CN113874051A - 包含抗tm4sf1抗体的抗体-药物缀合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

描述了抗体‑药物缀合物(ADC)，其包含抗TM4SF1抗体及其抗原结合片段。还描述了所述ADC的使用方法。

Description

包含抗TM4SF1抗体的抗体-药物缀合物及其使用方法
交叉引用
本申请要求2019年2月27日提交的第62/811,411号美国临时申请和2020年1月29日提交的第62/967,377号美国临时申请的权益，所述临时申请中的每一个均通过引用整体并入本文。
背景技术
本领域仍然需要癌症治疗剂，特别是具有可以消退原发性肿瘤以及侵袭性肿瘤细胞和转移的改善的治疗范围的治疗剂。
旨在破坏肿瘤血管的癌症疗法过去由于毒性而在临床试验中失败。实例包括血管破坏剂，如考布他汀(CA4P)。参见，例如，Grisham等人.Clinical trial experience withCA4P anticancer therapy:focus on efficacy,cardiovascular adverse events,andhypertension management.Gynecol Oncol Res Pract.2018；5:1..在II期FALCON研究中，CA4P将总生存期从16.2个月降低到13.6个月，并且有7名患者在接受CA4P治疗时经历了心脏病发作。同上。由于冠心病和中风是导致死亡的主要原因，因此任何血管靶向毒性治疗都可能导致致命毒性的风险。
TM4SF1是一种内皮标志物，在血管生成中具有功能性作用。参见，例如，Shih等人.The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumorangiogenesis.Cancer Res.2009；69(8):3272-7。尽管以前已经考虑过靶向TM4SF1的抗体-药物缀合物，参见，例如，Visintin等人.Novel Anti-TM4SF1 Antibody–Drug Conjugateswith Activity against Tumor Cells and Tumor Vasculature,Mol Cancer Ther 2015(14)(8)1868-1876，但是为了使抗TM4SF1 ADC能够满足作为实体瘤疗法的前景，需要对正常血管，尤其是动脉的毒性降低的TM4SF1靶向ADC。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
发明内容
一个实施方案提供了一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含IgG Fc区，该IgGFc区包含在选自E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、M428和N434的一个或多个位置处的突变；如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含所述在位置N297处的突变。在一些实施方案中，所述在位置N297处的突变包括N297C。在一些实施方案中，所述IgG Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
一个实施方案提供了一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含IgG Fc区，该IgGFc区包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述IgG Fc区进一步包含在选自E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、T356、M428和N434的一个或多个位置处的突变；如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含所述在位置N297处的突变。在一些实施方案中，所述在位置N297处的突变包括N297C。
一个实施方案提供了一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含IgG Fc区，该IgGFc区在位置N297处包含半胱氨酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述IgG Fc区进一步包含在选自E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、M428和N434的一个或多个位置处的突变；如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
在一些实施方案中，所述IgG Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
一个实施方案提供了一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含IgG Fc区，该IgGFc区包含人IgG1 Fc区，该人IgG1 Fc区包含在位置N297处的半胱氨酸残基和在选自E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、M428和N434的一个或多个位置处的突变；如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述IgG Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
一个实施方案提供了一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含IgG Fc区，该IgGFc区在位置N297处包含半胱氨酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的，其中所述抗体-药物缀合物的药物与抗体之比(DAR)大于或等于约1。在一些实施方案中，所述IgG Fc区进一步包含在选自E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、M428和N434的一个或多个位置处的突变；如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述IgG Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
一个实施方案提供了一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含IgG Fc区，该IgGFc区包含在位置N297处的半胱氨酸残基和带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，其中编号是按照Kabat中阐述的EU索引。在一些实施方案中，所述IgG Fc区进一步包含在选自E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、M428和N434的一个或多个位置处的突变；如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述在位置K447之后的一个或多个氨基酸残基独立地选自：赖氨酸、脯氨酸、精氨酸或其任意组合。
在一些实施方案中，所述在位置K447之后的一个或多个氨基酸残基独立地选自：所述赖氨酸和所述脯氨酸。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含所述在位置E233处的突变。在一些实施方案中，所述在位置E233处的突变包括E233P。在一些实施方案中，所述IgGFc区包含所述在位置L234处的突变。在一些实施方案中，所述在位置L234处的突变包括L234A。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含所述在位置L235处的突变。在一些实施方案中，所述在位置L235处的突变包括L235A。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含所述在位置G237处的突变。在一些实施方案中，所述在位置G237处的突变包括G237A。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含所述在位置M252处的突变。在一些实施方案中，所述在位置M252处的突变包括M252Y。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含所述在位置S254处的突变。在一些实施方案中，所述在位置S254处的突变包括S254T。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含所述在位置T256处的突变。在一些实施方案中，所述在位置T256处的突变包括T256E。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含所述在位置M428处的突变。在一些实施方案中，所述在位置M428处的突变包括M428L。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含所述在位置N434处的突变。在一些实施方案中，所述在位置N434处的突变包括N434S或N434A。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含所述在位置T250处的突变。在一些实施方案中，所述在位置T250处的突变包括T250Q。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含所述在位置D265处的突变。在一些实施方案中，所述在位置D265处的突变包括D265A。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含所述在位置K322处的突变。在一些实施方案中，所述在位置K322处的突变包括K322A。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含所述在位置P331处的突变。在一些实施方案中，所述在位置P331处的突变包括P331G。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含T250Q和M428L。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含M428L。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含M428L和N434S。
在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含N434A。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含L234A、L235A和G237A。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含L234A、L235A、G237A和P331G。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含L234A、L235A、G237A、N297C和P331G。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含L234A、L235A、G237A、K322A和P331G。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含E233P、L234A、L235A、G237A和P331G。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含E233P、L234A、L235A、G237A和N297C。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含E233P、L234A、L235A、G237A和N297C。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含L234A、L235A、G237A、N297C、K322A和P331G。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含E233P、L234A、L235A、G237A、D265A、N297C、K322A和P331G。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含E233P、L234A、L235A、G237A、D265A、N297C、K322A和P331G。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含E233P和D265A。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含M252Y、S254T和T256E。在一些实施方案中，所述IgGFc区包含M252Y、S254T、T256E和N297C。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含K322A和P331G，并且其中所述IgG Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述IgG Fc区包含选自SEQ ID No.87-88、135-145和151-153的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IgG Fc区表现出与C1q的结合降低或消除。在一些实施方案中，所述IgG Fc区表现出与Fc受体的结合降低或消除。在一些实施方案中，所述抗TM4SF1抗体表现出降低或消除的ADCC或CDC效应子功能。
一个实施方案提供了一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含人IgG4 Fc区，该人IgG4 Fc区包含在选自S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434、H435和N297的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含所述在位置N297处的突变。在一些实施方案中，所述在位置N297处的突变包括N297C。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
一个实施方案提供了一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含人IgG4 Fc区，该人IgG4 Fc区包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区进一步包含在选自S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434、H435和N297的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含所述在位置N297处的突变。在一些实施方案中，所述在位置N297处的突变包括N297C。
一个实施方案提供了一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含人IgG4 Fc区，该人IgG4 Fc区在位置N297处包含半胱氨酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区进一步包含在选自S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434和H435的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
一个实施方案提供了一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含人IgG4 Fc区，该人IgG4 Fc区包含在位置N297处的半胱氨酸残基和在选自S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434和H435的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
一个实施方案提供了一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含人IgG4 Fc区，该人IgG4 Fc区在位置N297处包含半胱氨酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的，其中所述抗体-药物缀合物的药物与抗体之比(DAR)大于或等于1。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区进一步包含在选自S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434和H435的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
一个实施方案提供了一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含人IgG4 Fc区，该人IgG4 Fc区包含在位置N297处的半胱氨酸残基和带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，其中编号是按照Kabat中阐述的EU索引。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区进一步包含在选自S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434和H435的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述在位置K447之后的一个或多个氨基酸残基独立地选自：赖氨酸、脯氨酸、精氨酸或其任意组合。在一些实施方案中，所述在位置K447之后的一个或多个氨基酸残基独立地选自：所述赖氨酸和所述脯氨酸。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含所述在位置S228处的突变。在一些实施方案中，所述在位置S228处的突变包括S228P。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含所述在位置F234处的突变。在一些实施方案中，所述在位置F234处的突变包括F234A。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含所述在位置L235处的突变。在一些实施方案中，所述在位置L235处的突变包括L235E。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含S228P和L235E。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含S228P、L235E和N297C。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含S228P、F234A、L235E和N297C。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含S228P、L235E和N297C，并且其中所述人IgG4 Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含M428L和N434S。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含在L235和F234处的突变。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含在位置L328、A330和T299处的突变。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含S228P、F234A、L235A、G237A和P238S。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含F243A和V264A。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含S228P和L235A。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含M252Y和M428L；D259I和V308F；或N434S。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含T307Q和N434S；M428L和V308F；Q311V和N434S；H433K和N434F；E258F和V427T；或T256D、Q311V和A378V。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区具有一种或多种以下性质：(i)与C1q的结合降低或消除；(ii)与Fc受体的结合降低或消除；(iii)降低或消除的ADCC或CDC效应子功能。在一些实施方案中，所述包含所述人IgG4 Fc区的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID No.146-150和154-155的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链，其包含CDR3结构域，该CDR3结构域包含与选自SEQ ID NO:8、20、32、44、56、68、80、96、118、119、120或121的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；CDR2结构域，该CDR2结构域包含与选自SEQ ID NO:7、19、31、43、55、67、79、95、116或117的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和CDRl结构域，该CDRl结构域包含与选自SEQ ID NO:6、18、30、42、54、66、78、94或115的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；以及
(b)轻链，其包含CDR3结构域，该CDR3结构域包含与选自SEQ ID NO:14、26、38、50、62、74、86、110或129的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；CDR2结构域，该CDR2结构域包含与选自SEQ ID NO:13、25、37、49、61、73、85、109或128的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和CDRl结构域，该CDRl结构域包含与选自SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72或84、107、108、124、125、126或127的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链包含与SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63、75、90、92、112、114、130或132具有至少75％同一性的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:9、21、33、45、57、69、81、97、99、101、122、131或133具有至少75％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链包含SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63、75、90、92、112、114、130或132所示的序列，并且其中所述轻链可变域包含SEQ ID NO:9、21、33、45、57、69、81、97、99、101、122、131或133所示的序列。在一些实施方案中，所述重链含有包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，所述重链含有包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，所述重链含有包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
在一些实施方案中，所述重链含有包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，所述重链含有包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ IDNO:54所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQID NO:60所示的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，所述重链含有包含SEQ IDNO:68所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQID NO:74所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，所述重链含有包含SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，所述重链含有包含SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:107或SEQ IDNO:108所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
在一些实施方案中，所述重链含有包含SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:107所示的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，所述重链含有包含SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:108所示的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，所述重链含有包含SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:111所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:107所示的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，所述重链含有包含SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:111所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ IDNO:109所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:108所示的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，所述重链含有包含SEQ ID NO:118所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:116所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:115所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:129所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:124所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
在一些实施方案中，所述重链含有包含SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ INNO:120或SEQ ID NO:121所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:116或SEQ IDNO:117所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:115所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:129所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126或SEQ ID NO:127所示的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，所述抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab')2、Fv或scFv。
一个实施方案提供了一种包含修饰的人IgG1 Fc区的抗TM4SF1结合蛋白，其中所述修饰的人IgG1 Fc区包含一个或多个选自E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、M428和N434的氨基酸置换，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的，其中与不包含选自E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、M428和N434的氨基酸置换而在其他方面相同的结合蛋白相比，所述抗TM4SF1结合蛋白展示出改善的血管安全性。在一些实施方案中，所述修饰的人IgG1 Fc区包含在选自T250、M252、S254、T256、M428和N434的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述修饰的人IgG1 Fc区包含选自T250Q、M252Y、S254T、T256E、M428L和N434S的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述修饰的人IgG1 Fc区包含突变T250Q和M428L。在一些实施方案中，所述修饰的人IgG1 Fc区包含突变M252Y、S254T和T256E。在一些实施方案中，所述修饰的人IgG1 Fc区包含突变M428L和N434S。
一个实施方案提供了一种包含修饰的人IgG4 Fc区的抗TM4SF1结合蛋白，其中所述修饰的人IgG4 Fc区包含一个或多个选自S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434、H435和N297的氨基酸置换，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的，其中与不包含选自S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434、H435和N297的氨基酸置换而在其他方面相同的结合蛋白相比，所述抗TM4SF1结合蛋白展示出改善的血管安全性。在一些实施方案中，所述修饰的人IgG4 Fc区包含在选自T250、M428和N434的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述修饰的人IgG4Fc区包含选自T250Q、M428L和N434S的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述修饰的人IgG4 Fc区包含突变T250Q和M428L。在一些实施方案中，所述修饰的人IgG4 Fc区包含M428L和N434S。在一些实施方案中，与包含野生型IgG1 Fc或IgG4 Fc的对照抗TM4SF1结合蛋白相比，所述结合蛋白表现出对FcRn的亲和力增加。在一些实施方案中，所述抗TM4SF1结合蛋白包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段与治疗分子缀合，其中所述治疗分子包括以下至少一种：小分子、降解剂、核酸分子、CRISPR-Cas9基因编辑系统和脂质纳米颗粒，或其任意组合。
一个实施方案提供了一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其所述抗原结合片段包含人IgG1 Fc区，该人IgG1 Fc区包含在选自T250、M252、S254、T256、M428和N434的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区包含选自T250Q、M252Y、S254T、T256E、M428L和N434S的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区包含在位置T250和M428处的突变。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区包含突变T250Q和M428L。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区包含在位置M252、S254和T256处的突变。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区包含突变M252Y、S254T和T256E。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区包含在位置M428和N434处的突变。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区包含突变M428L和N434S。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区进一步包含在位置N297处的突变。在一些实施方案中，所述在位置N297处的突变是N297C。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区进一步包含在选自E233、L234、L235、G237、D265、N297、K322和P331的一个或多个位置处的突变；如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区包含选自E233P、L234A、L235A、G237A、D265A、N297C、K322A和P331G的突变。
在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区包含2、3、4、5、6或7个选自E233P、L234A、L235A、G237A、D265A、N297C、K322A和P331G的突变。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区包含突变L234A、L235A和G237A。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区包含突变L234A、L235A、G237A和P331G。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区包含突变L234A、L235A、G237A、K322A和P331G。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区包含突变L234A、L235A、G237A、E233P和P331G。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区包含突变L234A、L235A、G237A和N297C。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区包含突变L234A、L235A、G237A、N297C和P331G。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区包含突变L234A、L235A、G237A、N297C、K322A和P331G。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区包含突变L234A、L235A、G237A、N297C、E233P和P331G。在一些实施方案中，所述人IgG1 Fc区包含突变L234A、L235A、G237A、D265A、N297C、K322A和P331G。
一个实施方案提供了一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其所述抗原结合片段包含人IgG4 Fc区，该人IgG4 Fc区包含在选自T250、M428和N434的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含选自T250Q、M428L和N434S的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含在位置T250和M428处的突变。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含突变T250Q和M428L。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含在位置M428和N434处的突变。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含突变M428L和N434S。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区进一步包含在位置N297处的突变。在一些实施方案中，所述在位置N297处的突变是N297C。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区进一步包含在选自S228、F234和L235的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述人IgG4Fc区包含选自S228P、F234A、L235E和N297C的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。在一些实施方案中，所述人IgG4 Fc区包含2、3或4个选自S228P、F234A、L235E和N297C的突变。在一些实施方案中，所述IgG4 Fc区包含在位置S228处的突变。在一些实施方案中，所述在位置S228处的突变是S228P。在一些实施方案中，所述IgG4 Fc区包含在位置S228和L235处的突变。在一些实施方案中，所述IgG4 Fc区包含突变S228P和L235E。在一些实施方案中，所述IgG4 Fc区包含在位置S228、L235和N297处的突变。在一些实施方案中，所述IgG4 Fc区包含突变S228P、L235E和N297C。在一些实施方案中，与包含野生型IgG1 Fc或IgG4 Fc的对照抗体-药物缀合物相比，所述抗体-药物缀合物表现出对FcRn的亲和力增加。
在一些实施方案中，所述治疗分子包括以下至少一种：小分子、降解剂、核酸分子、CRISPR-Cas9基因编辑系统和脂质纳米颗粒，或其任意组合。在一些实施方案中，所述治疗分子包括以下至少一种：V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、瑞奥西汀(auristatin)、多拉司他汀、美登木素生物碱、MetAP(甲硫氨酸氨肽酶)、蛋白质核输出抑制剂CRM1、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中的磷酰基转移反应的抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂、DHFR抑制剂、核酸、CRISPR酶或其任意组合。在一些实施方案中，所述降解剂包括诱导蛋白质降解的试剂。在一些实施方案中，所述诱导蛋白质降解的试剂包括疏水性标签、诱导蛋白水解的嵌合体、HSP90抑制剂、选择性雌激素受体降解剂(SERD)和选择性雄激素受体降解剂(SARD)，或其任意组合。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包封一种或多种治疗分子。在一些实施方案中，所述核酸分子包括RNA分子或DNA分子。在一些实施方案中，所述RNA分子包含siRNA、反义RNA、miRNA、反义miRNA、antagomir(抗miRNA)、shRNA或mRNA。在一些实施方案中，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段与所述治疗分子在单步或多步方案中通过连接体缀合。在一些实施方案中，所述连接体包括可切割的连接体、不可切割的连接体、亲水性连接体、促带电荷的连接体或基于二羧酸的连接体。在一些实施方案中，所述可切割的连接体包括可切割的共价或非共价连接体。在一些实施方案中，所述连接体包括不可切割的共价或非共价连接体。在一些实施方案中，所述可切割的连接体包括酸不稳定的连接体、蛋白酶敏感的连接体、光不稳定的连接体或含二硫键的连接体。在一些实施方案中，所述连接体包括半胱氨酸连接体或非半胱氨酸连接体。在一些实施方案中，所述非半胱氨酸连接体包括赖氨酸连接体。在一些实施方案中，所述连接体包括MC(6-马来酰亚胺基己酰基)、MCC(马来酰亚胺基甲基环己烷-1-甲酸酯)、MP(马来酰亚胺基丙酰基)、val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)、val-ala(缬氨酸-丙氨酸)、ala-phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、PAB(对氨基苄氧羰基)、SPP(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-(吡啶-2-基硫基)己酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基5-甲基-4-(吡啶-2-基硫基)己酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基5-甲基-4-(吡啶-2-基硫基)庚酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基5-乙基-4-(吡啶-2-基硫基)庚酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丙基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丁基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环戊基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环己基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸酯、SMCC(N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1甲酸酯)或SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯)。在一些实施方案中，所述连接体衍生自交联剂，其中所述交联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、2，5-二氧代吡咯烷-1-基3-环丙基-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-环丁基-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸酯、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(SPP)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丙基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丁基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丙基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丁基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(磺基-SMCC)或2,5-二氧代吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸酯(CX1-1)。
一个实施方案提供了一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，其中该疾病或病症的特征在于异常内皮细胞(EC)-细胞相互作用，所述方法包括向所述受试者施用根据本公开的抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，该EC-细胞相互作用包括EC-间充质干细胞、EC-成纤维细胞、EC-平滑肌细胞、EC-肿瘤细胞、EC-白细胞、EC-脂肪细胞和EC-神经元细胞相互作用中的一种或多种。在一些实施方案中，该疾病或病症包括炎性疾病或癌症。一个实施方案提供了一种治疗或预防受试者的炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据本公开的抗体-药物缀合物。一个实施方案提供了一种治疗或预防受试者的转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据本公开的抗体-药物缀合物，其中所述受试者从癌症部分或完全缓解。一个实施方案提供了一种治疗患有与高转移风险相关的癌症的受试者的方法，所述方法包括向患有与高转移风险相关的癌症的受试者施用根据本公开的抗体-药物缀合物。一个实施方案提供了一种治疗或预防患有癌症的受试者的转移的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用根据本公开的抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，所述受试者正在接受可诱导转移的治疗。在一些实施方案中，所述治疗包括手术、放射治疗和化学疗法。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述癌症是癌或肉瘤。在一些实施方案中，所述癌包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌。在一些实施方案中，所述肉瘤包括血管肉瘤、骨肉瘤或软组织肉瘤。在一些实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤。一个实施方案提供了一种治疗或预防人类受试者的淋巴或血源性转移的方法，其包括向所述人类受试者施用根据本公开的抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，与包含野生型IgG1 Fc或IgG4 Fc的对照抗体-药物缀合物相比，所述抗体-药物缀合物在施用后表现出更长的血清半衰期。
一个实施方案提供了一种药物组合物，其包含(i)根据本公开的抗体-药物缀合物和(ii)药学上可接受的载体。一个实施方案提供了一种药物组合物，其包含根据本公开的结合蛋白。
一个实施方案提供了一种包含通过连接体与治疗分子缀合的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含修饰的IgGFc区，该修饰的IgG Fc区包含一个或多个选自下组的突变：(i)S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434、H435和N297；或(ii)E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、M428和N434，其中所述连接体衍生自下式的化合物：
Figure BDA0003324235030000201
Figure BDA0003324235030000211
附图说明
本公开的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本公开的原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会对本公开的特征和优点获得更好的理解，在这些附图中：
图1示出了使用溴乙酰胺缀合的示例性抗体药物缀合物(ADC)。
图2示出了使用马来酰亚胺缀合的示例性ADC。
