CN113831352A - 山菅根新黄烷类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供山菅根新黄烷类化合物及制备方法和用途，其以山菅根为原料，通过溶剂提取、萃取、硅胶柱层析、凝胶柱、反相ODS和高效液相色谱制备，分离得到了八个新的黄烷类化合物，其制备方法稳定、重现性好，可用于化合物的大量制备。所述化合物可用于制备治疗缺血性心脑血管疾病的药物。

Description

山菅根新黄烷类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及八种新黄烷类化合物，具体涉及从山菅根分离制备八种新黄烷类化合物，同时涉及这些化合物的制备方法和用途。
背景技术
山菅[Dianella ensifolia(L.)DC.]为百合科(Liliaceae)山菅属植物，又名山菅兰、山交剪、山猫儿等，产于广东、广西和云南等省区。其性味甘、辛、性凉，叶可治蛇伤，根状茎可治腹痛，磨成粉状外敷可治脓肿、癣、淋巴结炎等疾病。目前，山菅的化学成分研究尚处于起步阶段，仅从该植物中分离鉴定了23个化合物，结构类型主要为黄烷、黄酮、三萜、查尔酮及间苯二酚等，相关生物活性研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供从山菅根中分离制备的山菅根新黄烷类化合物及其制备方法，从而明确山菅的化学物质基础，为其进一步开发利用奠定基础，以克服现有技术的不足。
本发明解决其技术问题的技术方案是：山菅根新黄烷类化合物，其结构式如下：
Figure BDA0003355922230000011
其中，R是Me或H。
山菅根新黄烷类化合物，其结构式如下：
Figure BDA0003355922230000012
其中，R1至R6分别是R1至R6分别是：OH、OMe、OH、H、OMe、H。
山菅根新黄烷类化合物，其结构式如下：
Figure BDA0003355922230000021
其中，R1至R6分别是：OH、OMe、H、H、OMe、H；或者是，R1至R6分别是：H、OMe、H、OH、OMe、H。
山菅根新黄烷类化合物，其结构式如下：
Figure BDA0003355922230000022
其中，R1至R6分别是：OH、OMe、H、OH、OMe、H。
山菅根新黄烷类化合物，其结构式如下：
Figure BDA0003355922230000023
其中，R1至R6分别是H、OMe、H、OH、OMe、OH。
山菅根新黄烷类化合物，其结构式如下：
Figure BDA0003355922230000024
所述山菅根新黄烷类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
S1)提取：山菅根干燥粉碎物，用95％质量浓度的乙醇溶液，室温浸泡12h后，渗漉提取4次，过滤，合并三次滤液，减压浓缩成干燥浸膏；
S2)萃取处理：上述浸膏加入水混悬，并依次用等体积的石油醚，氯仿和正丁醇各萃取三次，回收萃取液，减压浓缩，得各部位浸膏；
S3)分离纯化：取氯仿部位浸膏，用氯仿-甲醇混合溶剂溶解，进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，得到十六个流分，分别以数字1～16表示，即是流分1～流分16；把流分10用1.5倍硅胶干法拌样，进行二次硅胶柱层析，用氯仿-丙酮梯度洗脱，得到10a～10e五个流分；把流分10a进行高效液相色谱制备分离，用70％甲醇-水在ODS制备柱上等度洗脱，得到式(I)、式(II)、其中R1至R6分别是OH、OMe、OH、H、OMe、H的式(III)的山菅根新黄烷类化合物。
上述山菅根新黄烷类化合物的制备方法，包括以下步骤：
S1)提取：山菅根干燥粉碎物，用95％质量浓度的乙醇溶液，室温浸泡12h后，渗漉提取4次，过滤，合并三次滤液，减压浓缩成干燥浸膏；
S2)萃取处理：上述浸膏加入水混悬，并依次用等体积的石油醚，氯仿和正丁醇各萃取三次，回收萃取液，减压浓缩，得各部位浸膏；
