CN113880914A - 一种抗肿瘤多肽及其衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗肿瘤多肽,所述抗肿瘤多肽的氨基酸序列为GVLSCASPFCRT(SEQ ID No:1)。该多肽与SIX1具有较好的亲和力,且该多肽及其衍生肽均对癌细胞表现出较高的选择性杀伤作用,因而可作为抗肿瘤药物。本发明为肿瘤药物的开发设计提供了一种新方向。
Description
技术领域
本发明涉及生物药物技术领域,具体涉及一种抗肿瘤多肽及其衍生物。
背景技术
SIX1(Sine Oculis Homeobox Homolog 1,SIX1)促进肿瘤细胞的增殖、促进表皮-间质型转化(EMT)与转移,促进淋巴管生成,抑制肿瘤细胞凋亡。这也提示S1X1可作为一个抗肿瘤治疗的靶点。本发明的目的正是基于以S1X1作为抗肿瘤治疗的靶点进行抗肿瘤药物的开发。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足,本发明提供一种抗肿瘤多肽及其衍生物,所述抗肿瘤多肽是利用噬菌体表面展示肽库(Ph.D.-12TM)对SIX1 蛋白进行筛选得到的与SIX1蛋白具有较好结合力的多肽,实验证明该多肽及其衍生物均表现出很强的选择性杀伤肿瘤细胞系的特点,因而该多肽及其衍生物可作为抗肿瘤药物。
(二)本发明的技术方案包括:
一种抗肿瘤多肽,其具有与SEQ ID No:1所示氨基酸序列 (GVLSCASPFCRT)至少70%以上同源性;优选地,至少具有80%、更优为90%的同源性。
一种抗肿瘤多肽衍生物,其包含上述的抗肿瘤多肽和与其连接的穿膜肽或/和降解肽。
优选地,所述穿膜肽由8-20个精氨酸所组成;优选地,所述穿膜肽为8个精氨酸所组成的序列RRRRRRRR。
优选地,所述降解肽为DP1或DP2;其中DP1的氨基酸序列为 KEFRQKILDRFFE(SEQID No:2),其中DP2的氨基酸序列为GSGSALAPYIP(SEQ ID No:3)。
优选地,所述抗肿瘤多肽衍生物的氨基酸序列为
GVLSCASPFCRTRRRRRRRR(SEQ ID No:6)或者
GVLSCASPFCRT KEFRQKILDRFFERRRRRRRR(SEQ ID No:4)或者
GVLSCASPFCRT GSGSALAPYIPRRRRRRRR(SEQ ID No:5)。
一种核苷酸序列,包括编码SEQ ID No:1所示序列的抗肿瘤多肽或 SEQ ID No:1-6所示序列的多肽衍生物的核苷酸序列。
一种重组表达载体,用于携带和表达上述核苷酸序列。
一种宿主细胞,含有所述的重组表达载体。
(三)有益效果
本发明筛选的如SEQ ID No:1所示序列的多肽与SIX1具有较好的亲和力,且该多肽及其衍生肽均对癌细胞表现出较高的选择性杀伤作用,因而可作为抗肿瘤药物。本发明为肿瘤药物的开发设计提供了一种新方向。鉴于PDP1多肽对肿瘤细胞的高选择性杀伤活性,编码该PDP1多肽及其衍生物的核苷酸序列、用于携带上述核苷酸序列的重组表达载体、用于将该表达载体进行表达的宿主细胞都应可直接或间接作为抗肿瘤的药物。
附图说明
图1为His-SIX1蛋白包被、噬菌体结合与洗脱流程图。
图2为噬菌体展示多肽文库第一轮扩增流程图。
图3为采用M13滴度测定法测定滴度的流程图。
图4为对单个噬菌斑扩增及核酸提取的流程图。
图5为采用HRP标记的M13抗体评估多肽与SIX1亲和力的流程图。
图6为CPP-PDP1对PANC1(人胰腺癌细胞)和HEK293T的毒性实验结果;其中:a-c:CPP-DP1加入3、5、7天对HEK293T(左侧)及 PANC1(右侧)细胞存活率的影响;CPP-DP1:GVLSCASPFCRTRRRRRRRR;e.不同剂量CPP-DP1影响细胞存活的估计边际均值(以细胞系分群);f:不同加药时间影响细胞存活的估计边际均值(以细胞系分群);g:不同剂量CPP-DP1影响细胞存活的估计边际均值(以给药时间分群);其中e-f中上面的线为对HEK293T细胞的毒性估计边际均值,下方曲线对应PANC1细胞的毒性估计边际均值;g中间曲线为对HEK293T细胞的毒性估计边际均值,最下方曲线对应PANC1 细胞的毒性估计边际均值。
