠杆菌，涂板，挑菌斑，摇菌，抽质粒并送样测序，序列与EGFP-SMIM1一致的作为实例1的游离细胞捕获探针的表达质粒，用于完整游离细胞捕获探针的制备。
a)步骤5产生的表达质粒用于转染培养的293FT细胞(293细胞用加10％的胎牛血清的DMEM培养基培养，转染前24h以1×105个细胞每孔6孔板铺板)。
b)转染后，用无血清的optiMEM培养基继续培养6h后，去除上清，加2ml的含10％的胎牛血清的DMEM培养基继续培养细胞48h，去除上清后用1ml的DPBS清洗3次，再用4％的多聚甲醛固定细胞30min。再用1ml的DPBS清洗3次后，用兔多克隆抗EGFP一抗孵育1h(抗体用DPBS稀释至1:1000)，孵育后，用DPBS清洗细胞3次，再用红色的二抗孵育1h(二抗被DPBS稀释至1:1000)。以转染正常PclneoEGFP质粒的细胞做对照组。
c)用共聚焦显微镜拍照结果如图4。
实例结果说明：
图2显示为表达载体基本结构示意图，图3显示融合蛋白表达成跨膜蛋白的局部结构示意图，图4中A为经我们设计构建的，用融合表达SMIM1和EGFP的质粒转染细胞，转染后的细胞用EGFP抗体免疫荧光染色以后，拍照得到的照片；B为相同方法处理的对照组照片。表1中引物画线序列为限制性内切酶的酶切位点，加黑部分为kozak序列。
与传统方法相比，我们的方法可以使细胞膜表面有固定的EGFP表达。可以通过融合表达，在特定的位置观察某种特定的蛋白的生物特征；同样，也可以通过把跨膜蛋白的胞外部分换成特定HA标签，分离标记的细胞。因为跨膜蛋白的信号肽可以把目的蛋白带到细胞膜上，跨膜蛋白的跨膜结构域为融合蛋白的跨膜区域，所以该结构不仅可以把融合表达特定HA标签的EGFP带到细胞膜膜上，还可以使其跨膜表达在细胞膜表面，从而通过免疫磁珠法捕获并分离特定细胞。
.步骤5所制备的具有细胞膜表面定位和分离功能的EGFP表达质粒，作为实例1的游离细胞捕获探针的表达质粒，用于完整游离细胞捕获探针的制备。代替实施例1步骤3中的pCIneoEGFP质粒，其余步骤同实施例1。
所得的游离细胞捕获探针可以特异性的感染外周血中的胎儿滋养层细胞，并且在胎儿滋养层细胞表面表达EGFP，便于细胞的分离。
实施例3游离细胞捕获探针标记孕妇外周血中的胎儿滋养层细胞
1.用EDTA抗凝管，分别从5位怀孕12周的怀男婴和5位怀孕12周的怀女婴的孕妇各抽取10ml的血液；再从5位未孕女性各抽取10ml的血液，取1×103的上皮组织来源的癌细胞(女性宫颈癌细胞系)，混入这5位未孕女性的血液中；分别取5位男性血液各10ml取1×103的上皮组织来源的癌细胞(男性前列腺癌细胞系)；分别用红细胞裂解液与血液体积1:1混合之后,4℃静置10分钟(操作在无菌环境中进行)破红处理；用1ml的DPBS轻轻冲洗3次；
2.分别用200μl在37℃细胞培养箱放置30min的，含10％的胎牛血清的DMEM培养基重悬后，每个样本分别移到96孔板的1个孔中做好标记，在37℃细胞培养箱中培养过夜(24h)；
3.用移液器吸取含有细胞的上层培养液到15ml离心管中，贴壁细胞用胰蛋白酶消化3min后转入同一离心管中，500g离心10min后去上清，用3ml的DPBS缓冲液轻轻吹打均匀，500g离心10min后去上清后，加入200μl胰蛋白酶消化5min，500g离心10min后去上清，用3ml的DPBS缓冲液轻轻吹打均匀，500g离心10min后去上清。
4.以实施例2的质粒为模板，通过PCR的方法把SMIM1的胞外区换成HA-tag，并在其两端加上NheI和EcoRI限制性内切酶的酶切位点，引物如表8，反应体系和反应程序如表9和表10；再分别使用NheI和EcoRI限制性内切酶把PCR产物和质粒切出粘性末端，使用T4连接酶把两个露出粘性末端的片段连接在一起，获得产物序列如SEQ ID NO.13，把连接产物转化大肠杆菌，挑取菌斑摇菌15h后抽提质粒并送样测序，测序正确的质粒即为构建的完整质粒，作为实例1的游离细胞捕获探针的表达质粒，用于完整游离细胞捕获探针的制备。
表8
表9
混合引物 1μl
2×SYBR mix 10μl
实施例2构建质粒 0.5μl
灭菌水 8.5μl
表10
SEQ ID NO.11：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG(此前序列为EGFP去掉终止密码子，此以后HA-tag以前为SMIM1的跨膜区域)CCTCTTCTGGATCATCTTCATCCTGGGCTAC(以后为HA-tag)TACCCATACGATGTTCCAG ATTACGCTTAA。