图3示出了评估示例性抗TM4SF1抗体在各种内皮细胞中的亲和力的研究结果。
图4示出了包含各种Fc突变的示例性抗TM4SF1抗体(鼠替代物，MS)的体内组织分布(大肠、小肠、胃)。
图5示出了包含各种Fc突变的示例性抗TM4SF1抗体(鼠替代物，MS)的体内组织分布(雌性生殖道、与肿瘤相邻的皮肤和皮下肿瘤)。
图6示出了通过疏水相互作用色谱法(HIC)评估的示例性抗TM4SF1抗体(鼠替代物，MS；和抗人AGX-A07)的疏水性。
图7提供了显示示例性抗TM4SF1抗体(鼠替代物，MS)的药物与抗体之比(DAR)的光谱。
图8提供了评估含有抗TM4SF1抗体(鼠替代物，MS)的示例性ADC(马来酰亚胺缀合)在小鼠中以不同剂量(40mg/kg-左图；50mg/kg-中图；和60mg/kg-右图)施用后的体内耐受性的研究结果。该图的上半部分显示存活百分比，下半部分显示施用ADC后的体重变化。
图9提供了评估含有抗TM4SF1抗体(鼠替代物，MS)的示例性ADC(溴乙酰胺缀合)在小鼠中以60mg/kg施用后的体内耐受性的研究结果。
图10提供了使用含有示例性抗人TM4SF1抗体(AGX-A07)或鼠替代(MS)TM4SF1抗体的ADC的药代动力学研究的结果。含有AGX-A07的ADC在食蟹猴中进行了测试，而含有MS的ADC在小鼠中进行了测试。
图11提供了体内研究的结果，该研究评估了含有含各种Fc区突变的抗TM4SF1抗体(鼠替代物，MS)的示例性ADC在以两种剂量(12mg/kg和20mg/kg)施用时，在小鼠肿瘤生长消退中的功效。
图12提供了体内研究的结果，该研究评估了含有含各种Fc区突变的抗TM4SF1抗体(鼠替代物，MS)的示例性ADC在以24mg/kg施用时，在小鼠肿瘤生长消退中的功效。
图13提供了体内研究的结果，该研究评估了含有含各种Fc区突变的抗TM4SF1抗体(鼠替代物，MS；抗人TM4SF1抗体(AGX-A07)；或两者的组合)的ADC在以不同剂量(3mg/kg和12mg/kg)施用时，在异种移植模型的肿瘤生长消退中的功效。
具体实施方式
跨膜-4L六家族成员-1(TM4SF1)是一种具有四跨膜蛋白拓扑结构的小型膜糖蛋白，其在许多人类上皮肿瘤细胞和内皮细胞，尤其是血管生成血管中的内皮细胞中高度表达。
在一个实施方案中，本文提供了一种用于血管靶向疗法的抗体-药物缀合物(ADC)，例如，其可以通过杀死肿瘤血管的内皮细胞来消退原发性肿瘤。这种疗法可包括各种具有吸引力的特征。值得注意的是，(1)血管生成是癌症的标志，而破坏血管生成血管的疗法可以成为实体瘤的通用治疗方法；(2)血管内皮是未突变的宿主系统，并且可能无法对疗法产生抗性。因此，血管靶向疗法可能能够克服肿瘤细胞靶向疗法的常见问题，在肿瘤细胞靶向疗法中，靶组织进化并产生对该疗法的抗性；(3)肿瘤的血管内皮直接暴露于静脉内(IV)输注的药物，因此可以接近无法到达肿瘤细胞的药物。肿瘤细胞的不可接近性可能是癌症如胰腺癌中的主要问题，胰腺癌具有致密的纤维化基质，从而限制了药物接近肿瘤细胞。使用包含抗TM4SF1抗体的ADC的血管靶向疗法可以有利地到达肿瘤的血管内皮。
在一个实施方案中，本公开提供了抗体-药物缀合物(ADC)，其包含TM4SF1结合蛋白，如抗TM4SF1抗体及其抗原结合片段。在一些实例中，本公开包括使用ADC治疗或预防癌症的方法。在一些实施方案中，本公开包括ADC，其中与抗体缀合的药物有效负载由小分子、RNA、DNA、降解剂、蛋白质或其组合组成。
I.定义
除非在本文中另有定义，否则与本公开关联使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。术语的含义和范围应当是清楚的，然而，如果存在任何潜在歧义，则本文提供的定义优先于任何词典或外部定义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语将包括复数，并且复数术语将包括单数。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式如“包含”和“含有”的使用不是限制性的。
通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交关联使用的命名及其技术是本领域公知且常用的。除非另有规定，否则本公开的方法和技术通常根据本领域公知的以及如本说明书通篇引用和论述的各种通用的和更具体的参考文献中描述的常规方法来进行。酶反应和纯化技术按照制造商的说明书进行，以本领域通常实现的方式进行，或如本文所述进行。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学关联使用的命名及其实验室程序和技术是本领域公知且常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及治疗患者。
为了可以更容易地理解本公开内容，所选术语如下定义。如本文所用的术语“跨膜-4L六家族成员-1”或“TM4SF1”是指跨膜4超家族/四跨膜蛋白家族的多肽，该多肽在肿瘤血管结构内皮细胞(EC)、肿瘤细胞(TC)、发育中的视网膜血管结构的EC以及血管生成性血管上高度表达。TM4SF1具有两个被四个跨膜域(M1、M2、M3和M4)隔开的胞外环(ECL1和ECL2)、N末端和C末端以及胞内环(ICL)。ECL2含有两个N-糖基化位点。人TM4SF1(hTM4SF1)的氨基酸序列以SEQ ID NO:134描述(也参见NCBI参考序列号NP_055035.1)。
如本文所用的术语“抗体”意指包含至少一个与特定抗原(例如TM4SF1)特异性结合或相互作用的互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子。术语“抗体”包括包含四条多肽链，即通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链的免疫球蛋白分子，及其多聚体(例如IgM)。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含CH1、CH2和CH3这三个结构域。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可进一步细分为超变区，被称为互补决定区(CDR)，其中散布有更保守的区域，被称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。在本公开的不同实施方案中，抗TMS4F1抗体(或其抗原结合部分)的FR可与人种系序列相同，或者可被天然地或人工地修饰。可以基于对两个或更多个CDR的并排分析来确定氨基酸共有序列。
术语“完整抗体”是指包含四条多肽链，即通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链的抗体。在一个实施方案中，所述抗TM4SF1抗体是完整抗体。在一个实施方案中，该完整抗体是完整的人IgG1、IgG2或IgG4同种型。在某些实施方案中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人IgG1、IgG2或IgG4同种型。
如本文所用的，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、可以酶法获得的、合成的或遗传工程化的多肽或糖蛋白。例如，抗体的抗原结合片段可使用任何合适的标准技术从完整抗体分子衍生，所述技术例如是蛋白水解消化，或涉及操作和表达编码抗体可变域和可选的恒定域的DNA的重组遗传工程技术。这样的DNA是已知的，并且/或者易于从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)获得，或者可以合成获得。可对DNA进行测序，并且以化学方式或通过使用分子生物学技术进行操作，例如用以将一个或多个可变域和/或恒定域排列成合适的构型，或者用以引入密码子，创建半胱氨酸残基，修饰、添加或删除氨基酸，等等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如，分离的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)，或受约束的FR3-CDR3-FR4肽。
如本文所用的术语抗体或其片段的“可变区”或“可变域”是指抗体分子的轻链和重链的部分，其包括互补决定区(CDR；即CDR-1、CDR-2和CDR-3)和框架区(FR)的氨基酸序列。VH是指重链的可变域。VL是指轻链的可变域。根据本公开中使用的方法，分配给CDR和FR的氨基酸位置可根据Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987和1991))来确定。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号也按照Kabat的编号。
如本文所用的术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在三个CDR，对于每个可变区，这些CDR被指定为CDR1、CDR2和CDR3。如本文所用的术语“CDR集”是指存在于单一可变区中的能够结合抗原的一组三个CDR。这些CDR的精确边界已根据不同系统以不同方式限定。由Kabat(Kabat等人,Sequencesof Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)和(1991)))描述的系统不仅提供适用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，而且还提供界定三个CDR的确切残基边界。这些CDR可被称为Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)和Chothia等人,Nature 342:877-883(1989))发现，Kabat CDR内的某些子部分尽管在氨基酸序列水平上具有极大多样性，但却采用几乎相同的肽骨架构象。这些子部分被指定为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链区域和重链区域。这些区域可被称为Chothia CDR，它们具有与Kabat CDR重叠的边界。界定与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界已由Padlan(FASEB J.9:133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5):732-45(1996))描述。其他CDR边界界定可能不严格遵循以上系统之一，但仍然与Kabat CDR重叠，尽管鉴于特定残基或残基组乃至整个CDR不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以是缩短的或延长的。本文所用的方法可利用根据这些系统中的任何系统所确定的CDR，但优选实施方案使用Kabat或Chothia确定的CDR。
如本文所用的术语“框架区”(在下文中称为FR)是指除CDR残基以外的那些可变域残基。每个可变域一般具有四个FR，被标识为FR1、FR2、FR3和FR4。抗体或其功能片段的可变区之间的共同结构特征是本领域公知的。编码特定抗体的DNA序列通常可按照公知方法来获得，所述方法例如是在此引入作为参考的的Kabat等人1987 Sequence of Proteins ofImmunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,BethesdaMD中描述的那些方法。另外，用于从抗体克隆功能性可变区的一般方法可见于在此引入作为参考的Chaudhary,V.K.等人,1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1066中。
本文的术语“Fc区”用来定义抗体重链的C末端区域，包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变异Fc区。尽管抗体重链的Fc区的边界可能变化，但人IgG重链Fc区常常被定义为从位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230伸展至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据Kabat等人中的EU编号系统的残基447)可以例如在抗体的产生或纯化期间，或通过重组工程改造编码抗体重链的核酸琮去除。因此，完整抗体的组合物可包含已去除所有K447残基的抗体群体，没有去除K447残基的抗体群体，以及具有含K447残基的抗体和不含K447残基的抗体的混合物的抗体群体。此外，本公开中完整抗体的组合物可包含在C末端赖氨酸K447之后具有残基延伸的抗体群体。
如本文所用的术语“人源化抗体”是指与目的抗原(例如人TM4SF1)免疫特异性结合，并且包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)的抗体或其变体、衍生物、类似物或片段。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白。通常，人源化抗体将包含基本上全部至少一个、通常两个可变域，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且全部或基本上全部FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般是具有人免疫球蛋白共有序列的免疫球蛋白恒定区的至少一部分。抗体人源化方法是本领域已知的。参见，例如，Riechmann等人,1988,Nature 332:323-7；Queen等人的美国专利：5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370；EP239400；PCT公布WO 91/09967；美国专利5,225,539；EP592106；EP519596；Padlan,1991,Mol.Immunol.,28:489-498；Studnicka等人,1994,Prot.Eng.7:805-814；Roguska等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.91:969-973；以及美国专利5,565,332，所述文献均通过引用整体并入本文。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能少量存在的可能的突变，例如天然发生的突变外，构成该群体的各个抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”将抗体的特性指示为不是离散抗体的混合物。在某些实施方案中，这样的单克隆抗体通常包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中靶标结合性多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单一靶标结合性多肽序列的过程来获得。例如，选择过程可以是从多个克隆，例如从一系列杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆中选择独特的克隆。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个表位。
如本文所用的术语“嵌合抗体”是指重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源的抗体(免疫球蛋白)，以及这类抗体的片段，只要它们展现所需的生物活性即可(美国专利4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
如本文所用的术语“表位”是指与抗体分子的可变区中被称为互补位的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单一抗原可具有超过一个表位。因此，不同抗体可与抗原上的不同区域结合，并且可具有不同的生物效应。表位可被定义为结构性的或功能性的。功能性表位通常是结构性表位的子集，并且具有直接贡献于相互作用的亲和力的那些残基。表位还可以是构象性的，即，由非线性氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可包括作为诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基等分子的化学活性表面组群的决定簇，并且在某些实施方案中，可具有特定的三维结构特性和/或特定的电荷特性。
术语“有效负载”、“药物有效负载”、“治疗分子”、“治疗有效负载”、“治疗剂”、“治疗部分”在本文中可互换使用，是指与抗TMSF1抗体或抗原结合片段(例如，本文公开的抗TM4SF1抗体或抗原结合片段)缀合的化学或生物部分，并且可以包括任何治疗剂或诊断剂，例如但不限于用于癌症和非癌症血管生成适应症的小分子；V-ATP酶抑制剂；促凋亡剂；Bcl2抑制剂；MCL1抑制剂；HSP90抑制剂；IAP抑制剂；mTor抑制剂；微管稳定剂；微管去稳定剂；瑞奥西汀(auristatin)；多拉司他汀；美登木素生物碱；MetAP(甲硫氨酸氨肽酶)；蛋白质核输出抑制剂CRM1；DPPIV抑制剂；蛋白酶体抑制剂；线粒体中的磷酰基转移反应的抑制剂；蛋白质合成抑制剂；激酶抑制剂(如CDK2抑制剂、CDK9抑制剂)；驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂、DHFR抑制剂、核酸、CRISPR酶；降解剂(如诱导蛋白质降解的试剂，(例如，HSP90抑制剂、选择性雌激素受体降解剂(SERD)、选择性雄激素受体降解剂(SARD)；可用于将分子伴侣募集到目的蛋白质的疏水性标签，例如金刚烷，Arg-Boc3；E3连接酶募集配体，例如，Nutlin-3a(MDM2配体)、苯丁抑制素(cIAP配体)、VHL配体、泊马度胺(CRBN配体)；可以利用不同的D3连接酶靶向目的蛋白质进行降解的蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC))(参见，例如，Lai AC,Crews CM.Induced proteindegradation:an emerging drug discovery paradigm.Nat Rev Drug Discov.2016；16(2):101-114)；反义寡核苷酸；RNAi剂(如siRNA)，CRISPR-Cas9基因编辑系统；RNA分子；DNA，例如，质粒；抗癌剂、抗炎剂、抗感染剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂)、麻醉剂；RNA聚合酶II抑制剂；DNA嵌入剂、DNA交联剂；抗微管蛋白剂；细胞毒性药物、肿瘤疫苗、抗体、肽、肽体、化疗剂、细胞毒性剂；细胞抑制剂；免疫调节剂、干扰素、白介素、免疫刺激性生长激素、细胞因子、维生素、矿物质、芳香酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、HDAC抑制剂；用于包封一种或多种治疗分子的脂质纳米颗粒。
术语“药物与抗体之比”或“DAR”可指本文公开的ADC中与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段附接的药物(在本文中也称为治疗分子、治疗剂或治疗部分)的数目。ADC的DAR通常在1至12的范围内，尽管更高的负载(例如16)也是可能的，这取决于抗体上连接位点的数目或多价连接的使用，其中多个药物有效负载附接至一个连接位点。术语DAR可以用来表示加载到单个抗体上的药物分子的数目，或者，可以用来表示一组ADC的平均DAR，以反映平均药物负载。多个ADC的组合物、批次和/或制剂可以用平均DAR来表征。DAR和平均DAR可以通过各种常规手段来测定，例如紫外光谱法、质谱法、ELISA测定、放射测定法、疏水相互作用色谱法(HIC)、电泳和HPLC。
术语“结合亲和力”通常是指分子(例如结合蛋白，如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。结合分子X(例如抗TM4SF1抗体)对其结合配偶体Y(例如人TM4SF1)的亲和力通常可用解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域已知的常用方法来测量，所述方法包括本文所述的那些方法。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快结合抗原并倾向于更久地保持结合。多种测量结合亲和力的方法是本领域已知的，其中任何方法均可用于本公开。具体的说明性实施方案包括以下。在一个实施方案中，“KD”或“KD值”可通过本领域已知的测定，例如通过结合测定来测量。KD可在例如用目的抗体的Fab形式及其抗原进行的RIA中测量(Chen等人,1999,J.Mol Biol 293:865-81)。KD还可以通过以下方式测量：使用FACS，或使用例如BIACORE 2000或BIACORE 3000通过BIACORE进行的表面等离子体共振测定，或通过使用例如OCTET QK384系统进行的生物层干涉测量法。在某些实施方案中，抗TM4SF1抗体的KD使用采用HUVEC细胞进行的标准流式细胞术测定来确定。“结合速率”或“缔合速率”或“kon”和“解离速率”或“解离的速率”或“koff”还可使用例如BIACORE 2000或BIACORE 3000或OCTETQK384系统，通过以上所述的相同表面等离子体共振或生物层干涉测量技术来确定。
如本文所用的，术语“kon”旨在表示如本领域已知，抗体与抗原缔合以形成抗体/抗原复合物的结合速率常数。
如本文所用的，术语“koff”旨在表示如本领域已知，抗体从抗体/抗原复合物上解离的解离速率常数。
术语“抑制”当在本文中使用时是指部分(如1％、2％、5％、
10％、20％、25％、50％、75％、90％、95％、99％)或完全(即100％)抑制。
如本文所用的术语“癌症”是指或描述哺乳动物中的生理状况，该状况的特征一般是不受调节的细胞生长。
如本文所用的术语“与高转移风险相关的癌症”是指与至少一种已知会增加患有癌症的受试者发生转移性癌症的风险的因素相关的癌症。与转移风险增加相关的因素的实例包括但不限于受试者在初始癌症诊断时具有的癌性淋巴结的数目、肿瘤的大小、组织学分级，以及在初始诊断时癌症的分期。
如本文所用的术语“血液性转移”是指癌细胞能够穿透血管壁，之后它们能够通过血流循环(循环肿瘤细胞)到身体中的其他部位和组织。
如本文所用的术语“淋巴性转移”是指癌细胞能够穿透淋巴管，并且排入血管中。
在本公开的背景下，如本文所用的术语“治疗”或“处理”意指逆转、减轻、预防应用这种术语的病症或病况或这种病症或病况的一种或多种症状或抑制其进展。如本文所用的术语“治疗癌症”意指抑制癌细胞的生长和/或增殖。在一个实施方案中，本文所述的组合物和方法用来治疗患有转移性癌症的受试者中的转移。
术语“预防癌症”或“癌症的预防”是指延迟、抑制或防止哺乳动物中癌症的发作，在该哺乳动物中，肿瘤生成或肿瘤发生的发作未经证实，但癌症倾向得到确认，无论是通过例如遗传筛查还是以其他方式确认。该术语还涵盖治疗具有恶化前状况的哺乳动物，以使恶化前状况向恶性肿瘤的进展停止，或导致恶化前状况的消退。恶化前状况的实例包括增生、发育不良和化生。在一些实施方案中，预防癌症针对处于癌症缓解期的受试者来使用。
多种癌症，包括恶性或良性和/或原发性或继发性癌症，可用本公开的方法治疗或预防。这类癌症的实例是本领域技术人员已知的，并且在标准教科书如Merck Manual ofDiagnosis and Therapy(由Merck出版)中列出。
如本文所用的术语“受试者”是指哺乳动物(例如人)。
如本文所用的术语“施用”是指向受试者给予一定剂量的抗体或其片段或组合物(例如药物组合物)的方法。施用方法可根据各种因素(例如，所施用的结合蛋白或药物组合物，以及所治疗的病况、疾病或病症的严重程度)而不同。
如本文所用的术语“有效量”是指本文提供的抗体或药物组合物的足以导致所需结果的量。
术语“约”和“大约”意指在给定值或范围的20％以内、15％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内或更小百分比内。
如在本文中可互换使用的术语“同一性”或“同源性”可以是两个或更多个核苷酸或氨基酸序列之间的“同一性”、“同源性”或“同源性百分比”的计算，其可以通过为了最佳比较目的而对序列进行比对来确定(例如，可以在第一序列的序列中引入空位)。然后可以比较相应位置处的核苷酸，并且两个序列之间的同一性百分比可以是序列共有的相同位置数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/位置的总数目x100)。例如，如果第一序列中的位置可以被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据，则分子在该位置处是相同的。两个序列之间的同源性百分比可以是序列共有的相同位置的数目的函数，其中考虑为了两个序列的最佳比对而需要引入的空位的数目和每个空位的长度。在一些实施方案中，为了比较目的而比对的序列的长度可以是参考序列长度的至少约：30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或95％。
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搜索可以确定两个序列之间的同源性。这两个序列可以是基因、核苷酸序列、蛋白质序列、肽序列、氨基酸序列或其片段。两个序列的实际比较可以通过公知的方法来完成，例如，使用数学算法。这样的数学算法的非限制性实例可描述于Karlin,S.和Altschul,S.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90-5873-5877(1993)中。如Altschul,S.等人,NucleicAcids Res.,25:3389-3402(1997)中所述，这样的算法可以并入NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，NBLAST)的任何相关参数。例如，用于序列比较的参数可设置为分数＝100，字长＝12，或可变化(例如，W＝5或W＝20)。其他实例包括Myers和Miller,CABIOS(1989)的算法、ADVANCE、ADAM、BLAT和FASTA。在另一个实施方案中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用例如GCG软件包(Accelrys,Cambridge,UK)中的GAP程序来完成。
如本文所用的术语“可制备性”是指特定蛋白质在该蛋白质的重组表达和纯化期间的稳定性。可制备性被认为是由于分子在表达和纯化条件下的内在性质。改善的可制备性特性的实例包括蛋白质的均一糖基化，在蛋白质重组产生期间的增加的细胞效价、生长和蛋白质表达，改善的纯化性质，较低的聚集或不聚集倾向，以及改善的稳定性，包括但不限于热稳定性和在低pH下的稳定性。在一些实施方案中，提供了与其他TM4SF1抗体相比展示出可制备性以及体外和体内活性的保留的TM4SF1结合蛋白。在一些实施方案中，通过在CDR或框架区中进行氨基酸置换对亲本TM4SF1结合蛋白进行人源化可赋予额外的可制备性益处。
在一些实施方案中，提供了展示出改善的可开发性特性的TM4SF1结合蛋白，所述特性包括但不限于例如在蛋白A纯化或大小排阻色谱法之后改善的纯化产率、在纯化之后改善的均质性、改善的热稳定性。在一些情况下，改善是相对于由杂交瘤小鼠细胞系8G4-5-13-13F(PTA-120523)产生的抗TM4SF1抗体而言的，如通过HLA分子结合所确定的。
在一些实例中，结合亲和力通过Scatchard分析来确定，该分析包括产生Scatchard图，Scatchard图是结合的配体与未结合的配体的浓度比相对于结合的配体浓度的图。
术语“血管毒性”是指抗TM4SF1抗体-治疗分子缀合物(在本文中也称为抗TM4SF1ADC或TM4SF1靶向ADC)的任何作用，其直接由于抗体或治疗分子对携带抗原的细胞的影响，或间接通过激活免疫系统和导致的炎症而导致血管损伤。这样的血管损伤可以包括但不限于影响血管内皮细胞或下面的平滑肌细胞或周细胞或任何血管的基底膜(包括心内膜(心脏的内衬))的损伤或炎症。这样的血管损伤可以影响动脉，包括主要动脉如主动脉、弹性动脉(如主动脉)、不同大小的肌动脉，如冠状动脉、肺动脉、颈动脉、小动脉、毛细血管、脑或视网膜动脉；静脉；或者它可以影响血管生成血管，包括供应毛囊、消化道和骨髓的血管。这样的血管损伤可包括心脏、肺、肾、视网膜、脑、皮肤、肝、消化道、骨髓、内分泌腺、睾丸或卵巢、子宫内膜和其他靶器官的微血管功能障碍或损伤，并且可包括肾脏、视网膜或脑血管循环功能障碍。
如本文所用的术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)”是指由细胞毒性效应细胞通过非吞噬过程杀伤抗体包被的靶细胞，该非吞噬过程的特征在于释放细胞毒性颗粒的内含物或表达诱导细胞死亡的分子。ADCC通过靶标结合的抗体(属于IgG或IgA或IgE类别)与某些Fc受体(FcR)的相互作用来触发，所述Fc受体是存在于效应细胞表面上的结合免疫球蛋白(Ig)的Fc区的糖蛋白。介导ADCC的效应细胞包括自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性粒细胞和树突细胞。ADCC是一种快速效应机制，其功效依赖于许多参数(靶细胞表面上的抗原的密度和稳定性；抗体亲和力和FcR结合亲和力)。基于PBMC的ADCC测定和基于自然杀伤细胞的ADCC测定可用于检测ADCC。这些测定中的读出数据是终点驱动的(靶细胞裂解)。
术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体的存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的激活由补体系统的第一组分(C1q)与(适当子类的)抗体的结合引发，所述抗体与其同源抗原结合。为了评估补体活化，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人,1996,J.Immunol.Methods 202:163)。已经描述了具有改变的Fc区氨基酸序列(具有变异Fc区的多肽)以及增加或降低的C1q结合能力的多肽变体(参见例如美国专利6,194,551；WO1999/51642；Idusogie等人,2000,J.Immunol.164:4178-84)。可以选择不具有或具有极低CDC活性的抗体(或片段)进行使用。
如本文所用的术语“效应子功能”是指由IgG的Fc效应结构域(例如免疫球蛋白的Fc区)所导致的功能。这样的功能可通过例如Fc效应结构域与具有吞噬或溶解活性的免疫细胞上的Fc受体结合，或通过Fc效应结构域与补体系统的组分结合来实现。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬(ADCP)；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。
如本文所用的术语“降低”或“消除”是指能够导致优选20％或更大，更优选50％或更大，最优选75％、85％、90％、95％或更大的总体减低。降低或消除可指两个分子的结合亲和力，例如免疫球蛋白与C1q或Fc受体的结合；或者可指正在治疗的病症(例如癌症)的症状，如转移的存在或大小或原发性肿瘤的大小。
如本文所用的术语“降低的ADCC/CDC功能”是指与对照(例如具有不包括突变的Fc区的抗体)相比，特定效应子功能例如ADCC和/或CDC降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更大。
对于本公开中讨论的所有氨基酸位置，在抗体或其抗原结合片段的背景下，编号是根据EU索引。“EU索引”或“Kabat等人中的EU索引”或“EU编号方案”是指EU抗体的编号(参见，Edelman等人，1969；Rabat等人，1991)。
II.含有抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物，其具有修饰的Fc区和/或CDR区
本公开的一个实施方案提供了包含与治疗分子连接的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物(ADC)，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含经修饰的Fc区，如包含一个或多个突变的经修饰的IgG区(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。在一些情况下，所述Fc区中的一个或多个突变导致包含这样的修饰的Fc区的药物在以下方面的改善，例如：1)效应子功能的降低，2)半衰期调节，3)稳定性，以及4)下游过程。在一些情况下，修饰的Fc区可包含一个或多个突变，这些突变将降低或消除抗体与免疫系统之间的相互作用。关键的相互作用可包括抗体Fc与白细胞和血小板上的Fcγ受体的相互作用，以及与补体系统的C1q的相互作用，从而导致补体依赖性细胞毒性。
在一些情况下，本公开提供了包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的ADC，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包括免疫消除突变，例如，在Fc区中，在这种情况下其为修饰的Fc区，例如，修饰的IgG Fc区。在一些实施方案中，修饰的Fc区包含在位置N297处的修饰。在一些实施方案中，修饰的Fc区包含修饰的IgG Fc区(例如，修饰的IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，其在位置E233、L234 or F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、N297、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434和H435或其任意组合处包含一个或多个突变。在一些实施方案中，Fc区在其C末端包含残基的延伸，使得在C末端保持正电荷(例如，在一些情况下，如果抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含两条重链，则至少一条重链在C末端包含残基的延伸)。这样的残基延伸可包括添加一个或多个氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、脯氨酸或其任意组合。在一些实例中，Fc区的延伸的C末端导致抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的CDC功能降低，以及包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的ADC的CDC功能降低。在一些情况下，通过单独地或与其他突变(例如，K322A、P331G-IgGl)组合地在IgGl或IgG4中Fc的K447之后添加KP残基，可以看到这样的效果。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包含效应子功能降低的抗体，包括一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329的置换(参见，例如，美国专利6,737,056)。在一些情况下，Fc区中的此类突变可包含在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处的置换，例如残基265和297被置换为丙氨酸(DANA突变，即D265A和N297A)(参见，例如，美国专利7,332,581)。在一些情况下，Fc区中的突变可包含在一个或多个氨基酸位置E233、L234、L235、G237、D265、N297、K322和P331处的置换。在一些情况下，Fc区中的突变可包含E233P、L234A、L235A、G237A、D265A、N297A、K322A和P331G中的至少一个，或它们的任意组合。例如，Fc区中的突变可包含L234A/L235A/G237A(IgG1)或F234A/L235E(IgG4)，并且包含此类突变的抗TM4SF1抗体或抗原结合片段可表现出改变的FcgRI相互作用。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包括包含以下突变的Fc变体：在位置M428和N434处的氨基酸置换(M428L、N434S)(参见例如US9803023)。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包括包含以下突变的Fc变体：在位置T250和M428处的氨基酸置换(T250Q、M428L)(参见例如US9803023)。
在一些实施方案中，TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包含突变D265A和N297A。在一些情况下，野生型人Fc区的位置329的脯氨酸(P329)可被置换为甘氨酸或精氨酸或足够大的氨基酸残基，氨基酸残基大到足以破坏Fc/Fcy受体界面内的脯氨酸夹心结构，其在Fc的P329与FcgRIII的色氨酸残基W87和WHO之间形成(参见，例如Sondermann等人,Nature406,267-273(2000年7月20日))。在进一步的实施方案中，Fc区中的突变可包含一个或多个氨基酸置换，如S228P(IgG4)、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S，并且在其他实施方案中：人IgG1 Fc区的L234A和L235A，或人IgG4 Fc区的S228P和F234A、L235A或L235E。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可以包括修饰的Fc区，该修饰的Fc区是野生型人IgG Fc区的Fc变体，其中人IgG Fc区的P329被甘氨酸置换并且其中该Fc变体包含在人IgG1 Fc区的L234A和L235A或人IgG4 Fc区的S228P和L235E处的至少两个另外的氨基酸置换，并且其中所述残基根据EU编号进行编号(参见，例如，US8969526)。包含P329G、L234A和L235A置换的多肽可表现出对人FcγRIIIA和FcγRIIA的亲和力降低，用于将ADCC下调至由包含野生型人IgG Fc区的多肽诱导的ADCC的至少20％，和/或用于ADCP的下调(参见，例如，US8969526)。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包括包含三重突变的Fc变体：位置P329、L234A和L235A处的氨基酸置换突变(P329/LALA)(参见，例如，US8969526)。
在一些实施方案中，本公开的某些抗TM4SF1抗体或抗原结合片段可包含表现出改善或减弱的与FcR结合的突变。(参见，例如，US6737056；WO 2004/056312，和Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在一些情况下，抗TM4SF1抗体或抗原结合片段可以包括具有一个或多个改善ADCC的氨基酸置换，例如在Fc区的位置298、333和/或334处的置换的Fc区。可以在Fc区进行改变，这导致改变(即改善或减弱)的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如US6194551、WO 99/51642和Idusogie等人(2000)J.Immunol.164:4178-4184所述。
半衰期延长且与新生儿Fc受体(FcRn)的结合改善的抗体。FcRn以其将母体IgG转移到胎儿的功能命名，它还通过在内体中捕获抗体并将它们返回到循环中来防止抗体在溶酶体中降解。(参见，例如，Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))，描述于US2005/0014934。不受任何特定理论的束缚，预期与FcRn的结合改善的抗体与TM4SF1分离并结合FcRn，然后将ADC再循环回循环，从而降低血管毒性。在本文的一些实施方案中提供了包含具有一个或多个增强FcRn再循环的置换的Fc区的抗TM4SF1抗体或抗原结合片段。在本文的一些实施方案中提供了抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其包含其中具有一个或多个置换的Fc区，所述置换改善Fc区与FcRn的结合，例如在一个或多个以下位置处的置换：238、250、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、428、424、434和435，例如，根据EU编号的Fc区残基434的置换(US7371826)。另见Duncan&amp；Winter,Nature 322:738-40(1988)；US 5648260；US 5624821；US2005/0014934和WO 94/29351，其涉及Fc区变体的其他实例，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本文提供了具有pH依赖性FcRn结合亲和力的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。不受任何特定理论的束缚，预期具有pH依赖性FcRn结合亲和力的ADC抗体或其抗原结合片段在pH>7时与FcRn分离，并在pH 6时与FcRn结合。因此，在酸性pH亚细胞器中，例如在内体中的FcRn结合这样的抗体，并将抗体带回细胞膜，并在pH>7时将抗体释放到血浆中，从而回收抗体并避免ADC有效负载的溶酶体释放。
在某些实施方案中，本文提供了抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其包含其中具有调节FcRn再循环的一个或多个置换的Fc区。在本文的一些实施方案中，提供了包含一个或多个置换的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述置换在酸性pH例如pH 6下增强FcRn结合，并且在中性或碱性pH例如pH 7下不影响FcRn结合。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包含在根据EU编号的位置250、252、254、256、428和434中的一个或多个处的置换。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包括包含置换T250Q、M252Y、S254T、T256E、M428L和N434S中的一个或多个的Fc变体。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包括包含置换T250Q和M428L的IgG1 Fc变体(“QL突变体”)。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包括包含置换T250Q和M428L的IgG4 Fc变体(“QL突变体”)。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包括包含置换M252Y、S254T和T256E的IgG1 Fc变体(“YTE突变体”)。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包括包含置换M428L和N434S的IgG1 Fc变体(“LS突变体”)。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包括包含置换M428L和N434S的IgG4 Fc变体(“LS突变体”)。调节FcRn再循环的Fc区中氨基酸置换的影响描述于，例如，Hamblett等人,Mol.Pharm.13(7):2387-96(2016)；Dall’Acqua等人,J.Biol.Chem.281(33):23514-24(2006)，Hinton等人,J.Biol.Chem.279(8):6213-6(2003)，Hinton等人,J.Immunol.,176(1):346-56(2006)，US20080181887，US 7361740和EP2235059，其全部内容通过引用并入本文。
在某些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有一个或多个选自T250Q、M252Y、S254T、T256E、M428L和N434S的置换的Fc区。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有一个或多个选自T250Q、M252Y、S254T、T256E、M428L和N434S的置换的Fc区。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有置换T250Q和M428L的Fc区。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有置换M252Y、S254T和T256E的Fc变体。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有置换M252Y、S254T和T256E的Fc变体。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有置换M428L和N434S的Fc变体。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有置换M428L和N434S的Fc变体。
在某些实施方案中，本文公开的ADC表现出降低的血管毒性、降低的溶酶体毒性、提高的功效和/或提高的治疗范围。在一些实施方案中，本文公开的ADC包含含有突变Fc区的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其具有增加的FcRn结合亲和力和延长的血清半衰期。在某些实施方案中，包含突变Fc区的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段具有至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天、至少100天或更长的血清半衰期。在一些实施方案中，
在某些实施方案中，本公开的ADC表现出降低的血管毒性、改善的治疗范围或两者。在某些实施方案中，本公开的ADC包含含有突变Fc区的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，相比于与本公开的抗体具有相同氨基酸序列，但不包含对Fc区进行的至少一个氨基酸残基的添加、置换或缺失的抗体(在本文中也称为“未修饰的抗体”)，所述抗体或其抗原结合片段具有降低的或消除的对负责促进效应子功能的Fc配体的亲和力。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有至少两个降低或消除抗体或其抗原结合片段的ADCC和/或CDC效应子功能的突变的Fc区。在进一步的实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或更多个降低或消除抗体或其抗原结合片段的ADCC和/或CDC效应子功能的突变的Fc区。
在某些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有一个或多个选自E233P、L234V、L234A、L235A、G236Δ(缺失)、G237A、V263L、N297A、N297D、N297G、N297Q、K322A、A327G、P329A、P329G、P329R、A330S、P331A、P331G和P331S的突变的Fc区。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有L234A/L235A突变，具有或不具有G237A突变的Fc区。在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有L234A、L235A和G237A突变的Fc区。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有A327G/A330S/P331S突变的Fc区。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有E233P/L234V/L235A/ΔG236(缺失)突变的Fc区，所述突变提供降低的与FcγRI(在本文中也称为FcgRI)、FcγRIIA(在本文中也称为FcgRIIA)、FcγRIIIA(在本文中也称为FcgRIIIAI)的结合，以及降低的ADCC和CDC效应子功能，例如，如An Z等人.Mabs 2009 Nov-Ec；1(6):572-9所述，其通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有N297x突变的Fc区，其中x＝A、D、G、Q。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有A327G/A330S/P331S突变的Fc区。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有K322A、P329A和P331A中一个或多个的突变的Fc区，所述突变提供降低的与C1q的结合，例如，如Canfield&Morrison.J Exp Med(1991)173(6):1483–91.10.1084所述，其通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有V263L突变的Fc区，所述突变提供增强的与FcγRIIB(在本文中也称为FcgRIIB)的结合和增强的ADCC，例如，如Hezareh等人.J Virol.2001年12月；75(24):12161-8所述，其通过引用整体并入本文。
