CN113832105A - 盆腔神经节体外培养模型、损伤模型及其构建方法和应用 - Google Patents

盆腔神经节体外培养模型、损伤模型及其构建方法和应用 Download PDF

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杨晓锋
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张振彬
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Abstract

本发明提供一种盆腔神经节体外培养模型、损伤模型及其构建方法和应用，以1640培养基为培养液基础成功实现盆腔神经节体外培养，获得盆腔神经节体外培养模型，更通过过氧化氢诱导盆腔神经节氧化应激损伤获得盆腔神经节损伤模型，且上述构建方法简单、成本低、便于操作，通过所述体外培养模型、损伤模型便于研究神经损伤性ED的发病机制和相应有效的治疗药物、方法等。

Description

盆腔神经节体外培养模型、损伤模型及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及动物模型技术领域，更具体地，涉及一种盆腔神经节体外培养模型、损伤模型及其构建方法和应用。
背景技术
据WHO癌症研究中心统计，2018年全球范围内结直肠癌新发病例为180万，死亡人数为88万。2015年中国直肠癌新发病例数38.8万，死亡病例数为18.7万，其发病率和死亡率分别位列我国恶性肿瘤第3位和第5位。结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，且结直肠癌中以直肠癌患者多见。现有技术中，手术治疗是治疗直肠癌的主要手段，是一种较为有效的治疗手段。但是，该手术治疗手段也存在一定的缺陷，其中就包括并发症的发生。直肠癌术后勃起功能障碍(Erectile dysfunction,ED)是其常见并发症，且在直肠癌手术治疗对象中，产生该并发症的患者高达50％。现有技术表明，引起该并发症的根源在于：术中难以完全避免的盆腔自主神经(PAN)损伤。且即使能通过神经电刺激技术辨认保护PAN以显著降低ED发生率，但仍有约20％男性直肠癌患者无法避免。该并发症将会直接影响患者的正常生活、心理健康，所以，对该并发症的治疗显得至关重要。而对于该神经损伤性ED患者，目前临床上还尚无有效的治疗方法。
而对此，实际上目前缺乏有效治疗方法的原因之一包含了基础研究条件的缺乏，主要体现于现有技术缺乏适于模拟人体神经性损伤ED的动物模型，尤其是盆腔神经节体外模型、损伤模型等，在没有该类实验动物模型的基础上，不便于研究盆腔神经节损伤引起的勃起功能障碍，也不方便为神经损伤性ED患者研究有效的治疗方法、药物等。因此，现有技术亟需一种盆腔神经节体外培养模型或损伤模型等，以便于研究神经损伤性ED发病机制以及相应的治疗策略。
发明内容
本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种盆腔神经节体外培养模型、损伤模型及其构建方法和应用，以1640培养基为培养液基础成功实现盆腔神经节体外培养，更通过过氧化氢诱导盆腔神经节损伤获得盆腔神经节损伤模型，且上述构建方法简单、成本低、便于操作，通过所述体外培养模型、损伤模型便于研究神经损伤性ED的发病机制和相应有效的治疗药物、方法等。