5.取6μl包装好的装载有膜定位绿色荧光蛋白和HA-tag的HPV假病毒，加入到120μl的DPBS缓冲液中备用；
6.取110μl稀释好的HPV假病毒与2.2ml的无血清DMEM培养基一起加到5ml的离心管中，轻轻吹打使其混合均匀；
7.把步骤6的混合液依次取100μl分别加入到步骤3处理好的细胞中轻轻吹打均匀，37℃细胞培养箱孵育24h，再分别加入100μl含10％的胎牛血清的DMEM培养基继续培养24h；
8.通过流式细胞仪分选出表达绿色荧光蛋白的细胞做成涂片，用50μl的4％的多聚甲醛固定30min；取出多聚甲醛后用100μl的DPBS缓冲液轻轻冲洗3次；
9.按性别决定基因SRY的特异性抗体的使用说明书处理细胞，并用红色的二抗处理后，用100μl的PBS缓冲液轻轻冲洗3次；
10.如表11是对应怀12周男婴孕妇的基本信息，图5是通过共聚焦显微镜拍摄的5位怀男婴的孕妇血液，经以上步骤处理后的照片，所有游离细胞捕获探针标记的细胞与所有含有性别决定基因的男性细胞重合，从而确定所有游离细胞捕获探针标记的细胞都是胎儿滋养层细胞。
表11
本实例选用怀孕12周女婴的孕妇血细胞，因其含有胎儿滋养层细胞不含男性细胞，作为雄性性别决定基因SRY的阴性对照，确定SRY抗体特异性的免疫荧光染色不会给女性细胞着色，从而排除后面结果中母体细胞的干扰；选用含有性别决定基因SRY却不含上皮细胞的男性血液，作为游离细胞捕获探针标记上皮细胞的阴性对照，从而确定血液中没有上皮组织来源的细胞，排除血细胞对检测结果的干扰，另外男性血细胞含有雄性性别决定基因SRY，也作为性别决定基因SRY的阳性对照；用上皮组织来源的癌细胞与未婚女性血细胞混合，做游离细胞捕获探针标记上皮细胞的阳性对照，判定游离细胞捕获探针特异性标记上皮组织来源的细胞。
结果显示：在怀12周女婴的孕妇血细胞组，经以上处理后涂片上的细胞，细胞只发绿色荧光，没有细胞发红色荧光；在怀12周男婴的孕妇血细胞组，经以上处理后涂片上的细胞，发绿色荧光与红色荧光的细胞完全重合；在加上皮组织来源的癌细胞的未孕女性血细胞组，经以上处理后图片上的细胞，细胞只发绿色荧光，没有细胞发红色荧光(若选男性来源的癌细胞，则发绿色荧光与红色荧光的细胞完全重合)；在男性血细胞组，经以上处理后图片上的细胞，细胞只发红色荧光，没有细胞发绿色荧光。从而确定本实例中所有被游离细胞捕获探针标记的细胞都是上皮组织来源的，因在孕妇血液中上皮组织来源的细胞只有胎儿滋养层细胞，所以孕妇血液中所有被游离细胞捕获探针标记的细胞都是胎儿滋养层细胞。
实施例4通过HA-tag标记分离孕妇外周血中胎儿滋养层细胞
1.用EDTA抗凝管从15位分别怀孕10-13周的孕妇抽取10ml的血液，分别用红细胞裂解液与血液体积1:1混合之后,4℃静置10分钟(操作在无菌环境中进行)；用1ml的DPBS轻轻冲洗3次；
2.用200μl在37℃细胞培养箱放置30min的，含10％的胎牛血清的DMEM培养基重悬后，分别移到96孔板的15个孔中做好标记在37℃细胞培养箱中培养过夜(22h)；
3.用移液器吸取含有细胞的上层培养液到15ml离心管中，贴壁细胞用胰蛋白酶消化3min后转入同一离心管中，500g离心10min后去上清，用3ml的DPBS缓冲液轻轻吹打均匀，500g离心10min后去上清后，加入200μl胰蛋白酶消化5min，500g离心10min后去上清，用3ml的DPBS缓冲液轻轻吹打均匀，500g离心10min后去上清。
4.取5μl实施例3制备好的可以表达膜定位绿色荧光蛋白及HA-tag的游离细胞捕获探针，加入到100μl的DPBS缓冲液中备用；
5.取80μl稀释好的游离细胞捕获探针与1.6ml的无血清DMEM培养基一起加到2ml的离心管中，轻轻吹打使其混合均匀；
6.把步骤5的混合液分别取100μl依次加入到步骤3处理好的15份细胞中轻轻吹打均匀，37℃细胞培养箱孵育24h，再加入100μl含10％的胎牛血清的DMEM培养基继续培养24h；
7.用移液枪轻柔吹打重悬Anti-HA标签免疫磁珠，分别转移50μL免疫磁珠到15个新的离心管中；
8.分别加入1ml TBST缓冲液，用移液枪轻柔吹打重悬免疫磁珠，磁力架上静置实现磁液分离后，移除上清，重复上述步骤2次；
9.分别把步骤6的细胞用胰蛋白酶消化以后，用500μl的TBST缓冲液重悬，加入到步骤8的免疫磁珠中做好标记，室温旋转混匀孵育2小时或者4℃条件下过夜；
10.重复洗涤大约3次，直到洗涤后的上清液中OD280小于0.05为止；
11.分别做好标记把细胞洗脱到对应的离心管中并收集，分别对这些细胞计数统计，如表12是孕妇的基本信息及对应的收集的胎儿滋养层细胞数。图6-图8分别是10ml母体血液中胎儿滋养层细胞的捕获数量与孕周、孕妇怀孕次数和生育史等参数的关系。