在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有L234A/L235A、G237A或L235E突变的Fc区。
在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有L234F、L235E或P331S突变的Fc区。
在某些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG2同种型，并且包含含有一个或多个选自V234A、G237A、P238S、H268A或H268Q、V309L、A330S和P331S的突变的Fc区。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG2同种型，并且包含含有A330S/P331S突变的Fc区。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG2同种型，并且包含含有A330S/P331S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S或H268Q/V309L/A330S/P331S突变的Fc区。
在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有一个或多个选自S228P、E233P、F234A、F234V、L235E、L235A、G236Δ(缺失)、N297A、N297D、N297G、N297Q、P329G、P329R的突变的Fc区。
在某些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有S228P突变的Fc区，所述突变提供降低的Fab-臂交换和降低的聚集，例如，如Chappel等人Proc Natl Acad Sci U S A(1991)88(20):9036–40所述，其通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG2同种型，并且包含含有S228P/L235E突变的Fc区。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有S228P/E233P/F234V/L235A/ΔG236(缺失)突变的Fc区。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有N297x突变的Fc区，其中x＝A、D、G、Q。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有S228P/F234A/L235A突变的Fc区。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有L235E突变的Fc区，所述突变提供降低的与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA的结合，以及降低的ADCC和CDC效应活性，例如，如Saxena等人.Front Immunol.2016年12月12日；7:580所述。
在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有S228P/F234A/L235A或E233P/L235A/G236Δ突变的Fc区。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有至少S228P突变的Fc区。参见，例如，Angal等人(Mol Immunol.1993年1月；30(1):105-8)描述了对人IgG4重链的铰链序列的分析，以将在残基241(根据EU编号系统，并且现在对应于Kabat编号中的残基228)处是否存在丝氨酸确定为在一定比例的分泌型人IgG4中的铰链区中重链间二硫桥异质性的原因。Silva等人(J Biol Chem.2015年2月27日；290(9):5462-9)描述了人IgG4中阻止体内和体外IgG4 Fab-臂交换的S228P突变。
在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有L235E或S228P突变的Fc区。
在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4或IgG1同种型，并且包含含有N297A、N297D或N297G突变的Fc区。
在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4或IgG1同种型，并且包含含有P329G、P329R突变的Fc区。
在一个示例性实施方案中，任何IgG同种型的突变Fc区在位置234、235、236、237、297、318、320、322处包含一个或多个突变(如WO1988007089所述，其通过引用整体并入本文)。Fc区中的其他可能的突变，包括置换、缺失和添加，还在例如US20140170140、WO2009100309、US20090136494和US8969526中描述，它们通过引用整体并入本文。
可进行体外和/或体内细胞毒性测定，以证实CDC和/或ADCC活性的降低或消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。用来评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063)和Hellstrom,I.等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502；美国专利5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中。或者，可采用非放射性测定方法，参见例如用于流式细胞术的ACTI.TM.非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,Calif.)；以及CytoTox 96.RTM.非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,Wis.)。可用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，可在体内，例如在诸如Clynes等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 95(1998)652-656中公开的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。还可进行C1q结合测定，以证实抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202(1996)163；Cragg,M.S.等人,Blood 101(2003)1045-1052；以及Cragg,M.S.和Glennie,M.J.,Blood 103(2004)2738-2743)。还可使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12)(2006)1759-1769)。
在一些实施方案中，任何IgG同种型的突变Fc区包含在位置L328处的突变，如L328M、L328D、L328E、L328N、L328Q、L328F、L328I、L328V、L328T、L328H、L328A(参见，例如，US20050054832)。
在一个实施方案中，与未修饰的抗体相比，本公开的抗体或其抗原结合片段展现出降低的或消除的ADCC效应子功能。在另一实施方案中，与未修饰的抗体相比，本公开的抗体或其抗原结合片段展现出至少减小至1/2或至少减小至1/3或至少减小至1/5或至少减小至1/10或至少减小至1/50或至少减小至1/100的降低的ADCC效应子功能。在又一实施方案中，与未修饰的抗体相比，本公开的抗体展现出降低至少10％或至少20％或至少30％或至少40％或至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％或至少100％的ADCC效应子功能。在本公开的另一方面，由本公开的抗体或其抗原结合片段诱导的ADCC效应子功能降低或下调是降低至对于由未修饰抗体导致的ADCC诱导所观察到的数值的0％、2.5％、5％、10％、20％、50％或75％。在某些实施方案中，ADCC活性的降低和/或消除可归因于本公开的抗体或其抗原结合片段对Fc配体和/或受体的亲和力降低。
调节抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的pH依赖性TM-4SF1结合的CDR置换
本公开的一个实施方案提供了包含与治疗分子或有效负载连接的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的ADC，其中该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段表现出对TM4SF1的pH依赖性结合亲和力。在一些情况下，与其他pH范围相比，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在某些pH范围下以更高的亲和力结合TM4SF1。例如，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可以在酸性pH下以与在中性pH或碱性pH下不同的亲和力结合TM4SF1。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在酸性pH下以比在中性或碱性pH下更高的亲和力结合TM4SF1。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在酸性pH下以比在中性或碱性pH下更低的亲和力结合TM4SF1。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或抗原其结合片段在酸性pH下与TM4SF1结合并在中性或碱性pH下与TM4SF1解离。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在pH 7或更高时与TM4SF1结合并在pH 6或更低时与TM4SF1分离。在诸如血浆、胞质溶胶和细胞核等亚细胞区室中，pH为中性或碱性。在溶酶体或内体中，pH为酸性。不受任何理论的束缚，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段与抗原结合并随后被内体的膜内化。pH依赖性抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可以在内体中与TM4SF1脱离并与内体中的FcRn受体结合，并且可以被FcRn受体再循环回到循环中而不是在内体进展的溶酶体中降解。因此，pH依赖性抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可以多次结合TM4SF1抗原。因此，pH依赖性抗TM4SF1抗体和与之缔合的治疗分子或有效负载可以被FcRn受体再循环，而不在溶酶体中释放有效负载。
当抗原将结合的抗体和/或任何缔合的ADC有效负载携带到溶酶体(在其中ADC降解并释放有效负载)时，发生靶标介导的药物处置或TMDD。与TMDD相关的溶酶体毒性如Grimm等人,J.Pharmacokinet.Pharmacodyn.36(5):407-20(2009)所述，通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，本文提供了包含与治疗分子连接的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的ADC，其表现出降低的血管毒性、延长的血清半衰期和/或改善的治疗范围。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在CDR残基中包含一个或多个组氨酸氨基酸残基置换。不受任何特定理论的束缚，在抗TM4SF1抗体的适当位置处引入组氨酸残基可以允许pH可调节的对TM4SF1的结合亲和力。例如，具有pH依赖性抗TM4SF1抗体的ADC可在酸性溶酶体或内体环境中与TM4SF1解离，随后通过FcRn结合再循环到循环中。与其他方面相当的野生型抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段相比，pH依赖性抗TM4SF1抗体可表现出延长的血清半衰期和在溶酶体中降低的降解率或有效负载释放率。在一些情况下，包含pH依赖性抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的ADC可展示出半衰期延长、血管毒性降低、治疗窗改善和/或体内效力提高或至少大致等同。
本文公开了制备包含具有增加的半衰期和/或药效学作用的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的ADC的方法，这是通过以pH依赖性方式调节抗体-TM4SF1结合亲和力，包括选择抗体CDR组氨酸残基或优化影响抗体pKa的微环境的其他残基，使得抗体-TM4SF1结合在pH6.0/pH7.4时的Kd比和/或Koff比至少为2、3、4、8、10、16或更大，或在2、3、4、8、10、16或更大的范围内。在一些实施方案中，该方法包括将氨基酸置换引入抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段中，以达到在pH7.4下具有至少100nM的KD的TM4SF1亲和力，如在25℃下测量的。在某些实施方案中，所述方法包括产生在CDR残基或优化影响pKa的微环境的其他残基中富含组氨酸的抗体文库。在一些实施方案中，该抗体文库包含具有引入CDR位置的组氨酸残基的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，该抗体文库包含一系列抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其中该抗体文库中的每个抗TM4SF1抗体在不同的CDR位置包含单个组氨酸置换。在一些实施方案中，该抗体文库包含一系列抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，每个包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个组氨酸残基突变。在一些实施方案中，在抗体文库的至少一种TM4SF1抗体或抗原片段中，每个CDR位置都被突变为组氨酸。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在CDR区包含1、2、3、4、5个或更多个组氨酸置换。可将组氨酸残基工程化到抗TM4SF1抗体轻链(LC)或重链(HC)的不同位置以实现pH依赖性结合亲和力。因此，在一些实施方案中，本文提供了具有组氨酸工程化抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的ADC。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在轻链可变区(VL)的CDR1、CDR2和/或CDR3中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在轻链可变区(VL)的CDR1中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在轻链可变区(VL)的CDR2中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在轻链可变区(VL)的CDR3中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在重链可变区(VH)的CDR1、CDR2和/或CDR3中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在重链可变区(VH)的CDR1中包含一个或多个组氨酸残基。在一些在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在重链可变区(VH)的CDR2中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在重链可变区(VH)的CDR3中包含一个或多个组氨酸残基。因此，在一些实施方案中，本公开的ADC包含组氨酸工程化的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中，例如在SEQ ID No.101或SEQ ID No.131的位置30(S30H)、92(S92H)和93(N93H)中的一个或多个中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在重链的CDR1、CDR2和/或CDR3中，例如在SEQ ID No.92或SEQ ID No.130的位置28(T28H)、31(N31H)、32(Y32H)、52(N52H)、54(Y54H)、57(N57H)、100(Q100H)和101(Y101H)中的一个或多个中包含一个或多个组氨酸残基。
位置N297(Asn297)处的置换和一种或多种治疗分子与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的缀合
人IgG分子在CH2结构域的每个N297残基处具有保守的糖基化位点，使得这些悬垂的N-聚糖成为位点特异性缀合的方便目标。该糖基化位点离可变区足够远，以至于药物部分与附接的聚糖的缀合不应影响抗原结合。在本公开的一些实施方案中，使用示例性方法将治疗分子连接到聚糖，包括用高碘酸盐氧化裂解这些聚糖中包含的邻二醇部分以生成醛，所述醛可以被还原胺化并缀合至酰肼和氨氧基化合物。(参见，例如，O'Shannessy等人(1984)Immunol.Lett.8:273-77)。
另一种方法可以包括增加这些聚糖中N-乙酰葡糖胺残基的岩藻糖基化。这些岩藻糖残基的氧化可产生羧酸和醛部分，这些部分可用于将药物和荧光团连接到抗体上的这些特定位点(参见，例如，Zuberbuhler等人(2012)Chem.Commun.48:7100-02)。另一种方法可以包括修饰这些聚糖中的唾液酸(以及增加这些聚糖中的唾液酸含量)，随后氧化唾液酸并与氨氧基药物缀合以形成肟连接的缀合物(参见，例如，Zhou等人(2014)BioconjugateChem.25:510-20)。
或者，可使用唾液酸转移酶将含有生物正交官能团的修饰唾液酸残基掺入这些聚糖中。然后可以修饰生物正交官能团以将治疗分子附接到聚糖的位点(参见，例如Li等人(2014)Angew.Chem.Int.53:7179-82)。另一种修饰这些聚糖位点的方法是使用糖基转移酶将半乳糖或含有酮或叠氮化物的半乳糖类似物与这些聚糖中的N-乙酰葡糖胺连接，并将药物或放射性核苷酸与半乳糖分子连接(参见，例如Khidekel等人(2003)J.Am.Chem.Soc.125:16162-63；Clark等人(2008)J.Am.Chem.Soc.130:11576-77；Boeggeman等人(2007)Bioconjugate Chem.18:806-14)。另一种方法依赖于在通过代谢寡糖工程化表达抗体时将修饰的糖引入这些聚糖中(参见，例如Campbell等人(2007)Mol.BioSyst.3:187-94；Agard等人(2009)Acc.Chem.Res.42:788-97)。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段通过位点特异性缀合与治疗分子缀合。可以选择几种天然或工程化氨基酸，包括半胱氨酸和谷氨酰胺，作为缀合位点。
在一些情况下，可以将半胱氨酸残基工程化到抗体重链(HC)或轻链(LC)的不同位置以供偶联，例如在位置N297，即，N297C。因此，在一些实施方案中，本公开的ADC包含半胱氨酸工程化的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。
在抗TM4SF1抗体的合适位置引入半胱氨酸残基可以允许控制缀合位点，并且获得的位点特异性缀合物可能比通过野生型缀合(即通过减少链间半胱氨酸的缀合)获得的缀合物更均匀。在一些情况下，与野生型缀合物相比，包含至少一种通过半胱氨酸的缀合的ADC可展示出至少等效的体内效力、改善的药代动力学(PK)和扩大的治疗窗口。在一些实施方案中，ADC包含可切割的二肽连接体(即缬氨酸-丙氨酸)和作为药物的DNA交联吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003324235030000511
(PBD)二聚体，其在抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的Fc部分的重链位置N297C处连接至半胱氨酸。在一些情况下，ADC的平均药物与抗体之比(DAR)大于或等于1，例如约2、6、10等的DAR。
不受任何特定理论的束缚，预期通过未配对的半胱氨酸的位点特异性缀合可以是相对简单和可扩大的。例如，治疗分子偶联无需特殊试剂即可完成。在一些情况下，通过位点特异性半胱氨酸制备的ADC可以显示出更强的体内抗肿瘤活性，并且比传统缀合物具有更好的耐受性。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的位置N297可以突变为半胱氨酸，即N297C，并且该半胱氨酸残基可以与治疗分子缀合。在一些情况下，N297C突变与附近残基中的额外突变组合，以添加稳定性残基(例如精氨酸、赖氨酸)和/或去除谷氨酸。在一些情况下，除了N297C之外，来自残基292-303的一个或多个位置也被修饰。位置292-303的序列可以是REEQYCSTYRVV(SEQ ID NO:158)(在IgG1中)和REEQFCSTYRVV(SEQ IDNO:159)(在IgG4中)。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段通过谷氨酰胺残基的位点特异性缀合与治疗分子缀合。在一些情况下，微生物转谷氨酰胺酶(mTG)可用于将含胺的药物-连接体或反应性间隔区转移到抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段(例如去糖基化抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段)重链中的Q295。可以使用两步化学酶法优化缀合，其中包含生物正交叠氮基或巯基功能连接体的反应性间隔区通过mTG附接到抗体，随后与二苯并环辛炔(DBCO)或含有马来酰亚胺的MMAE反应。通过使用应变促进的叠氮化物-炔环加成(SPAAC)或巯基-马来酰亚胺化学，可以生成DAR例如约为2的ADC。
在一些情况下，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段通过谷氨酰胺残基(例如，Q295)以及位置297处的半胱氨酸N297C的位点特异性缀合而与治疗分子缀合。这种突变组合可以在抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段中打开两个缀合柄，可以获得更高DAR的ADC。因此，在本公开的一些实施方案中，提供了ADC，其中通过在N297C和Q295处的位点特异性缀合将多于一个治疗分子(例如，两个治疗分子)缀合至抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。半胱氨酸缀合可以是例如马来酰亚胺、卤代乙酰胺或另一种配偶体。
增加的DAR可导致有效的ADC构建、抗体结构的最小不稳定和增强的ADC功效。最近开发了一种基于半胱氨酸缀合的双负载连接体，其可实现模块化有效负载安装(Levengood等人,2017)。因此，仍然需要能够递送多个有效负载的ADC。
另外，ADC连接体结构和抗体-有效负载缀合方式会影响ADC的均匀性、细胞毒性效力、耐受性和药代动力学(PK)。这些关键参数可能对整体体内治疗效果起关键作用(参见，例如Lu等人,2016，Hamblett等人,2004，Junutula等人,2008，和Behrens等人,2015)。因此，改进连接体和缀合化学对于使ADC的治疗潜力和安全性谱最大化至关重要。
可以优化生物缀合模式和方法以提高ADC稳定性和功效。在一些实施方案中，一种或多种治疗剂和/或诊断剂通过马来酰亚胺与抗TM4SF1抗体或抗原结合片段缀合，例如，半胱氨酸-马来酰亚胺缀合。除马来酰亚胺之外的其他官能团——在一些情况下与抗TM4SF1抗体具有反应性，如半胱氨酸工程化的抗TM4SF1抗体的巯基，包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。在一些实施方案中，治疗剂和/或诊断剂通过乙酰胺与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段缀合。例如，治疗剂可以通过溴乙酰胺缀合与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段缀合。在一些情况下，包含溴乙酰胺缀合的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的ADC表现出增加的稳定性、延长的半衰期、降低的毒性和/或改善的治疗范围。示例性ADC结构在图1和图2中提供。
III.抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段
TM4SF1是一种具有四跨膜蛋白拓扑结构而没有同源性的小质膜糖蛋白(NCBI参考序列号NP_055035.1)(Wright等人,Protein Sci.9:1594-1600,2000)。它在质膜上形成富含TM4SF1的结构域(TMED)，在该结构域中，如同真正的四跨膜蛋白一样，它充当募集功能相关膜和胞质分子的分子促进剂(Shih等人,Cancer Res.69:3272-3277,2009；Zukauskas等人,Angiogenesis.14:345-354,2011)，并且在癌细胞生长(Hellstrom等人,CancerRes.46:391 7-3923,1986)、运动性(Chang等人,Int J Cancer.116:243-252,2005)和转移(Richman等人,Cancer Res.5916s-5920s,1995)中起重要作用。人TM4SF1蛋白的氨基酸序列(NCBI参考序列号NP_055035.1)在以下显示为SEQ ID NO:134。
MCYGKCARCI GHSLVGLALL CIAANILLYF PNGETKYASE NHLSRFVWFF SGIVGGGLLMLLPAFVFIGL EQDDCCGCCG HENCGKRCAM LSSVLAALIG IAGSGYCVIV
AALGLAEGPLCLDSLGQWNYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHIVEWNVSLFSILLALGGIEFILCLIQVINGVLGGIC GFCCSHQQQY DC(SEQ ID NO:134)
在一些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体及其抗原结合片段对TM4SF1的ECL2结构域是特异性的。人TM4SF1 ECL2结构域的氨基酸序列是
EGPLCLDSLGQWNYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHIVEWNVSLFS(SEQ ID NO:157)。
如以下表1中所述，本公开中包括对TM4SF1为特异性的新型抗体。表1中所述的抗体是单克隆鼠抗体AGX-A03、AGX-A04、AGX-A05、AGX-A07、AGX-A08、AGX-A09和AGX-A11，其中每一种在实施例中描述的筛选中鉴定，并且结合TM4SF1的ECL2区。以下表1中进一步提供了人源化抗体h AGX-A07和h AGX-A01。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含IgG重链恒定区，该IgG重链恒定区包含SEQ ID NO:87或88所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:73或74至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列。
在另一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区，该轻链恒定区包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:89至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同或100％相同的序列。
在另一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63或75所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63或75至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同或100％相同的序列。
在另一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链，该重链包含SEQ ID NO:90或92所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:90或92至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同或100％相同的序列。
在另一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链，该重链包含SEQ ID NO:112或114所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:112或114至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同或100％相同的序列。
在另一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO:9、21、33、45、57、69或81所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9、21、33、45、57、69或81至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同或100％相同的序列。
在另一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO:97、99、101、103或105所示的氨基酸序列，或与SEQID NO:97、99、101、103或105至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同或100％相同的序列。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO:97、99或101所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:97、99或101至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同或100％相同的序列。
在另一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO:122所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:122至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同或100％相同的序列。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链CDR1，该重链CDR1包含与SEQ ID NO:6、18、30、42、54、66或78至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链CDR2，该重链CDR2包含与SEQ ID NO:7、19、31、43、55、67或79至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链CDR3，该重链CDR3包含与SEQ ID NO:8、20、32、44、56、68或80至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR1，该轻链CDR1包含与SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72或84至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR2，该轻链CDR2包含与SEQ ID NO:13、25、37、49、61、73或85至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR3，该轻链CDR3包含与SEQ ID NO:14、26、38、50、62、74或86至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链CDR1，该重链CDR1包含与SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:115至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链CDR2，该重链CDR2包含与SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:116或SEQID NO:117至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链CDR3，该重链CDR3包含与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:121至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链CDR1，该轻链CDR1包含与SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126或SEQ ID NO:127至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，包含轻链CDR2，该轻链CDR2包含与SEQ ID NO:109或SEQ ID NO:128至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链CDR3，该轻链CDR3包含与SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111或SEQID NO:129至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链CDR3，该轻链CDR3包含与SEQ ID NO:110或SEQ ID NO:129至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。
鼠单克隆抗体AGX-A03的氨基酸序列在表1中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQID NO:6、7和8(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO:12、13和14(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含含有如SEQ ID NO:6、7和8氨基酸序列所示的CDR的重链可变区，和/或含有如SEQ ID NO:12、13和14氨基酸序列所示的CDR的轻链可变区。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含AGX-A03的CDR。此外，AGX-A03的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO:3和9描述。
鼠单克隆抗体AGX-A04的氨基酸序列在表1中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQID NO:18、19和20(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO:24、25和26(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含含有如SEQ ID NO:18、19和20氨基酸序列所示的CDR的重链可变区，和/或含有如SEQ ID NO:24、25和26氨基酸序列所示的CDR的轻链可变区。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含AGX-A04的CDR。此外，AGX-A04的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO:15和21描述。
鼠单克隆抗体AGX-A05的氨基酸序列在表1中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQID NO:30、31和32(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO:36、37和38(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含含有如SEQ ID NO:30、31和32氨基酸序列所示的CDR的重链可变区，和/或含有如SEQ ID NO:36、37和38氨基酸序列所示的CDR的轻链可变区。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含AGX-A05的CDR。此外，AGX-A05的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO:27和33描述。鼠单克隆抗体AGX-A07的氨基酸序列在表1中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQ ID NO:42、43和44(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO:48、49和50(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含含有如SEQ ID NO:42、43和44氨基酸序列所示的CDR的重链可变区，和/或含有如SEQID NO:48、49和50氨基酸序列所示的CDR的轻链可变区。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含AGX-A07的CDR。此外，AGX-A07的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO:39和45描述。
在一个实施方案中，提供了一种人源化的AGX-A07(h AGX-A07)抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:90的氨基酸序列所示的重链序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07(hm AGX-A07)抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:90的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的重链序列。如表6中所示，SEQ ID NO:90所示的重链序列在本文中也称为AGX-A07 H2。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:90的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的重链序列，其中所述一个或多个置换处于SEQ ID NO:90的氨基酸位置1、44和80处。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含E1Q(在重链的位置1处谷氨酸被置换为谷氨酰胺，SEQ ID NO:90)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含D44G(在重链的位置44处天冬氨酸被置换为甘氨酸，SEQ ID NO:90)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含F80Y(在重链的位置80处苯丙氨酸被置换为酪氨酸，SEQ ID NO:90)。在一些实施方案中，提供了一种人源化的突变AGX-A07抗体或抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:92的氨基酸序列所示的重链序列。如表6中所示，SEQ IDNO:92所示的重链序列在本文中也称为AGX-A07 H2v1。在一些实施方案中，提供了人源化的AGX-A07抗体或抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:97的氨基酸序列所示的轻链序列。如表6中所示，SEQ ID NO:97所示的轻链序列在本文中也称为AGX-A07 L5。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:97的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的轻链序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:97的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的轻链序列，其中所述一个或多个置换处于SEQ ID NO:97的氨基酸位置3、26、62和90处。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含I3V(在轻链的位置3处异亮氨酸被置换为缬氨酸，SEQ ID NO:97)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含N26Q(在轻链的位置26处天冬酰胺被置换为谷氨酰胺，SEQ ID NO:97)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含N26S(在轻链的位置26处天冬酰胺被置换为丝氨酸，SEQ ID NO:97)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含G62S(在轻链的位置62处甘氨酸被置换为丝氨酸，SEQ ID NO:97)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含W90Y(在轻链的位置90处色氨酸被置换为酪氨酸，SEQ ID NO:97)。在一些实施方案中，提供了人源化的突变AGX-A07抗体或抗原结合片段，其包含如选自SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:105的氨基酸序列所示的轻链序列。如表6中所示，SEQ ID NO:99所示的轻链序列在本文中也称为AGX-A07 L5v1，SEQ ID NO:101所示的轻链序列在本文中也称为AGX-A07 L5v2，SEQID NO:103所示的轻链序列在本文中也称为AGX-A07 L5v3，而SEQ ID NO:105所示的轻链序列在本文中也称为AGX-A07 L5v4。人源化AGX-A07抗体或其抗原结合片段的重链的示例性编码序列在以SEQ ID NO:91提供。人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段的重链的示例性编码序列以SEQ ID NO:93提供。人源化AGX-A07抗体或其抗原结合片段的轻链的示例性编码序列以SEQ ID NO:98(AGX-A07 L5)提供。人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段的轻链的示例性编码序列以SEQ ID NO:100(AGX-A07 L5v1)、SEQ ID NO:102(AGX-A07L5v2)、SEQ ID NO:104(AGX-A07 L5v3)和SEQ ID NO:106(AGX-A07 L5v4)提供。
在一个实施方案中，提供了一种人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:132的氨基酸序列所示的重链可变域序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:132的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的重链可变域序列。在一个实施方案中，提供了一种人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:131或SEQ ID NO:133的氨基酸序列所示的轻链可变域序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:131或SEQ ID NO:133的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的轻链可变域序列。
在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变域序列和重链可变域序列，该轻链可变域序列包含如SEQ ID NO:131的氨基酸序列所示的序列，该重链可变域序列包含如SEQ IDNO:130的氨基酸序列所示的序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变域序列和重链可变域序列，该轻链可变域序列在如SEQ ID NO:131的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换，该重链可变域序列在如SEQ ID NO:130的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变域序列和重链可变域序列，该轻链可变域序列包含如SEQ ID NO:133的氨基酸序列所示的序列，该重链可变域序列包含如SEQ ID NO:132的氨基酸序列所示的序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变域序列和重链可变域序列，该轻链可变域序列在如SEQ ID NO:133的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换，该重链可变域序列在如SEQ ID NO:132的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含重链序列，该重链序列包含如SEQ ID NO:156的氨基酸序列所示的序列，或在SEQ ID NO:156的氨基酸序列中包含一个或多个置换的序列。
在一些情况下，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:94、95和96(CDR1、CDR2和CDR3)所示的重链CDR序列，或在如SEQ ID NO:94、95和96(CDR1、CDR2和CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:94、95和96(CDR1、CDR2和CDR3)所示的重链CDR序列，或在如SEQ ID NO:94、95和96(CDR1、CDR2和CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。
