CN113845581A - Atf5肽变体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及ATF5肽变体及其用途。本发明提供了具有截短的ATF5亮氨酸拉链区和任选的细胞穿透区的ATF5肽、包含所述ATF5肽的组合物以及使用所述ATF5肽抑制肿瘤细胞的增殖和促进所述肿瘤细胞中细胞毒性的方法。

Description

ATF5肽变体及其用途

本申请为2019年1月3日提交的、发明名称为“ATF5肽变体及其用途”的PCT申请PCT/US2019/012148的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2020年7月2日，申请号为201980007222.7。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年1月3日提交的美国临时专利申请号62/613,083的优先权权益。

序列表

本申请包含序列表，该序列表以ASCII格式电子提交并且由此全文以引用方式并入。创建于2018年12月21日的所述ASCII副本名称为Sapience_003_WO1_SL.txt，大小为29,385字节。

背景技术

转录激活因子5(ATF5)是碱性亮氨酸拉链蛋白ATF/CREB(cAMP应答元件结合蛋白)家族的成员。在正常发育的大脑中，ATF5在神经祖细胞/神经干细胞中高度表达，在那里它阻断细胞周期退出并促进细胞增殖，从而抑制神经发生和胶质发生。需要ATF5下调以允许神经祖细胞周期退出并分化成神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞(Greene等人2009；Sheng等人，2010a；Sheng等人，2010b；Arias等人，2012)。

除了在神经系统的正常发育中的作用外，ATF5还作为促进神经胶质瘤和其他肿瘤存活的致癌因子出现。大量研究已经表明，ATF5在多种癌症中高度表达，包括胶质母细胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、肺癌和结肠癌，并且对神经胶质瘤细胞的存活至关重要(Monaco等人，2007；Sheng等人，2010a)。在神经胶质瘤的情况下，ATF5的过表达与疾病的预后和存活负相关，即，具有较高ATF5表达的神经胶质瘤患者比具有较低ATF5表达的患者具有显著更差的结果。

在癌细胞中，诱导凋亡的基因通常被失活或下调，而抗凋亡基因则经常被激活或过表达。与该范例相一致，ATF5上调抗凋亡蛋白的转录，包括B细胞白血病2(Bcl-2)和髓样细胞白血病1(Mcl-1)，从而促进肿瘤细胞存活(Sheng等人，2010b；Chen等人，2012)。

发明概述

下面总结了本发明的一些主要方面。在本公开的具体实施方式、实施例、附图和权利要求部分中描述了另外的方面。本公开的每个部分中的描述旨在与其他部分一起阅读。此外，在本公开的每个部分中描述的各种实施方案可以各种不同的方式组合，并且所有此类组合旨在落入本发明的范围内。

因此，本公开提供了包含ATF5亮氨酸拉链结构域的ATF5的肽衍生物，任选地其中不存在经工程改造的增强的亮氨酸拉链序列，包含该ATF5肽的组合物和试剂盒，以及使用该ATF5肽在肿瘤细胞中诱导细胞毒性和/或抑制肿瘤细胞增殖的方法。特别地，本公开提供了包含ST-3亮氨酸拉链序列(SEQ ID NO:53)的ATF5肽的变体，该变体可包含非保守氨基酸取代。在本发明之前，无法预测此类取代将导致与包含ST-3亮氨酸拉链序列(SEQ ID NO:53)的ATF5肽相比具有类似或更好的细胞毒性活性的分子。在一些实施方案中，本公开提供了细胞穿透ATF5肽ST-3的变体，该变体与ST-3相比具有类似或更好的细胞毒性活性。

在一个方面，本发明提供了包含截短的ATF5亮氨酸拉链区的ATF5肽，其中该截短的ATF5亮氨酸拉链区包含氨基酸序列LEGECQGLEARNRELKERAESV(SEQ ID NO:53)的变体，其中该变体在SEQ ID NO:53的一个或多个位置处被如下修饰：(i)E4被带正电荷的残基取代；(ii)C5被非极性残基取代；(iii)Q6被丙氨酸取代；(iv)E9被带正电荷的残基取代；(v)R11被带负电荷的残基取代；(vi)N12被非极性残基取代；(vii)K16被带负电荷的残基取代；(viii)S21被丙氨酸取代。

在另一方面，本发明提供了包含截短的ATF5亮氨酸拉链区的ATF5肽，其中该截短的ATF5亮氨酸拉链区包含选自以下的氨基酸序列：LEGEGQGLEARNRELKERAESV(SEQ ID NO:54)，LEGEAQGLEARNRELKERAESV(SEQ ID NO:55)，LEGECQGLEARNRELKERAEAV(SEQ ID NO:56)，LEGECQGLEARLRELKERAESV(SEQ ID NO:57)，LEGECAGLEARNRELKERAESV(SEQ ID NO:58)，LEGRCQGLRAENRELEERAESV(SEQ ID NO:59)，LEGRCQGLRAELRELEERAEAV(SEQ ID NO:60)，以及LEGRAQGLRAELRELEERAEAV(SEQ ID NO:61)。

在一个实施方案中，ATF5肽还包含细胞穿透区，使得ATF5肽是细胞穿透肽。在一些实施方案中，细胞穿透区具有选自以下的氨基酸序列：RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:25)，RQLKLWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:26)，YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:40)和YGRKKRRQRR(SEQ IDNO:41)。

本发明的另一方面提供了包含氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKKLEGECQGLEARNRELKERAESV(SEQ ID NO:3)的变体的细胞穿透ATF5肽，其中该变体在SEQ ID NO:3的选自以下的位置处被修饰：(i)C21G(SEQ ID NO:4)；(ii)C21A(SEQ ID NO:5)；(iii)Q22A(SEQ ID NO:8)；(iv)E20R、E25R、R27E和K32E(SEQ ID NO:9)；(v)N28L(SEQ ID NO:7)；(vi)S37A(SEQ IDNO:6)；(vii)E20R、E25R、R27E、N28L、K32E和S37A(SEQ ID NO:10)；(viii)E20R、C21A、E25R、R27E、N28L、K32E和S37A(SEQ ID NO:11)。

在某些实施方案中，ATF5肽包含相对于本发明的ATF5肽的L-氨基酸序列而言反向的氨基酸序列的D-氨基酸。在一个实施方案中，逆反肽的截短的ATF5亮氨酸拉链区具有D-氨基酸序列VAEAREELERLEARLGQARGEL(SEQ ID NO:65)。在一个特定的实施方案中，逆反肽是包含D-氨基酸序列VAEAREELERLEARLGQARGELKKWKMRRNQFWLKLQR(SEQ ID NO:14)的细胞穿透ATF5肽。

在一些实施方案中，本发明的ATF5肽不包含延伸的亮氨酸拉链区。

在一些实施方案中，本发明的ATF5肽包含N端乙酰基和/或C端酰胺基。

还提供了包含本发明的ATF5肽的组合物。在一些实施方案中，该组合物是药物组合物。还提供了包含本发明的ATF5肽的试剂盒和编码本发明的ATF5肽的核酸分子。

本发明提供了本发明的ATF5肽用于促进肿瘤细胞中的细胞毒性。本发明还提供了本发明的ATF5肽用于抑制肿瘤细胞的增殖。本发明另外提供了促进肿瘤细胞中细胞毒性的方法，该方法包括使肿瘤细胞与本发明的ATF5肽接触。本发明另外提供了抑制肿瘤细胞增殖的方法，该方法包括使肿瘤细胞与本发明的ATF5肽接触。

具体地，本发明涉及以下实施方案：

1.一种ATF5肽，其包含截短的ATF5亮氨酸拉链区，其中所述截短的ATF5亮氨酸拉链区包含氨基酸序列LEGECQGLEARNRELKERAESV(SEQ ID NO:53)的变体，其中所述变体在SEQ ID NO:53的一个或多个位置处被如下修饰：

i.E4被带正电荷的残基取代；

ii.C5被非极性残基取代；

iii.Q6被丙氨酸取代；

iv.E9被带正电荷的残基取代；

v.R11被带负电荷的残基取代；

vi.N12被非极性残基取代；

vii.K16被带负电荷的残基取代；

viii.S21被丙氨酸取代；

2.一种ATF5肽，其包含截短的ATF5亮氨酸拉链区，其中所述截短的ATF5亮氨酸拉链区包含选自以下的氨基酸序列：LEGEGQGLEARNRELKERAESV(SEQ ID NO:54)，LEGEAQGLEARNRELKERAESV(SEQ ID NO:55)，LEGECQGLEARNRELKERAEAV(SEQ ID NO:56)，LEGECQGLEARLRELKERAESV(SEQ ID NO:57)，LEGECAGLEARNRELKERAESV(SEQ ID NO:58)，LEGRCQGLRAENRELEERAESV(SEQ ID NO:59)，LEGRCQGLRAELRELEERAEAV(SEQ ID NO:60)和LEGRAQGLRAELRELEERAEAV(SEQ ID NO:61)。