本发明的一个目的在于提供一种盆腔神经节损伤模型的构建方法，采用过氧化氢诱导组织培养液中的盆腔神经节。通过过氧化氢氧化应激以诱导盆腔神经节损伤，从而获得盆腔神经节损伤模型。该方法操作简单，成本低，且构建形成的模型表现优异。构建形成的盆腔神经节损伤模型便于研究以获得现有技术中神经损伤性勃起功能障碍病症的有效治疗措施，促进盆腔神经节损伤所致病症、药物的研究。在本发明的一个以上实施例中，本发明人获取成年大鼠MPG组织后以1640培养基作为基础培养环境进行体外培养，分别利用不同浓度的过氧化氢对体外培养的MPG进行氧化应激损伤，通过免疫组化、Elisa、神经丝长度比较，确定合适的损伤浓度，构建损伤模型。最终，通过体外培养MPG，并比较不同浓度的过氧化氢损伤后MPG免疫组化的神经蛋白染色、Elisa测定的神经因子浓度、神经丝生长长度，确定200μM浓度过氧化氢损伤可建立有效MPG体外损伤模型，获得适宜的过氧化氢破坏浓度，并成功构建相应的盆腔神经节损伤模型。
进一步地，过氧化氢浓度终浓度为0.1μM～500μM。
进一步地，过氧化氢浓度终浓度为100μM～500μM。所述过氧化氢为3％过氧化氢。
更进一步地，过氧化氢浓度终浓度为100μM～300μM。
更进一步地，过氧化氢浓度终浓度为200μM。
进一步地，具体包括步骤：
S1、从实验动物体内分离出盆腔神经节；在本发明的一个实施例中，实验动物为SD大鼠；从实验动物体内分离出盆腔神经节后，在过氧化氢诱导前将分离出的盆腔神经节置于1％的青霉素-链霉素的PBS中漂洗；进一步地，漂洗3次，每次1min；
S2、将盆腔神经节置于含有过氧化氢的组织培养液中培养；在本发明的一个实施例中，组织培养液包括1640培养基，通过往1640培养基中加入3％过氧化氢配置形成含有诱导损伤模型所需浓度过氧化氢的组织培养液。步骤S1获得大鼠盆腔神经节并经漂洗后，先置于24孔板中，贴壁5min后置于200μl含有诱导盆腔神经节损伤的过氧化氢的组织培养液中培养，且于37℃恒温培养12h，初步获取盆腔神经节损伤模型。
S3、检测盆腔神经节损伤程度以获取构建成功的盆腔神经节损伤模型。在步骤S2的基础上，对所得盆腔神经节损伤模型进行检测，鉴定其损伤程度，以获取所需损伤模型。
进一步地，组织培养液含有1640培养基；或，组织培养液含有1640培养基和基底胶。在本发明的一个实施例中，采用1640培养基作为盆腔神经节的培养液基础，尤其是和基底胶混合应用时，有利于保持盆腔神经节的活性和分化能力。更进一步地，组织培养液含有1640培养基和基底胶，且配比为1640培养基:基底胶＝2:1。
进一步地，步骤S3检测包括：盆腔神经节外围神经丝生长检测、盆腔神经节中神经蛋白的免疫组化检测和/或盆腔神经节神经因子的分泌检测。所述盆腔神经节外围神经丝生长检测包括对盆腔神经节周围神经丝长度的检测，通过检测神经丝的生长状况，利于判断当前条件下盆腔神经节损伤强度，从而获得所需损伤强度对应的损伤模型。在本发明的一个实施例中，0～400μM过氧化氢浓度范围内，随着过氧化氢浓度提升，盆腔神经节周围神经丝的长度逐渐生长缓慢，而当处于500μM过氧化氢浓度下的1640培养基中时，盆腔神经节周围神经丝甚至停止生长。即通过检测盆腔周围神经丝生长状况能反映盆腔神经节损伤强度。所述盆腔神经节中神经蛋白的免疫组化检测包括对盆腔神经节进行免疫组化以检测其中的神经蛋白，通过神经蛋白成分变化以鉴定损伤程度。在本发明的一个实施例中，0至500μM浓度范围内，随着过氧化氢浓度增加，MPG组织中的神经蛋白成分逐渐衰减，即损伤程度越来越严重。所述盆腔神经节神经因子的分泌检测包括对盆腔神经节旁分泌神经因子的分泌量进行检测，所述神经因子包括NGF、BDNF。在本发明的一个实施例中，过氧化氢对盆腔神经节神经因子的旁分泌具有抑制作用，且随着过氧化氢浓度增加，盆腔神经节的NGF、BDNF神经因子分泌受抑制状况加强，盆腔神经节损伤增强。
