CN113846055B - 纳米硅活性颗粒在制备用于诱导间充质干细胞迁移的试剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种纳米硅活性颗粒在制备用于诱导间充质干细胞迁移的试剂中的用途，其特征在于，所述纳米硅活性颗粒在施加时的有效平均粒径为100～200nm，有效浓度为1～4μg/mL。本发明证明了在间充质干细胞培养液中加入SBPs能够诱导MSCs产生SDF‑1和TGF‑β1，促进MSCs的迁移。由于SBPs具有诱导MSCs迁移和促成骨作用，还可以引入到天然高分子材料中，与透明质酸、海藻酸、丝素蛋白、明胶或壳聚糖等合成新型骨移植材料，进而在组织微环境中通过离子交换形成硅酸后募集宿主MSCs至骨损伤部位，加速骨损伤的修复。

Description

纳米硅活性颗粒在制备用于诱导间充质干细胞迁移的试剂中 的用途

技术领域

本发明涉及生物活性纳米材料技术领域，具体涉及一种纳米硅活性颗粒在制备用于诱导间充质干细胞迁移的试剂中的用途。

背景技术

严重骨创伤、骨感染的治疗和骨肿瘤的切除常常伴随有大段的骨缺损需要修复，骨移植术是临床修复骨缺损的重要手段，其中自体骨移植和异体骨移植应用最为广泛。自体骨移植来自于骨骼中选定的部位(如髂嵴)，具有无排异反应、成骨活性高等优点，但该方法使患者遭受二次手术，面临失血更多，伤口感染的风险增加，恢复正常功能的速度减慢等情况，这在一定程度上增加了患者并发症发病率及住院康复时间和成本。而异体骨的植入具有疾病传播、免疫排斥和吸收的潜在风险。且两者都面临来源有限的难题。目前，人工骨替代物已成为治疗骨缺损的重要策略，具有来源广泛，操作条件可控，无免疫原性等优点，临床对其需求量日益攀升。故对新型人工合成骨修复材料的研发和探究具有极其重大的意义。

Dashnyam等发现硅酸盐生物陶瓷通过刺激内皮细胞与骨髓基质细胞的相互作用，能促进血管化和成骨，硅离子的效果最为显著。适量的二氧化硅具有内在的对抗核转录因子NF-κB激活的能力，因此对破骨细胞有明显的抑制作用，对成骨细胞则有激活作用，改善了骨的生化和力学性能。在小鼠的饮食中添加二氧化硅颗粒能显著提高小鼠的骨密度。也有研究表明，随着硅含量的增加，骨髓间充质干细胞的总DNA含量、磷-粘附斑激酶(pfak)和总整合素水平均上升；硅离子通过激活MAPK/细胞外信号调节激酶(ERK)和p38信号通路刺激细胞粘附，它比钙离子更有效地促进成骨。此外，生物活性纳米颗粒的尺寸越接近于天然骨的无机组分羟基磷灰石(HA)微晶(直径小于100nm)尺寸，成骨效果越显著。然而,单纯的二氧化硅纳米颗粒不能显示出生物活性，但是在添加氢氧化钙Ca(OH)₂后，骨矿化、骨代谢、总蛋白合成和胶原合成都呈现出增加的趋势。同时，虽然二氧化硅材料在血管生成，药物输送和骨水泥中得到应用。然而，二氧化硅的脆性限制了其在组织工程中的应用。天然高分子具有良好的生物相容性，可降解吸收性，二氧化硅与之结合能显著提升韧性；虽然复合材料韧性大，但许多传统复合材料的缺点是组成相在微米尺度上相互作用，这可能导致在溶解过程中不同的吸收速率，这不可避免地导致体内物质的不稳定。

近二十余年，伴随着组织工程概念的出现，以复合细胞和支架构建的组织工程产品得到越来越多的研究，其显著的成骨诱导活性使其成为公认的治疗大节段骨缺损最有希望的策略之一。既往研究者认为，组织工程骨修复骨缺损就是模拟骨损伤后其自然的愈合过程，先是通过组织工程骨提供了一个骨缺损修复的原基，创伤局部产生炎症等各种因子，成骨祖细胞迁移、增殖和分化，分泌骨样基质，随着基质沉积、矿化，形成新生骨组织。目前，细胞的募集趋化与归巢被认为是干细胞修复重建受损组织的重要机制。目前大量研究认为，在骨髓和外周血中存在组织定向分化的干细胞群体，它们可以被募集迁移至损伤组织部位，增殖、分化后修复受损组织。尤其是MSCs，它的迁移和募集已被证实在多种组织的修复中发挥重要作用。在骨损伤的修复过程中，炎症反应释放的趋化因子启动了MSC与成骨祖细胞的募集，对于骨组织的修复起到了非常重要的作用。