图7为DP1-CPP-PDP1对PANC1(人胰腺癌细胞)和HEK293T的毒性实验结果;其中:a-c:DP1-CPP-PDP1加入3、5、7天对HEK293T (左侧)及PANC1(右侧)细胞存活率的影响;DP1-CPP-PDP1: GVLSCASPFCRTKEFRQKILDRFFERRRRRRRR;e.不同剂量 DP1-CPP-PDP1影响细胞存活的估计边际均值(以细胞系分群);f:不同加药时间影响细胞存活的估计边际均值(以细胞系分群);g:不同剂量 DP1-CPP-PDP1影响细胞存活的估计边际均值(以给药时间分群);其中 e-f中上面的线为对HEK293T细胞的毒性估计边际均值,下方曲线对应 PANC1细胞的毒性估计边际均值;g中间曲线为对HEK293T细胞的毒性估计边际均值,最下方曲线对应PANC1细胞的毒性估计边际均值。
图8为DP2-CPP-PDP1对PANC1(人胰腺癌细胞)和HEK293T的毒性实验结果;其中:a-c:DP2-CPP-PDP1加入3、5、7天对HEK293T (左侧)及PANC1(右侧)细胞存活率的影响;DP2-CPP-PDP1: GVLSCASPFCRTGSGSALAPYIPRRRRRRRR;e.不同剂量DP2-CPP-PDP1 影响细胞存活的估计边际均值(以细胞系分群);f:不同加药时间影响细胞存活的估计边际均值(以细胞系分群);g:不同剂量DP2-CPP-PDP1 影响细胞存活的估计边际均值(以给药时间分群);其中e-f中上面的线为对HEK293T细胞的毒性估计边际均值,下方曲线对应PANC1细胞的毒性估计边际均值;g中间曲线为对HEK293T细胞的毒性估计边际均值,最下方曲线对应PANC1细胞的毒性估计边际均值。
具体实施方式
为了更好的解释本发明,以便于理解,下面结合附图,通过具体实施方式,对本发明作详细描述。以下内容包括淘选目标多肽及设计多肽衍生物及活性验证两个部分:
一、采用噬菌体展示技术对SIX1蛋白进行筛选,得到一条与SIX1 蛋白结合较好的多肽,利用表面等离子共振(SPR)技术测定了其中两条多肽PDP1(核苷酸序列为:GVLSCASPFCRT,如SEQ ID No:1所示) 与SIX1的亲和力,PDP1多肽平衡解离常数(KD)为1.87×10-4。淘选目标多肽及其与SIX1结合力测定的方法按照(一)及(二)进行:
(一)、噬菌体展示技术淘选SIX1结合肽
将His(标签)-SIX1蛋白溶于0.1M pH8.6的NaHCO3溶液配制成浓度为100μg/ml靶分子溶液,利用Ph.D.-12TM噬菌体表面展示肽库试剂盒筛选与His-SIX1特异性结合的多肽,并以此推断与SIX1结合的蛋白。方法如下:
(1)His-SIX1蛋白包被、噬菌体结合与洗脱方法
按照图1的步骤包被His-SIX1蛋白,并利用游离靶分子His-SIX1蛋白溶液对结合的噬菌体文库进行洗脱、收集。
(2)第一轮噬菌体文库扩增
按照图2的流程对收集的噬菌体文库洗脱液进行第一轮扩增。
(3)第二轮噬菌体文库扩增
过夜培养的E.coli ER2738宿主菌1:100稀释于20ml LB培养液 (OD6000.5)中,加入收集的洗脱液,恒温摇床37℃,200rpm培养4.5h;第一轮淘选扩增洗脱液进行滴度测定后,以1-2×1011pfu/10μl噬菌体为第二次文库筛选物,再重复第一轮图1与图2的扩增流程,第二轮使用0.5% TBST(TBS+Tween的缩写)洗涤液。
每轮噬菌体文库扩增后收集的洗脱液均可储存于4℃冰箱。
(4)第三轮噬菌体文库扩增
第二轮淘选扩增洗脱液进行滴度测定后,以1-2×1011pfu/10μl噬菌体为第三次文库筛选物,重复第一轮图1与图2的扩增流程,第三轮使用 0.5%TBST洗涤液。
若第三轮噬菌体肽库淘选扩增测序后符合预期,则无需扩增,否则继续进入第四轮扩增。
(5)滴度测定
采用如图3所示的常规M13滴度测定方法测定滴度。感染微生物菌体之前,对噬菌体贮存液进行稀释,保证微生物菌体过量。对未经过第一轮扩增的洗脱液稀释范围101-104,对经过多轮扩增后的淘选洗脱液稀释范围108-1011。每10μl噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度:平板斑数×稀释因子。
(6)结合克隆的特征鉴定
对单个噬菌蓝斑按照图4所示流程扩增并提取核酸,对纯化后的核酸样品进行测序,-96gIII测序引物序列:5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3。
