CN113862236A - 一种水稻类钙调磷酸酶b蛋白互作蛋白激酶及其在育种中的应用 - Google Patents

一种水稻类钙调磷酸酶b蛋白互作蛋白激酶及其在育种中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及农业育种技术领域，具体涉及一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶及其在育种中的应用，水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶为CIPK17；CIPK17的过表达植株CIPK17‑OE2和CIPK17‑OE3在正常生长条件下表现为抑制植物的幼苗生长表型，CIPK17突变体CRISPR CIPK17‑41和CRISPR CIPK17‑44均表现与亲本表型相似，即幼苗生长正常，与野生型无异。CIPK17的材料在3μM甲基紫晶MV处理下，过表达植株CIPK17‑OE3和CIPK17‑OE9的幼苗生长表型明显好于亲本，CIPK17突变体CRISPR CIPK17‑41和CRISPR CIPK17‑44则与亲本表型相似。本发明通过实验证明CIPK17过表达株系和突变体，分别具有抗除草剂，幼苗生长好于亲本表型/正常表型及正常生长条件下，抑制幼苗生长的表型/正常表型，通过对水稻CIPK17进行转基因研究分析，筛选出需要的水稻种子进行培育，选种准确，节省时间。

Description

一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶及其在育种中的 应用
技术领域
本发明涉及农业育种技术领域，具体涉及一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶及其在育种中的应用。
背景技术
水稻是一种禾本科自花授粉植物。一年可生产一代甚至两代、籽粒多、生活力强。水稻籼粳亚型的基因组序列已公布，功能基因占总基因组的比例较高，目前还有许多基因的功能还未可知，因此克隆水稻相关基因，研究其功能就显得尤为必要。
水稻基因功能的研究可以通过正向遗传学来进行，它首先分析突变体表型，再到其基因的功能，涉及的材料主要有两大类：即某种缺陷的突变体和将该基因再导入后形成的过表达植株。例如，如果要研究与植物生物胁迫过程有关的基因调控机理，可以先用化学、物理或生物的方法将野生型水稻诱变，然后在生物胁迫条件下进行突变体的筛选。如果在诱变群体后代中出现了对该生物胁迫反应不同于野生型的个体(例如比野生型生长情况表现更好、更差等)，这种个体就是突变体，它对生物胁迫的反应不同可能就是因为突变体中某一个基因遭到破坏后所造成，而这个基因必定与生物胁迫有关。在得到了这样的一个突变体之后，可以对其中的突变基因进行定位和克隆。在获得了基因序列后，可以更深入了解它的功能，并分析它是以何种形式影响了生物胁迫以及与其它基因的相关关系。
由于水稻在遗传操作上具有优势，它被广泛应用于植物生命活动过程的研究，已取得了一系列重要发现；但对于水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶CIPK的研究以及其对生物胁迫的响应及应用于水稻的培育中还有待进一步研究，旨为育种工作提供理论依据。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶及其在育种中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶，所述水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶为水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶17，即CIPK17。
优选地，所述CIPK17构建该基因的过表达载体(PWM101-CIPK17)，获得过表达株系，通过荧光定量PCR对其表达进行验证，发现9个过表达株系均显著高于野生型。
优选地，通过CRISPR-Cas9构建敲除CIPK17基因特定序列的株系，通过克隆测序的方法对其进行鉴定，发现突变体缺失或插入部分碱基。
优选地，所述CIPK17的过表达植株CIPK17-OE2和CIPK17-OE3在正常生长条件下，幼苗生长比亲本更差的表型，即株高明显变矮，根长变短，地上部分、根系和整株的鲜重、干重和含水量均明显下降，根鲜重、根含水量不显著除外，CIPK17的突变体CRISPR CIPK17-41和CRISPR CIPK17-44与野生型表型相似。
优选地，所述CIPK17的材料在3μM甲基紫晶MV处理下，过表达植株CIPK17-OE3和CIPK17-OE9的幼苗生长表型表现为株高及叶绿素含量高于亲本，而CIPK17突变体CRISPRK17-41和CRISPR K17-44则与亲本表型相似。
本发明还提供了一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶在育种中的应用，所述育种包括通过转基因技术创制禾本科植物抗除草剂的种质和抑制幼苗生长的种质。其中，禾本科植物为水稻，除草剂为甲基紫晶MV。
优选地，所述水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶应用于禾本科植物转基因育种工作中。
本发明有益效果：
本发明针对水稻选育工作无法准确进行，如无法通过基因操作选择抗除草剂的水稻材料或无法根据实际需要在正常生长条件下获得抑制幼苗生长的技术问题，通过各种实验证明CIPK17过表达株系和突变体，分别具有抗除草剂，幼苗生长好于亲本表型/正常表型及正常生长条件下，抑制幼苗生长的表型/正常表型，通过上述研究，对水稻CIPK17进行转基因研究分析，筛选出需要的水稻种子进行培育，选种准确，节省时间。
附图说明
图1是本发明的水稻CIPK17的过表达株系的荧光定量表达鉴定图；
图2是本发明的CIPK17突变体的基因结构及缺失或插入部位和相应的碱基序列；
图3是本发明的CIPK17相关转基因植株在正常生长条件下幼苗生长表型及生物量分析图；
图4是本发明的CIPK17相关转基因植株在MV下的幼苗生长的表型及生物量、叶绿素含量比较图。
具体实施方式
下面结合附图将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供如下技术方案：一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶，所述水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶为水稻CIPK17。
其中，所述CIPK17构建该基因的过表达载体(PWM101-CIPK17)，获得过表达株系，通过荧光定量PCR对其表达进行了验证，发现9个过表达株系均显著高于野生型；通过CRISPR-Cas9构建了敲除CIPK17基因特定序列的株系，通过克隆测序的方法对其进行了鉴定，发现缺失或插入部分碱基。
所述的CIPK17基因过表达株系CIPK17-OE2和CIPK17-OE3，在正常条件下，与野生型相比，其幼苗生长被抑制，突变体CRISPR CIPK17-41和CRISPR CIPK17-44均与野生型幼苗生长情况无差异；在3μΜ的MV处理下，过表达株系CIPK17-OE3和CIPK17-OE9的幼苗较野生型植株生长更好，而突变体CRISPR CIPK17-41和CRISPR CIPK17-44则与亲本相似。
实施案例：
参照图1-图4，本实施案例提供了一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶在育种中的应用；其中，水稻CIPK17为类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶中的一种，构建该基因的过表达载体(PWM101-CIPK17)，获得过表达株系，通过荧光定量PCR对其表达进行了验证，发现9个过表达株系均显著高于野生型(如图1所示)；通过CRISPR-Cas9构建了敲除CIPK17基因特定序列的株系，通过克隆测序的方法对其进行了鉴定，发现缺失或插入部分碱基(如图2所示)。幼苗生长实验如图3所示，正常条件下，与野生型相比，CIPK17基因过表达株系CIPK17-OE2和CIPK17-OE3的幼苗生长被抑制，即株高明显变矮，根长变短，地上部分、根系和整株的鲜重、干重和含水量均明显下降，根鲜重、根含水量不显著除外，突变体CRISPRCIPK17-41和CRISPR CIPK17-44均与野生型幼苗生长情况无差异；MV表型实验如图4所示，在3μΜ的MV处理下，过表达株系CIPK17-OE3和CIPK17-OE9的幼苗较野生型植株生长更好，即株高更高，叶绿素含量也高，而突变体CRISPR CIPK17-41和CRISPR CIPK17-44则与亲本相似。即所述的CIPK17基因过表达株系CIPK17-OE2和CIPK17-OE3的幼苗在正常条件下其幼苗生长具有被抑制的表型，突变体CRISPR CIPK17-41和CRISPR CIPK17-44表型则与野生型相似(如图3所示)；所述的过表达株系CIPK17-OE3和CIPK17-OE9在3μΜ的MV处理下，其幼苗生长表型较野生型更好，即具有抗除草剂的表型，而突变体CRISPR CIPK17-41和CRISPRCIPK17-44则与亲本相似(如图4所示)。
综上所述，本发明针对水稻选育工作无法准确进行，如无法通过基因操作选择抗除草剂的水稻材料或无法根据实际需要在正常生长条件下获得抑制幼苗生长的技术问题，通过各种实验证明CIPK17过表达株系和突变体，分别具有抗除草剂，幼苗生长好于亲本表型/正常表型及正常生长条件下，抑制幼苗生长的表型/正常表型，通过上述研究，对水稻CIPK17进行转基因研究分析，筛选出需要的水稻种子进行培育，选种准确，节省时间。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (7)