发明内容

本发明提供了一种纳米硅活性颗粒在制备用于诱导间充质干细胞迁移的试剂中的用途，所述纳米硅活性颗粒在施加时的有效平均粒径约为100～200nm，有效浓度为1～4μg/mL。

在根据本发明的一个实施方案中，所述纳米硅活性颗粒复合于天然高分子材料中，能有效促进骨修复，所述天然高分子材料选自透明质酸、海藻酸、丝素蛋白、明胶或壳聚糖中的任一种。

在根据本发明的一个实施方案中，所述纳米硅活性颗粒分散于超纯水中形成悬液后施加于细胞培养液中。

在根据本发明的一个实施方案中，所述纳米硅活性颗粒是通过包括下述步骤的方法制备得到的：

1)将二氧化硅悬液与Ca(OH)2水溶液混合以体积比1:7～1:6的比例混合，室温下搅拌反应48～72h；

2)将步骤1)反应后的溶液以1000rpm离心15min，取沉淀物，将沉淀物以超纯水洗涤后再分散于超纯水中，即得纳米硅活性颗粒溶液。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)中所述的二氧化硅悬液是通过包括下述步骤的方法制备得到的：

将乙醇和水以体积比为10:1～11:1的比例混合搅拌均匀，获得混合液；然后将氨水和四乙氧基硅烷(TEOS)分别加入到上述混合液中，于室温搅拌反应8～12h，其中，氨水加入量为混合液体积的1.5％～1.6％，四乙氧基硅烷的加入量为混合液体积的4.4％～4.5％；反应完成后，液体在1000rpm转速下离心15min，取沉淀物，所述沉淀物分别以乙醇和超纯水离心洗涤2次，然后分散在适量超纯水中，制得二氧化硅颗粒悬浮液；优选地，二氧化硅颗粒悬浮液的浓度为2.5mg/Ml，置于室温备用。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

本发明证明了在间充质干细胞培养液中加入SBPs能够诱导MSCs产生SDF-1和TGF-β1，促进MSCs的迁移。由于SBPs具有诱导MSCs迁移和促成骨作用，还可以引入到天然高分子材料中，与透明质酸、海藻酸、丝素蛋白、明胶或壳聚糖等合成新型骨移植材料，进而在组织微环境中通过离子交换形成硅酸后募集宿主MSCs至骨损伤部位，可辅助加快骨伤修复。

附图说明

图1为SBPs的溶液状态以及颗粒的微观形态示意图：A.不同浓度SBPs溶液的光学图像；B.SBPs微观形态示意图；

图2为SBPs粒径分布示意图；

图3为不同浓度的SBPs对MSCs迁移的影响(x200)结果图：其中，A为0μg/mL的SBPs；B为1μg/mL的SBPs；C为4μg/mL的SBPs；D为8μg/mL的SBPs；

图4为使用ImageJ软件计算图片中的荧光强度值图谱；

图5为MSCs在4μg/mL SBPs刺激下第7d基因TGF-β1和SDF-1相对表达量图谱。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

实施例1 SBPs的制备

1、二氧化硅颗粒制备：

取215.7mL乙醇和20mL超纯水，搅拌均匀。然后加入3.7mL氨水(Aladdin，中国)和10.4mL四乙氧基硅烷(TEOS)(Aladdin，中国)，于室温下搅拌反应10h，完成后在1000rpm转速下离心15min，分别用乙醇和超纯水离心洗涤2次后分散在超纯水中，制备成浓度为2.5mg/mL的二氧化硅颗粒悬浮液置于室温备用。

2、纳米硅活性颗粒(Silicon-based bioactive particles，SBPs)的制备：

在22.4mmol/L的13mL Ca(OH)₂(Aladdin，中国)中加入2mL上述二氧化硅颗粒悬浮液，室温下搅拌反应60h，1000rpm,15min离心收集，超纯水洗涤3次，然后分散在超纯水中，制备成浓度为30wt％纳米硅活性颗粒溶液，密封保存备用。