3.根据实施方案1或实施方案2所述的ATF5肽，其还包含细胞穿透区，其中所述ATF5肽是细胞穿透ATF5肽。

4.根据实施方案3所述的细胞穿透ATF5肽，其中所述细胞穿透区具有选自以下的氨基酸序列：RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:25)，RQLKLWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:26)，YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:40)和YGRKKRRQRR(SEQ ID NO:41)。

5.一种细胞穿透ATF5肽，其包含氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKKLEGECQGLEARNRELKERAESV(SEQ ID NO:3)的变体，其中所述变体在SEQ ID NO:3的选自以下的位置处被修饰：

i.C21G(SEQ ID NO:4)；

ii.C21A(SEQ ID NO:5)；

iii.Q22A(SEQ ID NO:8)；

iv.E20R、E25R、R27E和K32E(SEQ ID NO:9)；

v.N28L(SEQ ID NO:7)；

vi.S37A(SEQ ID NO:6)；

vii.E20R、E25R、R27E、N28L、K32E和S37A(SEQ ID NO:10)；以及

viii.E20R、C21A、E25R、R27E、N28L、K32E和S37A(SEQ ID NO:11)。

6.一种ATF5肽，其包含截短的ATF5亮氨酸拉链区，其中所述肽包含相对于任何前述实施方案所述的氨基酸序列具有反向氨基酸序列的D-氨基酸。

7.根据实施方案6所述的ATF5肽，其中所述截短的ATF5亮氨酸拉链区具有D-氨基酸序列VAEAREELERLEARLGQARGEL(SEQ ID NO:65)。

8.根据实施方案7所述的ATF5肽，包含D-氨基酸序列VAEAREELERLEARLGQARGELKKWKMRRNQFWLKLQR(SEQ ID NO:14)，其中所述ATF5肽是细胞穿透肽。

9.根据任一项前述实施方案所述的ATF5肽，其中所述肽不包含延伸的亮氨酸拉链区。

10.根据任一项前述实施方案所述的ATF5肽，其中所述肽包含N端乙酰基和/或C端酰胺基。

11.一种组合物，包含根据任一项前述实施方案所述的ATF5肽。

12.根据实施方案11所述的组合物，所述组合物是药物组合物。

13.一种试剂盒，包含根据实施方案1至10中任一项所述的ATF5肽。

14.一种核酸分子，编码根据实施方案1至10中任一项所述的ATF5肽。

15.一种促进肿瘤细胞中细胞毒性的方法，所述方法包括使所述肿瘤细胞与根据实施方案1至10中任一项所述的ATF5肽接触。

16.一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，所述方法包括使所述肿瘤细胞与根据实施方案1至10中任一项所述的ATF5肽接触。

17.根据实施方案1至10中任一项所述的ATF5肽用于促进肿瘤细胞中的细胞毒性。

18.根据实施方案1至10中任一项所述的ATF5肽用于抑制肿瘤细胞增殖。

附图说明

图1A-1C示出了ATF-5肽NTAzip-ATF5(SEQ ID NO:1)(图1A)、ST-2(SEQ ID NO:2)(图1B)和ST-3(SEQ ID NO:3)(图1C)的氨基酸序列。延伸的亮氨酸拉链结构域用下划线标出，Penetratin细胞穿透结构域用斜体表示，并且ATF-5亮氨酸拉链结构域用粗体表示。

图2示出了其中单个半胱氨酸被替换的ST-3变体的体外活性。

图3示出了其中已进行单个氨基酸取代的ST-3变体的体外活性。

图4示出了其中已进行多个氨基酸取代的ST-3变体的体外活性。

图5示出了ST-13(即ST-11的逆反版本、ST-3变体)的体外活性。

图6A-6E示出了在HL60人早幼粒细胞白血病细胞(PML)(图6A)、急性髓性白血病细胞(AML14和SET2)(图6B、图6C)、黑素瘤细胞(A375)(图6D)和乳腺癌细胞(MCF7)(图6E)中ST-13相对于ST-3的体外活性。ST-3和ST-13的每种细胞类型的EC₅₀值分别为19.0μM和4.8μM(图6A)；29.6μM和<1μM(图6B)；98.2μM和17.7μM(图6C)；21.8μM和1.4μM(图6D)；和52.9μM和<1μM(图6E)。

图7A-7E示出了在HL60人早幼粒细胞白血病细胞(PML)(图7A)、急性髓性白血病细胞(AML14)(图7B)、胶质母细胞瘤细胞(U251)(图7C)、黑素瘤细胞(A375)(图7D)和乳腺癌细胞(MCF7)(图7E)中ST-14的体外活性。ST-2和ST-14的EC₅₀值分别为>300μM和<5μM(图7A)。

图8A-8D显示用ST-14处理下调Mcl-1、Bcl-2、BIRC5(存活素)和ATF5的表达。通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测量RNA表达。示出了处理后第4小时(图8A)和第24小时(图8B)相对于β-肌动蛋白表达的经5μM ST-14处理的HL60细胞中的表达水平。示出了在处理4小时(图8C)或24小时(图8D)后相对于β-肌动蛋白表达的经0、20、40μM ST-14处理的U251细胞(图8C)和HL60细胞(图8D)中的表达水平。

图9示出了ST-3变体在HL60皮下肿瘤模型中的抗肿瘤活性。用25mg/kg BID-IP处理Nu/J小鼠(每组n＝6-7)。

图10A-10C示出了ST-14在U251皮下肿瘤模型中的抗肿瘤活性。用50mg/kg SC处理NOD/SCID小鼠，每周三次，持续三周。平均起始肿瘤体积为约240mm³。示出了平均肿瘤体积(图10A)、存活百分比(图10B)和单个肿瘤体积(图10C)。数据点代表平均值±SEM；p<0.0001；n＝在每个时间点每组的活体动物的数量。

图11A-11B显示早期或延迟的ST-14施用在MCF7乳腺癌细胞中具有显著的抗肿瘤活性。从肿瘤接种后2天(图11A)或59天(图11B)开始，用25mg/kg SC处理Nu/J小鼠，每周三次，持续三周。平均起始肿瘤体积为约280-330mm³。接种：媒介物组中2x10⁶个细胞(图11A、图11B)；ST-14组中2x10⁶个细胞(图11A)；ST-14组中5x10⁶个细胞(图11B)。数据点代表平均值±SEM；p<0.0001。

图12示出了ST-14在HL60皮下肿瘤模型中的抗肿瘤活性。用20mg/kg SC处理Nu/J小鼠，每周三次，持续三周。平均起始肿瘤体积为约220mm³。数据点代表平均值±SEM；p<0.05。

图13示出了ST-14在A375皮下肿瘤模型中的抗肿瘤活性。用25mg/kg SC处理NOD/SCID小鼠，每天两次，持续三周。平均起始肿瘤体积为约250-344mm³。数据点代表平均值±SEM；p＝0.002。

具体实施方式

除非另有说明，否则本发明的实践将采用制药、制剂科学、蛋白质化学、细胞生物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术都在本领域的技术范围内。

为了可更容易地理解本发明，首先定义某些术语。贯穿本公开阐述了附加的定义。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

本文提供的任何标题不是对本发明的各个方面或实施方案的限制，其可通过整体参考说明书来获得。因此，如下直接定义的术语通过整体参考说明书而被更详细地定义。

本公开中引用的所有参考文献据此全文以引用方式并入本文。另外，本文引用或提及的任何产品的任何制造商的说明或目录均以引用方式并入。以引用方式并入本文的文件或其中的任何教导都可用于本发明的实践中。以引用方式并入本文的文件不被承认是现有技术。