S3)分离纯化：氯仿部位浸膏用氯仿-甲醇混合溶剂溶解，进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，得到十六个流分，分别是流分1～流分16，流分6进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，用纯甲醇洗脱，洗脱液减压浓缩，进行高效液相色谱制备分离，用75％甲醇-水在ODS制备柱上等度洗脱，得到其中R1至R6分别是：OH、OMe、H、H、OMe、H；或者，R1至R6分别是：H、OMe、H、OH、OMe、H的式(III)的山菅根新黄烷类化合物。
上述山菅根新黄烷类化合物的制备方法，包括以下步骤：
S1)提取：山菅根干燥粉碎物，用95％质量浓度的乙醇溶液，室温浸泡12h后，渗漉提取4次，过滤，合并三次滤液，减压浓缩成干燥浸膏；
S2)萃取处理：上述浸膏加入水混悬，并依次用等体积的石油醚，氯仿和正丁醇各萃取三次，回收萃取液，减压浓缩，得各部位浸膏；
S3)分离纯化：氯仿部位浸膏，用氯仿-甲醇混合溶剂溶解，进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，得到十六个流分，分别是流分1～流分16，取流分12进行中低压柱层析，用ODS柱分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到流分12a～12e五个流分；流分12b进行SephadexLH-20凝胶柱层析，用纯甲醇-氯仿洗脱，得到流分12b1～12b3三个流分；流分12b2进行高效液相色谱制备分离，用70％甲醇-水在ODS制备柱上等度洗脱，得到其中R1至R6分别是：OH、OMe、H、OH、OMe、H的式(III)的山菅根新黄烷类化合物。
上述山菅根新黄烷类化合物的制备方法，包括以下步骤：
S1)提取：山菅根干燥粉碎物，用95％质量浓度的乙醇溶液，室温浸泡12h后，渗漉提取4次，过滤，合并三次滤液，减压浓缩成干燥浸膏；
S2)萃取处理：上述浸膏加入水混悬，并依次用等体积的石油醚，氯仿和正丁醇各萃取三次，回收萃取液，减压浓缩，得各部位浸膏；
S3)分离纯化：氯仿部位浸膏730g，用氯仿-甲醇混合溶剂溶解，进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，得到十六个流分，分别是流分1～流分16，流分14进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，得到14a～14f六个流分，流分14c，进行中低压柱层析，用ODS柱分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到14c1～14c9九个流分；流分14c7用高效液相色谱制备分离，用70％乙腈-水在ODS制备柱上等度洗脱，得到其中R1至R6分别是H、OMe、H、OH、OMe、OH的式(III)和(IV)的山菅根新黄烷类化合物。
本发明进一步提供了所述山菅根新黄烷类化合物用于制备治疗缺血性血管疾病的药物的用途。
缺血性血管疾病例如为缺血性心肌梗死或脑梗死。
本发明的有益效果是：本发明以山菅根为原料，通过溶剂提取、萃取、硅胶柱层析、凝胶柱、反相ODS和高效液相色谱制备，分离得到了八个新的黄烷类化合物，该制备方法稳定、重现性好，可用于化合物的大量制备。所述化合物对于缺血性心脑血管疾病，显示了优异的活性。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
一、山菅根中新黄烷化合物的结构
Figure BDA0003355922230000051
从山菅根中分离制备出八种新黄烷类化合物，以数字1～8表示，分别是化合物1至化合物8，其中，化合物1和化合物2的R键分别是Me、H；而化合物3至化合物7具有的R1—R6见上。
二、新化合物的制备
提取：山菅根干燥粉碎物50kg，用75L 95％质量浓度的乙醇溶液室温浸泡12h，渗漉提取4次，过滤，合并三次滤液，减压浓缩成干燥浸膏。
萃取处理：上述浸膏加入水混悬，并依次用等体积的石油醚，氯仿和正丁醇各萃取三次，回收萃取液，减压浓缩，得各部位浸膏。
分离纯化：氯仿部位浸膏730g，用氯仿-甲醇混合溶剂溶解，进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇(100：0至0：100，v/v)梯度洗脱，得到十六个流分，分别以数字1～16表示，即是流分1～流分16；把流分10(28g)用1.5倍硅胶干法拌样，进行二次硅胶柱层析，用氯仿-丙酮(100：0至50：50，v/v)梯度洗脱，得到10a～10e五个流分；把流分10a(0.7g)进行高效液相色谱制备分离，用70％甲醇-水在ODS制备柱上等度洗脱，得到三个山菅根新黄烷类化合物：化合物1(11mg)、化合物2(7mg)和化合物5(7mg)；