表12
结果显示：通过游离细胞捕获探针可以有效标记并分离孕妇外周血中的胎儿滋养层细胞，所得细胞数量与孕妇的年龄、怀孕次数和生育史等参数无关系。
实施例5生物素标记的三代游离细胞捕获探针的制备及应用
1.以人肝组织的cDNA为模板，以表13的引物1为引物，通过PCR把SMIM1的胞外部分换成Avi-Tag反应体系和反应程序如表14，表15所示，并在SMIM1的C端加上NheI限制性内切酶的酶切位点。
SMIM1(SEQ ID NO.12):
AGGCCCGGCCCCTGCGGAGCCCAGAGACGCGGGGACACAGGTGAGGCGCGCGGGGTCCGGGCTGCGGCTTCCCGGTGCGGCCGCAGTGGGCAGGCTCGAGGCGTCTGCCGCACCTCAGCCCACGACCTGCCCCGCTGGGAGGTGCGGGCCGCTGGCCAGGCCCTGACCGCAACCTGGCCCAGAGGCCCCAGCCCTCAGGCAAGGTTCTCCGGTGAAGCCACAGCCTGGCCACCTGTCTTGATCTCCCCACCGAGAAGGCCCCGCCCCTCCCGCTGCAGCCCCACAGCATGCAGCCCCAGGAGAGCCACGTCCACTATAGTAGGTGGGAGGACGGCAGCAGGGACGGAGTCAGCCTAGGGGCTGTGTCCAGCACAGAAGAGGCCTCACGCTGCCGCAGGATCTCCCAGAGGCTGTGCACGGGCAAGCTGGGCATCGCCATGAAGGTGCTGGGCGGCGTGGCCCTCTTCTGGATCATCTTCATCCTGGGCTACCTCACAGGCTACTATGTGCACAAGTGCAAATAAATGCTGCCCCGCATGCACGCGGGGGGCTGGCCGCA
SMIM1-Avi-tag(SEQ ID NO.13):
ATGCAGCCCCAGGAGAGCCACGTCCACTATAGTAGGTGGGAGGACGGCAGCAGGGACGGAGTCAGCCTAGGGGCTGTGTCCAGCACAGAAGAGGCCTCACGCTGCCGCAGGATCTCCCAGAGGCTGTGCACGGGCAAGCTGGGCATCGCCATGAAGGTGCTGGGCGGCGTGGCCCTCTTCTGGATCATCTTCATCCTGGGC(此前为SMIM1的胞内及跨膜部分此后为Avi-tag)GGCCTGAATGACATCTTTGAGGCCCAGAAGATCGAGTGGCATGAGTAA
2.以大肠杆菌DNA为模板，分别以表13的引物2和引物3为引物，通过PCR扩增出IRES(内部核糖体进入位点序列)和BirA(生物素连接酶)序列，并在IRES序列的C端加上Avi-Tag，在IRES序列的N端和BirA序列的C端加上限制性内切酶BamH1的酶切位点，BirA的N端加上限制性内切酶EcoRI的酶切位点，反应体系和反应程序如表16，表17所示。
表13
Avi-Tag(SEQ ID NO.20)
ATGGGCCTGAATGACATCTTTGAGGCCCAGAAGATCGAGTGGCATGAGTAA
BirA(SEQ ID NO.21):
ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCGGTTATGGTGTTCAATGCTTTGCGAGATACCCAGATCATATGAAACAGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCTGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAATAA
表14
引物探针 0.5μl
2×SYBR mix 10μl
人肝脏cDNA 1μl
灭菌水 8.5μl
表15
表16
引物探针 0.5μl
2×SYBR mix 10μl
大肠杆菌DNA 0.5μl
灭菌水 9μl
表17
3.用限制性内切酶BamHI，酶切步骤2得到的两个扩增产物，胶回收后再用T4连接酶连接其粘性末端，再通过胶回收得到连接产物(比1500bp稍微小一点的片段为连接正确的片段)。
4.以步骤3的胶回收产物为模板，以表13的引物2的上游引物和引物3的下游引物为引物，PCR后胶回收PCR产物。
5.再以步骤1和步骤4的产物为模板，分别以表13的引物1的上游引物和引物3的下游引物为引物，通过PCR扩增出出序列如SEQ ID NO.24所示，其表达的蛋白结构如图10。