I.定义

本公开中的措辞或术语是为了描述而非限制的目的，使得本说明书的术语或措辞将由技术人员根据教导和指导来解释。

除非上下文另外明确指出，否则如本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。术语“一个”(或“一种”)以及术语“一个或多个”和“至少一个”可互换使用。

此外，“和/或”应被视为两个指定特征或组件中的每一个与或不与另一个的具体公开。因此，在短语中使用的术语“和/或”诸如“A和/或B”旨在包括：“A和B”；“A或B”；“A”(单独)；和“B”(单独)。类似地，在短语中使用的术语“和/或”诸如“A、B和/或C”旨在包括：A、B和C；A、B或C；A或B；A或C；B或C；A和B；A和C；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

每当用措辞“包含”来描述实施方案时，包括在术语“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似实施方案。

单位、前缀和符号以其国际单位制(Système International de Unite，SI)可接受的形式表示。数值范围包括限定该范围的数字，并且本文提供的任何单个值可用作包括本文提供的其他单个值的范围的端点。例如，一组值(诸如1、2、3、8、9和10)也是1-10、1-8、3-9等数字范围的公开。同样，所公开的范围是该范围所涵盖的每个单个值的公开。例如，5-10的所述范围也是5、6、7、8、9和10的公开。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可在本文中互换用于指任何长度的氨基酸聚合物及其盐。聚合物可以是直链或支链，可包含经修饰的氨基酸，并且可间杂非氨基酸。除非另外指明，例如对于本文所述的不常见或非天然氨基酸的缩写，本文使用本领域所用的三字母和单字母缩写来表示氨基酸残基。除非前面有“D”或小写字母，否则氨基酸是L-氨基酸。氨基酸缩写的组或串用于表示肽。除非特别指出，否则肽用左边的N末端指示，并且序列从N末端到C末端书写。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”还涵盖已被天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、内酰胺桥形成、糖基化、脂质化、乙酰化、酰化、酰胺化、磷酸化或其他操作或修饰(诸如与标记组分缀合或添加保护基团)。例如，含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如氨基异丁酸(Aib)、非天然氨基酸等)的多肽和包含D-氨基酸或由D-氨基酸组成的多肽，以及本领域已知的其他修饰也包括在该定义内。在某些实施方案中，多肽可作为单链、共价二聚体或非共价缔合链存在。多肽也可以是环状形式。环状多肽可例如通过桥接游离氨基和游离羧基来制备。环状化合物可通过用脱水剂处理(如果需要，进行适当的保护)来形成。开链(线性形式)至环状形式的反应可涉及分子内环化。环状多肽还可通过本领域已知的其他方法来制备，例如使用一个或多个内酰胺桥、氢键替代物(Patgiri等人，2008)、烃钉(Schafmeister等人，2000)、三唑钉(Le Chevalier Isaad等人，2009)或二硫键(Wang等人，2006)。桥或钉可间隔例如3、4、7或8个氨基酸。

术语“变体”是指与参考序列相比具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的肽。缺失和插入可以是内部的和/或在一个或多个末端。取代可包括用类似或同源的氨基酸或不类似的氨基酸替换一个或多个氨基酸。例如，一些变体包括在一个或多个氨基酸位置上的丙氨酸取代。其他取代包括对蛋白质的总净电荷、极性或疏水性影响很小或没有影响的保守取代。一些变体包括改变氨基酸的电荷或极性的非保守取代。可用L-或D-形式的氨基酸进行取代。

“逆反”肽相对于参考L-氨基酸序列具有反向的氨基酸序列，并且由D-氨基酸组成(倒转氨基酸亚基的α-中心手性)，以帮助保持与原始L-氨基酸肽类似的侧链拓扑结构。

如本文所用，术语“保守取代”是指一个或多个氨基酸被另一生物学上类似的残基替换。示例包括具有类似特征的氨基酸残基的取代，例如小氨基酸、酸性氨基酸、极性氨基酸、碱性氨基酸、疏水性氨基酸和芳香族氨基酸。有关肽和蛋白质中表型沉默取代的进一步信息，参见例如Bowie等人，Science 247:1306-1310(1990)。在以下方案中，氨基酸的保守取代根据物理化学性质分组；I：中性和/或亲水性，II：酸和酰胺，III：碱性，IV：疏水性，V：芳香族的大体积氨基酸。

I	II	III	IV	V
					A	N	H	M	F
S	D	R	L	Y
					T	E	K	I	W
P	Q		V
					G			C

在以下方案中，氨基酸的保守取代根据物理化学性质分组；VI：中性或疏水性，VII：酸性，VIII：碱性，IX：极性，X：芳香族。

VI	VII	VIII	IX	X
					A	D	H	M	F
L	E	R	S	Y
					I		K	T	W
V			N	H
					P			Q
G			C

鉴别不影响蛋白质功能的保守核苷酸和氨基酸取代的方法是本领域众所周知的(参见例如Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人，Protein Eng.12(10):879-884(1999)；以及Burks等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:412-417(1997))。

在两个或更多个核酸或肽的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指当进行比较和比对(如果需要，引入空位)以获得最大对应性时，相同或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列不考虑任何保守氨基酸取代作为序列同一性的部分。同一性百分比可使用序列比较软件或算法或通过视觉检查来测量。本领域已知可用于获得氨基酸或核苷酸序列比对的各种算法和软件。

序列比对算法的一个此类非限制性示例在Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，87:2264-2268(1990)中描述，如Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，90:5873-5877(1993)中进行修饰并且结合到NBLAST和XBLAST程序(Altschul等人，Nucleic Acids Res.，25:3389-3402(1991))中。在某些实施方案中，可如Altschul等人，Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)中所述使用空位BLAST。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等人，Methods inEnzymology，266:460-480(1996))、ALIGN、ALIGN-2(Genentech，South San Francisco，California)或Megalign(DNASTAR)是可用于序列比对的附加公开软件程序。在某些实施方案中，两个核苷酸序列之间的同一性百分比使用GCG软件包中的GAP程序来确定(例如，使用NWSgapdna.CMP矩阵，空位权重为40、50、60、70或90，长度权重为1、2、3、4、5或6)。在某些另选的实施方案中，GCG软件包中的GAP程序结合Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))的算法，可用于确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比(例如，使用BLOSUM62矩阵或PAM250矩阵，且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5)。另选地，在某些实施方案中，使用Myers和Miller(CABIOS 4:11-17(1989))的算法确定核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比。例如，可使用ALIGN程序(2.0版)并使用带有残基表(空位长度罚分为12和空位罚分为4)的PAM120来确定同一性百分比。本领域技术人员可通过特定的比对软件来确定用于最大比对的合适参数。在某些实施方案中，使用比对软件的默认参数。用于计算同一性的其他资源包括在以下文献中描述的方法：Computational MolecularBiology(Lesk编辑，1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith编辑，1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part 1(Griffin和Griffin编辑，1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(G.von Heinje，1987)；SequenceAnalysis Primer(Gribskov等人编辑，1991)；以及Carillo等人，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。

如本文所用，“多核苷酸”可包括一个或多个“核酸”、“核酸分子”或“核酸序列”，并且是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。多核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶结合到聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸及它们的类似物。先前的描述适用于本文所指的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

“分离的”分子是自然界中未发现的形式的分子，包括已经纯化的那些分子。

“标记”是可检测的化合物，其可直接或间接缀合至分子，以便产生“标记的”分子。标记可以是自身可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者可以是间接检测的，例如通过催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变(例如酶标记)或通过其他间接检测手段(例如生物素化)。

“结合亲和力”通常是指分子的单个结合位点与其结合配偶体(例如，受体与其配体、抗体与其抗原、形成二聚体的两个单体等)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对成员之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(K_D)来表示。亲和力可通过本领域已知的常用方法(包括本文所述的那些)来测量。低亲和力结合配偶体通常结合缓慢，并倾向于容易解离，而高亲和力结合配偶体通常结合较快，并倾向于保持结合较长时间。

分子对其结合配偶体的亲和力或亲合力可使用本领域已知的任何合适的方法通过实验确定，例如流式细胞术、酶联免疫吸附测定(ELISA)、或放射免疫测定(RIA)、或动力学(例如