流分6(11g)进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，用纯甲醇洗脱，洗脱液减压浓缩，进行高效液相色谱制备分离，用75％甲醇-水在ODS制备柱上等度洗脱，得到两个山菅根新黄烷类化合物：化合物3(13mg)和化合物6(10mg)；
流分12a(1.4g)，进行中低压柱层析，用ODS柱分离，用甲醇-水(30：70至100：0，v/v)梯度洗脱，得到流分12a～12e等五个流分；流分12b(1.4g)，进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，用纯甲醇-氯仿(1：1，v/v)洗脱，得到流分12b1～12b3三个流分；流分12b2(0.46g)，进行高效液相色谱制备分离，用70％甲醇-水在ODS制备柱上等度洗脱，得到化合物4(10mg)；
流分14(52g)，进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇(100：0至20：80，v/v)梯度洗脱，得到14a～14f六个流分。流分14c(2.8g)，进行中低压柱层析，用ODS柱分离，用甲醇-水(50：50至100：0，v/v)梯度洗脱，得到14c1～14c9九个流分。流分14c7(0.21g)，用高效液相色谱制备分离，用70％乙腈-水在ODS制备柱上等度洗脱，得到两个山菅根新黄烷类化合物：化合物7(10mg)和化合物8(7mg)。
三、新化合物的结构鉴定
制备得到化合物1～8共八种新黄烷类化合物，新化合物1为无色晶体，HR-ESI-MS显示准分子离子峰m/z 285.1127[M+H]+，确定分子式为C17H16O4，根据一维和二维核磁共振数据，并结合文献，确定化合物为：9-methoxy-10-methyl-6H,12H-6,12-methanodibenzo[b,f][1,5]dioxocin-3-ol，新化合物1的旋光为0，提示可能为外消旋化合物。对化合物1进行光学手性拆分，得到(+)-1，
Figure BDA0003355922230000061
(c 1.0,MeOH)；(-)-1，
Figure BDA0003355922230000062
(c 1.0,MeOH)；化合物结构如下，NMR信号归属见表1。
Figure BDA0003355922230000063
新化合物2为无色粉末，HR-ESI-MS显示准分子离子峰m/z 293.0787[M+Na]+，确定分子式为C16H14O4，根据一维和二维核磁共振数据，并结合文献，确定化合物为：9-methoxy-6H,12H-6,12-methanodibenzo[b,f][1,5]dioxocin-3-ol，新化合物2的旋光为0，提示可能为外消旋化合物。对化合物2进行光学手性拆分，得到(+)-2，
Figure BDA0003355922230000064
(c 0.9,MeOH)；(-)-2，
Figure BDA0003355922230000065
(c 0.9,MeOH)；化合物结构如下，NMR信号归属见表1。
Figure BDA0003355922230000071
新化合物3为无色晶体，HR-ESI-MS显示准分子离子峰m/z 301.1432[M+H]+，确定分子式为C18H20O4，根据一维和二维核磁共振数据，并结合文献，确定化合物为：(S)-7-methoxy-2-(4-methoxyphenyl)-8-methylchroman-6-ol，化合物结构如下，NMR信号归属见表2。
Figure BDA0003355922230000072
新化合物4为黄色油状，HR-ESI-MS显示准分子离子峰m/z 339.1205[M+Na]+，确定分子式为C18H20O5，根据一维和二维核磁共振数据，并结合文献，确定化合物为：(S)-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-7-methoxy-8-methylchroman-6-ol，化合物结构如下，NMR信号归属见表3。