6.分别使用NheI和EcoRI限制性内切酶把质粒PclneoEGFP和步骤5扩增的片段切出粘性末短。
7.再通过T4连接酶把两个片段链接起来，把连接产物转化大肠杆菌，挑取菌斑摇菌15h后抽提质粒并送样测序，测序正确的质粒即为构建的完整质粒，作为实例1的游离细胞捕获探针的表达质粒，用于完整三代游离细胞捕获探针(如图9所示)制备。
SEQ ID NO.22：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG(此前序列为EGFP去掉终止密码子，此以后Avi-tag以前为SMIM1的跨膜区域)CTGTGCACGGGCAAGCTGGGCATCGCCATGAAGGTGCTGGGCGGCGTGGCCCTCTTCTGGATCATCTTCATCCTGGGCTAC(以后为Avi-tag)GGCCTGAATGACATCTTTGAGGCCCAGAAGATCGAGTGGCATGAGTAA
8.分别取10ml如表18所示的5位孕妇的血，经实施例3的方法分离并培养细胞后，用步骤7得到的HPV假病毒转染细胞，转染过程按施例3的方法。
9.转染后把细胞培养液中加入10μmol/ml的生物素，继续培养48h后去上清，用DPBS缓冲液清洗3次后收集细胞。
10.把收集的细胞通过亲和素免疫磁珠分离，再把分离的细胞通过实施例3的方法鉴定为胎儿滋养层细胞。
表18
如表18为每10ml母体血液中，通过生物素标记分离的胎儿滋养层细胞在培养48h的情况下细胞个数，因生物素与亲和素结合的高度特异性和稳定性，分离的细胞数明显高于通过HA-tag标记分离的细胞数，因此其在细胞分离中会有很好的应用前景。
生物素与亲和素/链霉亲和素的结合具有高度特异性和稳定性，两者的亲和常数比抗原-抗体反应高10-100万倍，是目前已知强度最高的非共价作用，这使得它成为蛋白质生物化学中的一个非常好的工具。然而通过生物素标记分离细胞的方法到目前为止我们还是首次提出。我们通过构建三代游离细胞捕获探针，在IRES的作用下，使得BriA和融合了Avi-tag的细胞膜蛋白SMIM1，在HPV假病毒特异性感染的胎儿滋养层细胞内共表达，使SMIM1在转运到细胞膜之前已经被BirA催化生物素化，从而可以通过生物素与亲和素结合的高度特异性和稳定性分离出胎儿滋养层细胞。
实施例6孕妇外周血分离的胎儿滋养层细胞的核型分析
1.把实施例4分离得到的15例胎儿滋养层细胞固定；
2.染色和后核型分析；
3.受试者中有1例测出21号染色体有三条，结果如图11。
图11为通过固定染色后，画出的该受试者的分离出来的胎儿滋养层细胞的核型图。圆圈标出的位置即为第21号染色体的所在位置，如图所示：与其他染色体相比，该受试者胎儿滋养层细胞的第21号染色体明显多出一条染色。
21三体综合征等染色体疾病严重危害婴儿的生长，为社会和家庭带来了极大的患难，我们的方法在无创的条件下，在第一孕期就可以对胎儿的染色体疾病进行检测，能尽可能的保证受试孕妇生出健康的婴儿，为社会和家庭减轻负担。
实施例7孕妇外周血分离的胎儿滋养层细胞的全基因组测序
我们使用单细胞多次退火环状循环扩增(MALBAC)技术对单个胎儿滋养层细胞的全基因组进行扩增。具体步骤如下：
1.根据MALBAC试剂盒使用说明书，向105μl的Cell Lysis Buffer中加入2.1μl的Cell Lysis Enzyme，轻轻吹打使其混合均匀。
2.每管取4.5μl细胞裂解混合液置于200μl的PCR管中，分别从实施例4分离的15位胎儿的滋养层细胞和实施例3分离的5位胎儿的滋养层细胞中，挑取细胞到细胞裂解混合液中做好标记，用食指轻轻弹管壁10次左右后离心。
3.将步骤2中的混合液，在预热后的PCR仪中按50℃50min和80℃10min的步骤孵育。
4.向630μl的Pre-Amp Buffer中加入21μl的Pre-Amp Enzyme Mix，轻轻吹打使其混合均匀。
5.分别取30μl步骤4的混合液加入到步骤3孵育后的PCR管中，按表19的步骤进行预扩增。
表19
6.向630μl的Amplification Buffer中加入16.8μl的Amp Enzyme Mix，轻轻吹打使其混合均匀。
7.以每管30μl分别加入到步骤5扩增后的反应体系中，按表20的步骤行扩增。
表20
实施例8结直肠癌患者外周血中的循环肿瘤细胞的分离
1用EDTA抗凝管从4例确诊结直肠癌患者分别抽取10ml的血液，分别用红细胞裂解液与血液体积1∶1混合之后，4℃静置10分钟(操作在无菌环境中进行)；用1ml的DPBS轻轻冲洗3次；
2.其余步骤同实施例4标记并分离细胞。