或BIACORE^TM或

分析)。可容易地采用直接结合测定以及竞争性结合测定形式(参见，例如，Berzofsky等人，“Antibody-Antigen Interactions,”inFundamental Immunology,Paul,W.E.编辑，Raven Press:New York,N.Y.(1984)；Kuby,Immunology,W.H.Freeman and Company:New York,N.Y.(1992))。如果在不同条件(例如，盐浓度、pH、温度)下测量，则特定结合对相互作用的测量亲和力可变化。因此，如本领域已知的，用结合配偶体的标准溶液和标准缓冲液进行亲和力和其他结合参数(例如K_D或Kd、K_on、K_off)的测量。

“活性剂”是旨在提供生物活性的成分。活性剂可与一种或多种其他成分缔合。为肽的活性剂也可称为“活性肽”。

活性剂的“有效量”是足以实现特定目的的量。

术语“药物组合物”是指以允许活性成分的生物活性有效的形式存在并且不包含对将施用该组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分的制剂。此类组合物可以是无菌的，并且可包含药学上可接受的载体，诸如生理盐水。合适的药物组合物可包含一种或多种缓冲剂(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、表面活性剂(例如聚山梨酯)、稳定剂(例如多元醇或氨基酸)、防腐剂(例如苯甲酸钠)和/或其他常规的增溶剂或分散剂。

“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是需要诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家畜、农场动物、运动动物和实验室动物，包括例如人、非人灵长类、犬、猫、猪、牛、马、啮齿动物，包括大鼠和小鼠、兔等。

术语“抑制”、“阻断”和“压制”可互换使用，并且是指发生率或活性的任何统计学显著降低，包括发生率或活性的完全阻断。例如，“抑制”可指活性或发生率减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。“抑制剂”是在过程、途径或分子的发生率或活性上产生统计学上显著降低的分子、因子或物质。

“肿瘤细胞”或“肿瘤”与相同类型的正常细胞或组织相比通常经历了某种形式的突变/转化，从而导致异常生长。肿瘤包括形态学不规则以及病理性增生。肿瘤细胞可以是良性或恶性的。恶性肿瘤(即癌症)与良性肿瘤的区别在于它们表现出细胞的分化和定向丧失，并具有侵袭和转移的特性。

“实体瘤”是大量肿瘤细胞。“液体肿瘤”或“血液系统恶性肿瘤”是髓样或淋巴样谱系的血液癌。

II.ATF5肽和组合物

ATF5肽

ATF5是具有N端酸性激活结构域和C端碱性亮氨酸拉链(bZIP)结构域的282个氨基酸的真核转录因子。bZIP结构域含有DNA结合区和亮氨酸拉链区。亮氨酸拉链是常见的结构基序，通常在二聚化结构域中每第七个氨基酸具有一个亮氨酸。bZIP转录因子通过其亮氨酸拉链同源-和/或异源-二聚化以特异性结合DNA。野生型人、大鼠和鼠ATF5分别具有NCBI登录号NP_001180575、NP_758839和NP_109618中列出的氨基酸序列。

NTAzip-ATF5(图1A)是ATF5肽，其中缺失ATF5 N端活化结构域并且DNA结合结构域被经工程改造的增强亮氨酸拉链替换，即含七残基重复的两亲性酸性α-螺旋序列，其中每第七个残基有一个亮氨酸，这延伸了野生型ATF5亮氨酸拉链区(Angelastro等人2003)。细胞穿透显性负性ATF5(CP-d/n-ATF5)分子是NTAzip-ATF5的改进版本，其含有细胞穿透结构域和截短的ATF5亮氨酸拉链序列(相对于野生型)，以及延伸的亮氨酸拉链序列(US2016/0046686；Karpel-Massler等人，2016)。CP-d/n ATF5分子的示例示于图1B中。如本文所用，术语“延伸的亮氨酸拉链”，“亮氨酸拉链延伸物”和“增强的亮氨酸拉链”是指具有一至四个亮氨酸七肽，即Leu-(X)₆(SEQ ID NO:52)的肽，该序列不是野生型ATF5亮氨酸拉链序列。

ST-3(图1C)CP-d/n-ATF5分子的变体，其缺乏亮氨酸拉链延伸物并诱导肿瘤细胞中的细胞死亡。先前的研究表明，增强的亮氨酸拉链区对于显性阴性bZIP抑制剂的稳定性和抑制活性是必需的(Krylov等人，1995；Olive等人，1997；Moll等人，2000；Acharya等人，2006)。因此，ST-3在缺乏延伸的亮氨酸拉链区的情况下保留其特异性靶向和杀伤肿瘤细胞的能力的发现是出乎意料的。

本发明人已经发现，包含ST-3亮氨酸拉链序列(SEQ ID NO:53)的ATF5肽的非保守变体诱导肿瘤细胞中的细胞死亡。本发明的ATF5衍生肽保留了其特异性靶向和杀伤具有ST-3亮氨酸拉链区的多个非保守氨基酸取代的肿瘤细胞的能力的发现在本发明之前是没有被预测的。ST-3的逆反变体不仅具有活性，而且相对于ST-3具有增加的活性，这是出乎意料的。

本发明提供了具有截短的ATF5亮氨酸拉链区和任选的细胞穿透区的ATF5肽。本发明的ATF5肽能够干扰它们被引入的细胞中的ATF5活性。在一些实施方案中，ATF5肽可影响涉及凋亡的途径。ATF5活性可通过本领域已知的几种测定中的任何一种来评估，包括本文所述的细胞杀伤测定。ATF5活性也可通过其结合cAMP-应答元件(CRE)的能力来评估。

“ATF5亮氨酸拉链区”是衍生自野生型ATF5亮氨酸拉链区的截短序列。该术语仅用于指序列，而不必指二级结构。截短的ATF5亮氨酸拉链区可具有例如表1中所示的氨基酸序列。ST-3亮氨酸拉链序列(SEQ ID NO:53)示出作为参考点。SEQ ID NO:53中的取代以粗体下划线示出。

表1

亮氨酸拉链区可以是逆反形式。在一个实施方案中，逆反亮氨酸拉链区具有序列VAEAREELERLEARLGQARGEL(SEQ ID NO:65)。

这些序列的变体也包括在本发明的范围内。本发明的ATF5肽可具有与本文所公开的那些序列具有至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的亮氨酸拉链区。

在其中ATF5肽包含细胞穿透区的实施方案中，细胞穿透区可操作地连接至截短的ATF5亮氨酸拉链区。在一些实施方案中，细胞穿透区例如通过肽键、二硫键、硫醚键或本领域已知的接头共价连接至截短的ATF5亮氨酸拉链区(参见，例如，Klein等人2014)。示例性的接头包括但不限于取代的烷基或取代的环烷基。在肽被递送后，接头可以是可切割的。通过酰胺键直接连接的细胞穿透区和ATF5亮氨酸拉链区可称为“融合物”。如以上关于活性肽所讨论的，融合物可在细胞穿透区和ATF5亮氨酸拉链区之间含有氨基酸接头序列。细胞穿透区可连接至截短的ATF5亮氨酸拉链区的N末端或C末端，或通过残基侧链连接。细胞穿透区和截短的ATF5亮氨酸拉链区可具有相同或相反的手性。

本发明的细胞穿透ATF5肽可包含本文所公开的细胞穿透结构域和ATF5亮氨酸拉链结构域的任何组合。此类肽的非限制性示例示于表2中。细胞穿透区用斜体表示。相对于ST-3序列的取代以粗体下划线示出。

还包括本发明的ATF5肽的逆反形式。在一个实施方案中，ATF5肽是ST-13，一种包含细胞穿透区并且具有D-氨基酸序列

(SEQ ID NO:13)的逆反肽。在另一个实施方案中，ATF5肽是ST-14，一种包含细胞穿透区并且具有D-氨基酸序列

(SEQ ID NO:14)的逆反肽。细胞穿透区用斜体表示。相对于ST-3序列(SEQ ID NO:3)的取代以粗体下划线示出。

本发明的ATF5肽优选地长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31，32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸，包括具有这些长度中的任何一个为端点的范围，例如22-38个氨基酸。