Figure BDA0003355922230000073
新化合物5为黄色油状，HR-ESI-MS显示准分子离子峰m/z 339.1199[M+Na]+，确定分子式为C18H20O5，根据一维和二维核磁共振数据，并结合文献，确定化合物为：(S)-2-(2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-7-methoxy-8-methylchroman-6-ol，化合物结构如下，NMR信号归属见表3。
Figure BDA0003355922230000074
新化合物6为黄色油状，HR-ESI-MS显示准分子离子峰m/z 301.1430[M+H]+，确定分子式为C18H20O4，根据一维和二维核磁共振数据，并结合文献，确定化合物为：(S)-2-methoxy-5-(7-methoxy-8-methylchroman-2-yl)phenol，化合物结构如下，NMR信号归属见表4。
Figure BDA0003355922230000081
新化合物7为黄色油状，HR-ESI-MS显示准分子离子峰m/z 339.1208[M+Na]+，确定分子式为C18H20O5，根据一维和二维核磁共振数据，并结合文献，确定化合物为：(S)-2-methoxy-5-(7-methoxy-8-methylchroman-2-yl)benzene-1,3-diol，化合物结构如下，NMR信号归属见表2。
Figure BDA0003355922230000082
新化合物8为黄色油状，HR-ESI-MS显示准分子离子峰m/z 339.1210[M+Na]+，确定分子式为C18H20O5，根据一维和二维核磁共振数据，并结合文献，确定化合物为：(2R,3R)-2-(2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-7-methoxy-8-methylchroman-3-ol，化合物结构如下，NMR信号归属见表4。
Figure BDA0003355922230000083
以下，分别是表1～3。
表1.NMR Data of Compounds 1 and 2(DMSO-d6，δin ppm，J in Hz)a
Figure BDA0003355922230000091
表2.NMR Data of Compounds 3 and 7(DMSO-d6，δin ppm，J in Hz)a
Figure BDA0003355922230000101
Figure BDA0003355922230000111
应用试验
一、化合物对斑马鱼的安全性评价及促血管新生作用
实验方法：
1.化合物1、6和8对斑马鱼的安全性评价
将发育24小时的AB野生型斑马鱼胚胎分布放入24孔板中，每组15个胚胎，在28℃培养箱中用不同浓度的化合物1、6和8处理96小时，DMSO(0.1％)作为空白对照组。每24小时观察并记录存活情况及形态表型，计算得到半数致死量LD50。
2.化合物1、6和8对血管损伤斑马鱼的影响
Tg(fli1:EGFP)转基因斑马鱼模型中评价了化合物的促血管生成作用。将发育24小时的Tg(fli1a:EGFP)斑马鱼胚胎分布放入12孔板中，每组12个胚胎。每组用蛋白酶预处理，培养液洗3次，每次5分钟。对照组采用0.1％的DMSO胚胎培养液外，其余各组用500ng/ml酪氨酸激酶抑制剂ⅱ(VRI,VEGF受体抑制剂之一)处理3小时。去除VRI，用含有不同浓度化合物1、6和8的0.1％(v/v)DMSO胚胎培养基替换，置28.5℃恒温箱中24小时。在荧光显微镜下观察血管的形态变化，并使用奥林巴斯旋转盘共聚焦显微镜系统在4倍和10倍放大率下观察统计血管。
实验结果如表4所示，化合物1和化合物6在10μM、20μM和40μM浓度下的血管有效保护率为20～40％；化合物8在20μM、40μM和50μM浓度下的血管有效保护率为<20％。以上结揭示，化合物1、6和8能有效的保护血管损伤斑马鱼胚胎的血管，具有一定的促血管新生作用。
表4黄烷类化合物1、6和8对血管损斑马鱼胚胎的促血管生成作用
Figure BDA0003355922230000121