(7)利用HRP标记的M13抗体评估多肽与靶分子的亲和力
按照图5所示的流程,利用HRP标记的M13抗体结合(1)-(6) 步骤获得的一系列多肽,再与靶分子(SIX1蛋白)结合,反应后测定OD405值,评估靶分子亲和力的大小。HRP底物溶液ABTS溶于100ml 50mM 的柠檬酸钠溶液(pH 4.0)中,过滤除菌,4℃贮存。对每个待检测板,于检测步骤前将36μl 30%的H2O2加入21ml ABTS贮液中。清洗使用0.05%的TBST溶液。
(8)生物淘选
利用Biopannning data bank(BDB)http://i.uestc.edu.cn/bdb/index.php数据库筛选去除TUPs(靶非相关肽)。
将Ph.D.-12TM噬菌体表面展示肽库试剂盒淘选出的多肽序列逐一与 BDB数据库中的PSBinder、SABinder、phD7 FASTER、MIMOSCAN、 MIMOBLAST和MIMOSEARCH比对,删除TUPs,初步确认与SIX1结合的多肽。
①PSBinder:筛选所得多肽是否会与聚苯乙烯(培养皿基质)结合。
②SABinder:筛选所得多肽是否会与链霉抗生物素蛋白(培养皿包被)结合。
③ph.D.7FASTER:预测携带来自Ph.D.-7噬菌体表面展示文库的肽噬菌体是否可能生长得更快。
④MIMOSCAN:检查BDB数据库中是否存在于提交的模式匹配的肽。
⑤MIMOBLAST:检查BDB数据库中是否存在与用户提交相同或相似的肽。
⑥MIMOSEARCH:检查是否已经由具有各种目标的其他组获得提交的肽。
通过上述步骤淘选到多肽PDP1(核苷酸序列为:GVLSCASPFCRT,如SEQ ID No:1所示)
(二)、利用OPEN-SPR测定SIX1蛋白与十二肽PDP1体外结合力结合力测定方法如下:
(1)开机准备:点开软件start,待机器停止运转,取出空芯片;
(2)点微量80%异丙醇(IPA),吸耳球吹干,并按ENTER键检测 LED光源;
(3)4℃浸泡于PBS中羧基芯片插入SPR仪器;
(4)1×HEPES流动相以最大流速(150μL/min)流入;
(5)达到信号基线后,上样口注入80%的异丙醇(IPA)或酒精,控制阀推至inject,运行10s转回load排气泡,达到信号基线,缓冲液冲洗样本环并用洗耳球吹入空气排气泡;
(6)低流速(20μL/min)运行30min平衡基线,待基线平稳;注入 200μL 20mM CHAPS缓冲液(NHS:EDC=100:100)激活芯片,用缓冲液或纯化水冲洗样本环并用空气排气泡;平衡基线5-30min,确保相互作用达到稳定状态;
(7)羧基芯片固定样品:注入SIX1蛋白样品,通过对比前后信号确定配体偶联的数量,SIX1蛋白配体固定量最少800pm,如果需要更多 SIX1蛋白配体,可多次注入SIX1配体进行偶联,信号稳定,1×HEPES 缓冲液或纯化水冲洗样本环并吹入空气排气泡,注入200μL乙醇胺封闭液;
(8)由低浓度到高浓度依次流加十二肽PDP1分析物,基线响应值无增加时为最大浓度,记录图谱;
(9)测定完毕,0.01%-0.1%的SDS梯度洗脱芯片,4℃保存备用;
(10)再次测定时无需激活、封闭,待基线平稳即可注入下一与SIX1 蛋白测定十二肽PDP1分析物,由低浓度到高浓度依次作用记录图谱;
(11)利用Open SPR分析软件绘制拟合图,分析KD(结合速率常数), Bmax(最大理论值)及BI(溶剂效率)等数据。
按照上述方法利用OPEN-SPR精确测定SIX1蛋白与PDP1多肽的结合力,结果如表1所示;说明PDP1与SIX1蛋白具有较强结合力。
表1
二、对筛选的多肽PDP1及其衍生肽进行癌细胞毒性测定
(一)、多肽PDP1的衍生物包括:
(1)在PDP1序列(如SEQ ID No:1所示的GVLSCASPFCRT)上加入了8个精氨酸组成的穿膜肽(8个以上精氨酸均可以穿膜,但分子量变大后穿膜效率会下降)并将之命名为CPP-PDP1(如SEQ ID No:6所示的GVLSCASPFCRTRRRRRRRR),其为一种穿膜肽。
