CN113831568A - 多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶及其制备方法和应用，制备方法包括以下步骤：(1)将海藻酸钠和丙烯酰胺加入去离子水中，并加热使海藻酸钠完全溶解，得到溶液A；(2)将碱性磷酸酶水溶液和溶液A混合，搅拌后加入甲叉双丙烯酰胺水溶液和加速剂，继续搅拌，然后加入引发剂，继续搅拌，最后经除气处理后将其转移至模具中，于封闭条件下烘干形成固态水凝胶；(3)将固态水凝胶浸泡于离子溶液中过夜，然后取出浸泡于甘油磷酸钙矿化溶液中，于避光条件下进行矿化，制得多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶。本发明制得的水凝胶材料韧性好、力学强度优异，并且具有较好的成骨生物活性。

Description

多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医学材料技术领域，具体涉及一种多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
在生物医学材料-骨组织工程领域中，水凝胶因其良好的生物相容性、生物降解性、可调节的物理化学性质以及与细胞外基质相似的多孔结构得到了广泛的研究。但是传统多糖水凝胶和合成水凝胶的强度无法在新骨再生之前起到日常生活中缓冲应力的作用，用于骨组织工程的水凝胶应具有高弹性模量，足够的韧性，在生理条件下具有出色的溶胀稳定性，以支撑骨骼承受的载荷，以及一定生物活性，以促进新骨的生长。
研究人员开发了不同的方法来提高水凝胶的强度，其中一个重要途径就是在水凝胶网络中引入无机相进行杂化：如在PEG-AMI中掺入线装HA，提升幅度为17％；在壳聚糖-PVA双网络水凝胶中引入nHA，使力学性能提升了67％。然而，这些直接引入无机相颗粒的方法往往会导致颗粒聚集，因而容易造成力学性能的不均匀性。
除了直接引入外，最近骨组织工程的一个趋势是开发具有矿化能力的复合水凝胶，常用方法有原位沉淀矿化、生物玻璃矿化和模拟体液仿生矿化、酶诱导矿化等。如通过原位沉淀矿化，使P-A-V复合材料的压缩模量分别达到11.5MPa，提升率为105％；SA/F127Che-PEG通过生物玻璃矿化，使力学性能提升12.5％。这些矿化途径在一定程度上改善了无机相分布易产生团聚的问题也进一步改善了其力学性能。然而，上述增强手段对水凝胶材料力学性能提升幅度依然有待进一步提高。
酶诱导矿化是通过将碱性磷酸酶(ALP)包埋在PHEA/TEG、PDMA/TEG和PAAm/MBAm水凝胶中，在矿化液中矿化后，使压缩模量得到大幅度的提升。然而，这三种酶诱导矿化得到水凝胶的断裂伸长率分别为1％、3％和17％，就临床应用的标准而言，在韧性方面还存在着拉伸率较小的问题，限制了其在骨组织工程领域的应用。
为了提高水凝胶的韧性，有研究通过将一个刚性、交联度较高PAMPS化学网络和一个柔性的PAM中性网络互穿构成双网络水凝胶。这种短链耗散能量、长链保持弹性的增韧设计思路被广泛用于制备增韧水凝胶。在同样的理论基础上，将海藻酸钠(SA)和聚丙烯酰胺(PAM)结合，分别使用离子交联和共价交联研制出一种具有优秀拉伸性能的超强韧性。然而，SA-PAM水凝胶拥有高达2000％的溶胀率，不足200KPa的压缩杨氏模量，说明它有低稳定性和低强度的缺点。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶及其制备方法和应用，能够在大幅度提升原始水凝胶的低压缩强度和低溶胀稳定性的同时，解决现有矿化水凝胶脆性高，且缺乏成骨生物活性的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将海藻酸钠和丙烯酰胺加入去离子水中，并加热使海藻酸钠完全溶解，得到溶液A；
(2)将碱性磷酸酶水溶液和溶液A混合，搅拌10-60min后加入甲叉双丙烯酰胺水溶液和加速剂，继续搅拌0.5-2.5h，然后加入引发剂，继续搅拌5-15min，停止搅拌，最后经除气处理后将其转移至模具中，于封闭条件下烘干形成固态水凝胶；
(3)将固态水凝胶浸泡于离子溶液中过夜，然后取出浸泡于甘油磷酸钙矿化溶液中，于避光条件下进行矿化，每隔12-48h换一次矿化液，共矿化12h-7d，制得多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶。
本发明的有益效果为：本发明结合了海藻酸钠/聚丙烯酰胺双网络交联增韧和酶诱导矿化增强两种手段，设计出了“化学交联-离子交联-酶诱导矿化”的材料制备流程，化学交联、离子交联和酶诱导矿化过程这三个过程的顺序不能改变。本发明中的化学交联过程，是把化学试剂依次滴加在前驱体溶液里面，混匀后静置一段时间，让其中的丙烯酰胺单体首先形成网络结构，此时，海藻酸钠组分虽然还是单体形式，但是前驱体溶液已经形成凝胶态了。离子交联过程，是将化学交联后所得的凝胶浸泡在离子溶液中，海藻酸钠单体间通过形成的离子键而互相连接，形成海藻酸钠的网络结构，此时构成了具有强韧性和独特力学耗散性双网络结构。如果将化学交联和离子交联的顺序互换，即第一步将前驱体溶液倒在离子溶液里面的话，由于交联是一个很缓慢的过程，在成胶之前，前驱体就溶解了，而各原料的浓度就被稀释，前驱体力的丙烯酰胺单体也会扩散溶进离子溶液，这样就无法合成所需要的SA-PAM双网络原始水凝胶。而酶诱导矿化过程，是靠分布在已经成胶的水凝胶网络里的碱性磷酸酶分解矿化缓冲液中的甘油磷酸钙，使之形核并沉积在网络之间达到矿化效果的，所以必须先成胶即先通过化学交联-离子交联得到原始水凝胶，再矿化。