3.病人的基本信息和分离细胞情况如表21所示。
表21
患者编号 病理分期 接受手术状况 分离的细胞个数 细胞纯度 活细胞
1 IIb期 术后4个月 148 100％ 是
2 IIa期 术后12个月 89 100％ 是
3 IIIa期 术后6个月 265 100％ 是
4 IIa期 未手术 32 100％ 是
结直肠癌在诊断过程中不仅需要影像学数据，对一些早期和有远端转移的患者，甚至需要通过手术取样再通过病理检测才能确定肿瘤的良恶性和原发灶。不仅耗时耗力，也给患者带来巨大的身体和精神损害。尤其对那些经手术切除的患者，判断其是否复发更是必须经过多项检查，待确定的参数发生变化才能确诊，这个时候复发灶已经形成了一定的规模，大大地增加了医疗难度和缩短了患者的生存时间。通过血液检查就可以判断肿瘤的良恶性、原发灶或是否已复发，是肿瘤诊断的理想状态。但是这种检查需要极高的灵敏度和特异性，才能准确地从大量的血细胞中分离出极少数的肿瘤细胞。目前有许多方法用于检测循环肿瘤细胞，但是由于其诊断探针的灵敏度和特异性不够高，都不能成功应用于临床诊断。
如表21所示，我们的探针不受肿瘤分期和是否接受过手术治疗等参数的影响，能精确地从结直肠癌患者的血液中分离出癌细胞，而且分离出的是活细胞，不仅可以用于肿瘤的诊断，也可以通短时间的细胞培养得到大量的肿瘤细胞。这些细胞不仅可以通过二代测序等方法，检测病人的基因突变状况从而确定其接受靶向治疗的状况，还可以通过细胞的药物试验对用药剂量进行进一步研究，从而达到精准治疗的目的。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 沈剑萍
<120> 一种游离细胞标记及分离探针及其相关产品和用途
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgtgcacgg gcaagctggg 20
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaattcctg cggccagccc cccgcgt 27
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggctagccac catggatgag taaaggagaa gaact 35
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttgtatagt tcatccatgc c 21
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggctagccac catggatgag taaaggagaa gaact 35
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggaattctta ctgcggccag ccccccgcgt 30
<210> 7
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 8
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagctg 720
tgcacgggca agctgggcat cgccatgaag gtgctgggcg gcgtggccct cttctggatc 780
atcttcatcc tgggctacct cacaggctac tatgtgcaca agtgcaaata a 831
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggctagccac catggatgag taaaggagaa gaact 35
<210> 10
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggaattccag cgtaatctgg aacatcgtat gggtagccca ggatgaagat gat 53
<210> 11
<211> 778
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagcct 720
cttctggatc atcttcatcc tgggctacta cccatacgat gttccagatt acgcttaa 778
<210> 12
<211> 559
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aggcccggcc cctgcggagc ccagagacgc ggggacacag gtgaggcgcg cggggtccgg 60