1.一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶，其特征在于：所述水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶为水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶17，即CIPK17。
2.根据权利要求1所述的一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶，其特征在于：所述CIPK17构建该基因的过表达载体(PWM101-CIPK17)，获得过表达株系，通过荧光定量PCR对其表达进行验证，发现9个过表达株系均显著高于野生型。
3.根据权利要求1所述的一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶，其特征在于：通过CRISPR-Cas9构建敲除CIPK17基因特定序列的株系，通过克隆测序的方法对其进行鉴定，发现突变体缺失或插入部分碱基。
4.根据权利要求2所述的一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶，其特征在于：所述CIPK17的过表达植株CIPK17-OE2和CIPK17-OE3在正常生长条件下，均表现为抑制植物的幼苗生长表型；CIPK17突变体CRISPR CIPK17-41和CRISPR CIPK17-44均表现为幼苗生长正常表型，与野生型无差异。
5.根据权利要求3所述的一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶，其特征在于：所述CIPK17的材料在3μM甲基紫晶MV处理下，过表达植株CIPK17-OE3和CIPK17-OE9的幼苗生长表型表现为株高及叶绿素含量高于亲本，即抗除草剂，而CIPK17突变体CRISPR K17-41和CRISPR K17-44则与亲本表型相似。
6.一种如权利要求1所述的水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶在育种中的应用，其特征在于：所述育种包括通过转基因技术创制禾本科植物抗除草剂的种质和抑制幼苗生长的种质。
7.根据权利要求6所述的一种水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶在育种中的应用，其特征在于：所述水稻类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶应用于禾本科植物转基因育种工作中。
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