化学交联-离子交联能够同时兼顾微量元素的引入和双网络增韧，通过离子交联引入微量元素既是合成刚性网络的手段，也是材料促进成骨的前提。本身同时还协同酶诱导矿化提升材料的强度，首先将酶均匀分散到原始水凝胶内部，在矿化液中浸泡时，它能从内外一起沉积矿化相。原位沉积是直接将材料放在矿化溶液中浸泡，但这种矿化过程是从表面慢慢向里渗透，而当表面致密化之后，矿化物质就难以继续进入，这就造成外面形成一层矿化硬壳，而里面还是软的水凝胶。本申请的酶诱导矿化与原位沉积相比，能够均匀的使凝胶从外到内形成矿化相。
碱性磷酸酶ALP是一种同源二聚体酶，其结构位点上含有三种金属离子，两种锌和一种镁，金属离子可与海藻酸钠单体中的羧基结合，通过酶诱导矿化形成均匀弥散的矿化相，所以碱性磷酸酶ALP能够在双网络凝胶中更加牢固且分布均匀；同时加入离子溶液，离子可以促进酶诱导矿化，可以更大幅度提升水凝胶的强度和韧性。
此外，当材料与细胞共培养过程中，能够释放离子，离子与材料的无机矿化相成分以及力学微环境协同提高细胞的粘附、增殖与分化能力如向成骨细胞方向分化的能力。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，步骤(1)中海藻酸钠和丙烯酰胺的质量比为1:4-1:10。
进一步地，步骤(1)溶液A中去离子水的重量为80-90％。
进一步，步骤(2)中碱性磷酸酶水溶液和溶液A混合后碱性磷酸酶的浓度为1-3mg/mL、，甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺的质量比为0.0004:1-0.0007:1，、加速剂与丙烯酰胺的质量比为0.002:1-0.003:1，、引发剂与丙烯酰胺的质量比为0.002:1-0.0035:1。
进一步，步骤(2)中加速剂为四甲基乙二胺。
进一步，步骤(2)中引发剂为过硫酸铵。
进一步，步骤(3)中离子溶液为钙、锌或锶的盐溶液。
进一步，步骤(3)中离子溶液的浓度为0.05-0.2M。
进一步，步骤(3)中甘油磷酸钙矿化溶液的浓度为0.025-0.1M。
进一步，步骤(3)中矿化过程中在第一天每隔12h换一次矿化液，从第2天开始每天换一次矿化液，共矿化7天。
上述制得的多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶在骨组织工程领域中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明将离子元素如钙、锌、锶通过离子交联方式分布添加到具有韧性的SA-PAM双网络水凝胶中，再通过酶诱导矿化的方法增强其强度，将双网络增韧和酶诱导矿化强化结合起来。并且离子交联和酶诱导矿化存在协同作用，离子交联显著促进了酶诱导矿化，使原始水凝胶的力学性能得到大幅提升，并且离子的引入可以使矿化相均匀、弥散地分布，最终形成综合强度与韧性，同时兼具成骨作用的矿化水凝胶材料，在骨组织工程领域具有巨大的研究价值和临床应潜力。
本发明制得的多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶材料具有优异的综合力学性能，Ca-HAp、Zn-HAp和Sr-HAp经DMA动态机械分析结果显示其压缩杨氏模量分别达到2675KPa、5853KPa和17283KPa,其中工艺制备流程让Sr基体材料压缩力学性能提高的幅度达到3600％，超过现有的矿化手段。在满足高强度力学性能的同时，也兼顾了韧性，断裂伸长率达到140％、123％和84％，超过现有矿化水凝胶。溶胀率为4.93、2.99和2.39，其中Sr-HAp溶胀稳定性达到现有技术中较高水平。
附图说明
图1为本发明实施例1中矿化水凝胶材料的制备工艺简易流程图。
图2为本发明实施例1中Sr、Zn、Ca、Sr-HAp、Zn-HAp、Ca-HAp六种水凝胶的红外光谱图。
图3为本发明实施例1中Sr、Zn、Ca、Sr-HAp、Zn-HAp、Ca-HAp六种水凝胶的X射线衍射图。
图4为本发明实施例1中Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp三种矿化水凝胶的表面放大10000倍的扫描电镜微观形貌图及其对应的表面X射线能谱分析图。
图5为本发明实施例1中Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp三种矿化水凝胶截面的扫描电镜放大5000和10000倍的图。
图6为本发明实施例1中Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp三种矿化水凝胶的TGA热重分析图谱。
图7为本发明实施例1中Ca、Zn、Sr、Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp的孔隙率对比图。
图8为本发明实施例1中Ca、Zn、Sr、Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp的综合力学性能对比图。
图9为本发明实施例1中Ca、Zn、Sr、Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp于37℃条件下在PBS中(磷酸盐平衡生理盐水)溶胀实验图。
图10为本发明实施例1中Ca、Ca-HAp、Sr、Sr-HAp、Zn、Zn-HAp六组材料的生物相容性实验图。
图11为本发明实施例1中Ca、Ca-HAp、Sr、Sr-HAp、Zn、Zn-HAp六组材料的MSCs成骨蛋白表达测试结果。
具体实施方式
以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：
1、用Ca2+、Zn2+、Sr2+交联的未矿化原始SA-PAM水凝胶的制备