在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:94所示的重链CDR1序列，或在如SEQ ID NO:94所示的序列中包含一个或多个置换的重链CDR1序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:95所示的重链CDR2序列，或在如SEQ ID NO:95所示的序列中包含一个或多个置换的重链CDR2序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:96所示的重链CDR3序列，或在如SEQ ID NO:96所示的序列中包含一个或多个置换的重链CDR3序列。
在一些情况下，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:107、109和110(CDR1、CDR2和CDR3)所示的轻链CDR序列，或在如SEQ ID NO:107、109和110(CDR1、CDR2和CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。在一些情况下，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:107、109和111(CDR1、CDR2和CDR3)所示的轻链CDR序列，或在如SEQ ID NO:107、109和111(CDR1、CDR2和CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。在一些情况下，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQID NO:108、109和110(CDR1、CDR2和CDR3)所示的轻链CDR序列，或在如SEQ ID NO:108、109和110(CDR1、CDR2和CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。在一些情况下，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:108、109和111(CDR1、CDR2和CDR3)所示的轻链CDR序列，或在如SEQ ID NO:108、109和111(CDR1、CDR2和CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。
在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:107或108所示的轻链CDR1序列，或在如SEQ ID NO:107或108所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR1序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:109所示的轻链CDR2序列，或在如SEQ ID NO:109所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR2序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:110或111所示的轻链CDR3序列，或在如SEQ ID NO:110或111所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR1序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:110所示的轻链CDR3序列，或在如SEQ ID NO:110所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR1序列。
在一些实施方案中，人源化的突变AGX-A07包含在SEQ ID NO:132(在本文中也称为AGX-A07 H2)中包含以下氨基酸置换的重链可变区：Q1E、D44G、F80Y，以及在SEQ ID NO:133(在本文中也称为AGX-A07 L5)中包含以下氨基酸置换的轻链可变区：I3V、N26Q、G62S。在一些实施方案中，人源化的突变AGX-A07包含在SEQ ID NO:132中包含以下氨基酸置换的重链可变区：Q1E、D44G、F80Y，以及在SEQ ID NO:133中包含以下氨基酸置换的轻链可变区：I3V、N26Q、G62S，其中该重链包含CDR1(SEQ ID NO:94)、CDR2(SEQ ID NO:95)和CDR3(SEQID NO:96)，并且该轻链包含CDR1(SEQ ID NO:108)、CDR2(SEQ ID NO:109)和CDR3(SEQ IDNO:110)。在一些实施方案中，人源化的突变AGX-A07是AGX-A07 H2v1L5v2，并且包含重链和轻链，该重链包含如SEQ ID NO:130所示的氨基酸序列(在本文中也称为AGX-A07 H2v1)，该轻链包含如SEQ ID NO:131所示的氨基酸序列(在本文中也称为AGX-A07 L5v2)。在一些实施方案中，人源化的突变AGX-A07包含重链和轻链，该重链包含如SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列，该轻链包含如SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列。
鼠单克隆抗体AGX-A08的氨基酸序列在表1中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQID NO:54、55和56(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO:60、61和62(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含含有如SEQ ID NO:54、55和56氨基酸序列所示的CDR的重链可变区，和/或含有如SEQ ID NO:60、61和62氨基酸序列所示的CDR的轻链可变区。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含AGX-A08的CDR。此外，AGX-A08的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO:51和57描述。
鼠单克隆抗体AGX-A09的氨基酸序列在表1中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQID NO:66、67和68(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO:72、73和74(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含含有如SEQ ID NO:66、67和68氨基酸序列所示的CDR的重链可变区，和/或含有如SEQ ID NO:72、73和74氨基酸序列所示的CDR的轻链可变区。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含AGX-A09的CDR。此外，AGX-A09的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO:63和69描述。
鼠单克隆抗体AGX-A11的氨基酸序列在表1中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQID NO:78、79和80(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO:84、85和86(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含含有如SEQ ID NO:78、79和80氨基酸序列所示的CDR的重链可变区，和/或含有如SEQ ID NO:84、85和862氨基酸序列所示的CDR的轻链可变区。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含AGX-A11的CDR。此外，AGX-A11的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO:75和81描述。
人源化抗体AGX-A01(h AGX-A01)的氨基酸序列在表6中描述。如表6中所示，SEQID NO:112所示的重链序列在本文中也称为AGX-A01 H1。具体来说，重链CDR序列如SEQ IDNO:115、116和118(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO:124、128和129(CDR1、CDR2和CDR3)所示。此外，人源化的AGX-A01的示例性重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列分别以SEQ ID NO:112和122描述。人源化的AGX-A01的重链和轻链的示例性编码序列分别以SEQ ID NO:113和123描述。
在一些实施方案中，人源化的AGX-A01抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A01(hm AGX-A01)抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:112的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的重链序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A01抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:112的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的重链序列，其中所述一个或多个置换处于SEQ ID NO:112的氨基酸位置63和106处。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含G63S(在重链的位置63处甘氨酸被置换为丝氨酸，SEQ ID NO:112)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含D106E(在重链的位置106处天冬氨酸被置换为谷氨酸，SEQ ID NO:112)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含D106S(在重链的位置106处天冬氨酸被置换为丝氨酸，SEQ ID NO:112)。在一些实施方案中，提供了一种人源化的突变AGX-A01抗体或抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:114的氨基酸序列所示的重链序列。如表6中所示，SEQ ID NO:114所示的重链序列在本文中也称为AGX-A01 H1v1。
在一些实施方案中，提供了人源化的AGX-A01抗体或抗原结合片段，其包含如SEQID NO:122的氨基酸序列所示的轻链序列。如表6中所示，SEQ ID NO:122所示的轻链序列在本文中也称为AGX-A01L10。在一些实施方案中，人源化的AGX-A01抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:122的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的轻链序列。在一些实施方案中，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段是这样的人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:122的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的轻链序列，其中所述一个或多个置换处于选自SEQ ID NO:122的氨基酸位置1、33、42、51、86和90的一个或多个氨基酸位置处。在一些实施方案中，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段是这样的人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO:122的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的轻链序列，其中所述一个或多个置换处于选自SEQ ID NO:122的氨基酸位置1、33、42、51和86的一个或多个氨基酸位置处。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含A1E(在轻链的位置1处丙氨酸被置换为谷氨酸，SEQID NO:122)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含N33S(在轻链的位置33处天冬酰胺被置换为丝氨酸，SEQ ID NO:122)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含M42Q(在轻链的位置42处甲硫酰胺被置换为谷氨酰胺，SEQ ID NO:122)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含V51L(在轻链的位置51处缬酰胺被置换为亮氨酸，SEQ ID NO:122)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含D86E(在轻链的位置86处天冬氨酸被置换为谷氨酸，SEQ ID NO:122)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含I90V(在轻链的位置90处异亮氨酸被置换为缬氨酸，SEQ ID NO:122)。
在一些情况下，人源化的AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:115(CDR1)；116(CDR2)；和118(CDR3)所示的重链CDR序列，或在如SEQ ID NO:115(CDR1)；116(CDR2)；和118(CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:115(CDR1)；116或117(CDR2)；和118、119、120或121(CDR3)所示的重链CDR序列，或在如SEQ ID NO:115(CDR1)；116或117(CDR2)；和118、119、120或121(CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。
在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:115所示的重链CDR1序列，或在如SEQ ID NO:115所示的序列中包含一个或多个置换的重链CDR1序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:116所示的重链CDR2序列，或在如SEQ ID NO:116所示的序列中包含一个或多个置换的重链CDR2序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:117所示的重链CDR2序列，或在如SEQ ID NO:117所示的序列中包含一个或多个置换的重链CDR2序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如选自SEQ IDNO:118、119、120和121的序列所示的重链CDR3序列，或在选自SEQ ID NO:118、119、120和121的序列中包含一个或多个置换的重链CDR3序列。
在一些情况下，人源化的AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:124(CDR1)；128(CDR2)；和129(CDR3)所示的轻链CDR序列，或在如SEQ ID NO:124(CDR1)；128(CDR2)；和129(CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:124、125、126或127(CDR1)；128(CDR2)；和129(CDR3)所示的轻链CDR序列，或在如SEQ ID NO:124、125、126或127(CDR1)；128(CDR2)；和129(CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。
在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:125、126、127或128所示的轻链CDR1序列，或在如SEQ ID NO:125、126、127或128所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR1序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:129所示的轻链CDR2序列，或在如SEQ ID NO:129所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR2序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:130所示的轻链CDR3序列，或在如SEQ ID NO:130所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR1序列。
在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:3所示的核酸序列编码的重链可变域，以及由SEQ ID NO:9所示的核酸序列编码的轻链可变域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:15所示的核酸序列编码的重链可变域，以及由SEQ ID NO:21所示的核酸序列编码的轻链可变域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:27所示的核酸序列编码的重链可变域，以及由SEQ ID NO:33所示的核酸序列编码的轻链可变域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:39所示的核酸序列编码的重链可变域，以及由SEQ ID NO:45所示的核酸序列编码的轻链可变域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:51所示的核酸序列编码的重链可变域，以及由SEQID NO:57所示的核酸序列编码的轻链可变域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:63所示的核酸序列编码的重链可变域，以及由SEQ ID NO:69所示的核酸序列编码的轻链可变域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:75所示的核酸序列编码的重链可变域，以及由SEQID NO:81所示的核酸序列编码的轻链可变域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:90所示的核酸序列编码的重链可变域，以及由SEQ ID NO:97所示的核酸序列编码的轻链可变域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:90所示的核酸序列编码的重链可变域，以及由SEQID NO:99所示的核酸序列编码的轻链可变域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:90所示的核酸序列编码的重链可变域，以及由SEQ ID NO:101所示的核酸序列编码的轻链可变域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:90所示的核酸序列编码的重链可变域，以及由SEQID NO:103所示的核酸序列编码的轻链可变域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:90所示的核酸序列编码的重链可变域，以及由SEQ ID NO:105所示的核酸序列编码的轻链可变域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:92所示的核酸序列编码的重链可变域，以及由SEQID NO:97所示的核酸序列编码的轻链可变域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:92所示的核酸序列编码的重链可变域，以及由SEQ ID NO:99所示的核酸序列编码的轻链可变域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:92所示的核酸序列编码的重链可变域，以及由SEQID NO:101所示的核酸序列编码的轻链可变域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:92所示的核酸序列编码的重链可变域，以及由SEQ ID NO:103所示的核酸序列编码的轻链可变域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:92所示的核酸序列编码的重链可变域，以及由SEQID NO:105所示的核酸序列编码的轻链可变域。
在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其具有与选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:114的氨基酸序列至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同的重链可变域序列；并且具有与选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105或SEQ ID NO:122的氨基酸序列至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同的轻链可变域序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其具有与选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:51、SEQID NO:63、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:114的氨基酸序列至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同的重链可变域序列；并且具有与选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:122的氨基酸序列至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同的轻链可变域序列。
在一个实施方案中，本公开包括一种抗TM4SF1抗体，该抗TM4SF1抗体是IgG，并且包含四条多肽链，包括两条各自包含重链可变域和重链恒定区CH1、CH2和CH3的重链，以及两条各自包含轻链可变域和轻链恒定区(CL)的轻链。在某些实施方案中，该抗体是人IgG1、IgG2或IgG4。在某些实施方案中，该抗体是人IgG1。在其他实施方案中，该抗体是IgG2。重链可变域序列和轻链可变域序列可含有如表6所示的CDR。
互补决定区(CDR)被称为轻链可变域与重链可变域两者中的高变区。可变域更高度保守的部分被称为框架(FR)。给定抗体的CDR和框架区(FR)可使用由Kabat等人(同上)、Lefranc等人(同上)和/或Honegger和Pluckthun(同上)描述的系统来鉴定。本领域技术人员还熟悉Kabat等人(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical InformationService,Springfield,Va.)描述的编号系统。就此而言，Kabat等人定义了一种针对可变域序列，包括用于鉴定CDR的编号系统，该编号系统适用于任何抗体。
一个或多个CDR可共价地或非共价地并入分子中，以使其成为抗原结合蛋白。
抗原结合蛋白可并有CDR作为较大多肽链的一部分，可使CDR共价连接至另一多肽链，或者可非共价地并有CDR。CDR允许抗原结合蛋白与特定目的抗原特异性结合。特别是，已知CDR3在抗体或抗体片段的抗原结合中起重要作用。
在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链，该重链包含如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:20、SEQID NO:32、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:80中任一个所示的CDR3结构域，并且包含含有与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:75中任一个所示的序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列的可变域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链，该轻链包含如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:86中任一个所示的CDR3结构域，并且具有包含与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:57、SEQID NO:69或SEQ ID NO:81中任一个所示的序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变域。因此，在某些实施方案中，CDR3结构域保持不变，而可向重链和/或轻链的其余CDR和/或框架区中引入可变性，同时该抗体或其抗原结合片段保留结合TM4SF1的能力，并且保留亲本的功能特性，例如结合亲和力，或与亲本相比具有改善的功能特性，例如结合亲和力。
在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链，该重链包含如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQID NO:31、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:79中任一个所示的CDR2结构域，并且包含含有与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:75中任一个所示的序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％或100％相同的氨基酸序列的可变域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链，该轻链包含如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:85中任一个所示的CDR2结构域，并且具有包含与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:57、SEQID NO:69或SEQ ID NO:81中任一个所示的序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变域。因此，在某些实施方案中，CDR2结构域保持不变，而可向重链和/或轻链的其余CDR和/或框架区中引入可变性，同时该抗体或其抗原结合片段保留结合TM4SF1的能力，并且保留亲本的功能特性，例如结合亲和力，或与亲本相比具有改善的功能特性，例如结合亲和力。
在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链，该重链包含如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18、SEQID NO:30、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:78中任一个所示的CDR1结构域，并且包含含有与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:81中任一个所示的序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％或100％相同的氨基酸序列的可变域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链，该轻链包含如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:84中任一个所示的CDR1结构域，并且具有包含与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:57、SEQID NO:69或SEQ ID NO:81中任一个所示的序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变域。因此，在某些实施方案中，CDR1结构域保持不变，而可向重链和/或轻链的其余CDR和/或框架区中引入可变性，同时该抗体或其抗原结合片段保留结合TM4SF1的能力，并且保留亲本的功能特性，例如结合亲和力。
在一些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体包含含有Fc区的重链，其中所述Fc区包含选自SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQID NO:145、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:153的序列：或者其中所述Fc区包含在选自SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQID NO:145、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:153的序列中包含一个或多个置换的序列。例如，在一些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体包含Fc区，其中所述Fc区包含与选自SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ IDNO:145、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:153的序列至少约70％至约100％，如至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、在至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。
在一些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体包含重链，该重链包含选自SEQ IDNO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:156的序列：或者其中所述重链包含在选自SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:154、SEQ IDNO:155和SEQ ID NO:156的序列中包含一个或多个置换的序列。例如，在一些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体包含重链，该重链包含与选自SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:156的序列至少约70％至约100％，如至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、在至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。
还可以对表1中所述的抗TM4SF1抗体和片段进行人源化。对非人抗体进行人源化的各种方法是本领域已知的。例如，人源化抗体可具有一个或多个从非人类来源引入其中的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常常被称为“输入”残基，这些残基通常取自“输入”可变域。例如，可按照Jones等人,1986,Nature 321:522-25；Riechmann等人,1988,Nature332:323-27；以及Verhoeyen等人,1988,Science 239:1534-36的方法，通过用高变区序列代替人抗体的相应序列来进行人源化。
在一些情况下，通过CDR移植来构建人源化抗体，其中将亲本非人抗体(例如啮齿动物)的六个CDR的氨基酸序列移植到人抗体框架上。例如，Padlan等人确定CDR中仅有约三分之一的残基实际上接触抗原，并且将这些残基称为“特异性决定残基”或SDR(Padlan等人,1995,FASEB J.9:133-39)。在SDR移植技术中，仅将SDR残基移植到人抗体框架上(参见，例如，Kashmiri等人,2005,Methods 36:25-34)。
选择在制备人源化抗体中使用的人轻链可变域和重链可变域对于降低抗原性而言都可能是重要的。例如，根据所谓的“最佳匹配”方法，相对于已知人类可变域序列的整个文库来筛查非人(例如啮齿动物)抗体的可变域的序列。可将与啮齿动物序列最接近的人类序列选择为人源化抗体的人框架(Sims等人,1993,J.Immunol.151:2296-308；以及Chothia等人,1987,J.Mol.Biol.196:901-17)。另一种方法使用衍生自具有特定轻链或重链子组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同框架可用于若干不同人源化抗体(Carter等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89；以及Presta等人,1993,J.Immunol.151:2623-32)。在一些情况下，框架衍生自最丰富的人子类——VL6子组I(VL6 I)和VH子组III(VHIII)的共有序列。在另一种方法中，使用人种系基因作为框架区的来源。
通常更理想的是，使抗体在保留它们对抗原的亲和力和其他有利生物性质的情况下人源化。为了实现这个目标，根据一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且为本领域技术人员所熟悉。可获得用来说明并展示所选候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序。这些程序包括例如WAM(Whitelegg和Rees,2000,Protein Eng.13:819-24)、Modeller(Sali和Blundell,1993,J.Mol.Biol.234:779-815)和Swiss PDB Viewer(Guex和Peitsch,1997,Electrophoresis 18:2714-23)。对这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中可能的作用，例如分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可从接受序列和输入序列选择并组合FR残基，以便实现所需抗体特性，如增加的对靶抗原的亲和力。通常，高变区残基直接并最实质性地参与影响抗原结合。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳匹配”方法选择的框架区(参见例如Sims等人,J.Immunol.151(1993)2296)；衍生自具有轻链可变区或重链可变区特定子组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89(1992)4285；以及Presta等人,J.Immunol.,151(1993)2623)；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；以及通过筛查FR文库获得的框架区(参见例如Baca等人,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684以及Rosok等人,J.Biol.Chem.271(1996)22611-22618)。
人源化抗体及其制备方法例如综述于Almagro和Fransson,Front.Biosci.13(2008)1619-1633中，并且还描述于例如Riechmann等人,Nature 332(1988)323-329；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；美国专利5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36(2005)25-34(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua等人,Methods 36(2005)43-60(描述“FR改组”)；以及Osbourn等人,Methods 36(2005)61-68和Klimka等人,Br.J.Cancer,83(2000)252-260(描述FR改组的“指导选择”方法)中。
在一个实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x10-6M或更低的KD与食蟹猴TM4SF1结合。
在某些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x 10-8M或更低的KD与人TM4SF1的ECL2环上的表位结合，如在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中所确定的。
在某些实施方案中，在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x 10-8M或更低的KD与人TM4SF1结合。
在某些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x10-3M至约1x10-4M、约1x10-4M至约1x10-5M、约1x10-5M至约1x10-6M、约1x10-6至约1x10-7M、约1x10-7至约1x10-8M、约1x10-8M至约1x10-9M、约1x10-9M至约1x10-10M、约1x10-10M至约1x10-11M、约1x10-11M至约1x10-12M、约2x10-3M至约2x10-4M、约2x10-4M至约2x10-5M、约2x10-5M至约2x10-6M、约2x10-6至约2x10-7M、约2x10-7至约2x10-8M、约2x10-8M至约2x10-9M、约2x10-9M至约2x10-10M、约2x10-10M至约2x10-11M、约2x10-11M至约2x10-12M、约3x10-3M至约3x10-4M、约3x10-4M至约3x10- 5M、约3x10-5M至约3x10-6M、约3x10-6至约3x10-7M、约3x10-7至约3x10-8M、约3x10-8M至约3x10- 9M、约3x10-9M至约3x10-10M、约3x10-10M至约3x10-11M、约3x10-11M至约3x10-12M、约4x10-3M至约4x10-4M、约4x10-4M至约4x10-5M、约4x10-5M至约4x10-6M、约4x10-6至约4x10-7M、约4x10-7至约4x10-8M、约4x10-8M至约4x10-9M、约4x10-9M至约4x10-10M、约4x10-10M至约4x10-11M、约4x10-11M至约4x10-12M、约5x10-3M至约5x10-4M、约5x10-4M至约5x10-5M、约5x10-5M至约5x10-6M、约5x10-6至约5x10-7M、约5x10-7至约5x10-8M、约5x10-8M至约5x10-9M、约5x10-9M至约5x10-10M、约5x10-10M至约5x10-11M、约5x10-11M至约5x10-12M、约5x10-7M至约5x10-11M、约5x10-7M、约1x10- 7M、约5x10-8M、约1x10-8M、约5x10-9M、约1x10-9M、约5x10-10M、约1x10-10M、约5x10-11M或约1x10-11M的KD与人TM4SF1结合。在一些实施方案中，该KD在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中确定。
在某些实施方案中，在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x10-10M或更低的KD与人TM4SF1结合。
在某些实施方案中，在使用过表达HEK293的细胞的标准流式细胞术测定中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x10-6M或更低的KD与食蟹猴TM4SF1结合。在一个实施方案中，HEK293细胞被转染以表达食蟹猴TM4SF1。在进一步的实施方案中，HEK293细胞以约600个mRNA拷贝/106个18S rRNA拷贝表达食蟹猴TM4SF1。
测定抗体或抗体片段的KD的方法是本领域已知的。例如，表面等离子体共振可用于测定抗体对抗原的KD(例如，在25℃下使用BIACORE 2000或BIACORE 3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)，其中抗原或Fc受体以约10个响应单位(RU)固定在CM5芯片上)。在某些实施方案中，使用FACS或流式细胞术测定KD，由此使用表达TM4SF1的细胞如HEK293细胞或HUVEC细胞结合抗体或片段，并根据标准方法测量KD。使用流式细胞术测定抗体的亲和力例如描述于Geuijen等人(2005)J Immunol Methods.302(1-2):68-77中。在某些实施方案中，使用FACS测定抗体的亲和力。
在一个实施方案中，本公开表征了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段具有含有保守性氨基酸置换的本文所述的CDR氨基酸序列，使得该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含与表1所示CDR氨基酸序列至少95％相同(或至少96％相同，或至少97％相同，或至少98％相同，或至少99％相同)的CDR的氨基酸序列。“保守性氨基酸置换”是其中某一氨基酸残基被具有化学性质(例如电荷或疏水性)类似的侧链(R基团)的另一氨基酸残基代替的置换。通常，保守性氨基酸置换基本上不改变蛋白质的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列因保守性置换而彼此不同的情况下，序列同一性百分比或相似性程度可以向上调整，以校正该置换的保守性质。用于进行这种调整的手段是本领域技术人员公知的。参见，例如，Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331，通过引用并入本文。具有化学性质类似的侧链的氨基酸的群组的实例包括(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。
在一方面，本公开进一步表征了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，如在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中所确定的，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x10-8M或更低的KD与人TM4SF1的ECL2环上的表位结合，其中该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有人IgG框架区的轻链可变区，并且包含含有人IgG框架区的重链可变区。在一个实施方案中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的。在一个实施方案中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段与食蟹猴TM4SF1交叉反应。
在本公开的另一方面，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，如在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中所确定的，其以约5x10-8M或更低的KD与人TM4SF1的ECL2环上的表位结合。在一个实施方案中，在使用过表达HEK293的细胞的标准流式细胞术测定中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x10-6M或更低的KD与食蟹猴TM4SF1结合。在一个实施方案中，在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x10-8M或更低的KD与人TM4SF1结合。在一个实施方案中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以1x10-3M至约1x10-4M、约1x10-4M至约1x10-5M、约1x10-5M至约1x10-6M、约1x10-6至约1x10-7M、约1x10-7至约1x10-8M、约1x10-8M至约1x10-9M、约1x10-9M至约1x10-10M、约1x10-10M至约1x10-11M、约1x10-11M至约1x10-12M、约2x10-3M至约2x10-4M、约2x10-4M至约2x10-5M、约2x10-5M至约2x10-6M、约2x10-6至约2x10-7M、约2x10-7至约2x10-8M、约2x10-8M至约2x10-9M、约2x10-9M至约2x10-10M、约2x10-10M至约2x10-11M、约2x10-11M至约2x10-12M、约3x10-3M至约3x10-4M、约3x10-4M至约3x10-5M、约3x10-5M至约3x10-6M、约3x10-6至约3x10-7M、约3x10-7至约3x10-8M、约3x10-8M至约3x10-9M、约3x10-9M至约3x10-10M、约3x10-10M至约3x10-11M、约3x10-11M至约3x10-12M、约4x10-3M至约4x10-4M、约4x10-4M至约4x10-5M、约4x10-5M至约4x10-6M、约4x10-6至约4x10-7M、约4x10-7至约4x10-8M、约4x10-8M至约4x10-9M、约4x10-9M至约4x10-10M、约4x10-10M至约4x10-11M、约4x10-11M至约4x10-12M、约5x10-3M至约5x10-4M、约5x10-4M至约5x10-5M、约5x10-5M至约5x10-6M、约5x10-6至约5x10-7M、约5x10-7至约5x10-8M、约5x10-8M至约5x10-9M、约5x10-9M至约5x10-10M、约5x10-10M至约5x10-11M、约5x10-11M至约5x10-12M、约5x10-7M至约5x10-11M、约5x10-7M、约1x10-7M、约5x10-8M、约1x10-8M、约5x10-9M、约1x10-9M、约5x10-10M、约1x10-10M、约5x10-11M或约1x10-11M的KD与人TM4SF1结合。在一些实施方案中，该KD在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中确定。在一个实施方案中，在使用表达TM4SF1的HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x10-10M或更低的KD与人TM4SF1结合。
在一个实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体或抗原结合片段与人TM4SF1的结合不依赖于人TM4SF1的ECL2环的糖基化，即抗体的结合不依赖于TM4SF1的在ECL2环(SEQ IDNO:77)内的糖基化。
本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可以是任何同种型(例如但不限于IgG、IgM和IgE)中的任一种。在某些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段是IgG同种型。在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段是IgG1、IgG2或IgG4同种型。在某些实施方案中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人IgG1、人IgG2或人IgG4同种型。
在ADCC和/或CDC活性方面，IgG2是天然最低的(An等人,