(2)在CPP-PDP1序列上连接能使目标蛋白降解的降解肽 (Degradation Peptide,DP),选定的降解肽包括DP1(如SEQ ID No:2 所示的KEFRQKILDRFFE)和DP2(如SEQ ID No:3所示的GSGSALAPYIP),连接后得到如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列 GVLSCASPFCRTKEFRQKILDRFFERRRRRRRR(命名为 DP1-CPP-PDP1)和SEQ ID No:5所示的氨基酸序列GVLSCASPFCRT GSGSALAPYIPRRRRRRRR(命名为DP2-CPP-PDP1)。DP1-CPP-PDP1 和DP2-CPP-PDP1为两条既具有穿膜肽又具有降解肽的多肽。
(二)、利用CCK8法检测细胞毒性,CCK8法检测如下:
(1)利用CCK法对细胞增殖进行测定:培养细胞至60-70%汇合度,加入多肽培养6h以上,加入CCK-8试剂检测细胞增殖:
培养癌细胞至70%汇合度,PBS清洗2次,加入胰蛋白酶消化,细胞悬液离心;细胞计数并稀释至5000-10000个/ml,吸取1ml细胞悬液加于96孔板,外围加PBS溶液(防止蒸发),CO2培养箱37℃培养过夜;细胞汇合度达到60%-70%,每孔加入1μl不同浓度多肽溶液,实验组为修饰多肽,阴性药物组为PDP1十二肽,DMSO组为对照组,处理6h, 12h,24h,每孔加10μl CCK-8溶液,十字混匀孵育2h,酶标仪测定 OD450。
(2)RTCA检测细胞增殖
①网络连接iCELLigence instrument,打开软件并选择new experiment,在工作界面选择Proliferation/Cytotoxicity的方案。
②选择Layout界面,点击高亮待添加信息的孔,选择合适的well property(Sample实验孔,Control对照孔,Unused未采用孔),默认是 Sample实验孔,可以根据实验需要更改Contorl或Unused。一旦实验开始,将无法更改。
③向“cell”栏中添加信息:(Cell type:细胞类型、Cell number:每孔接种的细胞数、Compound name:孔中添加的试剂、药物名称、 Concentration:每孔中添加的试剂、药物浓度)。
④选择Procedure(实验流程)界面,打开相应protocol对应的流程,根据实际需要进行步骤添加/删减或设置。
⑤当金属细胞培养板放置在仪器上时,软件会自动开始扫描培养板,并在message页面显示扫描开始,培养板与仪器连接正常(connections OK)。如某孔的电阻值高于500ohm,则连接有问题。
⑥点击“开始”按钮,开始扫描检测细胞生长情况(软件会首先检测背景值,此时不得移动细胞培养板)。
⑦step 1检测结束自动暂停进入待机(standby)状态,或手动将实验暂停,可向实验孔中添加细胞或其它。点击“开始”按钮继续检测。
⑧点击plate选择Export Experiment info,弹出对话框选择需要导出的信息,点OK确定,即可导出所选择信息。
(三)、数据分析
数据利用IBM SPSS Statistics 20软件包分析,依据实验设计选用t 检验或多因素重复测量方差分析。
(四)、按照上述(二)的步骤测定SEQ ID No:6、SEQ ID No:4、 SEQ ID No:5的多肽对PANC1(人胰腺癌细胞株)的毒性
(1)测定CPP-PDP1(对应序列SEQ ID No:6)对PANC1(人胰腺癌细胞株)和HEK293T的毒性,一共设置了5个剂量,检测了给药3、 5、7天的细胞存活率。
对不同剂量数据进行了三因素重复测量的方差分析,结果如图6所示:CPP-DP1对PANC1(人胰腺癌细胞株)的毒性显著高于对HEK293T 细胞的毒性(p=0.017),且在所用的5种剂量(12.5μM,25μM,50μM, 100μM,150μM)中,最小剂量12.5μM杀伤效果显著低于100与150uM,最大剂量150μM杀伤效果显著高于12.5uM,25uM,50uM;提示CPP-DP1 可选择性杀伤肿瘤细胞系。
(2)测定DP1-CPP-PDP1(对应序列SEQ ID No:4)对PANC1(人胰腺癌细胞株)和HEK293T的毒性,一共设置了5个剂量,检测了给药 3、5、7天的细胞存活率。