(1)准确称量2g海藻酸钠(SA，购自科隆)与12g丙烯酰胺(AM，购自Sigma)，量取80mL的去离子水于烧杯中，将AM溶于去离子水后，加入SA，将烧杯放置于恒温水浴搅拌器上，以45℃加热过夜至SA完全溶解，记为溶液A。
(2)配制MBA和APS母液：准确称量0.1g的MBA(甲叉双丙烯酰胺，购自Sigma)粉末溶于5mL去离子水中；称量0.1g的APS(过硫酸铵，购自Sigma)粉末溶于1mL的去离子水中。将配制好的两种母液于室温中避光保存，分别记为溶液B(MBA)和溶液C(APS)。
(3)在37℃恒温水浴搅拌的条件下，在溶液A中加入0.36mL的溶液B与30μL的TMEDA(四甲基乙二胺，购自Sigma)，继续搅拌1h；然后加入0.5mL的溶液C，继续搅拌10min，停止搅拌；将烧杯里的混合溶液做除气处理后转移至模具中，封闭后放置于37℃烘箱中6h至AM形成网络结构。
(4)配置摩尔分数均为0.1M的CaCl2、ZnCl2、SrCl2·6H2O溶液各1L于烧杯中，将模具中凝固状态的水凝胶取出，分为三组分别浸泡于不同的离子溶液中过夜，至SA形成网络结构，得到SA(Ca2+)-PAM水凝胶(记为Ca)、SA(Zn2+)-PAM水凝胶(记为Zn)、SA(Sr2+)-PAM水凝胶(记为Sr)。
2、多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶材料的制备
(1)准确称量2g海藻酸钠(SA，购自科隆)与12g丙烯酰胺(AM，购自Sigma)，量取80mL的去离子水于烧杯中，将AM溶于去离子水后，加入SA，将烧杯放置于恒温水浴搅拌器上，以45℃加热过夜至SA完全溶解，记为溶液A。
(2)配制MBA和APS母液：准确称量0.1g的MBA(甲叉双丙烯酰胺，购自Sigma)粉末溶于5mL去离子水中；称量0.1g的APS(过硫酸铵，购自Sigma)粉末溶于1mL的去离子水中。将配制好的两种母液于室温中避光保存，分别记为溶液B(MBA)和溶液C(APS)。
(3)称取200mg的ALP(碱性磷酸酶，购自Sigma)倒入装有6mL去离子水的离心管中，超声溶解30min，记为溶液D。
(4)在37℃恒温水浴搅拌的条件下，将完全溶解的溶液D加入溶液A中，搅拌30min后加入0.36mL的溶液B与30μL的TMEDA(四甲基乙二胺，购自Sigma)，继续搅拌1h；然后加入0.5mL的溶液C，继续搅拌10min，停止搅拌；将烧杯里的混合溶液做除气处理后转移至模具中，封闭后放置于37℃烘箱中6h至AM形成网络结构。
(5)配置摩尔分数均为0.1M的CaCl2、ZnCl2、SrCl2·6H2O溶液各1L于烧杯中，将模具中凝固状态的水凝胶取出，分为三组分别浸泡于不同的离子溶液中过夜，至SA形成网络结构，得到SA-PAM-ALP水凝胶。
(6)配置TEA(三乙醇胺，购自科隆)缓冲液：将55mL TEA溶于2L去离子水中，用稀盐酸调pH值至9.8后转移至烧杯中避光储存。
(7)以11g/L的浓度，将甘油磷酸钙(购自Sigma)溶于TEA缓冲液中，得到0.05M的甘油磷酸钙矿化溶液(甘油磷酸钙即CaGP，分子量为212g/mol，11g甘油磷酸钙溶解在1L的TEA缓冲液中，摩尔浓度为0.05M)，矿化溶液需现用现配。
(8)将SA-PAM-ALP水凝胶浸泡在CaGP矿化溶液中，于避光条件下进行矿化，在第1天每隔12h换一次矿化液，从第2天开始每天换一次矿化液，材料一共矿化七天，最终得到SA(Ca2+)-PAM-HAp矿化水凝胶(记为Ca-HAp)、SA(Zn2+)-PAM-HAp矿化水凝胶(记为Zn-HAp)、SA(Sr2+)-PAM-HAp矿化水凝胶(记为Sr-HAp)。
实施例2：
1、用Ca2+、Sr2+交联的未矿化SA-PAM水凝胶的制备
(1)准确称量1.5g海藻酸钠(SA，购自科隆)与13.5g丙烯酰胺(AM，购自Sigma)，量取70mL的去离子水于烧杯中，将AM溶于去离子水后，加入SA，将烧杯放置于恒温水浴搅拌器上，以37℃加热过夜至SA完全溶解，记为溶液A。
(2)配制MBA和APS母液：准确称量0.15g的MBA(甲叉双丙烯酰胺，购自Sigma)粉末溶于5mL去离子水中；称量0.15g的APS(过硫酸铵，购自Sigma)粉末溶于1mL的去离子水中。将配制好的两种母液于室温中避光保存，分别记为溶液B(MBA)和溶液C(APS)。
(3)在37℃恒温水浴搅拌的条件下，在溶液A中加入0.5mL的溶液B与30μL的TMEDA(四甲基乙二胺，购自Sigma)，继续搅拌2h；然后加入0.5mL的溶液C，继续搅拌20min，停止搅拌；将烧杯里的混合溶液做除气处理后转移至模具中，封闭后放置于37℃烘箱中4h至AM形成网络结构。
(4)配置摩尔分数均为0.1M的CaCl2、SrCl2·6H2O溶液各1L于烧杯中，将模具中凝固状态的水凝胶取出，分为三组分别浸泡于不同的离子溶液中过夜，至SA形成网络结构，得到SA(Ca2+)-PAM水凝胶(记为Ca)、SA(Sr2+)-PAM水凝胶(记为Sr)。
2、多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶材料的制备
(1)准确称量1.5g海藻酸钠(SA，购自科隆)与13.5g丙烯酰胺(AM，购自Sigma)，量取70mL的去离子水于烧杯中，将AM溶于去离子水后，加入SA，将烧杯放置于恒温水浴搅拌器上，以37℃加热过夜至SA完全溶解，记为溶液A。
(2)配制MBA和APS母液：准确称量0.15g的MBA(甲叉双丙烯酰胺，购自Sigma)粉末溶于5mL去离子水中；称量0.15g的APS(过硫酸铵，购自Sigma)粉末溶于1mL的去离子水中。将配制好的两种母液于室温中避光保存，分别记为溶液B(MBA)和溶液C(APS)。
