CN113866138B - 一种基于铜离子介导的银纳米簇荧光检测草甘膦的方法 - Google Patents

一种基于铜离子介导的银纳米簇荧光检测草甘膦的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于铜离子介导的银纳米簇荧光检测草甘膦的方法，属于分析化学技术领域。本发明以不同DNA为模板制备DNA‑Ag NCs，采用“一步法”合成，获得了一种荧光量子产率高、稳定性强的探针；并将DNA‑Ag NCs荧光探针首次应用于草甘膦的检测，并开发出一种新颖的荧光传感器；本发明基于铜离子介导的DNA‑Ag NCs荧光变化，实现了草甘膦高灵敏度和特异性的检测，检测限为0.2ng/mL；构建了一种成本低、操作简单、特异性好且灵敏度高的草甘膦检测方法。

Description

一种基于铜离子介导的银纳米簇荧光检测草甘膦的方法
技术领域
本发明涉及一种基于铜离子介导的银纳米簇荧光检测草甘膦的方法，属于分析化学技术领域。
背景技术
草甘膦(glyphosate)是一种广谱有机磷类除草剂，主要用于农作物种植前的杂草去除。在全球范围内广泛使用，是全球作物保护市场中销售额最大的农药品种。水环境是农药等污染物的重要归宿，农业环境中的草甘膦可通过多种途径进入水体。近年来，在水源中检测到草甘膦残留的现象越来越频繁，在全球范围表层水体中已发现草甘膦的存在。越来越多的证据表明草甘膦及其制剂对非靶标生物同样具有潜在毒性。2017年，国际癌症研究机构(IARC)也将草甘膦归为人体可能致癌物。因此，测定水体中的草甘膦含量十分重要。目前，世界卫生组织设定的饮用水中草甘膦的最大残留量为0.90mg/L。传统应用于检测农药残留的分析方法，例如高效液相色谱(HPLC)、气相色谱-质谱(GC-MS)、毛细管电泳(CE)和电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)等，它们在提供准确检测的同时也存在操作复杂、耗时长、费用高等一些固有问题，这在一定程度上限制了它们的应用。因此，建立简单、快速、灵敏且成本低的草甘膦检测方法已成为日益增长的需求。
近来，荧光传感器因其具有高选择性、灵敏度和易于原位检测等特点引起了农药检测的极大关注。由于草甘膦分子结构中缺少发色团或荧光团，也没有任何传统的分子识别位点，所以设计一种荧光传感器检测草甘膦具有很大的挑战性。此外，很多有机磷农药本身带负电并且具有抑制酶活的作用从而导致荧光传感器检测草甘膦的特异性也较差。因此，设计一种特异性强的荧光传感器来检测有机磷农药草甘膦是至关重要的。
发明内容
本发明的主要目的在于探究DNA模板化的银纳米簇(DNA-Ag NCs)的进一步应用，开发了一种基于DNA-Ag NCs荧光检测农药草甘膦的方法。本发明基于图1所示的原理：Cu2+可以与DNA中的磷酸根和碱基结合，使得DNA-Ag NCs荧光淬灭；同时还可以与草甘膦分子中存在的膦酰基(–PO3H2)和羧基(–COOH)与Cu2+结合，从而在DNA-Ag NCs和草甘膦之间发生对Cu2+捕获的竞争；草甘膦竞争捕获Cu2+，会抑制Cu2+对DNA-Ag NCs的荧光淬灭。基于DNA-AgNCs荧光变化实现草甘膦农药的超灵敏检测，该发明可以用于食品中草甘膦的检测。
本发明的目的是提供一种快速检测草甘膦的方法，所述方法是采用上述基于铜离子介导的DNA-Ag NCs荧光变化模式进行检测，在最优条件下，将Cu(NO3)2溶液与不同浓度的草甘膦室温反应20min，然后加入Mops及DNA-Ag NCs原液，室温反应25min。通过记录混合溶液620nm处荧光强度的变化(激发波长为530nm)完成检测。
在本发明的一种实施方式中，所述方法可用于食品样品中草甘膦的检测。
一种检测草甘膦的方法，所述方法是利用铜离子介导的DNA-Ag NCs荧光变化进行检测，包括如下过程：
(1)DNA-Ag NCs的制备：将DNA分散在缓冲液中，获得混合溶液；然后加入可溶性银盐，混匀，进行孵育；孵育结束后，加入NaBH4，混匀，避光孵育，结束后，稀释，获得含DNA-AgNCs的溶液；
(2)Cu2+介导DNA-Ag NCs荧光强度变化检测草甘膦：将二价铜离子加入到一系列已知浓度的草甘膦溶液中进行反应；然后加入步骤(1)所得含DNA-Ag NCs的溶液进行反应，分别获得反应液；检测反应液的荧光强度，其中，草甘膦溶液的浓度为0时的荧光强度记作F1，草甘膦溶液的浓度不为0时的荧光强度记作F2，荧光强度变化值为F2-F1/F1；利用草甘膦溶液的浓度与F2-F1/F1进行线性关联，构建得到检测模型。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，DNA的序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，DNA与可溶性银盐中银离子的摩尔比为1：5-8；具体优选1：6。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，混合溶液的浓度为250μmol/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，预先将可溶性银盐配制成4mmol/L的水溶液，然后加入使用。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，加入可溶性银盐进行孵育的时间为20min，温度为4℃。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，预先利用冰水将NaBH4配制成2mmol/L的水溶液，然后加入使用。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，NaBH4与可溶性银盐中银离子的摩尔比为(0.8-1.5)：1；具体优选1：1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，加入NaBH4进行孵育的时间为3h；温度为室温(20-30℃)；并在避光环境下。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，稀释的倍数为100倍。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，二价铜离子的来源包括Cu(NO3)2溶液。浓度为300nM。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，Cu(NO3)2溶液与草甘膦溶液的体积比为4：1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，加入步骤(1)所得的DNA-Ag NCs进行反应的过程中，包括加入Mops缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，Mops缓冲液的浓度为10mM，pH＝7.5。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，检测反应液在620nm处的荧光强度。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，一系列已知浓度的草甘膦溶液的浓度范围为1-50ng/mL。