gctgcggctt cccggtgcgg ccgcagtggg caggctcgag gcgtctgccg cacctcagcc 120
cacgacctgc cccgctggga ggtgcgggcc gctggccagg ccctgaccgc aacctggccc 180
agaggcccca gccctcaggc aaggttctcc ggtgaagcca cagcctggcc acctgtcttg 240
atctccccac cgagaaggcc ccgcccctcc cgctgcagcc ccacagcatg cagccccagg 300
agagccacgt ccactatagt aggtgggagg acggcagcag ggacggagtc agcctagggg 360
ctgtgtccag cacagaagag gcctcacgct gccgcaggat ctcccagagg ctgtgcacgg 420
gcaagctggg catcgccatg aaggtgctgg gcggcgtggc cctcttctgg atcatcttca 480
tcctgggcta cctcacaggc tactatgtgc acaagtgcaa ataaatgctg ccccgcatgc 540
acgcgggggg ctggccgca 559
<210> 13
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgcagcccc aggagagcca cgtccactat agtaggtggg aggacggcag cagggacgga 60
gtcagcctag gggctgtgtc cagcacagaa gaggcctcac gctgccgcag gatctcccag 120
aggctgtgca cgggcaagct gggcatcgcc atgaaggtgc tgggcggcgt ggccctcttc 180
tggatcatct tcatcctggg cggcctgaat gacatctttg aggcccagaa gatcgagtgg 240
catgagtaa 249
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gctagccacc aatgcagccc caggagagcc a 31
<210> 15
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atcctgggct acggcctgaa tgacatcttt gaggcccaga agatcgagtg gcatgag 57
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggcctgaatg acatctttga ggcccagaag atcgagtggc atgaggcccc tctccctccc 60
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggatccggaa aaccacgtcc ccgtgg 26
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggatccacca atgaaggata acaccgtgcc a 31
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaattcacgc atcacgtctt tttatt 26
<210> 20
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atgggcctga atgacatctt tgaggcccag aagatcgagt ggcatgagta a 51
<210> 21
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60
gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120
aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180
gtcactactt tcggttatgg tgttcaatgc tttgcgagat acccagatca tatgaaacag 240