本发明的又一目的在于提供由上述构建方法构建形成的盆腔神经节损伤模型。通过上述方法构建形成的盆腔神经节损伤模型，有利于应用以研究盆腔神经节损伤引发病症的机制，便于促进盆腔神经节损伤所致疾病上治疗方面的研究。
本发明的再一目的在于提供一种盆腔神经节体外培养模型的构建方法，具体包括步骤：S1、从实验动物体内分离出盆腔神经节；S2、将盆腔神经节置于组织培养液中培养；S3、检测盆腔神经节外围神经丝生长，获得外围神经丝生长良好的盆腔神经节体外培养模型。通过该体外培养模型的构建方法，能成功的从大鼠中分离盆腔神经节，维持其活性、分化特性，通过检测、鉴定则能进一步确认、筛选构建成功的盆腔神经节体外培养模型。
本发明的再一目的在于提供由上述盆腔神经节体外培养模型的构建方法构建的盆腔神经节体外培养模型。通过构建盆腔神经节体外培养模型，一方面能作为如上述盆腔神经节损伤模型的对照以促进盆腔神经节神经损伤病症研究，尤其包括神经损伤性勃起功能障碍病症研究，另一方面，也便于提供盆腔神经节体外培养模型至盆腔神经节相关实验。
本发明的再一目的在于提供上述盆腔神经节损伤模型或上述盆腔神经节体外培养模型在神经损伤性勃起功能障碍治疗药物筛选、盆腔神经损伤相关病症治疗药物筛选、盆腔神经损伤相关病症发病机制研究模型中的应用。
本发明的再一目的在于提供一种筛选构建盆腔神经节损伤模型所需过氧化氢浓度的方法，具体包括步骤：S1、从实验动物体内分离出盆腔神经节；S2、将盆腔神经节分别置于含有不同浓度过氧化氢的组织培养液中培养；S3、检测盆腔神经节损伤程度，依据盆腔神经节损伤程度确定用于构建盆腔神经节损伤模型的过氧化氢浓度。通过设置不同浓度过氧化氢于培养液中，有利于基于多组实验结果以确定所需损伤模型对应的过氧化氢浓度，从而便于后续为构建所需模型提供相应的过氧化氢浓度，便于所需模型的成功构建。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：为了更好地研究盆腔自主神经损伤引起的勃起功能障碍以及为神经损伤性ED患者研制更好的治疗方法，本申请利用成年SD大鼠盆腔神经节(Major pelvic ganglion，MPG)进行体外培养，以确认适于培养盆腔神经节的1640培养基，并获得成功的盆腔神经节体外培养模型；确定构建体外培养模型成功后，本申请文件还使用多种浓度过氧化氢处理分离出的盆腔神经节，通过过氧化氢氧化应激损伤盆腔神经节，依据损伤程度筛选所需盆腔神经节体外损伤模型并确认对应过氧化氢浓度，具体地，筛选能贴切地模拟人体神经损伤性勃起功能障碍的体外盆腔神经节损伤模型。本申请构建方法简单、成本低、易于操作，对实验室硬件要求低，使该模型的构建以及相应神经损伤性ED发病机制、治疗策略的研究更易实现，克服现有技术缺乏适宜动物模型以研究的缺陷，从而及时发现相应的治疗措施，改善神经损伤性ED病症，尤其是直肠癌术后神经损伤性ED。
附图说明
图1显示大鼠体内盆腔神经节。
图2显示MPG体外培养时外围神经丝生长(一)。
图3显示MPG体外培养时外围神经丝生长(二)。
图4显示MPG体外培养时外围神经丝生长(三)。
图5显示神经丝蛋白NF-H免疫荧光染色。
图6显示氧化应激损伤后的MPG免疫组化结果(一)。
图7显示氧化应激损伤后的MPG免疫组化结果(二)。
图8显示氧化应激损伤后的MPG免疫组化结果(三)。
图9显示氧化应激损伤后的MPG免疫组化分数统计。
图10显示氧化应激损伤后MPG外围神经丝生长(一)。
图11显示氧化应激损伤后MPG外围神经丝生长(二)。