MAbs.2009年11月-12月；1(6):572–579)。因此，在某些实施方案中，有利地使用IgG2。然而，IgG2具有两个额外半胱氨酸(导致4个铰链间二硫键)，这使其倾向于通过形成抗体间二硫键而聚集。在相关实施方案中，对IgG2半胱氨酸进行突变以减少聚集。
本公开提供了与TM4SF1结合的抗体片段。在某些情况下，使用抗体片段而非完整抗体存在优势。片段的较小大小允许快速清除，并且可导致改进的细胞、组织或器官可及性。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人,2003,Nature Med.9:129-34。
已开发了用于产生抗体片段的各种技术。在传统上，这些片段通过蛋白水解消化完整抗体而获得(参见例如Morimoto等人,1992,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-17；以及Brennan等人,1985,Science 229:81-83)。然而，这些片段现在可以直接由重组宿主细胞产生。Fab、Fv和scFv抗体片段全部可在大肠杆菌或酵母细胞中表达并从大肠杆菌或酵母细胞分泌，由此允许轻松产生大量这些片段。可从以上讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，可以直接从大肠杆菌中回收Fab’-SH片段，并且化学偶联以形成F(ab’)2片段(Carter等人,1992,Bio/Technology 10:163-67)。根据另一方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab’)2片段。例如，美国专利5,869,046中描述了包含补救受体结合表位残基的具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段。产生抗体片段的其他技术对熟练技术人员来说是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)(参见，例如，WO 93/16185；美国专利5,571,894和5,587,458)。Fv和scFv具有完整的组合位点，其没有恒定区；因此，它们可能适合在体内使用过程中减少的非特异性结合。可以构建scFv融合蛋白，以在scFv的氨基或羧基末端产生效应蛋白的融合(参见，例如，Borrebaeck编，同上)。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如，如以上引用的参考文献所述。这类线性抗体可以是单特异性的或多特异性的，如双特异性的。
在某些实施方案中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和scFv。
例如，对人TM4SF1具有高亲和力的抗TM4SF1抗体(和片段)可使用本领域已知的筛选技术来鉴定。例如，单克隆抗体可使用首先由Kohler等人,1975,Nature 256:495-97描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利4,816,567)。
在杂交瘤方法中，例如使用人TM4SF1的ECL2环或表达TM4SF1的细胞(由此在细胞表面上表达ECL2环)免疫小鼠或其他适当的宿主动物，如仓鼠，以引发产生或能够产生将与用于免疫的蛋白质特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，可在体外免疫淋巴细胞。在免疫后，分离淋巴细胞，然后使用合适的融合剂如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice 59-103(1986))。
接种由此制备的杂交瘤细胞，并使其在合适的培养基中生长，在某些实施方案中，该培养基含有一种或多种抑制未融合亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质(也被称为融合配偶体)。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的选择性培养基一般将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，它们阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
示例性融合配偶体骨髓瘤细胞是高效融合，支持由所选抗体生产细胞稳定高水平产生抗体，并且对针对未融合亲本细胞进行选择的选择性培养基敏感的细胞。示例性骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，如SP-2和衍生物，例如可从美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection，Manassas,Va.)获得的X63-Ag8-653细胞，以及来源于可从SalkInstitute Cell Distribution Center(San Diego,Calif.)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系。还已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(Kozbor,1984,Immunol.133:3001-05；以及Brodeur等人,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications 51-63(1987))。
测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。通过免疫沉淀或通过体外结合测定如RIA或ELISA来测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson等人,1980,Anal.Biochem.107:220-39中所述的Scatchard分析来测定。
一旦鉴定出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，即可通过有限稀释程序对克隆进行亚克隆，并且通过标准方法使其生长(Goding，同上)。用于该目的的合适的培养基包括例如DMEM或RPMI-1640培养基。另外，例如通过将细胞腹膜内注射到小鼠中，可使杂交瘤细胞在动物中体内生长为腹水肿瘤。
通过常规抗体纯化程序，例如亲和色谱法(例如使用蛋白A或蛋白G-琼脂糖)或离子交换色谱法、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析等，从培养基、腹水或血清中适当地分离由亚克隆分泌的单克隆抗体。
使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，易于对编码单克隆抗体的DNA进行分离和测序。杂交瘤细胞可充当这类DNA的来源。一旦分离，即可将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或者否则不产生抗体蛋白质的骨髓瘤细胞中，以获得在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra等人,1993,Curr.Opinion in Immunol.5:256-62以及Pluckthun,1992,Immunol.Revs.130:151-88。
在进一步的实施方案中，单克隆抗体或抗体片段可从使用例如在Antibody PhageDisplay:Methods and Protocols(O’Brien和Aitken编,2002)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离。在原则上，通过筛查含有展示与噬菌体外壳蛋白融合的抗体可变区(Fv)的各种片段的噬菌体的噬菌体文库来选择合成抗体克隆。针对所需抗原筛查这类噬菌体文库。使表达能够结合所需抗原的Fv片段的克隆吸附于抗原，因此与文库中的非结合克隆分离。然后将结合克隆从抗原中洗脱下来，并且可通过额外的抗原吸附/洗脱循环来进一步富集。
可使可变域功能性地在噬菌体上展示为单链Fv(scFv)片段，其中VH和VL通过短柔性肽共价连接，或展示为Fab片段，其中VH和VL各自与恒定域融合并且非共价地相互作用，如例如Winter等人,1994,Ann.Rev.Immunol.12:433-55中所述。
VH和VL基因的组库(Repertoires)可通过PCR单独地克隆，并且在噬菌体文库中随机重组，然后可搜索噬菌体文库中的抗原结合克隆，如Winter等人(同上)所述。来自经免疫的来源的文库提供对免疫原具有高亲和力的抗体，而无需构建杂交瘤。或者，可以克隆天然组库以提供单一来源的针对广泛范围的非自身抗原以及自身抗原的人抗体，而不进行任何免疫，如Griffiths等人,1993,EMBO J 12:725-34所述。最后，还可以通过以下方式合成制备天然文库：从干细胞克隆未重排的V基因区段，以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高变CDR3区域并实现体外重排，如例如Hoogenboom和Winter,1992,J.Mol.Biol.227:227-88所述。
对文库的筛查可通过本领域中已知的各种技术来实现。例如，可使用TM4SF1(例如ECL2环的可溶性形式或表达所述环的细胞)包被吸附板的各孔，在固定于吸附板或在细胞分选中使用的宿主细胞上表达，缀合至生物素以供用链霉亲和素包被的珠子捕集，或者在用于淘选展示文库的其他任何方法中使用。通过使用如Bass等人,1990,Proteins 8:309-14以及WO 92/09690所述的长时间洗涤和单价噬菌体展示，以及通过使用如Marks等人,1992,Biotechnol.10:779-83所述的低抗原包被密度，可以促进对具有缓慢解离动力学(例如良好结合亲和力)的抗体的选择。
抗TM4SF1抗体可通过以下方式获得：设计适于选择目的噬菌体克隆的抗原筛选程序，随后使用来自目的噬菌体克隆的VH和/或VL序列(例如Fv序列)或来自VH和VL序列的各种CDR序列以及Kabat等人(同上)所述的适当恒定区(例如Fc)序列来构建全长抗TM4SF1抗体克隆。
可使用本领域中已知以及本文所述的结合测定对抗TM4SF1抗体进行筛选，以确定抗体是否对TM4SF1的ECL2环具有治疗性亲和力。抗体抑制或降低转移性细胞活性的能力可使用本领域中的标准测定以及本文所述的测定来测量。临床前测定需要使用通常属于以下三种类型之一的动物转移模型：(i)通常通过用以产生肺转移的尾静脉注射，通过用以产生肝转移的门静脉或脾内注射，或通过用以产生骨转移和其他转移的左心室心脏注射，将转移性小鼠肿瘤细胞如B16F10黑素瘤TC注射至小鼠中；(ii)将转移性肿瘤细胞或完整肿瘤片段正位移植至小鼠中，所述方法常常需要稍后手术切除原发性肿瘤以预防与原发性肿瘤生长相关的发病；和(iii)自发性转移的遗传工程小鼠模型，其中最常见的是MMTV-Pyt(小鼠乳腺肿瘤病毒-多瘤病毒中T抗原)小鼠乳腺癌模型，该模型提供人类癌症转移的一种高度真实的小鼠模型；超过85％的半合子MMTV-PyMT雌性自发地发生可触知的乳腺肿瘤，所述肿瘤在8-16周龄时转移至肺。通过随TM4SF1免疫阻断程度而变化的，处死动物的肺中转移性结节的活体动物成像或直接计数来量化肺中的转移性负荷，以及实现例如肺转移降低至少50％的治疗水平，将指示例如治疗性抗体可以在本公开的方法中使用。此外，跨物种反应性测定在本领域中是已知的。可使用的测定的实例例如描述于Khanna和Hunter(Carcinogenesis.2005年3月；26(3):513-23)以及Saxena和Christofori(Mol Oncol.2013年4月；7(2):283-96)中，这些文献通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，所述抗TM4SF1抗体及其抗原结合片段例如可用来治疗或预防癌症。在某些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体和抗原结合片段可用来预防肿瘤细胞的转移。在一些实例中，本公开的抗TM4SF1抗体及其抗原结合片段通过干扰肿瘤细胞与血管内皮细胞之间的相互作用来预防肿瘤细胞转移。
IV.ADC中的治疗分子
在一些实施方案中，本公开的ADC包含与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段缀合的一种或多种治疗剂(本文中也称为治疗分子或治疗剂)。在一些实施方案中，该药剂是治疗剂或诊断剂。在一些实施方案中，该治疗剂是生物活性部分。在一些实施方案中，该生物活性部分包括放射性同位素、细胞毒性剂、化学治疗剂、蛋白质、肽、抗体、生长抑制剂、前药活化酶和抗激素剂。在一些实施方案中，治疗分子可以是小分子(例如，用于癌症和非癌症血管生成适应症)；V-ATP酶抑制剂；促凋亡剂；Bcl2抑制剂；MCL1抑制剂；HSP90抑制剂；IAP抑制剂；mTor抑制剂；微管稳定剂；微管去稳定剂；瑞奥西汀(auristatin)；多拉司他汀；美登木素生物碱；MetAP(甲硫氨酸氨肽酶)；蛋白质核输出抑制剂CRM1；DPPIV抑制剂；蛋白酶体抑制剂；线粒体中的磷酰基转移反应的抑制剂；蛋白质合成抑制剂；激酶抑制剂(如CDK2抑制剂、CDK9抑制剂)；驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂、DHFR抑制剂、核酸、CRISPR酶；降解剂(如诱导蛋白质降解的试剂，(例如，HSP90抑制剂、选择性雌激素受体降解剂(SERD)、选择性雄激素受体降解剂(SARD)；可用于将分子伴侣募集到目的蛋白质的疏水性标签，例如金刚烷，Arg-Boc3；E3连接酶募集配体，例如，Nutlin-3a(MDM2配体)、苯丁抑制素(cIAP配体)、VHL配体、泊马度胺(CRBN配体)；可以利用不同的D3连接酶靶向目的蛋白质进行降解的蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC))(参见，例如，Lai AC,Crews CM.Induced protein degradation:an emerging drug discoveryparadigm.Nat Rev Drug Discov.2016；16(2):101-114)；反义寡核苷酸；RNAi剂(如siRNA)，CRISPR-Cas9基因编辑系统；RNA分子；DNA，例如，质粒；抗癌剂、抗炎剂、抗感染剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂)、麻醉剂；RNA聚合酶II抑制剂；DNA嵌入剂、DNA交联剂；抗微管蛋白剂；细胞毒性药物、肿瘤疫苗、抗体、肽、肽体、化疗剂、细胞毒性剂；细胞抑制剂；免疫调节剂、干扰素、白介素、免疫刺激性生长激素、细胞因子、维生素、矿物质、芳香酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、HDAC抑制剂；用于包封一种或多种治疗分子的脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，放射性同位素可以是选自211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P和Lu的放射性同位素的一种或多种，但不限于此。在一些实施方案中，前药活化酶是选自下组的一种或多种：碱性磷酸酶、芳基硫酸酯酶、胞嘧啶脱氨酶、蛋白酶、D-丙氨酰羧肽酶、碳水化合物裂解酶、β-内酰胺酶和青霉素酰胺酶，但不限于此。
在一些实施方案中，细胞毒性剂包括选自下组的一种或多种：蓖麻毒蛋白、皂草毒蛋白(saporin)、白树毒素(gelonin)、苦瓜蛋白(momordin)、debouganin、白喉毒素、假单胞菌毒素等，但不限于此。在一些情况下，细胞毒性剂是选自下组的一种或多种：顺铂、卡铂、奥沙利铂、紫杉醇、美法仑、多柔比星、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、氮芥、环磷酰胺、博来霉素、加利车霉素、美登素、单端孢霉烯(trichothene)、CC1065、白喉A链、铜绿假单胞菌外毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆蛋白A链、塑莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素、单端孢霉烯类、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶，但不限于此。在一些实施方案中，细胞毒性剂为选自下组的一种或多种：倍癌霉素、单甲基瑞奥西汀E(MMAE)、单甲基瑞奥西汀F(MMAF)、N2′-脱乙酰基-N2′-(3-巯基-1-氧代丙基)美登素(DM1)、PBD(吡咯并苯并二氮杂
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)二聚体、倍癌霉素、单甲基瑞奥西汀E(MMAE)、单甲基瑞奥西汀F(MMAF)，但不限于此。在一些实施方案中，细胞毒性剂包括核糖体失活蛋白、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、微管蛋白抑制剂、烷化剂、抗生素、抗肿瘤剂、抗增生剂、抗代谢物、拓扑异构酶I或II抑制剂、激素激动剂或拮抗剂、免疫调节剂、DNA小沟结合物和放射性药剂。在某些实施方案中，核糖体失活蛋白是皂草毒蛋白(saporin)。在一些实施方案中，该诊断剂是标记物。在一些实施方案中，该标记物是荧光标记物、发色标记物或放射性标记物。在一些实施方案中，所述药剂直接缀合至抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。在其他实施方案中，所述药剂任选地通过连接体间接缀合至抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开的ADC包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和一种或多种药剂(例如1、2、3或4种或更多种药剂)，如治疗剂，所述药剂在治疗与病理性血管生成相关的病症如癌症中，与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以累加方式或以协同方式作用，例如杀伤或抑制肿瘤细胞(TC)和/或肿瘤血管结构内皮细胞(EC)。例如，该治疗剂可以是生物活性部分，如细胞毒性剂、化疗剂、蛋白质、肽、抗体、生长抑制剂和/或抗激素剂。
可以与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段直接或间接缀合的微管蛋白抑制剂的实例可包括不限于聚合抑制剂(例如长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、长春氟宁、念珠藻素52(cryptophycin 52)、软海绵素(hallchondrin)、多拉司他汀、可结合微管蛋白的长春结构域的hemiasterlin；秋水仙碱、考布他汀、2-甲氧基-雌二醇、可结合微管蛋白的秋水仙碱结构域的E7010；解聚抑制剂，如紫杉醇、多西他赛、埃博霉素(epothilon)、可结合紫杉烷位点的盘皮海绵内酯(discodermolide))。
示例性化疗剂包括但不限于氨甲蝶呤、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂；酶及其片段，如核分解酶、抗生素、以及毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括它们的片段和/或变体。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉(diphtheria)A链、白喉毒素的非结合性活性片段、外毒素(exotoxin)A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲霉素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、mitogellin、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯(tricothecene)。
另外，多种放射性核素可用于将抗TM4SF1抗体或抗原结合片段与治疗剂缀合，以生成本公开的ADC。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Sm153、Bi212、P32，以及Lu的放射性同位素。或者，抗TM4SF1抗体或抗原结合片段可以缀合至一个或多个较小的分子毒素，如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱(maytansinoid)、多拉司他汀(dolastatin)、aurostatin、单端孢霉烯和CC1065，并且本文还涉及这些毒素的具有毒素活性的衍生物。在各个实例中，可与本公开的TM4SF1结合蛋白缀合的其他治疗剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱和5-氟尿嘧啶等。
在一些实施方案中，用于缀合的诊断剂是标记物，如荧光标记、发色标记或放射性标记。因此，标记物可用于检测目的，并且可以是荧光化合物、酶、辅基、发光物质、生物发光物质或放射性物质。例如，放射性标记可包含用于闪烁照相研究的放射性原子，例如Tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也被称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
一种或多种药剂(例如治疗剂和/或诊断剂)可以与抗TM4SF1抗体或抗原结合片段直接缀合(例如通过直接共价或非共价相互作用的方式)，以使药剂直接地与该蛋白质缀合。药剂可以例如通过直接肽键而直接缀合至本公开的结合蛋白。在其他情况下，直接缀合是通过直接非共价相互作用，如抗TM4SF1抗体或抗原结合片段与特异性结合该抗TM4SF1抗体或抗原结合片段的药剂之间的相互作用。
V.连接体
一种或多种药剂(例如治疗剂和/或诊断剂)可以与抗TM4SF1抗体或抗原结合片段间接缀合(例如，通过采用直接共价或非共价相互作用的连接体的方式)。连接体可以是化学连接剂，如同双官能性和异双官能性交联剂，它们可从许多商业来源获得。可用于交联的区域可在本公开的结合蛋白(例如抗TM4SF1抗体)上发现。连接体可包含柔性臂，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碳原子。示例性的连接体包括：BS3([双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯]；BS3是一种靶向可及的伯胺的同双官能性N-羟基琥珀酰亚胺酯)、NHS/EDC(N-羟基琥珀酰亚胺和N-乙基-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺；NHS/EDC允许伯胺基团与羧基的缀合)、磺基-EMCS([N-e-马来酰亚胺基己酸]酰肼；磺基-EMCS是对巯基和氨基具有反应性的异双官能性反应性基团(马来酰亚胺和NHS酯))、酰肼(大多数蛋白质含有暴露的碳水化合物，并且酰肼是可用于使羧基连接至伯胺的试剂)以及SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯；SATA对胺具有反应性，并且添加经保护的巯基)。为了形成共价键，可使用具有广泛多种活性羧基(例如酯)的化学反应性基团，其中羟基部分在对肽进行修饰所需的水平上是生理学上可接受的。特定试剂包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基-磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、马来酰亚胺-苯甲酰基-琥珀酰亚胺(MBS)、γ-马来酰亚胺基-丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、马来酰亚胺基丙酸(MPA)、马来酰亚胺基己酸(MHA)和马来酰亚胺基十一烷酸(MUA)。伯胺是NHS酯的主要靶标。存在于蛋白质的N末端上的可及的a-氨基和赖氨酸的ε-胺与NHS酯反应。当NHS酯缀合反应物与伯胺反应时形成酰胺键，从而释放N-羟基琥珀酰亚胺。这些含有琥珀酰亚胺的反应性基团在本文中被称为琥珀酰亚胺基。在本公开的某些实施方案中，蛋白质上的官能团将是巯基，并且化学反应性基团将是含有马来酰亚胺基的基团，如γ-马来酰亚胺-丁酰胺(GMBA或MPA)。这类含有马来酰亚胺的基团在本文中被称为马来酰亚胺基。当反应混合物的pH是6.5-7.4时，马来酰亚胺基对肽上的巯基最具选择性。在pH 7.0时，马来酰亚胺基与巯基(例如蛋白质如血清白蛋白或IgG上的巯基)的反应速率是与胺的反应速率和1000倍。因此，可形成马来酰亚胺基与巯基之间的稳定硫醚连接。
在一些实施方案中用于缀合如本文所述的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的其他示例性连接体/连接体化学包括可在点击缀合，例如两步缀合中使用的部分，在两步缀合中第一部分与工程化半胱氨酸缀合(例如，在具有N297C突变的位置N297处)，所述第一部分包含反应性柄，第二部分包含与第一部分反应的连接体-有效负载。第一部分的反应柄和第二部分之间可能发生的反应的一个实例是利用应变促进的叠氮化物-炔环加成的无金属点击反应。部分的实例包括但不限于与叠氮化物或四嗪反应的双环壬炔(BCN)、与叠氮化物反应的二苯并环辛炔(DBCO)——也表示为氮杂-二苯并环辛炔(DIBAC)、与四嗪(如甲基四嗪)反应的反式环辛烯(TCO)或与四嗪反应的甲基环戊烯点击柄。此类部分的具体实例如下，但不限于：二苄基环辛炔-PegX-羧酸，6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸全氟苯酯，化学式：C16H12F5NO4，分子量：377.27；6-(3,4-二溴-2,5-二氧-2,5-二氢代-1H-吡咯-1-基)己酸，化学式：C10H11Br2NO4，分子量：369.01；(2-甲基环丙-2-烯-1-基)甲基氨基甲酸酯(E)-环辛-4-烯-1-基(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯3-(5-甲基吡啶-2-基)-6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪；((1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯，化学式：C17H28N2O4，分子量：324.42；((1R,8S,9s)-双环[6.10]壬-4-炔-9-基)甲基(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯，化学式：C17H28N2O4，分子量：324.42。
在其他实施方案中，连接体包括至少一个氨基酸(例如具有至少2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、40或50个氨基酸的肽)。在某些实施方案中，该连接体是单一氨基酸(例如任何天然存在的氨基酸，如Cys)。在其他实施方案中，可使用肽，如富含甘氨酸的肽。在一些情况下，该连接体可以是单一氨基酸(例如任何氨基酸，如Gly或Cys)。合适的连接体的实例是琥珀酸、Lys、Glu和Asp，或二肽，如Gly-Lys。当连接体是琥珀酸时，其一个羧基可与氨基酸残基的氨基形成酰胺键，其另一个羧基例如可与肽或取代基的氨基形成酰胺键。当连接体是Lys、Glu或Asp时，其羧基可与氨基酸残基的氨基形成酰胺键，而其氨基例如可与取代基的羧基形成酰胺键。当Lys用作连接体时，可以在Lys的ε-氨基与取代基之间插入另一连接体。在一个特定实施方案中，所述另一连接体是琥珀酸，其例如与Lys的ε-氨基以及与存在于取代基中的氨基形成酰胺键。在一个实施方案中，所述另一连接体是Glu或Asp(例如，其与Lys的ε-氨基形成酰胺键，并且与存在于取代基中的羧基形成另一酰胺键)，即，该取代基是NE酰化的赖氨酸残基。
在一些实施方案中，如本文所述的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和寡核苷酸(例如，核酸分子，如RNA分子或DNA分子)可以是使用诸如遗传缀合、酶促缀合、化学缀合或其任意组合等多种方法的缀合物。
在一些实施方案中，可以使用涉及使用哺乳动物或细菌转谷氨酰胺酶的酶促位点特异性缀合方法将ADC内的RNA分子缀合至抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。微生物转谷氨酰胺酶(mTG)是现代研究和生物技术中的多功能工具。大量的相对较纯的酶的可获得性、易用性以及钙和鸟嘌呤-5'-三磷酸(GTP)的调节缺乏使mTG成为食品工业和生物技术中使用的主要交联酶。当前，mTG在许多应用中用来将蛋白质和肽附接至小分子、聚合物、表面、DNA以及其他蛋白质上。参见，例如，Pavel Strp,Veracity of microbial transglutaminase,Bioconjugate Chem.25,5,855-862。
在一些实施方案中，所述缀合物内的RNA分子可以通过具有直接共价或非共价相互作用的连接体与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段缀合。连接体可以是基于氨基酸或肽的连接体，或化学连接剂，如同双官能性和异双官能性交联剂，它们可从许多商业来源获得。可用于交联的区域可在本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段上发现。连接体可包含柔性臂，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碳原子。示例性连接体包括可切割的、不可切割的、共价或非共价连接体，或其任意组合。在一些实施方案中，可切割的连接体包括酸不稳定的连接体、蛋白酶敏感的连接体、光不稳定的连接体或含二硫键的连接体。在一些实施方案中，该连接体包括半胱氨酸连接体或非半胱氨酸连接体，如赖氨酸连接体。在一些实施方案中，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含非天然氨基酸，其中该抗体或抗体片段与寡核苷酸通过非天然氨基酸连接/缀合。
在一些实施方案中，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含天然氨基酸，其中该抗体或抗体片段与寡核苷酸通过天然氨基酸连接/缀合。非天然氨基酸可插入抗体或抗体片段中的两个天然存在的氨基酸之间。一个或多个非天然氨基酸可代替抗体或抗体片段中的一个或多个天然存在的氨基酸。一个或多个非天然氨基酸可在抗体或抗体片段的N末端并入。一个或多个非天然氨基酸可在抗体或抗体片段的C末端并入。非天然氨基酸可在抗体或抗体片段的结合区的远端并入。非天然氨基酸可在抗体或抗体片段的结合区的附近并入。非天然氨基酸可在抗体或抗体片段的结合区并入。
一个或多个非天然氨基酸可由密码子编码，该密码子不编码二十种天然氨基酸之一。一个或多个非天然氨基酸可由无义密码子(终止密码子)编码。该终止密码子可以是琥珀密码子。该琥珀密码子可包含UAG序列。该终止密码子可以是赭石密码子。该赭石密码子可包含UAA序列。该终止密码子可以是乳白密码子或棕土密码子。该乳白密码子或棕土密码子可包含UGA序列。一个或多个非天然氨基酸可由四碱基密码子编码。
一个或多个非天然氨基酸可以是对乙酰基苯丙氨酸(pAcF或pAcPhe)。一个或多个非天然氨基酸可以是硒代半胱氨酸。一个或多个非天然氨基酸可以是对氟苯丙氨酸(pFPhe)。一个或多个非天然氨基酸可选自对叠氮基苯丙氨酸(pAzF)、对叠氮基甲基苯丙氨酸(pAzCH2F)、对苯甲酰基苯丙氨酸(pBpF)、对炔丙基氧基苯丙氨酸(pPrF)、对碘苯丙氨酸(pIF)、对氰基苯丙氨酸(pCNF)、对羧基甲基苯丙氨酸(pCmF)、3-(2-萘基)丙氨酸(NapA)、对二羟硼基苯丙氨酸(pBoF)、邻硝基苯丙氨酸(oNiF)、(8-羟基喹啉-3-基)丙氨酸(HQA)、硒代半胱氨酸和(2,2'-联吡啶-5-基)丙氨酸(BipyA)。).所述一个或多个非天然氨基酸可以是4-(6-甲基-s-四嗪-3-基)氨基苯丙氨酸。
一个或多个非天然氨基酸可以是β-氨基酸(β3和β2)、高氨基酸、脯氨酸和丙酮酸衍生物、3-取代的丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、环取代的苯丙氨酸和酪氨酸衍生物、线形核心氨基酸、二氨酸、D-氨基酸、N-甲基氨基酸或其组合。
非天然氨基酸的其他实例包括但不限于，1)各种取代的酪氨酸和苯丙氨酸类似物，如邻甲基-L-酪氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、对硝基-L-苯丙氨酸、间甲氧基-L-苯丙氨酸和对异丙基-L-苯丙氨酸；2)具有可光交联的芳基叠氮化物和二苯甲酮基团的氨基酸；3)具有独特化学反应性的氨基酸，包括乙酰基-L-苯丙氨酸和间乙酰基-L-苯丙氨酸、O-烯丙基-L-酪氨酸、O-(2-丙炔基)-L-酪氨酸、对乙基硫基羰基-L-苯丙氨酸和对-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸；4)用于在X射线晶体学中定相的含重原子的氨基酸，包括对碘和对溴-L-苯丙氨酸；5)氧化还原活性的氨基酸二羟基-L-苯丙氨酸；6)糖基化的氨基酸，包括b-N-乙酰基葡糖胺-O-丝氨酸和a-N-乙酰基半乳糖胺-O-苏氨酸；7)具有萘基、丹酰和7-氨基香豆素侧链的荧光氨基酸；8)具有偶氮苯和硝基苄基Cys、Ser和Tyr侧链的可光裂解和可光异构化的氨基酸；9)磷酸酪氨酸模拟物对羧甲基-L-苯丙氨酸；10)谷氨酰胺同系物高谷氨酰胺；以及11)2-氨基辛酸。可对非天然氨基酸进行修饰以并入化学基团。可对非天然氨基酸进行修饰以并入酮基团。
一个或多个非天然氨基酸可包含至少一个肟、羰基、二羰基、羟胺基团或其组合。一个或多个非天然氨基酸可包含至少一个羰基、二羰基、烷氧基胺、肼、无环烯烃、五环炔烃、环辛炔、芳基/烷基叠氮、降冰片烯、环丙烯、反式环辛烯或四嗪官能团或其组合。
一个或多个非天然氨基酸可通过本领域已知的方法并入抗体或抗体片段中。基于细胞的或无细胞的系统可用来改变抗体或抗体片段的基因序列，从而产生具有一个或多个非天然氨基酸的抗体或抗体片段。营养缺陷型菌株可代替工程化的tRNA和合成酶而使用。一个或多个非天然氨基酸可通过一个或多个天然氨基酸的选择性反应而产生。该选择性反应可被一种或多种酶介导。在一个非限制性实例中，一个或多个半胱氨酸与甲酰基甘氨酸生成酶(FGE)的选择性反应可产生一个或多个甲酰基甘氨酸，如Rabuka等人,NatureProtocols 7:1052-1067(2012)所述。
一个或多个非天然氨基酸可参与化学反应以形成连接体。形成连接体的化学反应可以是生物正交反应。形成连接体的化学反应可以是点击化学。
另外的非天然氨基酸在Liu等人(Annu Rev Biochem,79:413-44,2010)、Wang等人(Angew Chem Int Ed,44:34-66,2005)和PCT申请PCT/US2012/039472、PCT/US2012/039468、PCT/US2007/088009、PCT/US2009/058668、PCT/US2007/089142、PCT/US2007/088011、PCT/US2007/001485、PCT/US2006/049397、PCT/US2006/047822和PCT/US2006/044682中公开，这些均通过引用整体并入本文。
一个或多个非天然氨基酸可代替抗体或抗体片段中的一个或多个氨基酸。一个或多个非天然氨基酸可代替抗体或抗体片段中的任何天然氨基酸。
一个或多个非天然氨基酸可并入抗体或抗体片段的轻链中。一个或多个非天然氨基酸可并入抗体或抗体片段的重链中。一个或多个非天然氨基酸可并入抗体或抗体片段的重链和轻链中。一个或多个非天然氨基酸可代替抗体或抗体片段的轻链中的氨基酸。一个或多个非天然氨基酸可代替抗体或抗体片段的重链中的氨基酸。一个或多个非天然氨基酸可代替抗体或抗体片段的重链和轻链中的氨基酸。
抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，连接体包含小分子片段、间隔区、非共价连接体或其组合。在一些实施方案中，该连接体包含一个或多个小分子片段。在一些实施方案中，该连接体包含间隔区。
在一些实施方案中，连接体包含一个或多个反应性部分。在一些实施方案中，连接体包含选自Michael受体部分、离去基团部分或能够与抗体片段和/或治疗剂形成共价键的部分的反应性部分。
在一些实施方案中，小抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含反应性部分。在一些实施方案中，小分子片段包含选自Michael受体部分、离去基团部分或能够与半胱氨酸残基的巯基形成共价键的部分的反应性部分。
在一些实施方案中，Michael受体部分包含烯烃或炔烃部分。在一些实施方案中，小分子片段获自化合物文库。在一些实施方案中，化合物文库包括ChemBridge片段文库、Pyramid Platform Fragment-Based Drug Discovery、Maybridge片段文库、来自AnalytiCon的FRGx、来自AnCoreX的TCI-Frag、来自ASINEX的Bio Building Blocks、来自Charles River的BioFocus 3D、来自Emerald Bio的Fragments of Life(FOL)、EnamineFragment Library、IOTA Diverse 1500、BIONET片段文库、Life Chemicals FragmentsCollection、OTAVA片段文库、Prestwick片段文库、Selcia片段文库、基于TimTec片段的文库、来自Vitas-M Laboratory的Allium或Zenobia片段文库。
在一些实施方案中，小分子片段包含碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、亚氨基酯、五氟苯基酯、羟甲基膦、马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、硫代磺酸酯、乙烯基砜、酰肼、烷氧基胺、炔烃、叠氮化物或异氰酸酯基团。在一些实施方案中，小分子片段包含炔烃或叠氮基团。在一些实施方案中，小分子片段包含炔基。在一些实施方案中，小分子片段包含叠氮基团。
在一些实施方案中，小分子片段与间隔区共价相互作用。在一些实施方案中，间隔区包含酰胺部分、酯部分、醚部分、取代或未取代的C1-C6亚烷基部分、取代或未取代的C1-C6卤代亚烷基部分、取代或未取代的C1-C6杂亚烷基部分、取代或未取代的C3-C8环亚烷基部分、取代或未取代的C2-C7杂亚烷基部分、取代或未取代的亚芳基部分、取代或未取代的杂亚芳基部分或其任意组合。
在一些实施方案中，连接体包含MC(6-马来酰亚胺基己酰基)、MCC(马来酰亚胺基甲基环己烷-1-甲酸酯)、MP(马来酰亚胺基丙酰基)、val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)、val-ala(缬氨酸-丙氨酸)、ala-phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、PAB(对氨基苄氧羰基)、SPP(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯)、SMCC(N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1甲酸酯)、SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯)。连接体的其他实例包括：BS3([双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯]；BS3是一种靶向可及的伯胺的同双官能性N-羟基琥珀酰亚胺酯)、NHS/EDC(N-羟基琥珀酰亚胺和N-乙基-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺；NHS/EDC允许伯胺基团与羧基的缀合)、磺基-EMCS([N-e-马来酰亚胺基己酸]酰肼；磺基-EMCS是对巯基和氨基具有反应性的异双官能性反应性基团(马来酰亚胺和NHS酯))、酰肼(大多数蛋白质含有暴露的碳水化合物，并且酰肼是可用于使羧基连接至伯胺的试剂)以及SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯；SATA对胺具有反应性，并且添加经保护的巯基)。为了形成共价键，可使用具有广泛多种活性羧基(例如酯)的化学反应性基团，其中羟基部分在对肽进行修饰所需的水平上是生理学上可接受的。特定试剂包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基-磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、马来酰亚胺-苯甲酰基-琥珀酰亚胺(MBS)、γ-马来酰亚胺基-丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、马来酰亚胺基丙酸(MPA)、马来酰亚胺基己酸(MHA)和马来酰亚胺基十一烷酸(MUA)。伯胺是NHS酯的主要靶标。存在于蛋白质的N末端上的可及的a-氨基和赖氨酸的ε-胺与NHS酯反应。当NHS酯缀合反应物与伯胺反应时形成酰胺键，从而释放N-羟基琥珀酰亚胺。这些含有琥珀酰亚胺的反应性基团在本文中被称为琥珀酰亚胺基。在本公开的某些实施方案中，蛋白质上的官能团将是巯基，并且化学反应性基团将是含有马来酰亚胺基的基团，如γ-马来酰亚胺-丁酰胺(GMBA或MPA)。这类含有马来酰亚胺的基团在本文中被称为马来酰亚胺基。当反应混合物的pH是6.5-7.4时，马来酰亚胺基对肽上的巯基最具选择性。在pH 7.0时，马来酰亚胺基与巯基(例如蛋白质如血清白蛋白或IgG上的巯基)的反应速率是与胺的反应速率和1000倍。因此，可形成马来酰亚胺基与巯基之间的稳定硫醚连接。
在其他实施方案中，连接体包括至少一个氨基酸(例如具有至少2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、40或50个氨基酸的肽)。在某些实施方案中，该连接体是单一氨基酸(例如任何天然存在的氨基酸，如Cys或Lys)。在其他实施方案中，可使用肽，如富含甘氨酸的肽。在一些情况下，该连接体可以是单一氨基酸(例如任何氨基酸，如Gly或Cys或Lys)。合适的连接体的实例是琥珀酸、Lys、Glu和Asp，或二肽，如Gly-Lys。当连接体是琥珀酸时，其一个羧基可与氨基酸残基的氨基形成酰胺键，其另一个羧基例如可与肽或取代基的氨基形成酰胺键。当连接体是Lys、Glu或Asp时，其羧基可与氨基酸残基的氨基形成酰胺键，而其氨基例如可与取代基的羧基形成酰胺键。当Lys用作连接体时，可以在Lys的ε-氨基与取代基之间插入另一连接体。在一个特定实施方案中，所述另一连接体是琥珀酸，其例如与Lys的ε-氨基以及与存在于取代基中的氨基形成酰胺键。在一个实施方案中，所述另一连接体是Glu或Asp(例如，其与Lys的ε-氨基形成酰胺键，并且与存在于取代基中的羧基形成另一酰胺键)，即，该取代基是NE酰化的赖氨酸残基。在一些实施方案中，连接体包含由赖氨酸组成的单氨基酸肽。在一些实施方案中，连接体包含LysLys二肽。在一些实施方案中，连接体包含*Lys和/或Lys*二肽。在一些实施方案中，连接体包含LysLys*和/或*LysLys、Lys*Lys三肽。在一些实施方案中，连接体包含LysLysLys三肽。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段与RNA分子的缀合以产生带环分子的方式进行。在一些实施方案中，间隔区另外包括大环。在一些实施方案中，大环包括非共价大环。在一些实施方案中，大环包括共价大环。
在一些实施方案中，大环包括葫芦[X]脲，其中X为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施方案中，大环包括葫芦[X]脲，其中X为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施方案中，大环包括葫芦[X]脲，其中X为5、6、7或8。在一些实施方案中，该葫芦[X]脲具有以下所示的结构：
Figure BDA0003324235030001011
其中x为5、6、7或8。
在一些实施方案中，x为5。在一些实施方案中，x为6。在一些实施方案中，x为7。在一些实施方案中，x为8。
在一些实施方案中，大环包括葫芦[6]脲(CB6)。在一些实施方案中，大环包括葫芦[7]脲(CB7)。在一些实施方案中，该葫芦[7]脲具有以下所示的结构：
Figure BDA0003324235030001021
在一些实施方案中，大环包括环糊精(CD)。在一些实施方案中，该环糊精具有以下所示的结构：
Figure BDA0003324235030001022
其中n为5、6、7或8。
在一些实施方案中，大环包括β-环糊精(n＝7)。在一些实施方案中，大环包括γ-环糊精(n＝8)。在一些实施方案中，该β-环糊精具有以下所示的结构：
Figure BDA0003324235030001023
在一些实施方案中，大环包括多肽。在一些实施方案中，该多肽具有以下所示的结构：
Figure BDA0003324235030001024
其中
R1为H、D、F、-CN、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C1-C6氟烷基、取代或未取代的C1-C6杂烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基；且m为5、6、7或8。
在一些实施方案中，大环包括环甘氨酸。在一些实施方案中，大环包括环环(甘氨酰基甘氨酰基甘氨酰基甘氨酰基甘氨酰基甘氨酰基)(SEQ ID NO:160)。在一些实施方案中，大环包括环(甘氨酰基甘氨酰基甘氨酰基甘氨酰基甘氨酰基甘氨酰基甘氨酰基)(SEQID NO:161)。在一些实施方案中，该环(甘氨酰基甘氨酰基甘氨酰基甘氨酰基甘氨酰基甘氨酰基甘氨酰基)(SEQ ID NO:161)具有以下所示的结构：
Figure BDA0003324235030001031
在一些实施方案中，大环包括冠醚。在一些实施方案中，该冠醚为15-冠-5、18-冠-6、二苯并-18-冠-6或二氮杂-18-冠-6。
在一些实施方案中，大环包括环烷烃。在一些实施方案中，该环烷烃是环十五烷、环十六烷、环十七烷或环十八烷。
在一些实施方案中，大环包括环双(百草枯-对亚苯基)
(CBPQT4+)。在一些实施方案中，该环双(百草枯-对亚苯基)(CBPQT4+)具有以下所示的结构：
Figure BDA0003324235030001041
在一些实施方案中，连接体包含季氮。在一些实施方案中，所述连接体是：
Figure BDA0003324235030001042
其中每个R独立地为H或C1-C6烷基。在一些实施方案中，所述连接体是：
Figure BDA0003324235030001043
其中每个R独立地为H或C1-C6烷基。在一些实施方案中，所述连接体是：
Figure BDA0003324235030001044
其中每个R独立地为H或C1-C6烷基。
在一些实施方案中，所述连接体是：
Figure BDA0003324235030001045
Figure BDA0003324235030001051
在一些实施方案中，通过将连接体的第一部分连接至抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，并将连接体的第二部分连接至寡核苷酸来产生缀合物。将连接体与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段或治疗分子缀合可包括在连接体与抗体、其抗原结合片段或治疗剂之间产生离子键、共价键、非共价键或其组合。在一些情况下，将连接体与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段或寡核苷酸缀合可以如Roberts等人,Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476(2002)所述进行。连接体可选自双官能团连接体、可切割的连接体、不可切割的连接体、乙二醇连接体、双官能乙二醇连接体、柔性连接体或非柔性连接体。连接体可包含选自环辛炔、环丙烯、芳基/烷基叠氮化物、反式-环辛烯、降冰片烯和四嗪的化学基团。在一些实施方案中，连接体的末端包含烷氧基-胺。在一些实施方案中，连接体的末端包含叠氮基或环辛炔基团。在一些实施方案中，抗体或抗体片段或治疗剂可以通过选自环辛炔、环丙烯、芳基/烷基叠氮化物、反式-环辛烯、降冰片烯和四嗪的化学基团偶联至连接体。将抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段或寡核苷酸与连接体连接可包括进行一个或多个无铜反应。将抗体或抗体片段或寡核苷酸与连接体连接可包括进行一个或多个含铜反应。将抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段或寡核苷酸与连接体连接可包括一个或多个环加成。将抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段或寡核苷酸与连接体连接可包括一个或多个Huisgen-环加成。将抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段或寡核苷酸与连接体连接可包括一个或多个Diels Alder反应。将抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段或寡核苷酸与连接体连接可包括一个或多个HeteroDiels Alder反应。在一些实施方案中，连接体的末端包含离去基团。