catgactttt tcaagagtgc catgcctgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300
aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360
aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420
ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480
atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540
cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600
ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660
cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataa 717
<210> 22
<211> 846
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagctg 720
tgcacgggca agctgggcat cgccatgaag gtgctgggcg gcgtggccct cttctggatc 780
atcttcatcc tgggctacgg cctgaatgac atctttgagg cccagaagat cgagtggcat 840
gagtaa 846

Claims (29)

1.人乳头瘤病毒病毒样颗粒在制备用于识别和分离人乳头瘤病毒易感细胞的产品中的用途，所述人乳头瘤病毒病毒样颗粒是指HPV病毒中的L1和L2共表达后可自行组装成不含病毒DNA的病毒样颗粒。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述人乳头瘤病毒易感细胞选自胎儿滋养层细胞或上皮组织来源肿瘤细胞。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述产品用于识别和分离血液样品中的人乳头瘤病毒易感细胞。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述血液样品为外周血样品。
5.根据权利要求4 所述的用途，其特征在于：所述外周血来自孕妇或者肿瘤/疑似肿瘤患者。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述人乳头瘤病毒病毒样颗粒携带有报告基因和/或用于分离目的细胞的蛋白标签表达基因。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述报告基因和/或蛋白标签表达基因位于表达载体中，所述人乳头瘤病毒病毒样颗粒携带有所述表达载体。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述报告基因选自荧光蛋白、荧光素酶、抗生素抗性蛋白或者特异性膜蛋白受体的基因中任一。
9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述蛋白标签选自HA-tag、Flag、His、GST、MBP、His-MBP、Myc、His-Myc、Sumo、His-sumo、SNAP-tag、halo-tag、可被生物素化标签、可被亲和素化标签或可被链霉亲和素化标签中任一。
10.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述蛋白标签表达基因选自可被生物素化标签表达基因，所述人乳头瘤病毒病毒样颗粒还携带有生物素连接酶表达基因和共表达序列，所述可被生物素化标签表达基因与生物素连接酶表达基因通过共表达序列在目的细胞中共表达。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，还包括以下特征的任一项或多项：（1）所述生物素连接酶表达基因的序列如SEQ ID NO.21所示；（2）所述共表达序列为IRES；（3）所述可被生物素化标签为Avi-tag。
12.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述表达载体中还含有表达跨膜蛋白的跨膜蛋白表达基因，所述跨膜蛋白表达基因与所述报告基因和/或蛋白标签表达基因融合表 达，以将所述报告基因和/或蛋白标签表达基因跨过细胞膜在目的细胞的细胞膜上或细胞膜外表达。