图12显示氧化应激损伤后MPG外围神经丝生长(三)。
图13显示各组氧化应激损伤后MPG外围神经丝长度统计(一)。
图14显示各组氧化应激损伤后MPG外围神经丝长度统计(二)。
图15显示氧化应激损伤实验组、对照组统计。
图16显示氧化应激损伤后MPG神经因子BDNF浓度。
图17显示氧化应激损伤后MPG神经因子NGF浓度。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。
以下实施例中涉及的材料包括：经检疫合格的SD大鼠、10％水合氯醛(Leagene)、24孔板、过氧化氢(Sigma)、基底胶(碧迪)、S100β抗体(Abcam)、1％青霉素-链霉素(Gibco)、1640培养基(Gibco)、BDNF神经营养因子Elisa试剂盒(酶免)、NGF神经营养因子Elisa试剂盒(酶)。
实施例1
一、成年SD大鼠MPG取材
200g成年SD大鼠用10％的水合氯醛腹腔麻醉后，备皮，在无菌条件下，下腹部正中切口，下置耻骨上缘，切口长度约4-5cm，逐层解剖进腹。显露出膀胱以及前列腺，在前列腺背侧叶表面寻找，以精囊腺发出输精管的位置作为标志，可找到一处白色半透明斑块，并向周围分支发出，如图1所示，即为盆腔神经节。
迅速取出双侧MPG，并将MPG于1％的青霉素-链霉素的PBS中漂洗3次，每次1分钟。
二、构建MPG体外培养模型
选用营养较为充分的1640培养基作为MPG的培养液，将取出的MPG经过漂洗步骤后，于24孔板中贴壁5分钟，之后进行如下①、②不同处理，以鉴定MPG体外培养是否成功：
①将基底胶与1640培养基按照1：2比例混合制成特定的MPG组织培养液。
将MPG置于200μL含有基底胶和组织培养液的24孔板中，37℃恒温箱培养3至4天后，于倒置显微镜下观察MPG周围神经丝生长情况；
②将MPG置于含有200μL纯1640培养基的24孔板中，37℃恒温箱培养1周，每2天换一次培养液。
三、构建MPG体外培养模型的结果与分析
①将MPG置于1640培养基与基底胶混合的培养液中，培养3-4天之后，我们在高倍显微镜下，发现MPG外围有神经丝的生长，如图2、3所示，MPG的生长状况表明：1640培养基适宜作为MPG的体外培养基。
②将MPG置于1640培养基中培养，1周后可在高倍显微镜下可见MPG神经珠外围有细胞生长，呈不规则梭形，胞体逐渐由细变粗，如图4所示；
本发明人通过观察捕捉到了这类细胞在MPG旁边生长的图片，于是对该类细胞进行鉴定，本发明人使用神经丝蛋白NF-H免疫荧光染色，结果如图5所示，该类细胞能被NF-H神经丝蛋白抗体荧光染红色。该类细胞被认为是MPG分化出来的神经细胞。结合实验的操作结果，确认用1640培养基在24孔板上构建体外MPG培养模型成功。
由于MPG体外培养中，周围神经丝的生长一定程度上依赖于NGF、B27等神经营养因子，甚至需要Neurobasal(Gibco)类神经细胞系专用培养基，而本发明人通过大量相关研究后，最终选用营养成分较为全面的1640培养基作为MPG的培养环境对MPG进行培养，能很好的满足MPG所需培养条件。具体的，如上述实验结果所示，在经过72h培养后观察，在未加入NGF和B27的条件下，能够达到令人满意的培养效果。对于MPG体外培养模型而言，结合实验结果得知，本实施例用1640培养基在24孔板上构建MPG体外培养模型构建成功。
实施例2
一、成年SD大鼠MPG取材
过程与实施例1中MPG取材及处理相同。
二、构建过氧化氢氧化应激损伤MPG模型
(一)MPG取材后干预处理