在一些实施方案中，如本文所述，连接体的第一部分与含半胱氨酸的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段共价相互作用。在一些实施方案中，如本文所述，连接体的第一部分与含半胱氨酸的TM4SF1抗体或其抗原结合片段共价相互作用。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸与连接体的第二部分共价相互作用。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸与连接体的第二部分非共价相互作用。
在一些实施方案中，涉及基于病毒蛋白p19的siRNA载体，该蛋白质已显示对siRNA具有高亲和力。参见，例如，Yang等人,Cytosolic delivery of siRNA by ultra-highaffinity dsRNA binding proteins,Nucleic Acids Res.2017年7月27日；45(13):7602–7614。在一些实例中，生成p19-siRNA复合物，并将其融合至抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。在另外的实施方案中，通过抗体或其抗原结合片段内的Cys、Lys或精氨酸(Arginie)残基的统计或随机缀合方法。
包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和siRNA的ADC的合成
在一个实施方案中，通过抗体或抗原结合片段与RNA分子(例如siRNA)的共价缀合来开发包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和寡核苷酸的缀合物。作为这种示例性过程的第一步，产生工程化抗TM4SF1抗体，其中在重链中已经引入了半胱氨酸残基(从而产生抗TM4SF1 HC THIOMAB)。在一些实例中，抗TM4SF1 thiomab提供了至少两个离散的位置，用于与RNA分子如siRNA偶联。例如，一个siRNA分子可以与抗TM4SF1 thiomab的每条重链偶联。在缀合过程的单独步骤或后续步骤中，生成化学稳定化的siRNA(例如，用siSTABLE化学法合成的)，其用3′-胺修饰以供与具有靶向肽基脯氨酰异构酶B(PPIB，亲环蛋白B)的序列的过客链偶联。在一些实施方案中，该缀合进一步包括可还原的N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)或不可还原的琥珀酰胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸酯(SMCC)NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)连接体。在一些实施方案中，使用抗TM4SF1 thiomab，在包括至少两个以下主要步骤的多步骤过程中生成根据本公开的示例性缀合物分子：(i)胺标记的siRNA与NHS-连接体的反应，以形成巯基反应性siRNA-连接体加合物，和(ii)使该加合物与THIOMAB上的巯基反应，以通过硫酯键共价连接siRNA。随后使用阴离子交换色谱法去除游离的siRNA，然后通过大小排阻色谱法去除未偶联的抗体，从而纯化示例性的ADC。然后可以使用其他技术如凝胶电泳和电喷雾TOP质谱法来评估示例性ADC的产率以及诸如每个抗体具有一个或两个连接的siRNA的单体缀合物的特性。可以用于缀合的其他方法包括使用基于化学或肽的连接体、化学或酶促缀合方法(例如，使用哺乳动物或细菌转谷氨酰胺酶)或其任意组合。上述任何连接体和/或方法均可用来偶联缀合物的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和寡核苷酸。
使用适当的偶联方法，可能生成本公开的ADC，其中抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段与寡核苷酸与之比例如约为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10或更高。在一些实施方案中，该ADC中抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段与寡核苷酸之比为1:1。这可以例如通过使用抗原结合片段或抗体的一部分例如半抗体、Fab或包含THIOMAB工程化半胱氨酸的其他片段来实现。在一些实例中，可以在分子识别的基础上，使用通过缀合方法与寡核苷酸缀合的完整抗体，将ADC设计为抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段与寡核苷酸之比为1:1，该缀合方法使用多金属蛋白(例如六铑金属肽)以进行蛋白质的修饰。例如，基于多金属蛋白对抗体的Fc结构域恒定区的分子识别，可以使用位点特异性抗体官能化来缀合抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和寡核苷酸。在一些实施方案中，多金属蛋白包含附接至与抗体的Fc结构域结合的蛋白质的特定位点的三个铑络合物。结合后，多金属蛋白可以催化寡核苷酸与抗体的位点特异性缀合。使用多金属蛋白的优点可以是，在缀合过程中，例如通过避免抗体内的工程化残基，使抗体的破坏最小化。
VI.多核苷酸
在一些实施方案中，还提供了编码抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。在一些实施方案中，该多核苷酸分子以DNA构建体的形式提供。在其他实施方案中，该多核苷酸分子以信使RNA转录物的形式提供。
在一些实例中，本公开的抗TM4SF1抗体包含由SEQ ID NO:4、16、28、40、52、64或76中任一个所示的核酸序列编码的重链可变域。在一些实例中，本公开的抗TM4SF1抗体包含由SEQ ID NO:10、22、34、46、58、70或82中任一个所示的核酸序列编码的轻链可变域。
在一些实施方案中，提供了针对在宿主细胞，例如细菌如大肠杆菌或真核细胞如CHO细胞中表达进行密码子优化的核酸序列。在一些实例中，核酸序列针对在CHO细胞中表达进行密码子优化。在一些实例中，本公开的抗TM4SF1抗体包含由SEQ ID NO:5、17、29、41、53、65或77中任一个所示的密码子优化的核酸序列编码的重链可变域。在一些实例中，本公开的抗TM4SF1抗体包含由SEQ ID NO:11、23、35、47、59、71或83中任一个所示的密码子优化的核酸序列编码的轻链可变域。在某些情况下，SEQ ID NO:5、17、29、41、53、65或77中任一个的核酸序列是针对在CHO细胞中表达进行密码子优化的核酸序列。在某些情况下，SEQ IDNO:11、23、35、47、59、71或83中任一个的核酸序列是针对在CHO细胞中表达进行密码子优化的核酸序列。
多核苷酸分子通过已知方法构建，诸如通过将编码结合蛋白的基因并入遗传构建体中，连接至合适的启动子以及可选的合适的转录终止子，并且在细菌或其他适当表达系统如CHO细胞中表达该遗传构建体。根据所采用的载体系统和宿主，可使用任何数目的合适的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。选择启动子，以使其驱动多核苷酸在相应宿主细胞中的表达。
在一些实施方案中，将本文所述的多核苷酸插入载体中，优选表达载体中，这代表进一步的实施方案。该重组载体可根据已知方法来构建。特别感兴趣的载体包括质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、病毒(virii)(例如，逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、慢病毒等)和粘粒。
可利用多种表达载体/宿主系统，以包含并表达编码所述TM4SF1结合蛋白的多肽的多核苷酸。表达载体的实例是用于在大肠杆菌中表达的pSKK(Le Gall等人,J ImmunolMethods.(2004)285(1):111-27)，或用于在哺乳动物细胞中表达的pcDNA5(Invitrogen)。
因此，在一些实施方案中，如本文所述的TM4SF1结合蛋白通过以下步骤产生：将编码如上所述蛋白质的载体引入宿主细胞中，并在允许蛋白质结构域表达的条件下培养所述宿主细胞，可将其分离并任选地进一步纯化。
VII.治疗方法
本公开进一步提供了一种抑制内皮细胞(EC)所特有的细胞-细胞相互作用的方法，所述相互作用例如是但不限于EC-EC、EC-间充质干细胞、EC-成纤维细胞、EC-平滑肌细胞、EC-肿瘤细胞、EC-白细胞、EC-脂肪细胞和EC-神经元细胞相互作用。在某些实施方案中，本公开的含有抗TM4SF1抗体和片段的ADC可用来治疗具有特征在于异常EC-细胞相互作用的病理学的任何人疾病或病症。在某些实施方案中，该EC-细胞相互作用是EC-白细胞相互作用，其中使用对EC-白细胞相互作用的抑制来预防炎症。
在其他实施方案中，本公开提出了一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，其中该疾病或病症的特征在于异常内皮细胞(EC)-细胞相互作用，所述方法包括施用如本文所述的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，该EC-细胞相互作用包括EC-间充质干细胞、EC-成纤维细胞、EC-平滑肌细胞、EC-肿瘤细胞、EC-白细胞、EC-脂肪细胞和EC-神经元细胞相互作用中的一种或多种。在示例性实施方案中，该疾病是炎性疾病或病症，并且本公开的抗体和片段用于抑制EC-白细胞相互作用。在另一示例性实施方案中，该疾病或病症选自炎性疾病或癌症。白细胞向血管内皮的粘附是炎性过程的标志。因此，在一个实施方案中，本公开的含有抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的ADC用来治疗其中抑制白细胞向内皮细胞的附着或抑制白细胞跨内皮的变移有助于治疗的炎性疾病(参见例如Rychly等人,Curr Pharm Des.2006；12(29):3799-806，该文献通过引用整体并入本文)。实例包括但不限于脓毒症、炎性肠病、银屑病或多发性硬化。
每年，仅在美国就有约50万患者死于癌症。肿瘤转移导致这些死亡中的约90％。没有阻断转移的疗法是已知的。本公开提供了抗体及其抗原结合片段，所述抗体及其抗原结合片段可基于对由新颖靶标TM4SF1介导的肿瘤细胞(TC)-内皮细胞(EC)相互作用的免疫阻断来治疗癌症并抑制转移性细胞。
如上所述，TM4SF1是一种四跨膜蛋白样细胞表面小糖蛋白，最初作为在TC侵袭和转移中具有作用的TC抗原被发现。TM4SF1由TC和EC选择性表达。在小鼠与人中，TM4SF1均以低水平在对正常组织进行供给的血管EC上表达。已经表明，TM4SF1以约10-20倍高的水平在内衬于对许多人类癌症进行供给的血管的血管EC上表达，并且以等同的高水平在培养的EC上表达。富含TM4SF1的微域(TMED)募集细胞表面蛋白，如整联蛋白，以帮助形成nanopodia，即从细胞表面延伸并且介导细胞-细胞相互作用的薄膜通道。因此，在某些情况下，本文所述的含有抗TM4SF1抗体和片段的ADC干扰nanopodia介导的相互作用，并且抑制TC外渗所必需的TC与EC的相互作用。
本公开的ADC可被配制用于治疗患有与病理性血管生成相关的病症(例如癌症，如乳腺癌、卵巢癌、肾癌、结直肠癌、肝癌、胃癌和肺癌；肥胖症；黄斑变性；糖尿病视网膜病变；银屑病；类风湿性关节炎；细胞免疫性；和红斑痤疮)的受试者(例如人)。
TM4SF1在大多数上皮TC的表面上高度表达，并且还在内衬于肿瘤血管的EC上以及在培养的EC上高度表达。它在正常血管EC的表面上以约1/10-1/20低的水平表达。在小鼠模型中，肿瘤向肺的转移与EC和TC两者上的TM4SF1表达相关。转移需要TC初始附着至血管EC上，它们随后跨越EC迁移进入肺或其他转移部位。以下实施例显示，在一些情况下，本公开的抗TM4SF1抗体在培养中干扰TC-EC相互作用，并且还可在体内抑制肿瘤转移。
因此，本公开的ADC可用来阻断转移中的一个或两个最早步骤，即，TC向血管EC的附着和/或TC跨越EC的变移，由此预防高危癌症患者中的转移或大大减少转移的数目。
本公开还提供了一种用于预防转移的方法。人类肿瘤通常在生长的早期阶段使TC脱落到血液和淋巴中；因此，对原发性肿瘤的早期治疗不能提供转移尚未发生的保证。因此，TM4SF1的免疫阻断可用于治疗或预防血液性转移或者治疗或预防淋巴性转移。
在一些实施方案中，本公开的方法涉及抑制受试者中的转移性细胞。在一个实施方案中，受试者患有癌症，例如与转移相关的癌症或已转移的癌症。在其他实施方案中，受试者已针对癌症进行了治疗，并且处于缓解期或部分缓解期，其中施用本文所述的含有抗TM4SF1抗体或片段的ADC的益处是它们起到预防转移以及维持缓解或部分缓解的作用。
在某些实施方案中，本公开提供了一种治疗具有发生转移的较大风险的个体的方法，其中施用本文所述的含有抗TM4SF1抗体和片段的ADC可用来抑制转移或延迟转移的发作。
本公开中包括一种通过向有需要的受试者施用抗TM4SF1抗体来阻断肿瘤转移，特别是向肺的转移的方法。在一些实例中，抗TM4SF1抗体是人抗TM4SF1抗体，在本文中也称为抗hTM4SF1。在某些实施方案中，所述方法可包括向有需要的受试者施用有效量的含有抗hTM4SF1抗体的ADC，其中所述有效量的所述抗体阻止肿瘤细胞(TC)附着于血管内皮细胞(EC)以及跨血管内皮细胞(EC)迁移。
在某些实施方案中，向患有癌症或处于转移风险中的受试者施用含有抗TM4SF1抗体的ADC，以使剂量和频率维持长期TM4SF1免疫阻断。给药方案将通过以足以使在受试者的正常血管EC上表达的TM4SF1饱和的量向受试者施用含有抗TM4SF1抗体的ADC，来最大程度地抑制TM4SF1介导的转移。
在某些实施方案中，含有抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的ADC的有效施用量是足以在一周时实现循环抗体浓度>1μg/ml的量。
在某些实施方案中，含有抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的ADC的有效施用量是足以持续约1个月连续维持抗体的血清浓度等于或高于1μg/ml的量。
在一个实施方案中，本公开提供了一种治疗或预防人类受试者中的转移的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的含有抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的ADC，其中该抗体或其抗原结合片段的所述有效量包括1至80mg/kg的量的所述抗体或其抗原结合片段。
用于治疗性使用本公开的ADC的给药模式可以是将抗体递送至宿主的任何适当途径，如肠胃外给药，例如真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、经肺、经粘膜(口服、鼻内、阴道内、经直肠)，使用呈片剂、胶囊、溶液、粉剂、凝胶、颗粒形式的制剂；以及容纳于注射器、植入装置、渗透泵、药筒、微型泵中；或为熟练技术人员所了解以及本领域中已知的其他手段。部位特异性给药可通过例如关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、大肠内、颈管内、胃内、肝内、心脏内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病变内、经阴道、经直肠、经颊、舌下、鼻内或经皮递送来实现。
在一些实施方案中，本公开的ADC可通过任何适合途径向受试者施用，例如通过静脉内(i.v.)输注或团注以胃肠外方式、以肌肉内方式或以皮下方式或以腹膜内方式。静脉内输注可以经例如15、30、60、90、120、180或240分钟，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时来给予。在一些实施方案中，给予受试者的剂量是约0.005mg至约100mg/kg，例如约0.05mg至约30mg/kg或约5mg至约25mg/kg，或约4mg/kg、约8mg/kg、约16mg/kg或约24mg/kg，或例如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg。在某些实施方案中，给予受试者的剂量是例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90或100mg/kg。在一些情况下，给予受试者的本公开的抗体的剂量可以是通过静脉内给药的约0.1mg/kg至10mg/kg。在一些情况下，给予受试者的本公开的抗体的剂量是通过皮下给药的约0.1mg/kg至10mg/kg。在一些情况下，给予受试者的本公开的抗体的剂量是通过静脉内给药的约0.1mg/kg。在一些情况下，给予受试者的本公开的抗体的剂量是通过皮下给药的约0.1mg/kg。在一些实施方案中，给予受试者的本公开的抗体的剂量是通过静脉内给药的约0.3mg/kg。在一些实例中，给予受试者的本公开的抗体的剂量是通过皮下给药的约0.3mg/kg。在一些实例中，给予受试者的本公开的抗体的剂量是通过静脉内给药的约1.0mg/kg。在一些实例中，给予受试者的本公开的抗体的剂量是通过皮下给药的约1.0mg/kg。在一些实例中，给予受试者的本公开的抗体的剂量是通过静脉内给药的约3.0mg/kg。在一些实例中，给予受试者的本公开的抗体的剂量是通过皮下给药的约3.0mg/kg。在一些实例中，给予受试者的本公开的抗体的剂量可以是通过静脉内给药的约10.0mg/kg。在一些实例中，给予受试者的本公开的抗体的剂量是通过皮下给药的约10.0mg/kg。
在某些实施方案中，给予本公开的抗体的固定单位剂量，例如50、100、200、500或1000mg，或者剂量可基于患者的表面积，例如500、400、300、250、200或100mg/m2。在一些情况下，施用1至8次剂量(例如1、2、3、4、5、6、7或8次)以治疗患者，但可以给予9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20次或更多次剂量。
在一些实施方案中，在一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更久之后，重复施用本文所述的本公开的ADC。如同长期给药一样，重复治疗过程也是可能的。重复给药以相同剂量或以不同剂量进行。在一些实例中，本文所述的本公开的ADC通过静脉内输注在每周间隔下以8mg/kg或以16mg/kg施用8周，随后每两周以8mg/kg或以16mg/kg进行施用，再持续16周，随后每四周以8mg/kg或以16mg/kg进行施用。或者，在一些实施方案中，本文所述的本公开的ADC在每周间隔下以0.1mg/kg至约10mg/kg施用17周。例如，在一些情况下，在启动治疗之后，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、
22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天，或替代地，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周中的至少一周，或以其任意组合，使用每24、12、8、6、4或2小时一次的单剂量或分剂量，或以其任意组合，以每天约0.1-100mg/kg，如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg的量，以每日剂量提供本公开的抗体。在一些实施方案中，预防性施用本文所述的本公开的抗体，以降低发生炎性疾病如RA、银屑病关节炎或银屑病的风险，延迟炎性疾病如RA、银屑病关节炎或银屑病的进展中的事件的发生。在一些实例中，将本公开的ADC冻干以供储存，并且在使用前在合适的载体中重建。在一些情况下，本公开的抗体以无菌冷冻液体形式提供于具有塞子和带有翻开式盖子的铝封的玻璃小瓶中。在一些实例中，每个小瓶可容纳含有3.3mL 50mg/mL的抗体(包括10％过量灌装)在10mM组氨酸、8.5％(w/v)蔗糖和0.04％(w/v)聚山梨醇酯80的制剂(pH 5.8)中的溶液的ADC。在一些实例中，小瓶不含防腐剂，并且用于单次使用。小瓶可冷冻并避光保存。为了准备用于静脉内给药，在一些实例中，将ADC制剂在用无菌稀释剂稀释之前用0.22微米过滤器过滤。在一些实例中，使用管线内0.22微米过滤器，经至少30分钟的一段时间，通过静脉内输注来施用多达约100mL体积的稀释的ADC。或者，在一些实施方案中，以1或2次皮下注射施用ADC，其在约3.3mL中含有约50mg/mL抗体。皮下注射部位可以例如在腹部区域内。
VIII.药物组合物
在一些实施方案中，本公开的ADC可以包含在组合物(例如药物组合物)中。本公开的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
如本文所用的术语“药物组合物”是指含有与药学上可接受的载体一起配制的本文所述的TM4SF1结合蛋白，并且在政府监管机构批准下作为用于治疗哺乳动物疾病的治疗方案的一部分制造或销售的组合物。例如，可以将药物组合物配制成以单位剂型(例如，片剂、胶囊、囊片、软胶囊(gel cap)或糖浆)口服给药；局部给药(例如，作为乳膏、凝胶、洗剂或软膏)；静脉内给药(例如，作为无颗粒栓子的无菌溶液并在适合静脉内使用的溶剂系统中)；或本文所述的其他任何制剂。
如本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指对于所治疗的哺乳动物(例如人)在生理学上可接受，同时维持与其一起施用的蛋白质的治疗性质的载体。一种示例性的药学上可接受的载体为生理盐水。其他生理学上可接受的载体及其制剂是本领域技术人员已知的，并且例如在通过引用并入本文的Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版,A.Gennaro,1990,Mack Publishing Company,Easton,PA)中描述。
在一些实施方案中，包含含有TM4SF1抗体或其抗原结合片段的ADC的药物组合物被制备成溶液，在甘油、液体聚乙二醇中的分散体，及其在油中的任何组合，固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型，或它们的任意组合。
在一些实例中，药学上可接受的赋形剂是Handbook of PharmaceuticalExcipients,American Pharmaceutical Association(1986)中描述的赋形剂。合适的赋形剂的非限制性实例包括缓冲剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂、压实剂、润滑剂、螯合剂、分散增强剂、崩解剂、调味剂、甜味剂、着色剂。
在一些实施方案中，赋形剂是缓冲剂。合适的缓冲剂的非限制性实例包括柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙和碳酸氢钙。在一些实施方案中，作为缓冲剂，碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化镁、乳酸镁、葡糖酸镁、氢氧化铝、柠檬酸钠、酒石酸钠、乙酸钠、碳酸钠、多磷酸钠、多磷酸钾、焦磷酸钠、焦磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钠、磷酸三钾、偏磷酸钾、氧化镁、氢氧化镁、碳酸镁、硅酸镁、乙酸钙、甘油磷酸钙、氯化钙、氢氧化钙和其他钙盐或其组合在本公开的药物组合物中使用。
在一些实施方案中，赋形剂包括防腐剂。合适的防腐剂的非限制性实例包括抗氧化剂，如α-生育酚和抗坏血酸盐，以及抗微生物剂，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚。在一些实例中，抗氧化剂进一步包括但不限于EDTA、柠檬酸、抗坏血酸、丁羟甲苯(BHT)、丁羟茴醚(BHA)、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽、没食子酸丙酯、半胱氨酸、甲硫氨酸、乙醇和N-乙酰半胱氨酸。在一些情况下，防腐剂包括有效霉素A、TL-3、原钒酸钠、氟化钠、N-a-甲苯磺酰基-Phe-氯甲基酮、N-a-甲苯磺酰基-Lys-氯甲基酮、抑肽酶、苯甲基磺酰氟、氟磷酸二异丙酯、激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂、粒酶抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞分裂抑制剂、细胞周期抑制剂、脂质信号传导抑制剂、蛋白酶抑制剂、还原剂、烷化剂、抗微生物剂、氧化酶抑制剂或其他抑制剂。
在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物包含粘合剂作为赋形剂。合适的粘合剂的非限制性实例包括淀粉、预胶化淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯基噁唑烷酮、聚乙烯醇、C12-C18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖类、寡糖及其组合。在一些实例中，在药物制剂中使用的粘合剂选自淀粉，如马铃薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉；糖，如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖糊精；天然树胶和合成树胶；明胶；纤维素衍生物，如微晶纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)；聚乙二醇(PEG)；蜡类；碳酸钙；磷酸钙；醇类，如山梨醇、木糖醇、甘露醇，以及水，或其任意组合。
在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物包含润滑剂作为赋形剂。合适的润滑剂的非限制性实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、氢化植物油、sterotex、聚氧乙烯单硬脂酸酯、滑石、聚乙二醇、苯甲酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁和轻质矿物油。在一些实施方案中，在药物制剂中使用的润滑剂选自金属硬脂酸盐(如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸铝)、脂肪酸酯(如硬脂酰富马酸钠)、脂肪酸(如硬脂酸)、脂肪醇、山萮酸甘油酯、矿物油、石蜡、氢化植物油、亮氨酸、聚乙二醇(PEG)、金属十二烷基硫酸盐(如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁)、氯化钠、苯甲酸钠、乙酸钠和滑石，或它们的组合。
在一些实施方案中，药物制剂包含分散增强剂作为赋形剂。在一些实例中，合适的分散剂的非限制性实例包括淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、高岭土、膨润土、纯化木纤维素、羟基乙酸淀粉钠、同晶硅酸盐(isoamorphous silicate)和微晶纤维素作为高HLB乳化剂表面活性剂。
在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物包含崩解剂作为赋形剂。在一些实施方案中，崩解剂是非泡腾崩解剂。合适的非泡腾崩解剂的非限制性实例包括淀粉如玉米淀粉、马铃薯淀粉、其预胶化和改性淀粉、甜味剂、粘土如膨润土、微晶纤维素、藻酸盐、羟基乙酸淀粉钠、树胶如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐胶、果胶和黄蓍胶。在一些实施方案中，崩解剂是泡腾崩解剂。合适的泡腾崩解剂的非限制性实例包括碳酸氢钠与柠檬酸的组合，以及碳酸氢钠与酒石酸的组合。
在一些实施方案中，赋形剂包括调味剂。在一些实例中，掺入外层的调味剂选自合成调味油和调味芳香剂；天然油；植物、叶、花和果实的提取物；及其组合。在一些实施方案中，调味剂可选自肉桂油；冬青油；薄荷油；三叶草油；干草油；茴香油；桉；香草；柑橘油，如柠檬油、橙油、葡萄油和葡萄柚油；以及水果香精，包括苹果、桃、梨、草莓、覆盆子、樱桃、李子、菠萝和杏的香精。
在一些实施方案中，赋形剂包括甜味剂。合适的甜味剂的非限制性实例包括葡萄糖(玉米糖浆)、右旋糖、转化糖、果糖及其混合物(当不用作载体时)；糖精及其各种盐，如钠盐；二肽甜味剂，如阿斯巴甜；二氢查尔酮化合物、甘草甜素；甜叶菊(Stevia Rebaudiana)(甜菊甙)；蔗糖的氯衍生物如三氯蔗糖；以及糖醇如山梨醇、甘露醇、木糖醇等。
在一些情况下，如本文所述的药物组合物包含着色剂。合适的着色剂的非限制性实例可包括食品、药物和化妆品着色剂(FD&C)，药物和化妆品着色剂(D&C)，以及外用药物和化妆品着色剂(Ext.D&C)。着色剂可用作染料或其相应的色淀。
在一些情况下，如本文所述的药物组合物包含螯合剂。在一些情况下，螯合剂是杀真菌螯合剂。实例包括但不限于：乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(EDTA)；EDTA的二钠、三钠、四钠、二钾、三钾、二锂和二铵盐；EDTA的钡、钙、钴、铜、镝、铕、铁、铟、镧、镁、锰、镍、钐、锶或锌螯合物；反式-1,2-环己烷-N,N,N',N'-四乙酸一水合物；N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸；1,3-二氨基-2-羟基丙烷-N,N,N',N'-四乙酸；1,3-二氨基丙烷-N,N,N',N'-四乙酸；乙二胺-N,N'-二乙酸；乙二胺-N,N'-二丙酸二盐酸盐；乙二胺-N,N'-双(亚甲基膦酸)半水合物；N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N',N'-三乙酸；乙二胺-N,N,N',N'-四(亚甲基膦酸)；O,O'-双(2-氨基乙基)乙二醇-N,N,N',N'-四乙酸；N,N-双(2-羟基苄基)乙二胺-N,N-二乙酸；1,6-六亚甲基二胺-N,N,N',N'-四乙酸；N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸；亚氨基二乙酸；1,2-二氨基丙烷-N,N,N',N'-四乙酸；次氮基三乙酸；次氮基三丙酸；次氮基三(亚甲基磷酸)的三钠盐；7,19,30-三氧杂-1,4,10,13,16,22,27,33-八氮杂双环[11,11,11]三十五烷六氢溴化物；或三乙烯四胺-N,N,N',N”,N”’,N”’-六乙酸。
还涉及组合产品，其包含本文公开的抗TM4SF1抗体和一种或多种其他抗微生物剂或抗真菌剂，例如，多烯如两性霉素B、两性霉素B脂质复合物(ABCD)、脂质体两性霉素B(L-AMB)和脂质体制霉菌素、唑类和三唑类如伏立康唑、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、泊沙康唑等；葡聚糖合酶抑制剂如卡泊芬净、米卡芬净(FK463)和V-棘白菌素(LY303366)；灰黄霉素；烯丙胺类如特比萘芬；氟胞嘧啶或其他抗真菌剂，包括本文所述的那些。另外，预期肽可以与局部抗真菌剂如环吡酮胺、卤普罗近、托萘酯、十一烯酸酯、局部制霉菌素、阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬和其他局部药剂组合。在一些情况下，药物组合物包含额外的药剂。在一些情况下，额外的药剂以治疗有效量存在于药物组合物中。
在普通的储存和使用条件下，如本文所述的药物组合物包含防腐剂以防止微生物的生长。在某些实例中，如本文所述的药物组合物不包含防腐剂。适合注射使用的药物形式包括无菌的水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。药物组合物包含载体，该载体是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和/或植物油，或其任意组合。例如，通过使用包衣，如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需要的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来阻止微生物的作用。在许多情况下，包含等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以引起可注射组合物的延长吸收。
例如，对于在水溶液中的肠胃外施用，如有必要，将液体剂型适当地缓冲，并且用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。液体剂型特别适用于静脉内、肌肉内、皮下、瘤内和腹膜内施用。在这方面，根据本公开内容，可采用的无菌水性介质是本领域技术人员已知的。例如，在某些情况下，将一个剂量溶解于1mL至20mL的等渗NaCl溶液中，并且添加至100mL至1000mL的流体(例如，碳酸氢钠缓冲盐水)中，或在建议的输注部位处注射。
在某些实施方案中，通过将所需量的免疫治疗剂与以上列举的各种其他成分(如果需要)一起并入合适的溶剂中，然后过滤除菌，来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散体，该无菌媒介物含有基础分散介质和来自上文列举的那些成分中的所需其他成分。在一些情况下，本文公开的组合物被配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括，例如，酸加成盐(通过蛋白质的游离氨基形成)，并且该盐是用无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的。在一些情况下，通过游离羧基形成的盐衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。在一些实施方案中，在配制后，药物组合物以与剂量制剂相容的方式和治疗有效的量施用。
在某些实施方案中，本公开的药物组合物包含有效量的如本文公开的抗TM4SF1抗体与药学上可接受的载体的组合。如本文所用的，“药学上可接受的”包括不干扰活性成分的生物活性的有效性并且/或者对其所施用至的患者无毒的任何载体。合适的药物载体的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水乳液、各种类型的润湿剂和无菌溶液。药学上相容的载体的其他非限制性实例可包括凝胶、生物可吸收的基质材料、含有免疫治疗剂的植入元件，或其他任何合适的媒介物、递送或分配工具或材料。这样的载体例如通过常规方法配制，并且以有效量施用于受试者。
IX.联合疗法
在某些实施方案中，本公开的方法包括在一种或多种另外的疗法之前、之后或与其联合地施用如本文公开的ADC。所述另外的疗法的实例可包括但不限于化学疗法、放射疗法、抗癌剂或其任意组合。相对于所述免疫疗法的施用，所述另外的疗法可以同时或顺序地施用。在某些实施方案中，本公开的方法包括在一种或多种抗癌剂或癌症疗法之前、之后或与其联合地施用如本文公开的免疫疗法。抗癌剂包括但不限于化疗剂、放疗剂、细胞因子、免疫检查点抑制剂、抗血管生成剂、凋亡诱导剂、抗癌抗体和/或抗细胞周期蛋白依赖性激酶剂。在某些实施方案中，癌症疗法包括化学疗法、生物疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、抗血管疗法、冷冻疗法、毒素疗法和/或手术或其组合。在某些实施方案中，本公开的方法包括在一种或多种另外的免疫调节剂之前、之后或与其联合地施用如本文公开的免疫疗法。在一些实例中，免疫调节剂包括能够抑制与肿瘤或癌症相关的抗病毒免疫的任何化合物、分子或物质。所述另外的免疫调节剂的非限制性实例包括抗CD33抗体或其可变区、抗CD11b抗体或其可变区、COX2抑制剂(例如，塞来昔布)、细胞因子如IL-12、GM-CSF、IL-2、IFN3和1FNy，以及趋化因子如MIP-1、MCP-1和IL-8。
在某些实例中，在所述另外的疗法是放射疗法的情况下，示例性的剂量是5,000Rad(50Gy)至100,000Rad(1000Gy)，或50,000Rad(500Gy)，或所述范围内的其他合适的剂量。或者，放射剂量是约30至60Gy、约40至约50Gy、约40至48Gy或约44Gy，或所述范围内的其他合适的剂量，其中该剂量例如通过如上所述的剂量学研究来确定。如本文所用的“Gy”可指等于100Rad的辐射的特定吸收剂量的单位。Gy是“戈瑞(Gray)”的缩写。
在某些实例中，在所述另外的疗法是化学疗法的情况下，示例性的化疗剂包括但不限于烷化剂(例如，氮芥衍生物、乙烯亚胺、烷基磺酸酯、肼和三嗪、亚硝基脲和金属盐)、植物生物碱(例如，长春花生物碱、紫杉烷、鬼臼毒素和喜树碱类似物)、抗肿瘤抗生素(例如，蒽环类、色霉素类等)、抗代谢物(例如，叶酸拮抗剂、嘧啶拮抗剂、嘌呤拮抗剂和腺苷脱氨酶抑制剂)、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂和各种其他抗肿瘤药(例如，核糖核苷酸还原酶抑制剂、肾上腺皮质类固醇抑制剂、酶、抗微管剂和类视黄醇)。示例性的化疗剂可以包括但不限于阿那曲唑
Figure BDA0003324235030001219
比卡鲁胺
Figure BDA0003324235030001212
硫酸博来霉素
Figure BDA0003324235030001213
白消安
Figure BDA0003324235030001214
白消安注射液
Figure BDA0003324235030001215
卡培他滨
Figure BDA0003324235030001216
N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂
Figure BDA0003324235030001217
卡莫司汀
Figure BDA0003324235030001218
苯丁酸氮芥
Figure BDA0003324235030001221
顺铂
Figure BDA0003324235030001222
克拉屈滨
Figure BDA0003324235030001223
环磷酰胺(
Figure BDA0003324235030001224
或
Figure BDA0003324235030001225
)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷
Figure BDA0003324235030001226
阿糖胞苷脂质体注射液
Figure BDA0003324235030001227
达卡巴嗪
Figure BDA0003324235030001228
更生霉素(放线菌素D、Cosmegan)、盐酸柔红霉素
Figure BDA0003324235030001229
柠檬酸柔红霉素脂质体注射液
Figure BDA00033242350300012210
地塞米松、多西他赛
Figure BDA00033242350300012211
盐酸多柔比星
Figure BDA00033242350300012212
依托泊苷
Figure BDA00033242350300012213
磷酸氟达拉滨
Figure BDA00033242350300012214
5-氟尿嘧啶
Figure BDA00033242350300012215
Figure BDA00033242350300012216
氟他胺
Figure BDA00033242350300012217
替扎他滨、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲
Figure BDA00033242350300012218
伊达比星
Figure BDA00033242350300012219
异环磷酰胺
Figure BDA00033242350300012220
伊立替康
Figure BDA00033242350300012221
L-天冬酰胺酶
Figure BDA00033242350300012222
甲酰四氢叶酸钙、美法仑
Figure BDA00033242350300012223
6-巯基嘌呤
Figure BDA00033242350300012224
甲氨蝶呤
Figure BDA00033242350300012225
米托蒽醌
Figure BDA00033242350300012226
麦罗塔、紫杉醇
Figure BDA00033242350300012227
phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他汀、聚苯丙生20和卡莫司汀植入物
Figure BDA00033242350300012228
枸橼酸他莫昔芬
Figure BDA00033242350300012229
替尼泊甙
Figure BDA00033242350300012230
6-硫鸟嘌呤、噻替派、替拉扎明
Figure BDA00033242350300012231
注射用盐酸拓扑替康
Figure BDA00033242350300012232
长春碱
Figure BDA00033242350300012233
长春新碱
Figure BDA00033242350300012234
和长春瑞滨
Figure BDA00033242350300012235
依鲁替尼、艾代拉利司(idelalisib)和维本妥昔单抗(brentuximabvedotin)。
示例性的烷化剂包括但不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲和三氮烯(triazenes)：尿嘧啶氮芥(Aminouracil
Figure BDA00033242350300012236
Figure BDA00033242350300012237
Uracil nitrogen
Figure BDA00033242350300012238
Figure BDA00033242350300012239
)、盐酸氮芥
Figure BDA00033242350300012240
环磷酰胺(
Figure BDA00033242350300012241
Figure BDA00033242350300012242
RevimmuneTM)、异环磷酰胺
Figure BDA00033242350300012243
美法仑
Figure BDA00033242350300012244
苯丁酸氮芥
Figure BDA00033242350300012245
哌泊溴烷
Figure BDA00033242350300012246
三亚乙基三聚氰胺
Figure BDA00033242350300012247
Figure BDA00033242350300012248
三亚乙基硫代磷酰胺、替莫唑胺
Figure BDA00033242350300012249
噻替派
Figure BDA00033242350300012250
白消安
Figure BDA00033242350300012251
卡莫司汀
Figure BDA0003324235030001231
洛莫司汀
Figure BDA0003324235030001232
链脲菌素
Figure BDA0003324235030001233
和达卡巴嗪
Figure BDA0003324235030001234
另外的示例性烷化剂包括但不限于奥沙利铂
Figure BDA0003324235030001235
替莫唑胺(
Figure BDA0003324235030001236
和
Figure BDA0003324235030001237
)；更生霉素(也称为放线菌素-D，
Figure BDA0003324235030001238
)；美法仑(也称为L-PAM、L-溶肉瘤素(L-sarcolysin)和苯丙氨酸氮芥，
Figure BDA0003324235030001239
)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)，
Figure BDA00033242350300012310
)；卡莫司汀
Figure BDA00033242350300012311
苯达莫司汀
Figure BDA00033242350300012312
白消安(
Figure BDA00033242350300012313
和
Figure BDA00033242350300012314
)；卡铂
Figure BDA00033242350300012315
洛莫司汀(也称为CCNU，
Figure BDA00033242350300012316
)；顺铂(也称为CDDP，
Figure BDA00033242350300012317
和
Figure BDA00033242350300012318
)；苯丁酸氮芥
Figure BDA00033242350300012319
环磷酰胺(
Figure BDA00033242350300012320
和
Figure BDA00033242350300012321
)；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺，
Figure BDA00033242350300012322
)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)，
Figure BDA00033242350300012323
)；异环磷酰胺
Figure BDA00033242350300012324
泼尼氮芥(Prednumustine)；丙卡巴肼
Figure BDA00033242350300012325
二氯甲基二乙胺(也称氮芥、盐酸氮芥(mustine)和二氯甲基二乙胺盐酸盐，
Figure BDA00033242350300012326
)；链脲菌素
Figure BDA00033242350300012327
噻替哌(也称为硫代磷酰胺、TESPA和TSPA，
Figure BDA00033242350300012328
)；环磷酰胺
Figure BDA00033242350300012329
以及盐酸苯达莫司汀
Figure BDA00033242350300012330
示例性的蒽环类可包括但不限于，例如，多柔比星(
Figure BDA00033242350300012331
和
Figure BDA00033242350300012332
)；博来霉素
Figure BDA00033242350300012333
柔红霉素(盐酸柔红霉素、道诺霉素和盐酸红比霉素，
Figure BDA00033242350300012334
)；柔红霉素脂质体(柠檬酸柔红霉素脂质体，
Figure BDA00033242350300012335
)；米托蒽醌(DHAD，
Figure BDA00033242350300012336
)；表柔比星(EllenceTM)；伊达比星(
Figure BDA00033242350300012337
Idamycin
Figure BDA00033242350300012338
)；丝裂霉素C
Figure BDA00033242350300012339
格尔德霉素；除莠霉素；拉维霉素(ravidomycin)；以及去乙酰基拉维霉素(desacetylravidomycin)。
示例性的长春花生物碱包括但不限于酒石酸长春瑞滨
Figure BDA00033242350300012340
长春新碱
Figure BDA00033242350300012341
和长春地辛
Figure BDA00033242350300012342
长春碱(也称为硫酸长春碱、长春花碱和VLB，
Figure BDA00033242350300012343
和
Figure BDA00033242350300012344
)；以及长春瑞滨
Figure BDA00033242350300012345
示例性的蛋白酶体抑制剂可以是但不限于硼替佐米
Figure BDA00033242350300012346
卡非佐米(PX-171-007，(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰氨基)-戊酰胺)；marizomib(NPI-0052)；枸橼酸艾沙佐米(MLN-9708)；delanzomib(CEP-18770)；以及O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰基-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。