在本发明的一种实施方式中，一种基于铜离子介导的银纳米簇荧光检测草甘膦的方法，具体包括如下步骤：
(1)DNA-Ag NCs的制备：
采用“一步法”合成DNA-Ag NCs，具体方法如下：
使用的DNA的序列(5’-3’)为ACCCGAACCTGGCTACCACCCTTAATCCCC。
将16μL、250μmol/L的DNA与166μL、20mM pH 7.0PB缓冲溶液混合；向混合溶液中加入6μL、4mM AgNO3溶液，混匀，于4℃孵育20min。随后加入12μL、2mmol/L冰水配制NaBH4，剧烈震荡混匀，置于暗处、室温下孵育3h，获得DNA-Ag NCs原液；将所得DNA-Ag NCs原液置于4℃下保存待用；
(2)Cu2+介导DNA-Ag NCs荧光强度变化检测草甘膦：
在如下草甘膦样品处理：将20μL、300nM Cu(NO3)2溶液与5uL不同浓度的草甘膦室温反应20min，然后加入15uL10 mM pH 7.5Mops及60μL DNA-Ag NCs溶液(步骤(1)中DNA-AgNCs原液稀释100倍制得)，室温反应25min；取95uL混合溶液记录620nm处荧光强度(激发波长为530nm)；F1为不存在草甘膦时体系在620nm处荧光强度；F2为存在草甘膦时体系在620nm处荧光强度；F2-F1/F1为荧光强度变化值；在1-50ng/mL草甘膦浓度范围内，F2-F1/F1的值与草甘膦浓度呈现良好的线性关系(如图2所示)。
在本发明的一种实施方式中，标准回归方程为Y＝0.058X+0.081(其中，Y为荧光强度变化值，X为草甘膦浓度)，R2为0.992，最低检出限(S/N＝3)为0.2ng/mL。
本发明的有益效果：
(1)本发明以不同DNA为模板制备DNA-Ag NCs，获得了一种荧光量子产率高、稳定性强的探针；将DNA-Ag NCs荧光探针首次应用于草甘膦的检测。
(2)本发明基于铜离子介导的DNA-Ag NCs荧光变化，实现了草甘膦高灵敏度和特异性的检测，检测限为0.2ng/mL；构建了一种成本低、操作简单、特异性好且灵敏度高的草甘膦检测方法。
(3)本发明可应用于食品样品中草甘膦的检测，回收率在80％-120％之间。
附图说明
图1为基于Cu2+介导的DNA-Ag NCs传感器检测草甘膦的示意图；
图2为A：不同草甘膦浓度下DNA-Ag NCs+Cu2+体系的荧光发射光谱(从下到上依次为：0、1、5、10、20、30、40、50、80、100、250、500、1000ng/mL)；B：620nm处荧光强度与草甘膦的浓度对应的散点图；F2-F1/F1值与草甘膦浓度的线性关系图；
图3为A：不同农药(水胺硫磷、伏杀硫磷、乐果、毒死蜱、苯线磷、吡虫啉、啶虫脒、克百威)存在下DNA-Ag NCs+Cu2+体系的荧光强度；B：F2-F1/F1荧光强度变化。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
实施例1：一种基于铜离子介导的银纳米簇荧光变化检测草甘膦的方法
一种基于铜离子介导的银纳米簇荧光变化检测草甘膦的方法，包括如下步骤：
(1)DNA-Ag NCs的制备
采用“一步法”合成DNA-Ag NCs，具体方法如下：
使用的DNA的序列(5’-3’)为ACCCGAACCTGGCTACCACCCTTAATCCCC。
将16μL、250μmol/L的DNA与166μL、20mM pH 7.0PB缓冲溶液混合。向混合溶液中加入6μL、4mM AgNO3溶液，混匀，于4℃孵育20min。随后加入12μL、2mmol/L冰水配制NaBH4，剧烈震荡混匀，置于暗处、室温下孵育3h，获得DNA-Ag NCs原液；将所得DNA-Ag NCs原液置于4℃下保存待用。
(2)Cu2+介导DNA-Ag NCs荧光强度变化检测草甘膦
在如下草甘膦样品处理：将20μL、300nM Cu(NO3)2溶液与5uL不同浓度的草甘膦室温反应20min，然后加入15uL10 mM pH 7.5Mops及60μL DNA-Ag NCs溶液(步骤(1)中DNA-AgNCs原液稀释100倍制得)，室温反应25min。取95uL混合溶液记录620nm处荧光强度(激发波长为530nm)。
建立Cu2+介导DNA-Ag NCs荧光强度变化检测草甘膦的标准曲线：
F1为不存在草甘膦时体系在620nm处荧光强度；F2为存在草甘膦时体系在620nm处荧光强度；F2-F1/F1为荧光强度变化值。在1-50ng/mL草甘膦浓度范围内，F2-F1/F1的值与草甘膦浓度呈现良好的线性关系(如图2所示)。标准回归方程为Y＝0.058X+0.081(其中，Y为荧光强度变化值，X为草甘膦浓度)，R2为0.992，最低检出限(S/N＝3)为0.2ng/mL。
结合表1可知，与其他检测草甘膦的方法相比，我们构建的基于Cu2+和DNA-Ag NCs的荧光检测方法灵敏度很高。此外，该方法无需复杂的制剂及检测手段，操作简单，更加具有应用前景。
表1不同检测方法检测分析草甘膦的结果
Figure BDA0003244022070000051
文献来源：
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5.Sawetwong,P.；Chairam,S.；Jarujamrus,P.；Amatatongchai,M.,Enhancedselectivity and sensitivity for colorimetric determination of glyphosateusing Mn–ZnS quantum dot embedded molecularly imprinted polymers combinedwith a 3D-microfluidic paper-based analytical device.Talanta 2021,225.