(3)称取200mg的ALP(碱性磷酸酶，购自Sigma)倒入装有6mL去离子水的离心管中，超声溶解30min，记为溶液D。
(4)在37℃恒温水浴搅拌的条件下，将完全溶解的溶液D加入溶液A中，搅拌30min后加入0.5mL的溶液B与30μL的TMEDA(四甲基乙二胺，购自Sigma)，继续搅拌2h；然后加入0.5mL的溶液C，继续搅拌20min，停止搅拌；将烧杯里的混合溶液做除气处理后转移至模具中，封闭后放置于37℃烘箱中4h至AM形成网络结构。
(5)配置摩尔分数均为0.1M的CaCl2、SrCl2·6H2O溶液各1L于烧杯中，将模具中凝固状态的水凝胶取出，分为三组分别浸泡于不同的离子溶液中过夜，至SA形成网络结构。
(6)配置TEA(三乙醇胺，购自科隆)缓冲液：将40mL TEA溶于2L去离子水中，用稀盐酸调pH值至10后转移至烧杯中避光储存。
(7)以5.5g/L的浓度，将甘油磷酸钙(购自Sigma)溶于TEA缓冲液中，得到0.025M的甘油磷酸钙矿化溶液(甘油磷酸钙即CaGP，分子量为212g/mol，5.5g甘油磷酸钙溶解在1L的TEA缓冲液中，摩尔浓度为0.025M)，矿化溶液需现用现配。
(8)将SA-PAM-ALP水凝胶浸泡在CaGP矿化溶液中，于避光条件下进行矿化，每天换一次矿化液，材料一共矿化七天，最终得到SA(Ca2+)-PAM-HAp矿化水凝胶(记为Ca-HAp)、SA(Sr2+)-PAM-HAp矿化水凝胶(记为Sr-HAp)。
实施例3：
1、用Ca2+、Zn2+、Sr2+交联的未矿化SA-PAM水凝胶的制备
(1)准确称量3g海藻酸钠(SA，购自科隆)与12g丙烯酰胺(AM，购自Sigma)，量取80mL的去离子水于烧杯中，将AM溶于去离子水后，加入SA，将烧杯放置于恒温水浴搅拌器上，以37℃加热过夜至SA完全溶解，记为溶液A。
(2)配制MBA和APS母液：准确称量0.1g的MBA(甲叉双丙烯酰胺，购自Sigma)粉末溶于5mL去离子水中；称量0.1g的APS(过硫酸铵，购自Sigma)粉末溶于1mL的去离子水中。将配制好的两种母液于室温中避光保存，分别记为溶液B(MBA)和溶液C(APS)。
(3)在37℃恒温水浴搅拌的条件下，在溶液A中加入0.36mL的溶液B与30μL的TMEDA(四甲基乙二胺购自Sigma)，继续搅拌2h；然后加入0.5mL的溶液C，继续搅拌30min，停止搅拌；将烧杯里的混合溶液做除气处理后转移至模具中，封闭后放置于37℃烘箱中6h至AM形成网络结构。
(4)配置摩尔分数均为0.2M的CaCl2、ZnCl2、SrCl2·6H2O溶液各1L于烧杯中，将模具中凝固状态的水凝胶取出，分为三组分别浸泡于不同的离子溶液中过夜，至SA形成网络结构，得到SA(Ca2+)-PAM水凝胶(记为Ca)、SA(Zn2+)-PAM水凝胶(记为Zn)、SA(Sr2+)-PAM水凝胶(记为Sr)。
2、多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶材料的制备
(1)准确称量3g海藻酸钠(SA，购自科隆)与12g丙烯酰胺(AM，购自Sigma)，量取80mL的去离子水于烧杯中，将AM溶于去离子水后，加入SA，将烧杯放置于恒温水浴搅拌器上，以37℃加热过夜至SA完全溶解，记为溶液A。
(2)配制MBA和APS母液：准确称量0.1g的MBA(甲叉双丙烯酰胺，购自Sigma)粉末溶于5mL去离子水中；称量0.1g的APS(过硫酸铵，购自Sigma)粉末溶于1mL的去离子水中。将配制好的两种母液于室温中避光保存，分别记为溶液B(MBA)和溶液C(APS)。
(3)称取300mg的ALP(碱性磷酸酶,购自Sigma)倒入装有6mL去离子水的离心管中，超声溶解20min，记为溶液D。
(4)在37℃恒温水浴搅拌的条件下，将完全溶解的溶液D加入溶液A中，搅拌30min后加入0.36mL的溶液B与30μL的TMEDA(四甲基乙二胺，购自Sigma)，继续搅拌2h；然后加入0.5mL的溶液C，继续搅拌30min，停止搅拌；将烧杯里的混合溶液做除气处理后转移至模具中，封闭后放置于37℃烘箱中6h至AM形成网络结构。
(5)配置摩尔分数均为0.2M的CaCl2、ZnCl2、SrCl2·6H2O溶液各1L于烧杯中，将模具中凝固状态的水凝胶取出，分为三组分别浸泡于不同的离子溶液中过夜，至SA形成网络结构。
(6)配置TEA(三乙醇胺，购自科隆)缓冲液：将60mL TEA溶于2L去离子水中，用稀盐酸调pH值至9.5后转移至烧杯中避光储存。
(7)以16.5g/L的浓度，将甘油磷酸钙(购自Sigma)溶于TEA缓冲液中，得到0.075M的甘油磷酸钙矿化溶液(甘油磷酸钙即CaGP，分子量为212g/mol，16.5g甘油磷酸钙溶解在1L的TEA缓冲液中，摩尔浓度为0.075M)，矿化溶液需现用现配。
(8)将SA-PAM-ALP水凝胶浸泡在CaGP矿化溶液中，于避光条件下进行矿化，每天换一次矿化液，材料一共矿化七天，最终得到SA(Ca2+)-PAM-HAp矿化水凝胶(记为Ca-HAp)、SA(Zn2+)-PAM-HAp矿化水凝胶(记为Zn-HAp)、SA(Sr2+)-PAM-HAp矿化水凝胶(记为Sr-HAp)。
实施例4：
1、用Ca2+、Zn2+、Sr2+交联的未矿化SA-PAM水凝胶的制备
(1)准确称量1.2g海藻酸钠(SA，购自科隆)与12g丙烯酰胺(AM，购自Sigma)，量取80mL的去离子水于烧杯中，将AM溶于去离子水后，加入SA，将烧杯放置于恒温水浴搅拌器上，以40℃加热过夜至SA完全溶解，记为溶液A。