分别往1640培养基中加入不同剂量的3％过氧化氢，配置成含有过氧化氢浓度分别为0，100μM，200μM，300μM，400μM，500μM的组织培养液，以通过六个不同梯度浓度的过氧化氢对体外MPG进行氧化应激损伤。
将刚从成年大鼠取出的MPG进行漂洗后置于24孔板中，贴壁5分钟后，将MPG置于200μL含有不同浓度的过氧化氢组织培养液中37℃恒温箱培养12小时。
(二)MPG干预培养后进一步处理
(1)免疫组化检测：
将经过12小时含不同浓度过氧化氢培养的MPG于1％的青霉素-链霉素的PBS中漂洗3次，每次1分钟，然后分别置于甲醇中固定组织后，行S100β抗体免疫组化染色。
(2)外围神经丝生长检测：
MPG经过氧化氢氧化应激损伤处理12h后，将基底胶与1640培养基按照1：2比例混合制成MPG组织培养液。
将经过12小时含不同浓度过氧化氢培养的MPG于1％的青霉素-链霉素的PBS中漂洗3次，每次1分钟，然后分别置于200μL含有基底胶和组织培养液的24孔板中，37℃恒温箱培养72小时后，于倒置显微镜下观察MPG周围神经丝生长情况。
(3)盆腔神经节神经因子ELISA检测：
将经过12小时含不同浓度过氧化氢培养的MPG上清培养液进行收集后，选用酶免公司生产的Elisa试剂盒，按说明书提示，测定BDNF与NGF这两个神经营养因子的含量，进行定量分析。
三、构建过氧化氢氧化应激损伤MPG模型的结果与分析
(一)免疫组化检测结果如下：
氧化应激损伤后，MPG免疫组化结果如图6、7、8，将收集好的免疫组化图片通过免疫分数进行统计分析，可得条形统计图9；进行T检验后，可得P<0.01，即统计有意义，据此，表明：在0至500μM浓度范围内，随着过氧化氢浓度增加，MPG组织中的神经蛋白成分逐渐衰减，即损伤程度越来越严重。
(二)外围神经丝生长检测结果如下：
MPG经过氧化氢氧化应激损伤12h后，神经丝生长情况如10、11、12所示。当用500μM的过氧化氢干预损伤MPG 12h后，铺胶状态下的神经丝，基本上没有生长。此时500μM的过氧化氢浓度太高，损伤MPG的程度较大。
进一步地，整理神经丝长度的数据可得图13；采用均数和标准差对上述资料进行统计学描述如图14；
利用SPSS25软件进行正态性及方差齐性检验后，数据可作为单因素方差分析进行统计处理；发现实验组与对照组均有统计学差异，进行方差分析结果如图15示：F＝100.163，P<0.05；经Dunnett-t检验后，可认为在0至400μM的浓度范围内，随着过氧化氢浓度增强，MPG周围神经丝的长度逐渐生长缓慢。在500μM过氧化氢浓度下的1640培养基中，MPG周围神经丝停止生长。
(三)盆腔神经节神经因子ELISA检测结果如下：
由Elisa测定BDNF的结果，可得标准样本测量得出曲线公式：Y＝-0.6294+91.6170X，r＝0.9985(Y代表浓度，X代表吸光度)；经过计算可得不同过氧化氢浓度作用下，BDNF的浓度不同，如16所示；
由Elisa测定NGF的结果，可得标准样本测量得出曲线公式：Y＝3.6592+306.2492X，r＝0.9970(Y代表浓度，X代表吸光度)；经过计算可得不同过氧化氢浓度作用下，NGF的浓度不同，如17所示；
从BDNF和NGF的Elisa结果可知，随着损伤破坏的过氧化氢浓度加强，MPG中BDNF、NGF这两种神经因子的含量也逐渐降低，即MPG的损伤程度随着过氧化氢加强而严重。
四、确认最终所需盆腔神经节损伤模型及相应诱导所需过氧化氢浓度