本发明的ATF5肽包括与本文所公开的那些序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的肽。

ATF5肽可具有经修饰的N末端和/或经修饰的C末端。例如，ATF5肽可任选地包含N端乙酰基和/或C端酰胺基。

本发明的ATF5肽可任选地是环状的。例如，ATF5肽可包括一个或多个内酰胺桥。内酰胺桥优选但非必须地在间隔四个氨基酸残基的侧链之间形成(BxxxB)。内酰胺桥可在例如Asp或Glu和Lys的侧链之间形成。可在内酰胺桥的位点进行氨基酸取代以促进连接。

本发明的ATF5肽可任选包括例如用于纯化或检测的一个或多个表位和/或亲和标签。此类标签的非限制性示例包括FLAG、HA、His、Myc、GST等。本发明的ATF5肽可任选包括一种或多种标记。

在某些方面，本发明提供了一种组合物，例如药物组合物，其包含本发明的ATF5肽，任选地还包含一种或多种载体、稀释剂、赋形剂或其他添加剂。

包含如本文所提供的ATF5肽和组合物以及任选的使用说明的试剂盒也在本发明的范围内。该试剂盒可进一步包含至少一种另外的试剂，和/或一种或多种另外的活性剂。试剂盒通常包括指示试剂盒内容物的预期用途的标记。术语“标记”包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式伴随试剂盒的任何书写或记录材料。

本发明的ATF5肽促进一组基因的差异基因表达，所述一组基因包括但不限于ATF5靶基因Bcl-2、Mcl-1和存活素。具体地，ATF5肽敲低了与细胞存活、增殖和可塑性相关的ATF5靶基因的表达。因此，ATF5肽可用于诱导细胞死亡、降低细胞增殖或激活细胞分化。在某些实施方案中，本发明的ATF5肽用于抑制肿瘤细胞的增殖和/或促进肿瘤细胞中的细胞毒性。增殖和细胞毒性可通过已知的测定来测量，包括本文所述的细胞杀伤测定。

细胞靶向

可通过本领域已知的方法将本发明的ATF5肽引入靶细胞。选择的引入方法将取决于例如预期的应用。

在一些情况下，编码ATF5肽的DNA或RNA可被递送至靶细胞并在靶细胞中表达。取决于应用，递送可通过任何合适的载体来完成。载体的示例包括质粒、粘粒、噬菌体、细菌、酵母和病毒载体，该病毒载体例如由逆转录病毒制备，包括慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒和包膜假型病毒。可使用例如纳米颗粒、流体动力学递送、电穿孔、声穿孔、磷酸钙沉淀或阳离子聚合物诸如DEAE-葡聚糖将载体引入细胞。载体可与脂质复合，诸如包封在脂质体中，或与阳离子缩合剂缔合。

本发明的ATF5肽可通过利用细胞受体的机制递送至细胞。此类机制的示例包括抗体-药物缀合物、嵌合抗原受体和整联蛋白靶向的RGD样序列。RGD样序列的示例包括GRGDS(SEQ ID NO:72)和GRGDNP(SEQ ID NO:73)。本发明的ATF5肽可包括如本文所述或通过本领域已知的任何方法连接的一个或多个RGD样序列，诸如两个、三个、四个或五个RGD样序列。可将一个或多个RGD样序列掺入ATF5亮氨酸拉链区的N端或C端侧。此类RGD样序列也可彼此独立地和与ATF5亮氨酸拉链区独立地为逆反形式。另选地，可将ATF5肽包封在囊泡(诸如外来体或脂质体)中或在胶束中并递送至细胞。将ATF5肽引入细胞的另一种方法是通过环化，例如使用烃钉(Bernal等人2007；Bird等人2016)或本领域已知的其他环化方法。

本发明的某些ATF5肽包含细胞穿透结构域或细胞穿透肽(CPP)。术语“细胞穿透结构域”、“细胞穿透区”和“细胞穿透肽”在本文中可互换使用。

CPP是能够穿过细胞膜的短肽(通常约6-40个氨基酸)。许多CPP能够穿过血脑屏障(BBB)。在一些实施方案中，CPP的长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39个氨基酸，包括具有这些长度中的任何一个作为端点的范围，例如10-30个氨基酸。CPP具有跨细胞膜和BBB转运共价或非共价连接的分子货物诸如多肽、多核苷酸和纳米颗粒的能力。该易位可以是通过易位的胞吞或能量非依赖性的(即，非胞吞)。在文献中描述和表征了许多CPP(参见，例如，Handbook of Cell-Penetrating Peptides(第2版，Ulo Langel编辑，2007)；Hervé等人2008；Heitz等人2009；Munyendo等人2012；Zou等人，2013；Krautwald等人，2016)。CPP的策展数据库在crdd.osdd.net/raghava/cppsite上维护(Gautam等人2012)。

被称为核定位序列(NLS)的肽是CPP的子集。经典的NLS含有一个(单部分)或两个(两部分)碱性氨基酸区。经典的单部分和二部分NLS的共有序列分别为K(K/R)X(K/R)(SEQID NO:66)和(K/R)(K/R)X_10-12(K/R)_3/5(SEQ ID NO:67)，其中3/5指示5个连续氨基酸中的至少3个是赖氨酸或精氨酸(Kosugi等人2009)。SV40大T抗原的NLS序列PKKKRKV(SEQ ID NO:36)是经典单部分NLS的示例，而核质蛋白的NLS序列KRPAATKKAGQAKKK(SEQ ID NO:68)是经典两部分NLS的示例(Lange等人，2007；Kosugi等人，2009)。也有许多非经典NLS，诸如来自核糖核蛋白(RNP)hnRNP A1、hnRNP K和U snRNP的那些(Mattaj等人1998)。

适用于本发明的CPP的非限制性示例包括衍生自蛋白质的肽，诸如来自果蝇(Drosophila)触角足转录因子(Penetratin及其衍生物RL-16和EB1)(Derossi等人1998；Thorén等人2000；Lundberg等人2007；Alves等人2008)；来自HIV-1转录反式激活因子(Tat)(Vivès等人，1997；

等人，2001)；来自狂犬病毒糖蛋白(RVG)(Kumar等人2007)；来自单纯疱疹病毒VP22(Elliott等人，1997)；来自抗微生物蛋白原1(SynB)(Rousselle等人2001)，来自大鼠胰岛素1基因增强子蛋白(pIS1)(Kilk等人2001；Magzoub等人2001)；来自鼠血管内皮钙粘蛋白(pVEC)(Elmquist等人，2001)；来自人降钙素(hCT)(Schmidt等人1998)；以及来自成纤维细胞生长因子4(FGF4)(Jo等人2005)。适用于本发明的CPP还包括合成和嵌合肽，诸如转运肽(TP)及其衍生物(Pooga等人1998；Soomets等人2000)；膜易位序列(MTS)(Brodsky等人，1998；Lindgren等人，2000；Zhao等人，2001)，诸如MPS肽(也称为基于融合序列的肽或FBP)(Chaloin等人，1998)；基于序列信号的肽(SBP)(Chaloin等人，1997)；模型两亲性肽(MAP)(Oehlke等人1998；Scheller等人1999；

等人2001)、易位肽2(TP2)(Cruz等人2013)、MPG(Morris等人1997；Kwon等人2009)、Pep-1(Morris等人2001；

等人2007)和聚精氨酸(例如，R₇-R₁₂)(SEQ ID NO:87)(Mitchell等人2000；Wender等人2000；Futaki等人2001；Suzuki等人2002)。代表性但非限制性的序列示于表3中。

表3

由于CPP的功能依赖于它们的物理特性而不是序列特异性相互作用，因此它们可具有如表3中提供的和/或本领域已知的反向序列和/或反向手性。例如，CPP的逆反形式(反向序列和反向手性)适用于本发明。逆反CPP的一个示例具有D-氨基酸序列KKWKMRRNQFWIKIQR(SEQ ID NO:50)。逆反CPP的另一个示例具有D-氨基酸序列KKWKMRRNQFWLKLQR(SEQ ID NO:51)。具有一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代的保留了跨细胞膜和/或BBB的能力的这些序列的变体也适用于本发明。本发明的ATF5肽可包括与表3中提供的示例性序列具有至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的细胞穿透结构域。氨基酸添加、缺失和/或取代对CPP介导细胞穿透能力的影响可使用本领域已知的方法来测试。

III.制备方法

本发明的ATF5肽可化学合成，例如使用固相肽合成或液相肽合成，或两者的组合。合成可作为肽的片段发生，随后通过化学或酶促结合。本发明的ATF5多肽可使用重组方法来表达。