(2)配制MBA和APS母液：准确称量0.1g的MBA(甲叉双丙烯酰胺，购自Sigma)粉末溶于5mL去离子水中；称量0.1g的APS(过硫酸铵，购自Sigma)粉末溶于1mL的去离子水中。将配制好的两种母液于室温中避光保存，分别记为溶液B(MBA)和溶液C(APS)。
(3)在40℃恒温水浴搅拌的条件下，在溶液A中加入0.36mL的溶液B与30μL的TMEDA(四甲基乙二胺，购自Sigma)，继续搅拌2h；然后加入0.5mL的溶液C，继续搅拌30min，停止搅拌；将烧杯里的混合溶液做除气处理后转移至模具中，封闭后放置于40℃烘箱中5h至AM形成网络结构。
(4)配置摩尔分数均为0.1M的CaCl2、ZnCl2、SrCl2·6H2O溶液各1L于烧杯中，将模具中凝固状态的水凝胶取出，分为三组分别浸泡于不同的离子溶液中过夜，至SA形成网络结构，得到SA(Ca2+)-PAM水凝胶(记为Ca)、SA(Zn2+)-PAM水凝胶(记为Zn)、SA(Sr2+)-PAM水凝胶(记为Sr)。
2、多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶材料的制备
(1)准确称量1.2g海藻酸钠(SA，购自科隆)与12g丙烯酰胺(AM，购自Sigma)，量取80mL的去离子水于烧杯中，将AM溶于去离子水后，加入SA，将烧杯放置于恒温水浴搅拌器上，以40℃加热过夜至SA完全溶解，记为溶液A。
(2)配制MBA和APS母液：准确称量0.1g的MBA(甲叉双丙烯酰胺，购自Sigma)粉末溶于5mL去离子水中；称量0.1g的APS(过硫酸铵，购自Sigma)粉末溶于1mL的去离子水中。将配制好的两种母液于室温中避光保存，分别记为溶液B(MBA)和溶液C(APS)。
(3)称取300mg的ALP(碱性磷酸酶，购自Sigma)倒入装有6mL去离子水的离心管中，超声溶解20min，记为溶液D。
(4)在40℃恒温水浴搅拌的条件下，将完全溶解的溶液D加入溶液A中，搅拌30min后加入0.36mL的溶液B与30μL的TMEDA(四甲基乙二胺，购自Sigma)，继续搅拌2h；然后加入0.5mL的溶液C，继续搅拌30min，停止搅拌；将烧杯里的混合溶液做除气处理后转移至模具中，封闭后放置于40℃烘箱中5h至AM形成网络结构。
(5)配置摩尔分数均为0.1M的CaCl2、ZnCl2、SrCl2·6H2O溶液各1L于烧杯中，将模具中凝固状态的水凝胶取出，分为三组分别浸泡于不同的离子溶液中过夜，至SA形成网络结构。
(6)配置TEA(三乙醇胺，购自科隆)缓冲液：将50mL TEA溶于2L去离子水中，用稀盐酸调pH值至10后转移至烧杯中避光储存。
(7)以11g/L的浓度，将甘油磷酸钙(购自Sigma)溶于TEA缓冲液中，得到0.05M的甘油磷酸钙矿化溶液(甘油磷酸钙即CaGP，分子量为212g/mol，11g甘油磷酸钙溶解在1L的TEA缓冲液中，摩尔浓度为0.05M)，矿化溶液需现用现配。
(8)将SA-PAM-ALP水凝胶浸泡在CaGP矿化溶液中，于避光条件下进行矿化，每天换一次矿化液，材料一共矿化五天，最终得到SA(Ca2+)-PAM-HAp矿化水凝胶(记为Ca-HAp)、SA(Zn2+)-PAM-HAp矿化水凝胶(记为Zn-HAp)、SA(Sr2+)-PAM-HAp矿化水凝胶(记为Sr-HAp)。
本发明实施例1-4制得的多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶材料具有相似的功能，现以实施例1为例，给出其具体分析，分析情况如下：
试验例1：成分与结构表征
1、本发明制备多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶材料的具体工艺流程图见图1，其中图1-1中纵线中较短的为AM，较长纵线为SA，连接两个AM的线为MBA，AM和SA相交处为式1所示的基团，SA和SA相交处为Ca2+/Zn2+/Sr2+，团状物质为ALP。
Figure BDA0003282887690000111
由图1可知，Sr、Zn、Ca材料的制备以及随后的酶诱导矿化中，ALP催化Ca-GP的分解、羟基磷灰石的形核、矿化相的堆积过程。
2、将按本发明实施例1中制备的材料Ca、Zn、Sr、Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp用去离子水洗净，利用冷冻干燥机干燥24h后在研磨皿中研磨成粉末，使用X射线衍射仪和FT-IR红外光谱仪进行成分分析，XRD结果如图2所示，FT-IR结果如图3所示。
图2a为Sr、Zn、Ca、Sr-HAp、Zn-HAp、Ca-HAp六种水凝胶的红外光谱图，1039cm-1和610cm-1的PO4 3-的特征峰对应羟基磷灰石的磷酸盐基团，通常，670cm-1处的特征峰被归因于碳羟磷灰石，证明有CaP矿化产物(羟基磷灰石)的生成。图2b为Sr、Zn、Ca在1400-1700cm-1波段的放大图谱，由图2b可知，Ca2+、Zn2+、Sr2+结合SA上的-COO-官能团，形成离子键，使-COO-反对称特征峰发生蓝移，对称吸收特征峰发生红移，使SA单体形成网络，并与PAM网络形成双网络结构，其中配位形成的键能越强，特征峰移动的位置相对越长。