具体的，上述三个检测过程中，免疫组化结果显示，在0至500μM范围内，随着浓度升高，组织切片免疫评分逐渐下降，即MPG免疫组化中神经蛋白成分逐渐减少，说明MPG受过氧化氢干预的损伤逐渐增强。在300μM之后，组织切片提示MPG组织逐渐呈松散，组织轮廓、边界不清；其中，400μM和500μM的过氧化氢浓度下，组织模糊的情况更加明显，破坏程度更为严重。
脑源性神经营养因子(BDNF)在神经系统发育和功能维持扮演重要角色；神经生长因子(NGF)在神经细胞、神经组织中可以促进分化、生长、存活。本发明人选用BDNF和NGF作为组织培养液的两个客观观察指标。Elisa结果显示，在1640培养基中，神经营养因子NGF与BDNF的含量较多，过氧化氢对于MPG神经因子的旁分泌具有抑制作用，随着过氧化氢浓度的增加，MPG的BDNF、NGF这两种神经因子分泌情况受抑制状况逐渐加强。
结合免疫组化、神经丝长度生长情况、Elisa结果，为了保持MPG损伤同时兼具基本功能的前提下，确定200μM为最适宜的损伤MPG浓度。通过上述过程能够建立成功所需的盆腔神经节损伤模型，而在现有技术结直肠癌发病率和死亡率居高不下、治疗手术难免造成盆腔神经损伤致使勃起功能障碍的情况下，通过本申请建立的过氧化氢损伤MPG模型，有助于为神经损伤性勃起功能障碍病症的临床研究带来一些全新思路以及科学依据。通过本申请的盆腔神经节体外培养模型、损伤模型，对推动神经损伤性勃起功能障碍的机制研究、治疗，具有重要意义。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.盆腔神经节损伤模型的构建方法，其特征在于，采用过氧化氢诱导组织培养液中的盆腔神经节。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，过氧化氢浓度终浓度为0.1μM～500μM。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，具体包括步骤：
S1、从实验动物体内分离出盆腔神经节；
S2、将盆腔神经节置于含有过氧化氢的组织培养液中培养；
S3、检测盆腔神经节损伤程度以获取构建成功的盆腔神经节损伤模型。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤S3检测包括：盆腔神经节外围神经丝生长检测、盆腔神经节中神经蛋白的免疫组化检测和/或盆腔神经节神经因子的分泌检测。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，组织培养液含有1640培养基；或，组织培养液含有1640培养基和基底胶。
6.由权利要求1～5任一项所述构建方法构建形成的盆腔神经节损伤模型。
7.盆腔神经节体外培养模型的构建方法，其特征在于，具体包括步骤：
S1、从实验动物体内分离出盆腔神经节；
S2、将盆腔神经节置于组织培养液中培养；
S3、检测盆腔神经节外围神经丝生长，获得外围神经丝生长良好的盆腔神经节体外培养模型。
8.由权利要求7所述构建方法构建的盆腔神经节体外培养模型。
9.权利要求6所述盆腔神经节损伤模型或权利要求8所述盆腔神经节体外培养模型在神经损伤性勃起功能障碍治疗药物筛选、盆腔神经损伤相关病症治疗药物筛选、盆腔神经损伤相关病症发病机制研究模型中的应用。
10.筛选构建盆腔神经节损伤模型所需过氧化氢浓度的方法，其特征在于，具体包括步骤：
S1、从实验动物体内分离出盆腔神经节；
S2、将盆腔神经节分别置于含有不同浓度过氧化氢的组织培养液中培养；
S3、检测盆腔神经节损伤程度，依据盆腔神经节损伤程度确定用于构建盆腔神经节损伤模型的过氧化氢浓度。
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