对不同剂量数据进行了三因素重复测量的方差分析,结果如图7所示:DP1-CPP-PDP1对PANC1(人胰腺癌细胞株)的毒性显著高于对 HEK293T细胞的毒性(p=0.006),且在所用的5种剂量(12.5μM,25μM, 50μM,100μM,150μM)中,最小剂量12.5μM杀伤效果显著低于50, 100与150μM,最大剂量150μM杀伤效果显著高于12.5uM,25uM,50μM;提DP1-CPP-PDP1可选择性杀伤肿瘤细胞系。
(3)测定DP2-CPP-PDP1(对应序列SEQ ID No:5)对PANC1(人胰腺癌细胞株)和HEK293T的毒性,一共设置了5个剂量,检测了给药 3、5、7天的细胞存活率。
对不同剂量数据进行了三因素重复测量的方差分析,结果如图8所示:DP2-CPP-PDP1对PANC1(人胰腺癌细胞株)的毒性显著高于对 HEK293T细胞的毒性(p=0.003),且在所用的5种剂量(12.5μM,25μM, 50μM,100μM,150μM)中,最小剂量12.5μM杀伤效果显著低于100uM 与150μM,最大剂量150μM杀伤效果显著高于12.5uM,25uM,50μM;同样提示DP2-CPP-PDP1可选择性杀伤肿瘤细胞系。
综上所述,三种多肽均具有选择性杀伤肿瘤细胞的能力,鉴于 DP1-CPP-PDP1和DP2-CPP-PDP1均为CPP-PDP1的衍生物,推测这种选择杀伤性性来源于PDP1多肽而与降解肽无关,故PDP1多肽可直接为间接作为杀伤肿瘤细胞的药物。
此外,鉴于PDP1多肽对肿瘤细胞的高选择性杀伤活性,编码该PDP1 多肽及其衍生物的核苷酸序列、用于携带上述核苷酸序列的重组表达载体、用于将该表达载体进行表达的宿主细胞都应可直接或间接作为抗肿瘤的药物。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 内蒙古农业大学
<120> 一种抗肿瘤多肽及其衍生物
<141> 2021-04-20
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> bacteriophage
<400> 1
Gly Val Leu Ser Cys Ala Ser Pro Phe Cys Arg Thr
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1 5 10
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20 25 30
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Gly Val Leu Ser Cys Ala Ser Pro Phe Cys Arg Thr Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg
20
Claims (8)
1.一种抗肿瘤多肽,其特征在于,所述抗肿瘤多肽具有与SEQ ID No:1所示氨基酸序列(GVLSCASPFCRT)至少70%以上同源性。
2.一种抗肿瘤多肽衍生物,其特征在于,其包含权利要求1所述的抗肿瘤多肽和与其连接的穿膜肽或/和降解肽。
3.根据权利要求2所述的抗肿瘤多肽衍生物,其特征在于,所述穿膜肽由8-20个精氨酸所组成。
4.根据权利要求2所述的抗肿瘤多肽衍生物,其特征在于,所述降解肽为DP1或DP2;其中DP1的氨基酸序列为KEFRQKILDRFFE,其中DP2的氨基酸序列为GSGSALAPYIP。
5.根据权利要求2所述的抗肿瘤多肽衍生物,其特征在于,所述抗肿瘤多肽衍生物的氨基酸序列为如SEQ ID No:4、或SEQ ID No:5或SEQ ID No:6所示序列。
6.一种核苷酸序列,包括编码SEQ ID No:1所示序列的抗肿瘤多肽或SEQ ID No:4-6所示序列的多肽衍生物的核苷酸序列。
7.一种重组表达载体,用于携带和表达权利要求6所述的核苷酸序列中的任意一种。
8.一种宿主细胞,其特征在于,其包含权利要求7所述的重组表达载体中的任意一种。
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2021
- 2021-04-25 CN CN202110446182.5A patent/CN113880914B/zh active Active
Patent Citations (3)
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