因此，还提供了编码本发明的ATF5肽的核酸分子。可使用寡核苷酸合成仪通过化学合成来构建此类核酸。本发明的核酸分子可基于所需ATF5肽的氨基酸序列和选择在将产生重组ATF5肽的宿主细胞中有利的那些密码子来设计。可应用标准方法来合成编码感兴趣ATF5肽的核酸分子。

一旦制备，可将编码特定ATF5肽的核酸插入表达载体中并将其可操作地连接至适于在期望宿主中表达该肽的表达控制序列。为了获得ATF5肽的高表达水平，核酸可与在所选表达宿主中有功能的转录和翻译表达控制序列可操作地连接或缔合。

本领域任何已知的技术人员都可采用多种表达宿主/载体组合。用于真核宿主的有用的表达载体包括例如包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。用于细菌宿主的有用的表达载体包括已知的细菌质粒，诸如来自大肠杆菌(E.coli)的质粒，包括pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物，更宽宿主范围的质粒，诸如M13，以及丝状单链DNA噬菌体。

合适的宿主细胞包括处于合适启动子控制下的原核生物、酵母、昆虫或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。可建立高等真核细胞或哺乳动物来源的细胞系，其示例包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、293细胞、COS-7细胞、L细胞、C127细胞、3T3细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞和BHK细胞。也可使用无细胞翻译系统。

实施例

可通过参考以下非限制性实施例来进一步限定本公开的实施方案。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本公开的范围的情况下，可对材料和方法进行许多修改。如下所述，制备并检查了参考肽ST-3的许多变体。

实施例1.具有保守半胱氨酸取代的ST-3变体具有体外活性

使用HL60细胞中的细胞毒性测定检查ST-3中氨基酸第21位的单个半胱氨酸对细胞毒性活性的需要。半胱氨酸残基在天然ATF5结构域内是高度保守的，并且被认为是在DNA结合之前ATF5同二聚化所必需的。

将HL60 PML悬浮细胞以3.5x10³个细胞/孔的密度置于96孔盘中的150μL RPMI+1.5％胎牛血清(FBS)中。将以10mg/mL浓度复溶于20mM His(pH7.5)中的ST-3以50μL的体积添加至各孔中，至0-80μM的终浓度范围。将细胞与ST-3在37℃下温育48小时。使用AbcamAnnexin V FITC凋亡检测试剂盒通过流式细胞术对细胞活力进行定量。简而言之，将细胞用PBS洗涤并重悬于含有膜联蛋白V FITC和碘化丙啶(PI)的1x测定缓冲液中。膜联蛋白V检测凋亡细胞，并且PI染色死细胞。染色后，凋亡细胞显示绿色荧光，死细胞显示红色和绿色荧光，并且活细胞显示很少或没有荧光。基于前向散射(FSC)相对于侧向散射(SSC)选择细胞进行分析，并通过BD Accuri C6 Plus流式细胞仪分析以使用FITC信号检测器检测膜联蛋白V-FITC结合(Ex＝488nm；Em＝530nm)并通过藻红蛋白发射信号检测器进行PI染色。对膜联蛋白V^低和PI^低的百分比进行定量并表示为％活力。

将冻干的ST-3或在氨基酸第21位用甘氨酸(ST-4)或丙氨酸(ST-5)取代半胱氨酸的ST-3在组氨酸缓冲液中新鲜复溶成5mg/mL的储备溶液，并以0-40μM的终浓度范围添加到细胞中。在对细胞活力进行定量之前，将细胞与ATF5肽温育48小时。结果示于图2中。

ST-3活性减弱，但不因第21位半胱氨酸被丙氨酸或甘氨酸取代而消除。对于ST-3、ST-4和ST-5，观察到的EC₅₀值分别为约16μM、35μM和38μM。在功能测定中，EC₅₀是使生物学应答降低其最大值的50％的浓度。在ATF5肽的情况下，EC₅₀被测量为使细胞活力降低其最大值50％的浓度。EC₅₀可通过本领域已知的任何数量的手段来计算。丙氨酸取代半胱氨酸不影响细胞穿透。没有测试甘氨酸取代的变体的渗透；然而，基于丙氨酸取代的数据，预期细胞穿透不受影响。

实施例2.具有非保守取代的ST-3变体具有体外活性

在该实施例中讨论的ST-3变体总结于表4中。ST-3具有约12-20μM的EC₅₀。

表4

单个取代

使用实施例1中所述的HL60细胞活力测定，我们检查了含有单个非保守氨基酸取代的ST-3变体的细胞毒性活性(图3)。变体ST-7在第28位具有非极性亮氨酸对极性天冬酰胺的取代，并且EC₅₀为约3μM。ST-8在第22位具有非极性丙氨酸对极性谷氨酰胺的取代，并且EC₅₀为约5μM。这种对ST-7和ST-8的活性增加比ST-3高3-6倍。ST-6在第37位具有丙氨酸对丝氨酸的保守取代，并且具有与ST-3相当的活性。

多个取代

使用实施例1中所述的HL60细胞活力测定，我们检查了含有多个非保守氨基酸取代的ST-3变体的细胞毒性活性。变体ST-9具有两个带负电荷的谷氨酸残基，其各自被带正电荷的精氨酸替换，以及带正电荷的精氨酸和带正电荷的赖氨酸，其各自被带负电荷的谷氨酸替换。(参见表4)这些变化涉及ST-3的约18％的ATF5亮氨酸拉链区。ST-9的活性比ST-3显著增加(图4)。ST-9具有约2μM的EC₅₀，而ST-3为约12-20μM。

ST-10具有与ST-9相同的四个“电荷”取代，以及如ST-7中在第28位亮氨酸(非极性)对天冬酰胺(极性)的非保守取代，和如ST-6中丙氨酸对丝氨酸的保守取代。(参见表4。)ST-10的活性与ST-9的活性相当(图4)。

ST-11具有与ST-10相同的取代，加上如ST-5中在第21位丙氨酸对保守半胱氨酸的取代。(参见表4。)ST-11具有比ST-3更高的细胞毒性活性(图4)。

实施例3.逆反ST-3变体具有体外活性

我们在实施例1中所述的HL60细胞活力测定中检查了逆反形式的ST-11的细胞毒性。逆反变体ST-13具有与ST-11相当的活性，以及优于ST-3的活性(图5)。

在各种人癌细胞系中进一步检查ST-13，作为第二逆反变体ST-14。将悬浮细胞(HL60、AML14或SET2)以3.5x10³个细胞/孔的密度置于组织培养处理的96孔皿中的150μLRPMI+1.5％胎牛血清(FBS)中。将以10mg/mL浓度复溶于20mM His(pH 7.5)中的ATF5肽以50μL的体积添加至各孔中，至0-80μM的终浓度范围。将细胞与肽在37℃下温育48小时。使用Abcam Annexin V FITC凋亡检测试剂盒通过流式细胞术对细胞活力进行定量。简而言之，将细胞用PBS洗涤并重悬于含有膜联蛋白V FITC和碘化丙啶(PI)的1x测定缓冲液中。通过BD Accuri C6 Plus流式细胞仪分析细胞，以使用FITC信号检测器检测膜联蛋白V-FITC结合(Ex＝488nm；Em＝530nm)，并使用藻红蛋白发射信号检测器检测PI染色。对膜联蛋白V^低和PI^低的百分比进行定量并表示为％活力。使用GraphPad Prism v.7XML计算EC₅₀值。

另外，在第-1天将贴壁A375、MCF7、U251、DU145、U87和A549细胞在200μL培养基中以3.5x10³个细胞/孔的密度培养。在第0天，移除培养基并补充150μL新鲜培养基，并用所述的ATF5肽处理细胞。在37℃下温育48小时后，收集漂浮的细胞，将贴壁细胞用Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤，在RT下用50μL 2.5％胰蛋白酶从培养皿中解离，并与漂浮的细胞合并。如上文针对悬浮细胞所述或通过MTT测定(MCF7细胞)确定细胞活力。另选地，在用2.5％胰蛋白酶进行胰蛋白酶消化后，将细胞从细胞培养板中轻轻移出，并如上所述使用Abcam Annexin V FITC凋亡检测试剂盒通过流式细胞术对细胞活力进行定量。