6.Wang,X.；Yang,Y.；Huo,D.；Ji,Z.；Ma,Y.；Yang,M.；Luo,H.；Luo,X.；Hou,C.；Lv,J.,A turn-on fluorescent nanoprobe based on N-doped silicon quantum dots forrapid determination of glyphosate.Mikrochim Acta 2020,187(6),341.
7.Yuan,Y.；Jiang,J.；Liu,S.；Yang,J.；zhang,H.；Yan,J.；Hu,X.,Fluorescentcarbon dots for glyphosate determination based on fluorescence resonanceenergy transfer and logic gate operation.Sensors and Actuators B:Chemical2017,242,545-553.
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9.Gui,M.；Jiang,J.；Wang,X.；Yan,Y.；Li,S.；Xiao,X.；Liu,T.；Liu,T.；Feng,Y.,Copper ion-mediated glyphosate detection with N-heterocycle basedpolyacetylene as a sensing platform.Sensors and Actuators B:Chemical 2017,243,696-703.
实施例2：荧光传感检测体系的选择性
选取了其他八种农药(水胺硫磷、伏杀硫磷、乐果、毒死蜱、苯线磷、吡虫啉、啶虫脒、克百威)来评估所构建的荧光传感体系的选择性。选择性实验是在实施例1中相同样品处理条件下进行的，草甘膦的浓度为250ng/mL，其他干扰农药浓度设置为草甘膦的5倍。结果如图3所示，这些高浓度干扰农药对DNA-Ag NCs+Cu2+荧光传感体系无响应，只有检测靶标草甘膦引起传感器荧光恢复。证明了我们的传感体系具有优异的选择性，可用于杀虫剂草甘膦的检测。
实施例3：加标回收验证荧光传感体系检测样品中草甘膦
为了验证此方法的实际应用，我们用此方法检测苹果中的草甘膦。将苹果样品切碎，称量5g样品，分别添加5ng/mL、20ng/mL和40ng/mL草甘膦于样品中。加入20mL水，均质；然后取15mL二氯甲烷，振荡2min。分离水相，用0.22μm的微孔膜过滤，再以磷酸盐缓冲液(10mM，pH＝7.4)稀释10倍，即得到用于检测的加标样。按照实施例1中相同方法检测苹果样品中草甘膦检测。如表2所示，苹果中添加草甘膦的回收率在92.6％-104.9％之间，相对标准偏差为2.1％-5％之间。结果说明此方法适用于检测食品中的草甘膦，且具有较高的准确性和可靠性。
表2样品中检测草甘膦加标测定结果(n＝3)
Figure BDA0003244022070000071
对比例1：不同DNA所得DNA-Ag NCs对Cu2+介导荧光强度变化检测草甘膦的对比
参照实施例1，将DNA替换为表3中不同的结构序列，其他不变，制得相应的DNA-AgNCs。
参照实施例1中Cu2+介导荧光强度变化检测草甘膦的过程，分析不同DNA相应的检测结果。结果见表4。我们所用的模板DNA 2与其他模板相比，对草甘膦的检测限最低，效果最好。
表3不同DNA模板
DNA编号 序列编号 序列(5’-3’)
1 SEQ ID NO.1 CCCTTAATCCCC
2(实施例1) SEQ ID NO.2 ACCCGAACCTGGCTACCACCCTTAATCCCC
3 SEQ ID NO.3 ATCCTCCCACCGGGCCTCCCACCATAAAAACCCTTAATCCCC
4 SEQ ID NO.4 GGCAGGTTGGGGTGACTAAAAACCCTTAATCCCC
5 SEQ ID NO.5 CTGACACCATATTATGAAGACCCTTAATCCCC
6 SEQ ID NO.6 GGGGGCCCTTAATCCCC
表4不同DNA-Ag NCs的草甘膦检测结果
DNA编号 检测限 检测范围
DNA1-Ag NCs 10ng/mL 50-300ng/mL
DNA2-Ag NCs 0.2ng/mL 1-50ng/mL
DNA3-Ag NCs 5ng/mL 10-400ng/mL
DNA4-Ag NCs 0.1μg/mL 0.3-5μg/mL
DNA5-Ag NCs 0.3μg/mL 1-10μg/mL
DNA6-Ag NCs 50ng/mL 0.2-3μg/mL
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种基于铜离子介导的银纳米簇荧光检测草甘膦的方法
<130> BAA210238A
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cccttaatcc cc 12
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acccgaacct ggctaccacc cttaatcccc 30
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atcctcccac cgggcctccc accataaaaa cccttaatcc cc 42
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggcaggttgg ggtgactaaa aacccttaat cccc 34
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctgacaccat attatgaaga cccttaatcc cc 32
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gggggccctt aatcccc 17