如本文所用的“与……组合”意指抗TM4SF1抗体和另外的疗法作为治疗方案或计划的一部分施用于受试者。在某些实施方案中，联合使用并不要求在施用前将抗TM4SF1抗体与另外的疗法物理组合，也不要求其在同一时间范围内施用。例如，非限制性地，所述抗TM4SF1抗体和一种或多种药剂同时施用于所治疗的受试者，或者在同一时间施用或以任何顺序或在不同的时间点顺序施用。
X.试剂盒
在一些实施方案中，本公开提供了包括本公开的组合物(例如药物组合物)(例如，包括含有抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的ADC的组合物)的试剂盒。试剂盒包括关于允许临床医师(例如医师或护士)向受试者施用其中含有的组合物以治疗与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)的说明书。
在某些实施方案中，试剂盒包括含有有效量的本公开的抗体的单剂量药物组合物的包装。任选地，试剂盒中可包括施用药物组合物所必需的仪器或装置。例如，本公开的试剂盒可提供一个或多个含有有效量的本公开的疫苗、载体、稳定化三聚体或优化的病毒多肽的预填充注射器。此外，试剂盒还可包括额外的组成部分，诸如关于患有与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)的受试者使用一种或多种含有本公开的TM4SF1结合蛋白或多核苷酸的药物组合物的施用时间表的说明书。
实施例
实施例1：示例性抗TM4SF1抗体的表征
亲和力
通过基于细胞的流式细胞术测定检测了包含各种Fc突变的抗TM4SF1抗体的抗原结合亲和力。包含Fc区突变N297C(“C”变体)或N297C与突变M252Y、S254T和T256E的组合(“YTEC”变体)的示例性抗TM4SF1抗体AGX-A07的变体，使用HUVEC细胞(原代脐静脉血管内皮细胞；
Figure BDA0003324235030001251
PCS-100-010TM)进行了测试。结合的EC50值显示在图3中(左上图)，其中A07-wt对应于无Fc区突变的AGX-A07抗体。类似地，在无限增殖化小鼠内皮细胞MS-1细胞(MILE SVEN 1；
Figure BDA0003324235030001252
CRL-2279TM)中测试了鼠替代物(在图中称为“MS”)的“C”变体和“YTEC”变体。结合的EC50值显示在图3中(右上图和右下图)，其中MS-wt对应于无Fc区突变的鼠替代抗体。
组织分布
在该研究中，在小鼠中确定了鼠替代(MS)抗TM4SF1抗体“C”和“YTEC”变体的体内组织分布。将与Alexa FluorTM 647缀合的鼠替代物“C”变体(MS-C-647)和与Alexa FluorTM488缀合的鼠替代物“YTEC”变体(MS-YTEC-488)以30mg/kg(30mpk)的剂量腹膜内共注射到LLC(Lewis肺癌)荷瘤C57BL/6(8周龄)小鼠中。主要器官在注射后24或48小时收获，并在4％低聚甲醛中固定，以供在OCT封固介质中包埋并切片。通过共聚焦显微镜捕获组织切片中的MS-C-647和MS-YTEC-488抗体信号，并检查组织分布差异。
发现所有血管对MS-C-647和MS-YTEC-488信号均呈阳性。在某些器官中，组织驻留肥大细胞和/或周细胞也与MS-YTEC-488强烈相互作用，但不与MS-C-647相互作用。这些结果表明，MS-YTEC-488可以容易地从内皮胞转到组织中，以便通过抗体恒定区与白细胞相互作用，或通过抗原结合与周细胞相互作用。总体组织分布观察在下表中汇总，并且还在图4和图5中示出(bv＝血管)。
表1：MS-C和MS-YTEC的组织分布
Figure BDA0003324235030001261
疏水性
在本研究中，使用疏水相互作用色谱法评估了示例性抗TM4SF1抗体及其含有Fc突变的变体的疏水性。测试的抗体是AGX-A07(“wt”、“C”和“YTEC”)；MS(“wt”、“C”和“YTEC”)。具有Fc突变的抗Her2抗体用作对照。结果绘制在图6中，并且也总结在表2中。在AGX-A07和鼠替代抗TM4SF1抗体的情况下，均观察到疏水性随着“C”和“YTEC”突变而增加。
表2：疏水性总结
Figure BDA0003324235030001262
Figure BDA0003324235030001271
实施例2：含有示例性抗TM4SF1抗体的抗体-药物缀合物
在体外和体内研究中制备并测试了含有示例性抗TM4SF1抗体的抗体-药物缀合物(ADC)。图1和图2提供了使用马来酰亚胺缀合(图2)或溴乙酰胺缀合(图1)制备的ADC的结构；14S,16S,32S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-氯-14-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧代-7-氮杂-1(6,4)-噁嗪烷并-3(2,3)-环氧乙烷并-8(1,3)-苯并环十四烷(benzenacyclotetradecaphane)-10,12-二烯-4-基N-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)-N-甲基-L-丙氨酸酯和14S,16S,32S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-氯-14-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧代-7-氮杂-1(6,4)-噁嗪烷并-3(2,3)-环氧乙烷并-8(1,3)-苯并环十四烷-10,12-二烯-4-基(S)-1-溴-26,27-二甲基-2,18,25-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,19,26-三氮杂二十八烷-28-酸酯。
体内耐受性
以不同剂量(40mg/kg、50mg/kg和60mg/kg)，向八周龄的C57B1/6小鼠施用使用马来酰亚胺缀合制备的，含有与美登素缀合的鼠替代物“C”变体(MS-C)的ADC(MS-C-mc-DM1)。该ADC的DAR约为2.0(解卷积谱在图7中示出)。
ADC在40mg/kg剂量下是耐受的，但在50mg/kg剂量下不耐受，如图8所示。另外，采用60mg/kg剂量的MS-C-mc-DM1，小鼠在第10-12天显示出胸腔积液。
在进一步的研究中，向不同年龄的小鼠施用(i)MS-C-BA-DM1 ADC(包含与美登素缀合的鼠替代物“C”变体，使用溴乙酰胺缀合制备)，或(ii)MS-YTEC-BA-DM1 ADC(包含与美登素缀合的鼠替代物“YTEC”变体，使用溴乙酰胺缀合制备)。据观察，一般来说，年龄较大的小鼠(4-9个月)对MS ADC的耐受好于年龄较小的小鼠(8周)。在60mg/kg的剂量下，小鼠对MS-YTEC-BA-DM1的耐受性好于MS-C-BA-DM1。此外，与马来酰亚胺缀合的ADC不同，采用BA-DM1缀合的MS-C和MS-YTEC抗体未观察到明显的胸腔积液。这是相比于马来酰亚胺缀合的ADC的改善，后者在60mg/kg时没有存活(见图8)。
溴乙酰胺缀合的ADC的结果显示在图9中。实验1和2用两组动物进行。下表总结了60mg/kg剂量下的存活率。
表3：存活率
Figure BDA0003324235030001281
在食蟹猴中的毒性研究
在本研究中，将动物随机分成不同的组，并施用(i)5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg的含有与美登素缀合的AGX-A07“C”变体(A07-C)的ADC(AGX-A07-C-BA-DM1)；或(ii)40mg/kg的含有与美登素缀合的AGX-A07“YTEC”(A07-YTEC)的ADC(AGX-A07-BA-YTEC-DM1)。表4提供了关于所测试的动物的详细信息。
表4：在食蟹猴中通过静脉内注射或输注，含有示例性抗人TM4SF1抗体的ADC的非 GLP单剂量研究
Figure BDA0003324235030001282
Figure BDA0003324235030001291
来自猴子研究的宏观和微观病理学观察的汇总在表5中提供。
表5：死亡时(注射1次测试物后42天)的宏观/微观病理学报告
Figure BDA0003324235030001292
Figure BDA0003324235030001301
在小鼠和食蟹猴中的药代动力学研究
在该研究中，在小鼠和食蟹猴中评估了各种浓度的示例性抗TM4SF1抗体和含有该抗体的ADC。替代抗小鼠TM4SF1抗体(MS-C和MS-YTEC)在小鼠中的清除比抗人TM4SF1抗体(A07-C和A07-YTEC)在猴子中的清除快得多。当以60mg/kg的相同剂量施用时，MS-YTEC在小鼠中的清除比MS-C快得多。在示例性抗人TM4SF1抗体的情况下，当以40mg/kg的相同剂量施用时，A07-C-BA-DM1和A07-YTEC-BA-DM1在猴子中以相似的速度被清除。
不同的注射途径——静脉内(iv)和腹腔内(ip)，在小鼠循环中显示出非常相似的鼠替代抗体水平，无论该抗体是裸抗体还是与DM1有效负载缀合。该研究的结果显示在图10中。
功效
在该研究中，测试了使用溴乙酰胺缀合与有效负载DM1缀合的鼠替代抗TM4SF1抗体——MS-C-BA-DM1和MS-YTEC-BA-DM1——在减小肿瘤体积方面的功效。
简言之，将预先植入B16-F10肿瘤细胞(
Figure BDA0003324235030001311
CRL-6475TM-小鼠皮肤黑素瘤细胞)的8周龄C57/Bl6小鼠随机分组，并注射对照或如下ADC：(i)12mg/kg或20mg/kg的MS-C-BA-DM1(DAR 2.2)；或(ii)12mg/kg或20mg/kg的MS-YTEC-BA-DM1(DAR2.1)。
测量注射后约16天期间的肿瘤体积，并将结果显示在图11中。在12mg/kg的剂量下，MS-C-BA-DM1和MS-YTEC-BA-DM1显示出非常相似的B16-F10肿瘤消退功效。而在20mg/kg的剂量下，MS-C-BA-DM1显示出比MS-YTEC-BA-DM1更好的B16-F10肿瘤消退功效。
接下来，如上所述，在预先植入B16-F10肿瘤细胞的八周龄C57/Bl6小鼠中，使用24mg/kg单次注射评估MS-YTEC-BA-DM1(DAR为约2或约1)的肿瘤消退性质。DARI和DAR2缀合时的MS-YTEC-BA-DM1显示出非常相似的B16F10肿瘤消退功效。结果在图12中示出。
使用MiaPaca(
Figure BDA0003324235030001312
CRL-1420TM-胰腺癌)异种移植肿瘤模型进行了进一步的功效研究。简言之，将八周龄的无胸腺裸鼠随机分组，并注射对照或如下ADC：(i)12mg/kg(单次注射)的MS-C-BA-DM1或12mg/kg(单次注射)的MS-YTEC-BA-DM1(图13-左上图)；(ii)12mg/kg(单次注射)的A07-C-BA-DM1或12mg/kg(单次注射)的A07-YTEC-BA-DM1(图13-右上图)；(iii)单次注射12mg/kg的MS-C-BA-DM1联合单次注射12mg/kg的A07-C-BA-DM1，或单次注射12mg/kg的MS-YTEC-BA-DM1联合12mg/kg的A07-YTEC-BA-DM1(图13-左下图)；(iv)3mg/kg(q7d4-每周，四次)的MS-C-BA-DM1联合3mg/kg(q7d4)的A07-C-BA-DM1，或3mg/kg(q7d4)的MS-YTEC-BA-DM1联合3mg/kg(q7d4)的A07-YTEC-BA-DM1(图13-右下图)。
MS-C-BA-DM1和MS-YTEC-BA-DM1显示出非常相似的MiaPaca2肿瘤消退功效。在MS+A07的联合治疗中，与每周注射4次的较小剂量(3mg/kg)相比，单次注射较高剂量(12mg/kg)的MiaPaca2肿瘤消退更好。
本领域技术人员将会明白，可在不脱离本公开的精神或范围的情况下，在本公开的组合物、方法和试剂盒方面进行各种修改和变化。因此，本公开意图涵盖本公开的修改和变化，前提是它们在随附的权利要求书及其等同物的范围内。
表6.序列描述
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虽然本文已经示出并描述了本公开的优选实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本公开内容的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实施本公开时可以采用本文所述本公开的实施方案的各种替代方案。旨在以所附权利要求书限定本公开的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (289)

1.一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含IgG Fc区，该IgG Fc区包含在选自E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、M428和N434的一个或多个位置处的突变；如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
2.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含所述在位置N297处的突变。
3.根据权利要求2所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置N297处的突变包括N297C。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
5.一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含IgG Fc区，该IgG Fc区包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
6.根据权利要求5所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区进一步包含在选自E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、T356、M428和N434的一个或多个位置处的突变；如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
7.根据权利要求6所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含所述在位置N297处的突变。
8.根据权利要求7所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置N297处的突变包括N297C。
9.一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含IgG Fc区，该IgG Fc区在位置N297处包含半胱氨酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
10.根据权利要求9所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区进一步包含在选自E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、M428和N434的一个或多个位置处的突变；如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
11.根据权利要求9或10所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
12.一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含IgG Fc区，该IgG Fc区包含人IgG1 Fc区，该人IgG1 Fc区包含在位置N297处的半胱氨酸残基和在选自E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、M428和N434的一个或多个位置处的突变；如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
13.根据权利要求12所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
14.一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含IgG Fc区，该IgG Fc区在位置N297处包含半胱氨酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的，其中所述抗体-药物缀合物的药物与抗体之比(DAR)大于或等于约1。
15.根据权利要求14所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区进一步包含在选自E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、M428和N434的一个或多个位置处的突变；如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
16.根据权利要求14或15所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
17.一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含IgG Fc区，该IgG Fc区包含在位置N297处的半胱氨酸残基和带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，其中编号是按照Kabat中阐述的EU索引。
18.根据权利要求17所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区进一步包含在选自E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、M428和N434的一个或多个位置处的突变；如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
19.根据权利要求4、5-8、11、13和16-18中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置K447之后的一个或多个氨基酸残基独立地选自：赖氨酸、脯氨酸、精氨酸或其任意组合。
20.根据权利要求19所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置K447之后的一个或多个氨基酸残基独立地选自：所述赖氨酸和所述脯氨酸。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含所述在位置E233处的突变。
22.根据权利要求21所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置E233处的突变包括E233P。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含所述在位置L234处的突变。
24.根据权利要求23所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置L234处的突变包括L234A。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含所述在位置L235处的突变。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置L235处的突变包括L235A。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含所述在位置G237处的突变。
28.根据权利要求27所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置G237处的突变包括G237A。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含所述在位置M252处的突变。
30.根据权利要求29所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置M252处的突变包括M252Y。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含所述在位置S254处的突变。
32.根据权利要求31所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置S254处的突变包括S254T。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含所述在位置T256处的突变。
34.根据权利要求33所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置T256处的突变包括T256E。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含所述在位置M428处的突变。
36.根据权利要求35所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置M428处的突变包括M428L。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含所述在位置N434处的突变。
38.根据权利要求37所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置N434处的突变包括N434S或N434A。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含所述在位置T250处的突变。
40.根据权利要求39所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置T250处的突变包括T250Q。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含所述在位置D265处的突变。
42.根据权利要求41所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置D265处的突变包括D265A。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含所述在位置K322处的突变。
44.根据权利要求43所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置K322处的突变包括K322A。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含所述在位置P331处的突变。
46.根据权利要求45所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置P331处的突变包括P331G。
47.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含T250Q和M428L。
48.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含M428L。
49.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含M428L和N434S。
50.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含N434A。
51.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含L234A、L235A和G237A。
52.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含L234A、L235A、G237A和P331G。
53.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含L234A、L235A、G237A、N297C和P331G。
54.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含L234A、L235A、G237A、K322A和P331G。
55.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含E233P、L234A、L235A、G237A和P331G。
56.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含E233P、L234A、L235A、G237A和N297C。
57.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含E233P、L234A、L235A、G237A和N297C。
58.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含L234A、L235A、G237A、N297C、K322A和P331G。
59.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含E233P、L234A、L235A、G237A、D265A、N297C、K322A和P331G。
60.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含E233P、L234A、L235A、G237A、D265A、N297C、K322A和P331G。
61.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含E233P和D265A。
62.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含M252Y、S254T和T256E。
63.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含M252Y、S254T、T256E和N297C。
64.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含K322A和P331G，并且其中所述IgG Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基。
65.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区包含选自SEQ IDNo.87-88、135-145和151-153的氨基酸序列。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区表现出与C1q的结合降低或消除。
67.根据权利要求1-66中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG Fc区表现出与Fc受体的结合降低或消除。
68.根据权利要求1-67中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗TM4SF1抗体表现出降低或消除的ADCC或CDC效应子功能。
69.根据权利要求1-68中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链，其包含CDR3结构域，该CDR3结构域包含与选自SEQ ID NO:8、20、32、44、56、68、80、96、118、119、120或121的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；CDR2结构域，该CDR2结构域包含与选自SEQ ID NO:7、19、31、43、55、67、79、95、116或117的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和CDRl结构域，该CDRl结构域包含与选自SEQ ID NO:6、18、30、42、54、66、78、94或115的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；以及
(b)轻链，其包含CDR3结构域，该CDR3结构域包含与选自SEQ ID NO:14、26、38、50、62、74、86、110或129的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；CDR2结构域，该CDR2结构域包含与选自SEQ ID NO:13、25、37、49、61、73、85、109或128的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和CDRl结构域，该CDRl结构域包含与选自SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72或84、107、108、124、125、126或127的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
70.根据权利要求69所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链包含与SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63、75、90、92、112、114、130或132具有至少75％同一性的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:9、21、33、45、57、69、81、97、99、101、122、131或133具有至少75％同一性的氨基酸序列。
71.根据权利要求70所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链包含SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63、75、90、92、112、114、130或132所示的序列，并且其中所述轻链可变域包含SEQ IDNO:9、21、33、45、57、69、81、97、99、101、122、131或133所示的序列。
72.根据权利要求69-71中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQID NO:8所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQID NO:14所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
73.根据权利要求69-71中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQID NO:20所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
74.根据权利要求69-71中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQID NO:32所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
75.根据权利要求69-71中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQID NO:44所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
76.根据权利要求69-71中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQID NO:56所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
77.根据权利要求69-71中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQID NO:68所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
78.根据权利要求69-71中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQID NO:80所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
79.根据权利要求69-71中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQID NO:96所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:107或SEQ ID NO:108所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
80.根据权利要求69-71中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQID NO:96所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:107所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
81.根据权利要求69-71中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQID NO:96所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:108所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
82.根据权利要求69-71中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQID NO:96所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:111所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:107所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
83.根据权利要求69-71中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQID NO:96所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:111所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:108所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
84.根据权利要求69-71中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQID NO:118所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:116所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:115所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:129所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:124所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
85.根据权利要求69-71中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ IN NO:120或SEQ ID NO:121所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:116或SEQ ID NO:117所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ IDNO:115所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:129所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126或SEQ ID NO:127所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
86.根据权利要求0-85中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab')2、Fv或scFv。
87.根据权利要求1-85中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述治疗分子包括以下至少一种：小分子、降解剂、核酸分子、CRISPR-Cas9基因编辑系统和脂质纳米颗粒，或其任意组合。
88.根据权利要求1-86中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述治疗分子包括以下至少一种：V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、瑞奥西汀(auristatin)、多拉司他汀、美登木素生物碱、MetAP(甲硫氨酸氨肽酶)、蛋白质核输出抑制剂CRM1、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中的磷酰基转移反应的抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂、DHFR抑制剂、核酸、CRISPR酶或其任意组合。
89.根据权利要求87所述的抗体-药物缀合物，其中所述降解剂包括诱导蛋白质降解的试剂。
90.根据权利要求89所述的抗体-药物缀合物，其中所述诱导蛋白质降解的试剂包括疏水性标签、诱导蛋白水解的嵌合体、HSP90抑制剂、选择性雌激素受体降解剂(SERD)和选择性雄激素受体降解剂(SARD)，或其任意组合。
91.根据权利要求87所述的抗体-药物缀合物，其中所述脂质纳米颗粒包封一种或多种治疗分子。
92.根据权利要求87所述的抗体-药物缀合物，其中所述核酸分子包括RNA分子或DNA分子。
93.根据权利要求92所述的抗体-药物缀合物，其中所述RNA分子包括siRNA、反义RNA、miRNA、反义miRNA、antagomir(抗miRNA)、shRNA或mRNA。
94.根据权利要求87-93中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段与所述治疗分子在单步或多步方案中通过连接体缀合。
95.根据权利要求94所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接体包括可切割的连接体、不可切割的连接体、亲水性连接体、促带电荷的连接体或基于二羧酸的连接体。
96.根据权利要求95所述的抗体-药物缀合物，其中所述可切割的连接体包括可切割的共价或非共价连接体。
97.根据权利要求94所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接体包括不可切割的共价或非共价连接体。
98.根据权利要求95或96所述的抗体-药物缀合物，其中所述可切割的连接体包括酸不稳定的连接体、蛋白酶敏感的连接体、光不稳定的连接体或含二硫键的连接体。
99.根据权利要求94所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接体包括半胱氨酸连接体或非半胱氨酸连接体。
100.根据权利要求99所述的抗体-药物缀合物，其中所述非半胱氨酸连接体包括赖氨酸连接体。
101.根据权利要求94所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接体包括MC(6-马来酰亚胺基己酰基)、MCC(马来酰亚胺基甲基环己烷-1-甲酸酯)、MP(马来酰亚胺基丙酰基)、val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)、val-ala(缬氨酸-丙氨酸)、ala-phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、PAB(对氨基苄氧羰基)、SPP(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-(吡啶-2-基硫基)己酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基5-甲基-4-(吡啶-2-基硫基)己酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基5-甲基-4-(吡啶-2-基硫基)庚酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基5-乙基-4-(吡啶-2-基硫基)庚酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丙基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丁基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环戊基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环己基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸酯、SMCC(N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1甲酸酯)或SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯)。
102.根据权利要求94所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接体衍生自交联剂，其中所述交联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、2，5-二氧代吡咯烷-1-基3-环丙基-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-环丁基-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸酯、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(SPP)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丙基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丁基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丙基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丁基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(磺基-SMCC)或2,5-二氧代吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸酯(CX1-1)。
103.一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含人IgG4 Fc区，该人IgG4 Fc区包含在选自S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434、H435和N297的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
104.根据权利要求103所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含所述在位置N297处的突变。
105.根据权利要求104所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置N297处的突变包括N297C。
106.根据权利要求103-105中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
107.一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含人IgG4 Fc区，该人IgG4 Fc区包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
108.根据权利要求107所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区进一步包含在选自S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434、H435和N297的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
109.根据权利要求107或108中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含所述在位置N297处的突变。
110.根据权利要求109所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置N297处的突变包括N297C。
111.一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含人IgG4 Fc区，该人IgG4 Fc区在位置N297处包含半胱氨酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
112.根据权利要求111所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区进一步包含在选自S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434和H435的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
113.根据权利要求111或112所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
114.一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含人IgG4 Fc区，该人IgG4 Fc区包含在位置N297处的半胱氨酸残基和在选自S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434和H435的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
115.根据权利要求114所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
116.一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含人IgG4 Fc区，该人IgG4 Fc区在位置N297处包含半胱氨酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的，其中所述抗体-药物缀合物的药物与抗体之比(DAR)大于或等于1。
117.根据权利要求116所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区进一步包含在选自S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434和H435的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
118.根据权利要求116或117所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
119.一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含人IgG4 Fc区，该人IgG4 Fc区包含在位置N297处的半胱氨酸残基和带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，其中编号是按照Kabat中阐述的EU索引。