PBMC和BMMC在上述悬浮细胞的条件下培养。

ST-13(图6A-6E)和ST-14(图7A-7E；表5)在多种肿瘤细胞类型中都显示出显著的细胞毒性活性；ST-14在外周血单核细胞(PBMC)和骨髓单核细胞(BMMC)中也具有细胞毒性(表5)。

表5

细胞系	ST-14计算的EC<sub>50</sub>(μM)
		HL60	9.2
AML14	4.8
		A375	0.7
MCF7	2.1
		U251	2.2
U87	3.6
		DU145	4.0
A549	1.2
		SET2	22.1
PBMC	>80
		BMMC	>80

我们测量了用ST-14处理后HL60细胞中相对于β-肌动蛋白表达的ATF5和凋亡调节蛋白Mcl-1、Bcl-2和存活素的RNA表达。简而言之，将8x10⁵个HL60悬浮细胞铺于6孔板中，并用0μM、5μM、20μM或40μM ST101处理4或24小时。将细胞以1,200rpm离心7.5分钟，然后将沉淀用750μl无DNAse-RNAse的H₂O洗涤以去除残留的培养基。使用Quick-RNA^TM MiniPrepPlus试剂盒(Zymo Research目录号R1054)根据制造商的说明提取RNA，并用55μl H₂O洗脱。将RNA(200ng)在Invitrogen预制的2％SYBR^TM Gold E-Gel(Thermo Fisher Scientific目录号G401002)上运行以评估RNA质量。使用Invitrogen SuperScript^TM IV VILO MasterMix与ezDNAse^TM酶(Thermo Fisher Scientific目录号11766050)，根据制造商的方案合成cDNA，其中进行了以下修改：cDNA在56℃而不是50℃延伸。设置负RT对照以排除gDNA污染。使用基因特异性引物(表6)和KOD Xtreme^TM热启动DNA聚合酶(Millipore Sigma目录号71975-3)扩增cDNA。向每个反应中添加等量的RNA。将所有PCR产物在Invitrogen预制的2％溴化乙锭E-Gel(Thermo Fisher Scientific)上运行。使用BioRad ImageLab软件将基因表达与β-肌动蛋白进行比较。

表6

ST-14暴露导致Mcl-1、Bcl2和BIRC5(存活素)的表达相对于β-肌动蛋白表达降低(图8A-8D)。

实施例4.ST-3变体具有体内活性

我们在HL60皮下肿瘤模型中检查了ST-3和三种变体对肿瘤体积的影响。简而言之，将悬浮在1:1基质胶中的5x10⁶个HL60细胞通过皮下注射植入NU/J小鼠的腋窝。在肿瘤接种后第2天开始给药，其中平均肿瘤体积为144-176mm³。ATF5肽通过腹膜内(IP)注射以25mg/kg的剂量一天施用两次。所有测试的变体均相对于媒介物减小了肿瘤体积，其中逆反变体ST-13显示出最大的抗肿瘤活性(图9)。

我们使用U251胶质母细胞瘤细胞、MCF7乳腺癌细胞、HL60早幼粒细胞白血病细胞和A375黑素瘤细胞检查了ST-14对肿瘤模型中肿瘤体积的影响。简而言之，将悬浮在1:1基质胶中的5x10⁶个细胞通过皮下注射植入NU/J小鼠(对于MCF7和HL60细胞)或NOD/SCID小鼠(对于U251和A375细胞)的腋窝。

对于U251细胞肿瘤，在肿瘤接种后第2天开始给药，其中平均肿瘤体积为约240mm³。ST-14以50mg/kg的剂量通过皮下(SC)注射施用，每周三次，持续三周。ST-14相对于媒介物显著减小肿瘤体积(图10A、图10C)并增加存活(图10B-10C)。用25mg/kg剂量的ST-14获得了类似的结果。

对于MCF7细胞肿瘤，我们检查了即时给药和延迟给药的效果。在即时给药实验中，在肿瘤接种后第2天(2x10⁶个细胞)开始给药，其中平均肿瘤体积为约280-330mm³。ST-14以25mg/kg的剂量通过SC注射施用，每周三次，持续三周。在延迟给药实验中，在肿瘤接种后第59天(媒介物：2x10⁶个细胞；处理组：5x10⁶个细胞)开始给药。接种后监测肿瘤体积92天。在即时和延迟处理组两者中，ST-14在监测期间相对于媒介物显著减小肿瘤体积(图11A-11B)。

对于HL60细胞肿瘤，在肿瘤接种后第2天开始给药，其中平均肿瘤体积为约220mm³。ST-14以20mg/kg的剂量通过SC注射施用，每周三次，持续三周。ST-14相对于媒介物显著减小肿瘤体积(图12)。

对于A375细胞肿瘤，在肿瘤接种后第2天开始给药，其中平均肿瘤体积为约250-344mm³。ST-14以25mg/kg的剂量通过SC注射施用，每天两次，持续三周。ST-14相对于媒介物显著减小肿瘤体积(图13)。

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***

通过以下权利要求进一步描述本发明。

序列表

<110> 智慧疗法有限公司(SAPIENCE THERAPEUTICS, INC.)

<120> ATF5肽变体及其用途

<130> SAPIENCE.003.WO1

<140>

<141>

<150> 62/613,083

<151> 2018-01-03

<160> 87

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 76

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<223> 人工序列的描述：合成肽

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<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 29

Pro Val Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys

1 5 10 15

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(12)

<223> 该区域可涵盖1-6个残基

<400> 30

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 31

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 31

Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His

1 5 10 15

<210> 32

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 32

Arg Arg Leu Arg Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Arg Leu Arg Arg

1 5 10 15

<210> 33

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 33

Arg Val Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 34

Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Arg Arg

1 5

<210> 35

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 35

Met Gly Leu Gly Leu His Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gly

1 5 10 15

Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

20 25

<210> 36

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 36

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210> 37

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 37

Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr

1 5 10 15

Gly Arg

<210> 38

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 38

Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe

1 5 10

<210> 39

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 39

Arg Gly Gly Arg Leu Ala Tyr Leu Arg Arg Arg Trp Ala Val Leu Gly

1 5 10 15

Arg

<210> 40

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 40

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 41

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 41

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 42

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg

1 5

<210> 43

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 43

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln

1 5 10

<210> 44

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 44

Gly Lys Lys Lys Lys Arg Lys Arg Glu Lys Leu

1 5 10

<210> 45

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 45

Ser Lys Lys Lys Lys Thr Lys Val

1 5

<210> 46

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 46

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu

1 5 10 15

Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu

20 25

<210> 47

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 47

Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu

1 5 10 15

Ala Lys Lys Ile Leu

20

<210> 48

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 48

Pro Leu Ile Tyr Leu Arg Leu Leu Arg Gly Gln Phe

1 5 10

<210> 49

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工序列的描述：合成肽

<400> 49

Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr

1 5 10 15

Gln Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro

20 25 30

Val Gln

<210> 50

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(16)

<223> D-氨基酸

<400> 50

Lys Lys Trp Lys Met Arg Arg Asn Gln Phe Trp Ile Lys Ile Gln Arg

1 5 10 15

<210> 51

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(16)

<223> D-氨基酸

<400> 51

Lys Lys Trp Lys Met Arg Arg Asn Gln Phe Trp Leu Lys Leu Gln Arg

1 5 10 15

<210> 52

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(7)

<223> 任何氨基酸

<400> 52

Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 53

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Glu或任何带正电荷的氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Cys或任何非极性氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Gln或Ala

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> Glu或任何带正电荷的氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> Arg或任何带负电荷的氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> Asn或任何非极性氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)..(16)

<223> Lys或任何带负电荷的氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (21)..(21)

<223> Ser或Ala

<400> 53

Leu Glu Gly Xaa Xaa Xaa Gly Leu Xaa Ala Xaa Xaa Arg Glu Leu Xaa

1 5 10 15

Glu Arg Ala Glu Xaa Val

20

<210> 54

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 54

Leu Glu Gly Glu Gly Gln Gly Leu Glu Ala Arg Asn Arg Glu Leu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Ala Glu Ser Val

20

<210> 55

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 55

Leu Glu Gly Glu Ala Gln Gly Leu Glu Ala Arg Asn Arg Glu Leu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Ala Glu Ser Val