13.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述表达载体中还含有表达具有膜定位功能蛋白的基因片段，用于识别定位目的细胞的细胞膜位置。
14.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述人乳头瘤病毒病毒样颗粒携带的表达载体中含有如SEQ ID NO.11所示序列，或所述表达载体同时含有SEQ ID NO.21和SEQ IDNO.22 所示序列。
15.一种分离人乳头瘤病毒易感细胞的方法，所述方法包括：
1） 用游离细胞捕获探针转染含有待检测细胞的样品；
2） 继续培养；
3） 分离目的细胞；
所述游离细胞捕获探针包括：人乳头瘤病毒病毒样颗粒，所述人乳头瘤病毒病毒样颗粒携带有报告基因和/或用于分离目的细胞的蛋白标签，所述人乳头瘤病毒病毒样颗粒是指HPV病毒中的L1和L2共表达后可自行组装成不含病毒DNA的病毒样颗粒。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述人乳头瘤病毒易感细胞选自胎儿滋养层细胞或上皮组织来源肿瘤细胞。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述步骤 1）中待检测细胞为经过预处理的血样样品，所述预处理是指去除样品中的血细胞。
18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述游离细胞捕获探针转染至目的细胞后，在目的细胞的细胞膜外表面表达蛋白标签，通过蛋白标签分离目的细胞或者通过能与报告蛋白结合的抗体分离目的细胞。
19.根据权要求18所述的方法，其特征在于：所述蛋白标签选自可被生物素化标签，所述游离细胞捕获探针在目的细胞的细胞膜外表面和细胞内共表达可被生物素化标签和生物素连接酶。
20.根据权要求15所述的方法，其特征在于：步骤3）中添加生物素，通过亲和素或亲和链霉素免疫磁珠分离目的细胞。
21.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述报告基因位和/或蛋白标签表达基因位于表达载体中；所述人乳头瘤病毒病毒样颗粒携带有所述表达载体。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于：所述表达载体还包含适用于在哺乳动物细胞表达的启动子。
23.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述报告基因选自荧光蛋白、荧光素酶、抗生素、抗性蛋白或者特异性膜蛋白受体的基因中任一。
24.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述蛋白标签选自HA-tag、Flag、His、GST、MBP、His-MBP、Myc、His-Myc、Sumo、His-sumo、SNAP-tag、halo-tag、可被生物素化标签、可被亲和素化标签或可被链霉亲和素化标签中任一。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于：所述蛋白标签表达基因选自可被生物素化标签表达基因，所述可被生物素化标签表达基因与生物素连接酶表达基因通过共表达序列在目的细胞中共表达。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于：还包括以下特征的任一项或多项：（1）所述生物素连接酶表达基因的序列如SEQ ID NO.21所示；（2）所述共表达序列为IRES；（3）所述可被生物素化标签为Avi-tag。
27.根据权利要求21所述的方法，其特征在于：所述表达载体中还含有表达跨膜蛋白的跨膜蛋白表达基因，所述跨膜蛋白表达基因与所述报告基因和/或蛋白标签表达基因融合表达，以将所述报告基因和/或蛋白标签表达的蛋白跨过细胞膜锚定在目的细胞的细胞膜外。
28.根据权利要求21所述的方法，其特征在于：所述表达载体中还含有表达具有膜定位功能蛋白的DNA片段，用于识别定位目的细胞的细胞膜。
29.根据权利要求21所述的方法，其特征在于：所述人乳头瘤病毒病毒样颗粒携带的表达载体含有如SEQ ID NO.11所示序列，或所述表达载体同时含有SEQ ID NO.21和SEQ IDNO.22所示序列。
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