120.根据权利要求119所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区进一步包含在选自S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434和H435的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
121.根据权利要求106-110、113、115、118-120中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置K447之后的一个或多个氨基酸残基独立地选自：赖氨酸、脯氨酸、精氨酸或其任意组合。
122.根据权利要求121所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置K447之后的一个或多个氨基酸残基独立地选自：所述赖氨酸和所述脯氨酸。
123.根据权利要求103-106、108-110、112-115、117-118和120-122中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含所述在位置S228处的突变。
124.根据权利要求123所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置S228处的突变包括S228P。
125.根据权利要求92-95、97-99、101-104、106-107和109-113中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含所述在位置F234处的突变。
126.根据权利要求114所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置F234处的突变包括F234A。
127.根据权利要求103-106、108-110、112-115、117-118和120-126中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含所述在位置L235处的突变。
128.根据权利要求127所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置L235处的突变包括L235E。
129.根据权利要求128所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含S228P和L235E。
130.根据权利要求129所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含S228P、L235E和N297C。
131.根据权利要求130所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含S228P、F234A、L235E和N297C。
132.根据权利要求130所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含S228P、L235E和N297C，并且其中所述人IgG4 Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基。
133.根据权利要求103所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含M428L和N434S。
134.根据权利要求103所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含在L235和F234处的突变。
135.根据权利要求103所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含在位置L328、A330和T299处的突变。
136.根据权利要求103所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含S228P、F234A、L235A、G237A和P238S。
137.根据权利要求103所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含F243A和V264A。
138.根据权利要求103所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含S228P和L235A。
139.根据权利要求103所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含M252Y和M428L；D259I和V308F；或N434S。
140.根据权利要求103所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含T307Q和N434S；M428L和V308F；Q311V和N434S；H433K和N434F；E258F和V427T；或T256D、Q311V和A378V。
141.根据权利要求103-140中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区具有一种或多种以下性质：(i)与C1q的结合降低或消除；(ii)与Fc受体的结合降低或消除；(iii)降低或消除的ADCC或CDC效应子功能。
142.根据权利要求103-141中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链，其包含CDR3结构域，该CDR3结构域包含与选自SEQ ID NO:8、20、32、44、56、68、80、96、118、119、120或121的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；CDR2结构域，该CDR2结构域包含与选自SEQ ID NO:7、19、31、43、55、67、79、95、116或117的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和CDRl结构域，该CDRl结构域包含与选自SEQ ID NO:6、18、30、42、54、66、78、94或115的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；以及
(b)轻链，其包含CDR3结构域，该CDR3结构域包含与选自SEQ ID NO:14、26、38、50、62、74、86、110或129的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；CDR2结构域，该CDR2结构域包含与选自SEQ ID NO:13、25、37、49、61、73、85、109或128的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和CDRl结构域，该CDRl结构域包含与选自SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72或84、107、108、124、125、126或127的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
143.根据权利要求142所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
144.根据权利要求142所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
145.根据权利要求142所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
146.根据权利要求142所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
147.根据权利要求142所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
148.根据权利要求142所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
149.根据权利要求142所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
150.根据权利要求142所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:107所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
151.根据权利要求142所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:108所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
152.根据权利要求142所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQ ID NO:118所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:116所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:115所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQID NO:129所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:124所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
153.根据权利要求142所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链含有包含SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ IN NO:120或SEQ ID NO:121所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:116或SEQ ID NO:117所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ ID NO:115所示的氨基酸序列的CDR1结构域；并且其中所述轻链含有包含SEQ ID NO:129所示的氨基酸序列的CDR3结构域、包含SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的CDR2结构域和包含SEQ IDNO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126或SEQ ID NO:127所示的氨基酸序列的CDR1结构域。
154.根据权利要求142-153中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链包含与SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63、75、90、92、112或114具有至少75％同一性的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:9、21、33、45、57、69、81、97、99、101或122具有至少75％同一性的氨基酸序列。
155.根据权利要求154所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链包含SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63、75、90、92、112、114、130或132所示的氨基酸序列，并且其中所述轻链包含SEQID NO:9、21、33、45、57、69、81、97、99、101、122、131或133所示的氨基酸序列。
156.根据权利要求103-155中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述包含所述人IgG4 Fc区的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID No.146-150和154-155的氨基酸序列。
157.根据权利要求103-156中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab')2、Fv或scFv。
158.根据权利要求103-157中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述治疗分子包括以下至少一种：小分子、降解剂、核酸分子、CRISPR-Cas9基因编辑系统和脂质纳米颗粒，或其任意组合。
159.根据权利要求103-158中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述治疗分子包括以下至少一种：V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、瑞奥西汀(auristatin)、多拉司他汀、美登木素生物碱、MetAP(甲硫氨酸氨肽酶)、蛋白质核输出抑制剂CRM1、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中的磷酰基转移反应的抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂、DHFR抑制剂、核酸、CRISPR酶或其任意组合。
160.根据权利要求158所述的抗体-药物缀合物，其中所述降解剂包括诱导蛋白质降解的试剂。
161.根据权利要求160所述的抗体-药物缀合物，其中所述诱导蛋白质降解的试剂包括疏水性标签、诱导蛋白水解的嵌合体、HSP90抑制剂、选择性雌激素受体降解剂(SERD)、选择性雄激素受体降解剂(SARD)或其任意组合。
162.根据权利要求158所述的抗体-药物缀合物，其中所述脂质纳米颗粒包封一种或多种治疗分子。
163.根据权利要求158所述的抗体-药物缀合物，其中所述核酸分子包括RNA分子或DNA分子。
164.根据权利要求163所述的抗体-药物缀合物，其中所述RNA分子包括siRNA、反义RNA、miRNA、反义miRNA、antagomir(抗miRNA)、shRNA或mRNA。
165.根据权利要求158-164中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段与所述治疗分子在单步或多步方案中通过连接体缀合。
166.根据权利要求165所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接体包括可切割的连接体、不可切割的连接体、亲水性连接体、促带电荷的连接体或基于二羧酸的连接体。
167.根据权利要求166所述的抗体-药物缀合物，其中所述可切割的连接体包括可切割的共价或非共价连接体。
168.根据权利要求165所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接体包括不可切割的共价或非共价连接体。
169.根据权利要求166或167所述的抗体-药物缀合物，其中所述可切割的连接体包括酸不稳定的连接体、蛋白酶敏感的连接体、光不稳定的连接体或含二硫键的连接体。
170.根据权利要求165所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接体包括半胱氨酸连接体或非半胱氨酸连接体。
171.根据权利要求170所述的抗体-药物缀合物，其中所述非半胱氨酸连接体包括赖氨酸连接体。
172.根据权利要求165所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接体包括MC(6-马来酰亚胺基己酰基)、MCC(马来酰亚胺基甲基环己烷-1-甲酸酯)、MP(马来酰亚胺基丙酰基)、val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)、val-ala(缬氨酸-丙氨酸)、ala-phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、PAB(对氨基苄氧羰基)、SPP(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-(吡啶-2-基硫基)己酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基5-甲基-4-(吡啶-2-基硫基)己酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基5-甲基-4-(吡啶-2-基硫基)庚酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基5-乙基-4-(吡啶-2-基硫基)庚酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丙基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丁基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环戊基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环己基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸酯、SMCC(N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1甲酸酯)或SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯)。
173.根据权利要求165所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接体衍生自交联剂，其中所述交联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、2，5-二氧代吡咯烷-1-基3-环丙基-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-环丁基-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸酯、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(SPP)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丙基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丁基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丙基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丁基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(磺基-SMCC)或2,5-二氧代吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸酯(CX1-1)。
174.一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，其中该疾病或病症的特征在于异常内皮细胞(EC)-细胞相互作用，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-102中任一项的抗体-药物缀合物。
175.一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，其中该疾病或病症的特征在于异常内皮细胞(EC)-细胞相互作用，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求103-173中任一项的抗体-药物缀合物。
176.根据权利要求174或175所述的方法，其中所述EC-细胞相互作用包括EC-间充质干细胞、EC-成纤维细胞、EC-平滑肌细胞、EC-肿瘤细胞、EC-白细胞、EC-脂肪细胞和EC-神经元细胞相互作用中的一种或多种。
177.根据权利要求174-176中任意一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括炎性疾病或癌症。
178.一种治疗或预防受试者的炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-102中任一项的抗体-药物缀合物。
179.一种治疗或预防受试者的炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求103-173中任一项的抗体-药物缀合物。
180.一种治疗或预防受试者的转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-102中任一项的抗体-药物缀合物，其中所述受试者从癌症部分或完全缓解。
181.一种治疗或预防受试者的转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求103-173中任一项的抗体-药物缀合物，其中所述受试者从癌症部分或完全缓解。
182.一种治疗患有与高转移风险相关的癌症的受试者的方法，所述方法包括向患有与高转移风险相关的癌症的受试者施用根据权利要求1-102中任一项的抗体-药物缀合物。
183.一种治疗患有与高转移风险相关的癌症的受试者的方法，所述方法包括向患有与高转移风险相关的癌症的受试者施用根据权利要求103-173中任一项的抗体-药物缀合物。
184.一种治疗或预防患有癌症的受试者的转移的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用根据权利要求1-102中任一项的抗体-药物缀合物。
185.一种治疗或预防患有癌症的受试者的转移的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用根据权利要求103-173中任一项的抗体-药物缀合物。
186.根据权利要求180-185中任一项所述的方法，其中所述受试者正在接受可诱导转移的治疗。
187.根据权利要求186所述的方法，其中所述治疗包括手术、放射治疗和化学疗法。
188.根据权利要求180-187中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
189.根据权利要求177和180-188中任一项所述的方法，其中所述癌症是癌或肉瘤。
190.根据权利要求189所述的方法，其中所述癌包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌。
191.根据权利要求189所述的方法，其中所述肉瘤包括血管肉瘤、骨肉瘤或软组织肉瘤。
192.根据权利要求177和180-188中任一项所述的方法，其中所述癌症是胶质母细胞瘤。
193.一种治疗或预防人类受试者的淋巴或血源性转移的方法，其包括向所述人类受试者施用根据权利要求1-102中任一项的抗体-药物缀合物。
194.一种治疗或预防人类受试者的淋巴或血源性转移的方法，其包括向所述人类受试者施用根据权利要求103-173中任一项的抗体-药物缀合物。
195.一种药物组合物，其包含(i)根据权利要求1-173中任一项的抗体-药物缀合物和(ii)药学上可接受的载体。
196.一种包含修饰的人IgG1 Fc区的抗TM4SF1结合蛋白，其中所述修饰的人IgG1 Fc区包含一个或多个选自E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、M428和N434的氨基酸置换，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的，其中与不包含选自E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、M428和N434的氨基酸置换而在其他方面相同的结合蛋白相比，所述抗TM4SF1结合蛋白展示出改善的血管安全性。
197.一种包含修饰的人IgG4 Fc区的抗TM4SF1结合蛋白，其中所述修饰的人IgG4 Fc区包含一个或多个选自S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434、H435和N297的氨基酸置换，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的，其中与不包含选自S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434、H435和N297的氨基酸置换而在其他方面相同的结合蛋白相比，所述抗TM4SF1结合蛋白展示出改善的血管安全性。
198.根据权利要求196所述的抗TM4SF1结合蛋白，其中所述修饰的人IgG1 Fc区包含在选自T250、M252、S254、T256、M428和N434的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
199.根据权利要求198所述的抗TM4SF1结合蛋白，其中所述修饰的人IgG1 Fc区包含选自T250Q、M252Y、S254T、T256E、M428L和N434S的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
200.根据权利要求198所述的抗TM4SF1结合蛋白，其中所述修饰的人IgG1 Fc区包含突变T250Q和M428L。
201.根据权利要求199所述的抗TM4SF1结合蛋白，其中所述修饰的人IgG1 Fc区包含突变M252Y、S254T和T256E。
202.根据权利要求199所述的抗TM4SF1结合蛋白，其中所述修饰的人IgG1 Fc区包含突变M428L和N434S。
203.根据权利要求197所述的抗TM4SF1结合蛋白，其中所述修饰的人IgG4 Fc区包含在选自T250、M428和N434的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
204.根据权利要求203所述的抗TM4SF1结合蛋白，其中所述修饰的人IgG4 Fc区包含选自T250Q、M428L和N434S的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
205.根据权利要求204所述的抗TM4SF1结合蛋白，其中所述修饰的人IgG4 Fc区包含突变T250Q和M428L。
206.根据权利要求204所述的抗TM4SF1结合蛋白，其中所述修饰的人IgG4 Fc区包含M428L和N434S。
207.根据权利要求196-206中任一项所述的抗TM4SF1结合蛋白，其中与包含野生型IgG1 Fc或IgG4 Fc的对照抗TM4SF1结合蛋白相比，所述结合蛋白表现出对FcRn的亲和力增加。
208.根据权利要求196-207中任一项所述的抗TM4SF1结合蛋白，其中所述抗TM4SF1结合蛋白包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。
209.根根据权利要求208所述的抗TM4SF1结合蛋白，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段与治疗分子缀合，其中所述治疗分子包括以下至少一种：小分子、降解剂、核酸分子、CRISPR-Cas9基因编辑系统和脂质纳米颗粒，或其任意组合。
210.一种药物组合物，其包含权利要求196-209中任一项的结合蛋白。
211.一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，其中该疾病或病症的特征在于异常内皮细胞(EC)-细胞相互作用，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求196-209中任一项的结合蛋白209或根据权利要求210的药物组合物。
212.根据权利要求211所述的方法，其中所述EC-细胞相互作用包括EC-间充质干细胞、EC-成纤维细胞、EC-平滑肌细胞、EC-肿瘤细胞、EC-白细胞、EC-脂肪细胞和EC-神经元细胞相互作用中的一种或多种。
213.根据权利要求211或212所述的方法，其中所述疾病或病症包括炎性疾病或癌症。
214.一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其所述抗原结合片段包含人IgG1 Fc区，该人IgG1 Fc区包含在选自T250、M252、S254、T256、M428和N434的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
215.根据权利要求214所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区包含选自T250Q、M252Y、S254T、T256E、M428L和N434S的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
216.根据权利要求215所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区包含在位置T250和M428处的突变。
217.根据权利要求215所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区包含突变T250Q和M428L。
218.根据权利要求214所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区包含在位置M252、S254和T256处的突变。
219.根据权利要求218所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区包含突变M252Y、S254T和T256E。
220.根据权利要求214所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区包含在位置M428和N434处的突变。
221.根据权利要求220所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区包含突变M428L和N434S。
222.根据权利要求214-221中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区进一步包含在位置N297处的突变。
223.根据权利要求222所述的抗体-药物缀合物，其中所述位置N297处的突变是N297C。
224.根据权利要求214-223中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
225.根据权利要求214-224中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区进一步包含在选自E233、L234、L235、G237、D265、N297、K322和P331的一个或多个位置处的突变；如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
226.根据权利要求225所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区包含选自E233P、L234A、L235A、G237A、D265A、N297C、K322A和P331G的突变。
227.根据权利要求226所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区包含2、3、4、5、6或7个选自E233P、L234A、L235A、G237A、D265A、N297C、K322A和P331G的突变。
228.根据权利要求226所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区包含突变L234A、L235A和G237A。
229.根据权利要求226所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区包含突变L234A、L235A、G237A和P331G。
230.根据权利要求226所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区包含突变L234A、L235A、G237A、K322A和P331G。
231.根据权利要求226所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区包含突变L234A、L235A、G237A、E233P和P331G。
232.根据权利要求226所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区包含突变L234A、L235A、G237A和N297C。
233.根据权利要求226所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区包含突变L234A、L235A、G237A、N297C和P331G。
234.根据权利要求226所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区包含突变L234A、L235A、G237A、N297C、K322A和P331G。
235.根据权利要求226所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区包含突变L234A、L235A、G237A、N297C、E233P和P331G。
236.根据权利要求226所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG1 Fc区包含突变L234A、L235A、G237A、D265A、N297C、K322A和P331G。
237.一种抗体-药物缀合物，其包含(i)抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)治疗分子，其中所述抗TM4SF1抗体或其所述抗原结合片段包含人IgG4 Fc区，该人IgG4 Fc区包含在选自T250、M428和N434的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
238.根据权利要求237所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含选自T250Q、M428L和N434S的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
239.根据权利要求238所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含在位置T250和M428处的突变。
240.根据权利要求239所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含突变T250Q和M428L。
241.根据权利要求238所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含在位置M428和N434处的突变。
242.根据权利要求241所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含突变M428L和N434S。
243.根据权利要求237-242中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区进一步包含在位置N297处的突变。
244.根据权利要求243所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置N297处的突变是N297C。
245.根据权利要求237-244中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区进一步包含带正电荷的延伸的C末端，其中所述延伸的C末端在位置K447之后包含一个或多个氨基酸残基，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
246.根据权利要求237-244中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区进一步包含在选自S228、F234和L235的一个或多个位置处的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
247.根据权利要求246所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含选自S228P、F234A、L235E和N297C的突变，如按照Kabat中阐述的EU索引所编号的。
248.根据权利要求247所述的抗体-药物缀合物，其中所述人IgG4 Fc区包含2、3或4个选自S228P、F234A、L235E和N297C的突变。
249.根据权利要求246所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG4 Fc区包含在位置S228处的突变。
250.根据权利要求249所述的抗体-药物缀合物，其中所述在位置S228处的突变是S228P。
251.根据权利要求246所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG4 Fc区包含在位置S228和L235处的突变。
252.根据权利要求251所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG4 Fc区包含突变S228P和L235E。
253.根据权利要求246所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG4 Fc区包含在位置S228、L235和N297处的突变。
254.根据权利要求253所述的抗体-药物缀合物，其中所述IgG4 Fc区包含突变S228P、L235E和N297C。
255.根据权利要求214-254中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中与包含野生型IgG1Fc或IgG4 Fc的对照抗体-药物缀合物相比，所述抗体-药物缀合物表现出对FcRn的亲和力增加。
256.根据权利要求214-255中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述治疗分子包括以下至少一种：小分子、降解剂、核酸分子、CRISPR-Cas9基因编辑系统和脂质纳米颗粒，或其任意组合。
257.根据权利要求214-255中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述治疗分子包括以下至少一种：V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、瑞奥西汀(auristatin)、多拉司他汀、美登木素生物碱、MetAP(甲硫氨酸氨肽酶)、蛋白质核输出抑制剂CRM1、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中的磷酰基转移反应的抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂、DHFR抑制剂、核酸、CRISPR酶或其任意组合。
258.根据权利要求256所述的抗体-药物缀合物，其中所述降解剂包括诱导蛋白质降解的试剂。
259.根据权利要求258所述的抗体-药物缀合物，其中所述诱导蛋白质降解的试剂包括疏水性标签、诱导蛋白水解的嵌合体、HSP90抑制剂、选择性雌激素受体降解剂(SERD)、选择性雄激素受体降解剂(SARD)或其任意组合。
260.根据权利要求256所述的抗体-药物缀合物，其中所述脂质纳米颗粒包封一种或多种治疗分子。
261.根据权利要求260所述的抗体-药物缀合物，其中所述核酸分子包括RNA分子或DNA分子。
262.根据权利要求261所述的抗体-药物缀合物，其中所述RNA分子包括siRNA、反义RNA、miRNA、反义miRNA、antagomir(抗miRNA)、shRNA或mRNA。
263.根据权利要求214-262中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段与所述治疗分子在单步或多步方案中通过连接体缀合。
264.根据权利要求263所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接体包括可切割的连接体、不可切割的连接体、亲水性连接体、促带电荷的连接体或基于二羧酸的连接体。
265.根据权利要求263所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接体包括可切割的共价或非共价连接体。
266.根据权利要求263所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接体包括不可切割的共价或非共价连接体。
267.根据权利要求265所述的抗体-药物缀合物，其中所述可切割的连接体包括酸不稳定的连接体、蛋白酶敏感的连接体、光不稳定的连接体或含二硫键的连接体。
268.根据权利要求263所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接体包括半胱氨酸连接体或非半胱氨酸连接体。
269.根据权利要求268所述的抗体-药物缀合物，其中所述非半胱氨酸连接体包括赖氨酸连接体。
270.根据权利要求263所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接体包括MC(6-马来酰亚胺基己酰基)、MCC(马来酰亚胺基甲基环己烷-1-甲酸酯)、MP(马来酰亚胺基丙酰基)、val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)、val-ala(缬氨酸-丙氨酸)、ala-phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、PAB(对氨基苄氧羰基)、SPP(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-(吡啶-2-基硫基)己酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基5-甲基-4-(吡啶-2-基硫基)己酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基5-甲基-4-(吡啶-2-基硫基)庚酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基5-乙基-4-(吡啶-2-基硫基)庚酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丙基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丁基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环戊基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环己基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸酯、SMCC(N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1甲酸酯)或SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯)。
271.根据权利要求263所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接体衍生自交联剂，其中所述交联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、2，5-二氧代吡咯烷-1-基3-环丙基-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-环丁基-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸酯、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(SPP)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丙基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丁基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丙基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-环丁基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(磺基-SMCC)或2,5-二氧代吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸酯(CX1-1)。
272.一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，其中该疾病或病症的特征在于异常内皮细胞(EC)-细胞相互作用，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求214-271中任一项的抗体-药物缀合物。
273.根据权利要求272所述的方法，其中所述EC-细胞相互作用包括EC-间充质干细胞、EC-成纤维细胞、EC-平滑肌细胞、EC-肿瘤细胞、EC-白细胞、EC-脂肪细胞和EC-神经元细胞相互作用中的一种或多种。
274.根据权利要求271或272所述的方法，其中所述疾病或病症包括炎性疾病或癌症。
275.一种治疗或预防受试者的炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求214-271中任一项的抗体-药物缀合物。
276.一种治疗或预防受试者的转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求214-271中任一项的抗体-药物缀合物，其中所述受试者从癌症部分或完全缓解。
277.一种治疗患有与高转移风险相关的癌症的受试者的方法，所述方法包括向患有与高转移风险相关的癌症的受试者施用根据权利要求214-271中任一项的抗体-药物缀合物。
278.一种治疗或预防患有癌症的受试者的转移的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用根据权利要求214-271中任一项的抗体-药物缀合物。
279.根据权利要求272-278中任一项所述的方法，其中所述受试者正在接受可诱导转移的治疗。
280.根据权利要求279所述的方法，其中所述治疗包括手术、放射治疗和化学疗法。
281.根据权利要求272-280中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
282.根据权利要求274和276-281中任一项所述的方法，其中所述癌症是癌或肉瘤。
283.根据权利要求282所述的方法，其中所述癌包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌。
284.根据权利要求282所述的方法，其中所述肉瘤包括骨肉瘤、血管肉瘤或软组织肉瘤。
285.根据权利要求274和276-281中任一项所述的方法，其中所述癌症是胶质母细胞瘤。
286.一种治疗或预防人类受试者的淋巴或血源性转移的方法，其包括向所述人类受试者施用根据权利要求214-271中任一项的抗体-药物缀合物。
287.根据权利要求272-286中任一项所述的方法，其中与包含野生型IgG1 Fc或IgG4Fc的对照抗体-药物缀合物相比，所述抗体-药物缀合物在施用后表现出更长的血清半衰期。
288.一种药物组合物，其包含(i)根据权利要求214-271中任一项的抗体-药物缀合物和(ii)药学上可接受的载体。
289.一种包含通过连接体与治疗分子缀合的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含修饰的IgG Fc区，该修饰的IgG Fc区包含一个或多个选自下组的突变：(i)S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434、H435和N297；或(ii)E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、M428和N434，其中所述连接体衍生自下式的化合物：
Figure FDA0003324235020000371
Figure FDA0003324235020000381
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