Claims (9)

1.一种检测草甘膦的方法，其特征在于，所述方法包括如下过程：
（1）DNA-Ag NCs的制备：将DNA分散在缓冲液中，获得混合溶液；然后加入可溶性银盐，混匀，进行孵育；孵育结束后，加入NaBH4，混匀，避光孵育，结束后，稀释，获得含DNA-Ag NCs的溶液；
（2）Cu2+介导DNA-Ag NCs荧光强度变化检测草甘膦：将二价铜离子加入到一系列已知浓度的草甘膦溶液中进行反应；然后加入步骤（1）所得含DNA-Ag NCs的溶液进行反应，分别获得反应液；检测反应液的荧光强度，其中，草甘膦溶液的浓度为0时的荧光强度记作F1，草甘膦溶液的浓度不为0时的荧光强度记作F2，荧光强度变化值为F2-F1/F1；利用草甘膦溶液的浓度与F2-F1/F1进行线性关联，构建得到检测模型；
DNA的序列为SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（1）中，DNA与可溶性银盐中银离子的摩尔比为1：5-8。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（1）中，混合溶液的浓度为250 μmol/L。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（1）中，预先将可溶性银盐配制成4mmol/L的水溶液，然后加入使用。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（1）中，加入可溶性银盐进行孵育的时间为20 min，温度为4℃。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（1）中，NaBH4与可溶性银盐中银离子的摩尔比为0.8-1.5：1。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（1）中，加入NaBH4进行孵育的时间为3h；温度为室温。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（2）中，加入步骤（1）所得的DNA-Ag NCs进行反应的过程中，包括加入Mops缓冲液。
9.根据权利要求1-8任一项所述方法，其特征在于，检测反应液在620 nm处的荧光强度。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108593613A (zh) * 2018-04-27 2018-09-28 重庆大学 一种草甘膦的检测方法
CN111518113A (zh) * 2020-05-11 2020-08-11 西北农林科技大学 用于检测草甘膦的荧光探针、检测试纸及其制备方法
CN111982879A (zh) * 2020-08-31 2020-11-24 重庆大学 一种基于SiNPs/OPD/Cu2+荧光传感体系对草甘膦的检测方法

Patent Citations (3)

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Title
A turn-on fluorescence sensor based on Cu2+modulated DNA-templated silver nanoclusters for glyphosate detection and mechanism investigation;Yixia Yang等;《Food Chemistry》;20210717;第1-7页 *

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