图3a为Sr、Zn、Ca、Sr-HAp、Zn-HAp、Ca-HAp六种水凝胶的X射线衍射图，从图3a中可以看出Sr、Zn、Ca三种水凝胶没有明显的特征峰，这说明在未进行矿化时，其水凝胶为纯高分子成分不含具有晶体结构的物质；而Sr-HAp、Zn-HAp、Ca-HAp的特征曲线上有清晰的晶体衍射峰，以JCPDS#09-0432的羟基磷灰石的标准图谱作为参考，可以看出它们在2θ＝25.9°，32°，46.8和49.6°上分别有对应羟基磷灰石(002)，(211)，(222)，和(213)晶面的特征峰，以上结果证明Sr-HAp、Zn-HAp、Ca-HAp三种矿化水凝胶中矿化产物主要成分有羟基磷灰石。对比Sr-HAp、Zn-HAp、Ca-HAp三条特征曲线可以看出：Ca-HAp的特征峰更加突出，说明其晶体含量最高，而Sr-HAp、Zn-HAp的图谱显示出宽阔、弥散的特征峰，说明其成分中含有更多的无定形态物质。图3b-d分别为Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp的放大后的衍射曲线，图3b可以看出Ca-HAp含有微量TCP(磷酸三钙)的特征峰。图3c中可以看出Zn-HAp的成分中含有无定型磷酸盐和含锌的磷酸盐成分。图3d中可以看出Sr-HAp的无机相中含有不同种类的锶代羟基磷灰石成分。
3、将按本发明实施例1中制备的材料Ca、Zn、Sr、Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp用去离子水洗净，利用冷冻干燥机干燥24h后，使用场发射扫描电镜观察表面和截面微观形貌，并使用X射线能谱仪(EDS)对材料表面进行元素分析，EDS和表面形貌结果如图4、截面形貌如图5所示；使用溶液替代法测试样品的孔隙率，不同样品设三个平行样，孔隙率结果如图7所示。
由图4a可知，Ca-HAp表面已经被矿化产物所覆盖，可以看到直径在200-300纳米范围内的矿化颗粒的堆积情况EDS结果显示Ca:P比值为1.43；从图4b中可以看出Zn-HAp表面也覆盖着一层矿化产物，以及稀疏的矿化颗粒，但总体比Ca-HAp的表面要光滑一些，EDS结果显示Zn-HAp表面Ca:P比值为1.29；从图4c中可以看出Sr-HAp表面除了矿化层与矿化颗粒外，还分布着大小在500-1000纳米左右的椭圆矿化颗粒，EDS结果显示Sr-HAp表面Ca:P比值为1.34。纯的羟基磷灰石的Ca:P比值为1.67，因此以上结果可以说明除了羟基磷灰石外，这三种矿化水凝胶表面的成分存在差异，结合图3可以分析得出它们的矿化产物中含有不同种类的磷酸钙盐成分；EDS结果也显示出三种矿化水凝胶表面的成分均含有对应的离子成分，证明了矿化后微量元素离子在材料表面存在。
图5为Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp三种矿化水凝胶截面的扫描电镜放大5000和10000倍的图。由图5可知，Ca-HAp和Zn-HAp的矿化截面除了磷灰石纳米颗粒外，分布着500nm级别的微孔，Ca-HAp的结构较松散，Zn-HAp微孔分布较均匀、整齐一些，而Sr-HAp则可以看出是由磷灰石纳米颗粒堆成一层一层比较致密的结构，这种致密结构我们认为是压缩模量大幅度提升的重要原因。
图7a为Ca、Zn、Sr、Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp的孔隙率，图7b为其矿化前后孔隙率的对比图(每个柱形图上部分为矿化前，下部分为矿化后)，从图7a中可以看出，Sr的孔隙率最高，达到61％，其矿化材料Sr-HAp的孔隙率仅为27.3％。从图7b的对比情况可以看出，Sr在矿化成为Sr-HAp后，孔隙率下降程度最多，这表明Sr在酶诱导矿化后得到的矿化产物最多。一般来讲，孔隙率越高的水凝胶其物质透过性和物质交换率越高，而得益于Sr水凝胶更为致密强韧的网络结构(从力学性能和溶胀性能证明，详见图8与图9)，CaGP在被碱性磷酸酶分解的Ca2+和PO4 3-在进入网络后能被更有效地包裹在网络里然后逐渐沉积、形核、长大，导致矿化后的Sr-HAp有更多的矿化产物和更致密的矿化结构(详见图6和图5)。
4、利用TGA分析材料中的矿化相含量，将样品放入热重仪器的坩埚中，通氧气后，以10℃/min的升温速度从30℃上升到600℃，得到样品的失重曲线，TGA结果如图6所示。
由图6可知，在600℃之后，剩余的质量主要是无法分解的矿化产物，如前文分析得出的羟基磷灰石和磷酸钙盐。从它们的TGA曲线剩余质量可以看出，Sr-HAp的矿化产物最高，Zn-HAp略高于Ca-HAp，证明微量元素离子有促进酶诱导矿化、沉淀更多矿化产物的作用。
试验例2：综合力学性能、溶胀稳定性表征
1、将按本发明实施例1中制备的材料Ca、Zn、Sr、Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp用去离子水洗净后，用吸水纸擦去表面的水分，切割成实验要求的直径为14mm的圆片状(压缩)和20×8×2mm的长方形(拉伸)后使用动态热机械分析(DMA)测试它们在弹性范围内的压缩、拉伸杨氏模量和拉伸-断裂曲线，结果如图8所示。
图8a为Ca、Zn、Sr、Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp的压缩弹性模量的对比图，从图中可以看出，在经过酶诱导矿化后Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp的压缩强度分别提升了972％、2200％和3600％，其中Sr-HAp的压缩弹性模量达到17283KPa，是三种矿化水凝胶中最高的，其提升的幅度也是最高的，Zn-HAp、Sr-HAp的压缩强度以及其提升幅度均高于Ca-HAp，证明了微量元素离子对酶诱导矿化的促进作用，证明了本材料具有极强的压缩强度；图8b-d分别是本发明实施例1中Ca、Zn、Sr、Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp的拉伸弹性模量的对比图、Ca、Zn、Sr的弹性范围应力-应变曲线图、Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp的弹性范围应力-应变曲线图，从图中可以看出在经过酶诱导矿化后Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp的拉伸强度分别提升了1148％、1589％和1527％，证明酶诱导矿化对材料拉伸强度有相当大的提升，同时Zn-HAp、Sr-HAp的拉伸强度的提升幅度高于Ca-HAp，证明了微量元素离子对酶诱导矿化的促进作用，也展示出了本材料具有极强拉伸强度；图8e-f分别是本发明实施例1中Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp的应力-应变图和断裂伸长率(断裂应变)图，证明了Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp材料在经过酶诱导矿化后，依然具有良好的韧性，与前文提到的掺无机相或矿化材料相比，本材料具有更强的抵抗变形的能力。
2、将按本发明实施例1中制备的材料Ca、Zn、Sr、Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp用去离子水洗净，利用冷冻干燥机干燥24h后，每组取三个平行样浸泡于37℃的PBS中，在不同时间点取出，用吸水纸擦去表面水分后称重记录，计算相应时间的溶胀率和最后达到溶胀平衡时溶胀率，结果如图9所示。
图9a是本发明实施例1中Ca、Zn、Sr、Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp于37℃条件下在PBS中(磷酸盐平衡生理盐水)溶胀率随时间变化的曲线图，图9b为96h时Ca、Zn、Sr、Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp的平衡溶胀率。从图9a中可以看出，在20h时，材料几乎都已达到溶胀平衡，从图9b(每个柱形图上部分为矿化前，下部分为矿化后)中可以看出矿化前溶胀率的大小顺序为：Ca>Zn>Sr，疏松的网络利于水凝胶吸水，那么这个结果可以证明Sr和Zn的网络结构更为紧密；矿化后溶胀率大小顺序为Ca-HAp>Zn-HAo>Sr-HAp，在矿化后Ca-HAp的溶胀率下降77％，Zn-HAp下降84.2％，Sr-HAp下降86.1％，Sr-HAp材料较低的溶胀率代表了它的稳定性，使其适用于骨修复临床应用，不仅可以填充缺损部位，还可以防止水凝胶材料过度溢出造成的伤害。图9c为Ca、Zn、Sr、Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp材料在溶胀前后的宏观形貌对比图，可以看出矿化前的Ca、Zn、Sr材料在达到溶胀平衡后体积增大较明显，而矿化后Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp材料的体积变化微小，其中Sr-HAp材料几乎看不出体积变化，证明其溶胀稳定性极佳。
试验例3：体外细胞试验
1、将按本发明实施例1中制备的材料Ca、Zn、Sr、Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp在辐照灭菌后置于48孔板中，每孔接种2万的P2代MSCs细胞，在培养3天、5天、7天后，使用CCK-8检测细胞的增殖情况；使用FDA/PI染色观察细胞的存活、粘附、铺展情况，结果如图10所示。
图10a为使用CCK-8测试MSCs细胞在材料与孔板对照组上培养3、5、7天增殖情况的测试结果，从图中可以看出，矿化后的Ca-HAp和Sr-HAp材料的OD值都高于它们矿化前的Ca和Sr水凝胶，且随着时间增加，它们的OD值都比上一个时间点有所增加，说明酶诱导矿化提高了材料的生物相容性；在第7天时，Sr及其矿化组Sr-HAp的细胞增殖情况优于Ca和Ca-HAp材料，说明微量元素离子和矿化相结合，协同提高了材料的生物相容性。而Zn以及Zn-HAp上的细胞增殖情况不太理想，可能跟释放出的Zn离子浓度太高有关。图10b-g分别为MSCs接种于Ca、Ca-HAp、Zn、Zn-HAp、Sr、Sr-HAp材料表面共培养3天和7天的FDA/PI染色结果，该结果可以直接反映细胞在材料表面的粘附、铺展、增殖情况。从图10b可以看出，在第7天时，Ca上细胞数量较第3天时明显增多，但是细胞呈圆形，说明其粘附、铺展的情况不好，图10c中Ca-HAp上的细胞大部分呈梭形，数量也有所增加，说明矿化材料Ca-HAp表面细胞的粘附、铺展与增殖情况更好；从图10d可以看出，Sr材料表面的细胞的铺展、粘附情况也不太理想，而且出现了细胞团聚的现象，而矿化材料Sr-HAp较前者而言，其细胞的铺展、粘附与增殖情况都有很高的改善。图10f-e中Zn、Zn-HAp上共培养的细胞大多已死亡，这可能跟材料释放出的Zn2+浓度太高有关。六组材料的FDA/PI染色结果与CCK-8结果在趋势上基本一致，其中使用微量元素Sr2+交联和经过酶诱导矿化后的Sr-HAp材料展现出了最好的生物相容性。
2、将按本发明实施例1中制备的材料Ca、Zn、Sr、Ca-HAp、Zn-HAp、Sr-HAp在辐照灭菌后置于48孔板中，每孔接种2万的P2代MSCs细胞，在培养7天、14天后，收集蛋白，用Elisa试剂盒检测不同材料上细胞的OCN、COLⅡ蛋白分泌情况，结果如图11所示，其中每组柱状图中从左到右分别为Ca、Ca-HAp、Sr、Sr-HAp、Zn、Zn-Hap、对照组。