3、SBPs的物理表征

1)SBPs在扫描电镜下(SEM)的形态：

取20μL的30wt％SBPs溶液滴在载玻片，置于50℃烘箱中烘干，得到干燥颗粒，环境扫描电镜于10KX倍数下观察颗粒的形态。

2)SBPs的粒径分布：

30wt％SBPs溶液稀释100倍，超声处理5min后，使用ZATA电位分析仪(Brookhaven，美国)，测得颗粒的粒径分布。

结果如图1、图2所示，SBPs的平均直径为100～200nm，并且呈均匀分散球形颗粒，不会成团聚集。

实施例2 SBPs对MSCs迁移的影响

1、条件培养基的制备：

取P6的MSCs接种至25cm²培养瓶，细胞贴壁后，使用SBPs浓度为0、1、4、8μg/mL成骨诱导培养基培养，3d后收集瓶内培养基作为条件培养基备用。

2、细胞的接种：

取P6的小鼠骨髓MSCs(Cyagen，中国)，用1％FBS的DMEM/F12(Hyclone，美国)培养基制备成浓度为3×10⁵个/mL的细胞悬液，取200μl接种在Transwell(康宁，美国)上室；下室加入条件培养基。

3、迁移相关染色：

细胞培养箱中静置8h后，4％多聚甲醛固定40min；PBS清洗两次；棉签擦拭去除小室上层细胞；使用1μg/mL DAPI(碧云天，中国)室温下避光染色10min；避光清洗两次；将小室放置在载玻片上，在荧光显微镜下，200X观察细胞的迁移情况。

4、基因TGF-β1和SDF-1相对表达量检测

按照下述步骤进行RNA的提取、Q-PCR和RT-PCR，检测MSCs在4μg/mL SBPs刺激下第7d基因TGF-β1和SDF-1相对表达量。

RNA提取：除去培养板中的培养基，每孔加入500微升的Trizol(康为，中国)，多次吹打，转移到EP管。加100μL氯仿(Sigma，美国)，充分震荡，室温静置5min。4℃、12 000rpm、离心15min。吸取上层透明水相至无酶EP管，加入同体积的异丙醇，混匀后室温静置20min，4℃、14 000rpm、15min。弃上清，加入1mL的75％乙醇重悬，12 000rpm，离心5min。弃上清，晾干除去乙醇，后加入30微升Rnase-free ddH₂O重悬，-4℃保存。

逆转录PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction RT-PCR)实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR Q-PCR)检测：引物设计如表格1所示，由上海生工合成。

表1引物序列

如图3、4所示，MSCs在MSCs与不同浓度SBPs共培养产生的条件培养基诱导下会出现不同程度的迁移，而4μg/mL SBPs所得条件培养基诱导MSCs迁移的数量最多；图5是MSCs在上述SBPs浓度刺激下SDF-1和TGF-β1的相对表达量，结果表明了SBPs能促进MSCs的SDF-1和TGF-β1合成和表达。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院

<120> 纳米硅活性颗粒在制备用于诱导间充质干细胞迁移的试剂中的用途

<141> 2021-09-15

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgctatgtt gctctagact tcg 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgccacagg attccatacc 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggaaggtaa aaccccaca 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacacacaaa gcccaaaga 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggggacttc ttggcact 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ataggggcgt ctgaggaac 19

Claims (4)

1.一种纳米硅活性颗粒在制备用于诱导间充质干细胞迁移的试剂中的用途；

所述纳米硅活性颗粒在施加时的有效平均粒径为100～200nm，有效浓度为1～4μg/mL；

所述纳米硅活性颗粒是通过下述步骤的方法制备得到的：

1）将二氧化硅悬液与Ca(OH)₂水溶液以体积比1:7～1:6的比例混合，室温下搅拌反应48～72h；

2）将步骤1）反应后的溶液以1000rpm离心15min，取沉淀物，将沉淀物以超纯水洗涤后再分散于超纯水中，即得纳米硅活性颗粒溶液；

步骤1）中所述的二氧化硅悬液是通过包括下述步骤的方法制备得到的：

将乙醇和水以体积比为10:1～11:1的比例混合搅拌均匀，获得混合液；然后将氨水和四乙氧基硅烷（TEOS）分别加入到上述混合液中，于室温搅拌反应8～12h，其中，氨水加入量为混合液体积的1.5%～1.6%，四乙氧基硅烷的加入量为混合液体积的4.4%-4.5%；反应完成后，在1000rpm转速下离心15min，取沉淀物，所述沉淀物分别以乙醇和超纯水离心洗涤2次，然后分散在适量超纯水中，制得二氧化硅悬液。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述纳米硅活性颗粒复合于天然高分子材料中，所述天然高分子材料选自透明质酸、海藻酸、丝素蛋白、明胶或壳聚糖中的任一种。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述纳米硅活性颗粒分散于超纯水中形成悬液后施加于细胞培养液中。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述二氧化硅悬液的浓度为2.5 mg/mL，置于室温备用。