20

<210> 56

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 56

Leu Glu Gly Glu Cys Gln Gly Leu Glu Ala Arg Asn Arg Glu Leu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Ala Glu Ala Val

20

<210> 57

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 57

Leu Glu Gly Glu Cys Gln Gly Leu Glu Ala Arg Leu Arg Glu Leu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Ala Glu Ser Val

20

<210> 58

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 58

Leu Glu Gly Glu Cys Ala Gly Leu Glu Ala Arg Asn Arg Glu Leu Lys

1 5 10 15

Glu Arg Ala Glu Ser Val

20

<210> 59

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 59

Leu Glu Gly Arg Cys Gln Gly Leu Arg Ala Glu Asn Arg Glu Leu Glu

1 5 10 15

Glu Arg Ala Glu Ser Val

20

<210> 60

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 60

Leu Glu Gly Arg Cys Gln Gly Leu Arg Ala Glu Leu Arg Glu Leu Glu

1 5 10 15

Glu Arg Ala Glu Ala Val

20

<210> 61

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 61

Leu Glu Gly Arg Ala Gln Gly Leu Arg Ala Glu Leu Arg Glu Leu Glu

1 5 10 15

Glu Arg Ala Glu Ala Val

20

<210> 62

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 62

Leu Glu Gly Arg Leu Gln Gly Leu Arg Ala Glu Leu Arg Glu Leu Glu

1 5 10 15

Glu Arg Ala Glu Ala Val

20

<210> 63

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 63

Leu Glu Gly Arg Leu Ala Gly Leu Arg Ala Glu Leu Arg Glu Leu Glu

1 5 10 15

Glu Arg Ala Glu Ala Val

20

<210> 64

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 64

Leu Glu Gly Arg Ala Ala Gly Leu Arg Ala Glu Leu Arg Glu Leu Glu

1 5 10 15

Glu Arg Ala Glu Ala Val

20

<210> 65

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(22)

<223> D-氨基酸

<400> 65

Val Ala Glu Ala Arg Glu Glu Leu Glu Arg Leu Glu Ala Arg Leu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Arg Gly Glu Leu

20

<210> 66

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Lys或Arg

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Lys或Arg

<400> 66

Lys Xaa Xaa Xaa

1

<210> 67

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(2)

<223> Lys或Arg

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(14)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(14)

<223> 该区域可涵盖10-12个残基

<220>

<221> MOD_RES

<222> (15)..(19)

<223> Lys or Arg

<220>

<223> 参见所提交的对取代和优选实施方案的详细描述的说明书

<400> 67

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa

<210> 68

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 68

Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys

1 5 10 15

<210> 69

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 69

Val Pro Thr Leu Lys

1 5

<210> 70

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 70

Lys Leu Pro Val Met

1 5

<210> 71

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 71

Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp

1 5

<210> 72

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 72

Gly Arg Gly Asp Ser

1 5

<210> 73

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 73

Gly Arg Gly Asp Asn Pro

1 5

<210> 74

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 74

atggatgatg atatcgccgc gc 22

<210> 75

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 75

gaagcatttg cggtggacga tg 22

<210> 76

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 76

atggcgcacg ctggg 15

<210> 77

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 77

cttgtggccc agataggcac c 21

<210> 78

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 78

gcccagactc acatcaccaa gtg 23

<210> 79

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 79

atgtttggcc tcaaaagaaa cgcgg 25

<210> 80

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 80

tcttattaga tatgccaaac cagctcctac tcc 33

<210> 81

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 81

atgtcactcc tggcgaccct 20

<210> 82

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 82

gcagctacgg gtcctctgg 19

<210> 83

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 83

atgcacctgc agcccg 16

<210> 84

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 84

cgcgcagttg cccatgg 17

<210> 85

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 85

atgggtgccc cgacgttg 18

<210> 86

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 86

tcaatccatg gcagccagct g 21

<210> 87

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(12)

<223> 该序列可涵盖7-12个残基

<400> 87

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

Claims (11)

1.一种激活转录因子5(ATF5)肽，其由选自以下的氨基酸序列组成：

(i)LEGEGQGLEARNRELKERAESV(SEQ ID NO:54)；

(ii)LEGEAQGLEARNRELKERAESV(SEQ ID NO:55)；

(iii)LEGECQGLEARNRELKERAEAV(SEQ ID NO:56)；

(iv)LEGECQGLEARLRELKERAESV(SEQ ID NO:57)；

(v)LEGECAGLEARNRELKERAESV(SEQ ID NO:58)；

(vi)LEGRCQGLRAENRELEERAESV(SEQ ID NO:59)；

(vii)LEGRCQGLRAELRELEERAEAV(SEQ ID NO:60)；

(viii)LEGRAQGLRAELRELEERAEAV(SEQ ID NO:61)；和(ix)LEGRAAGLRAELRELEERAEAV(SEQ ID NO:64)；

其中ATF5肽任选地包含任选地包含N端乙酰基和/或C端酰胺基。

2.ATF5肽由以下组成：

(i)选自由以下组成的组的氨基酸序列：

a)LEGEGQGLEARNRELKERAESV(SEQ ID NO:54)；

b)LEGEAQGLEARNRELKERAESV(SEQ ID NO:55)；

c)LEGECQGLEARNRELKERAEAV(SEQ ID NO:56)；

d)LEGECQGLEARLRELKERAESV(SEQ ID NO:57)；

e)LEGECAGLEARNRELKERAESV(SEQ ID NO:58)；

f)LEGRCQGLRAENRELEERAESV(SEQ ID NO:59)；

g)LEGRCQGLRAELRELEERAEAV(SEQ ID NO:60)；

h)LEGRAQGLRAELRELEERAEAV(SEQ ID NO:61)；和

i)LEGRAAGLRAELRELEERAEAV(SEQ ID NO:64)；和

(ii)细胞穿透区；

其中ATF5肽任选地包含N端乙酰基和/或C端酰胺基，并且其中ATF5肽是细胞穿透肽。

3.由选自下组的氨基酸序列组成的ATF5肽：

(i)RQIKIWFQNRRMKWKKLEGEGQGLEARNRELKERAESV(SEQ ID NO:4)；

(ii)RQIKIWFQNRRMKWKKLEGEAQGLEARNRELKERAESV(SEQ ID NO:5)；

(iii)RQIKIWFQNRRMKWKKLEGECQGLEARNRELKERAEAV(SEQ ID NO:6)；

(iv)RQIKIWFQNRRMKWKKLEGECQGLEARLRELKERAESV(SEQ ID NO:7)；

(v)RQIKIWFQNRRMKWKKLEGECAGLEARNRELKERAESV(SEQ ID NO:8)；

(vi)RQIKIWFQNRRMKWKKLEGRCQGLRAENRELEERAESV(SEQ ID NO:9)；

(vii)RQIKIWFQNRRMKWKKLEGRCQGLRAELRELEERAEAV(SEQ ID NO:10)；

(viii)

RQIKIWFQNRRMKWKKLEGRAQGLRAELRELEERAEAV(SEQ ID NO:11)；和

(ix)RQIKIWFQNRRMKWKKLEGRAAGLRAELRELEERAEAV(SEQ ID NO:12)；

其中ATF5肽任选地包含N端乙酰基和/或C端酰胺基，并且其中ATF5肽是细胞穿透肽。

4.一种ATF5肽，由相对于权利要求1-3中任一项的氨基酸序列反向的氨基酸序列中的D-氨基酸组成。

5.一种包含根据权利要求1-4中任一项所述的ATF5肽的组合物。

6.根据权利要求5的组合物，其为药物组合物。

7.一种包含根据权利要求1-4中任一项的ATF5肽的试剂盒。

8.一种在肿瘤细胞中促进细胞毒性的体外方法，该方法包括使肿瘤细胞与根据权利要求1-4中任一项的ATF5肽接触。

9.一种抑制肿瘤细胞增殖的体外方法，该方法包括使肿瘤细胞与根据权利要求1-4中任一项的ATF5肽接触。

10.根据权利要求1-4中任一项的ATF5肽在制备用于促进肿瘤细胞中的细胞毒性的组合物中的用途。

11.根据权利要求1-4中任一项的ATF5肽在制备用于抑制肿瘤细胞增殖的组合物中的用途。

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