由图11可知，在材料表面共培养MSCs细胞，培养至第7天和第14天时，使用Elisa试剂盒检测成骨分化相关蛋白OCN和ColⅡ，OCN结果如图11a所示，ColⅡ结果如图11b所示，图11a-b的数据表明矿化材料Ca-HAp和Sr-HAp的促成骨分化性能普遍比矿化前的材料高，图11b的结果也说明了微量元素Sr2+也与矿化引入的矿化相共同促进了MSCs向成骨细胞方向的分化。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将海藻酸钠和丙烯酰胺加入去离子水中，并加热使海藻酸钠完全溶解，得到溶液A；
(2)将碱性磷酸酶水溶液和溶液A混合，搅拌10-60min后加入甲叉双丙烯酰胺水溶液和加速剂，继续搅拌0.5-2.5h，然后加入引发剂，继续搅拌5-15min，停止搅拌，最后经除气处理后将其转移至模具中，于封闭条件下烘干形成固态水凝胶；
(3)将固态水凝胶浸泡于离子溶液中过夜，然后取出浸泡于甘油磷酸钙矿化溶液中，于避光条件下进行矿化，每隔12-48h换一次矿化液，共矿化12h-7d，制得多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶。
2.根据权利要求1所述的多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中海藻酸钠和丙烯酰胺的质量比为1:4-1:10。
3.根据权利要求1所述的多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)溶液A中去离子水的重量为80-90％。
4.根据权利要求1所述的多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中碱性磷酸酶水溶液和溶液A混合后碱性磷酸酶的浓度为1-3mg/mL，甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺的质量比为0.0004:1-0.0007:1，加速剂与丙烯酰胺的质量比为0.002:1-0.003:1，引发剂与丙烯酰胺的质量比为0.002:1-0.0035:1。
5.根据权利要求1所述的多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中加速剂为四甲基乙二胺，引发剂为过硫酸铵。
6.根据权利要求1所述的多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中离子溶液为钙、锌或锶的盐溶液，离子溶液的浓度为0.05-0.2M。
7.根据权利要求1所述的多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中甘油磷酸钙矿化溶液的浓度为0.025-0.1M。
8.根据权利要求1所述的多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中矿化过程中在第一天每隔12h换一次矿化液，从第2天开始每天换一次矿化液，共矿化7天。
9.采用权利要求1-8任一项所述的方法制得的多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶。
10.权利要求9所述的多重交联高强度酶诱导矿化水凝胶在骨组织工程领域中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114426683A (zh) * 2022-02-20 2022-05-03 浙江工业大学 一种高强度矿化水凝胶的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030232895A1 (en) * 2002-04-22 2003-12-18 Hossein Omidian Hydrogels having enhanced elasticity and mechanical strength properties
CN103396562A (zh) * 2013-07-09 2013-11-20 西安交通大学 一种基于海藻酸钠-聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法
CN112625158A (zh) * 2019-09-24 2021-04-09 天津大学 一种酶催化矿化聚丙烯酰基甘氨酰胺水凝胶及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030232895A1 (en) * 2002-04-22 2003-12-18 Hossein Omidian Hydrogels having enhanced elasticity and mechanical strength properties
CN103396562A (zh) * 2013-07-09 2013-11-20 西安交通大学 一种基于海藻酸钠-聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法
CN112625158A (zh) * 2019-09-24 2021-04-09 天津大学 一种酶催化矿化聚丙烯酰基甘氨酰胺水凝胶及其制备方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114426683A (zh) * 2022-02-20 2022-05-03 浙江工业大学 一种高强度矿化水凝胶的制备方法
CN114426683B (zh) * 2022-02-20 2023-07-25 浙江工业大学 一种高强度矿化水凝胶的制备方法

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