(注：用半定量量表示血管恢复率和促血管生成作用(在VRI诱导的血管不足模型中保留斑马鱼背部区域的血管生长)；toxic表示有毒；-说明无毒且无作用；+表示<20％保护；++表示20％～40％保护；+++表示40～60％保护；++++表示60～80％保护；+++++的在80％保护。)
上述实验结果揭示了本发明所述的黄烷类化合物可应用于促血管新生治疗。
二、化合物对缺血性心肌梗死的保护作用：
采用的体外H9c2细胞缺氧缺糖的病理模型对本发明的黄烷类化合物进行心肌缺血保护作用评价，选取丹参酚酸B作为阳性对照药。
仪器：超净工作台、恒温CO2培养箱、倒置生物显微镜、酶联免疫检测仪、平板摇床、离心机。
试剂：DMEM(GIBCO)、胎牛血清(GIBCO)、胰蛋白酶(SIGMA)、DMSO(SIGMA)、磷酸盐缓冲液(PBS)、青霉素-链霉素、0.25％(W/V)胰蛋白酶(Invitrogen,USA)、LDH试剂盒(Mennheim,Germany)、MTT(Sigma,St Louis,MO)。
细胞株：大鼠心肌细胞(H9c2,ATCC,Manassas)
方法：H9c2用含有4mM的L-谷氨酸、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％FBS的DMEM培养，置于5％CO2孵化箱中37℃培养。测试时，将H9c2大鼠心肌细胞消化并制成浓度为80000细胞/ml的细胞悬浮液，按8000细胞/孔，分别接种于两块96孔板上，一块为正常对照组，一块作为模型组，在37℃的5％CO2孵化箱中培养24小时，待细胞稳定贴壁后，模型组更换含有不同浓度的化合物1～8的低血清培养液(0.5％FBS)，放入37℃的5％CO2培养箱培养2小时，并设空白模型组，同时正常对照组更换低血清培养液(0.5％FBS)。模型组细胞去除原有培养液，更换无糖培养液，放入厌氧工作站缺糖缺氧处理6小时。
1.LDH法检测细胞毒性
取缺糖缺氧处理后的模型组和空白组细胞培养液50μl，加入LDH试剂盒指定剂量混合液50μl，放入培养箱孵育30分钟，随后用多功能酶标仪测定各孔在490nm处的吸光光度值。
2.MTT法检测细胞活力
取处理后的模型组与空白组细胞，移净培养液，每孔加入100μl 1mg/ml MTT检测液，放入培养箱孵育4小时，随后弃掉MTT溶液，每孔加入100μl DMSO溶解结晶，用多功能酶标仪测定各孔在570nm处的吸光光度值。
3.结果
(1)化合物对细胞LDH释放的影响
表5结果显示，H9c2细胞在缺糖缺氧处理6小时后，模型组细胞毒性显著增加。用不同浓度化合物3、4、5和阳性对照药丹参酚酸B，分别预处理H9c2细胞2小时再进行缺糖缺氧处理，其中化合物3～5在1μM和10μM均能降低缺糖缺氧造成的细胞毒性，以浓度为10μM时抑制效果最为显著，且化合物3的抑制效果优于阳性对照丹参酚酸B。
表5化合物对缺氧糖所致H9c2细胞LDH释放的影响(
Figure BDA0003355922230000131
n＝6)
Figure BDA0003355922230000141
注：与模型组比*P＜0.05，**P＜0.01
(2)化合物对细胞存活率的影响
表6结果显示，H9c2细胞在缺糖缺氧处理6小时后，细胞存活率明显下降。用不同浓度化合物3、4、5和阳性对照药丹参酚酸B，分别预处理H9c2细胞2小时再进行缺糖缺氧处理，其中化合物3～5在1μM和10μM毛蕊异黄酮均能增加缺氧缺糖状态下H9c2细胞存活率，以浓度为10μM时效果最为显著。
表6化合物对缺氧糖所致H9c2细胞存活率的影响(
Figure BDA0003355922230000142
n＝6)
Figure BDA0003355922230000143
注：与模型组比*P＜0.05，**P＜0.01
综上所述，黄烷类化合物3～5能够有效地抑制细胞缺氧缺糖所造成的细胞损伤。其中化合物3的保护效果最好，在10μM浓度下LDH释放为0.288±0.024，细胞存活率的OD值为0.892±0.032。

Claims (7)

1.山菅根新黄烷类化合物，其特征在于，所述山菅根新黄烷类化合物选自如下结构式(I)～(IV)的化合物中的一种或多种：
Figure FDA0003355922220000011
结构式(I)和(II)中，R是Me或H；
Figure FDA0003355922220000012
其中，R1至R6分别是OH、OMe、OH、H、OMe、H；
R1至R6分别是：OH、OMe、H、H、OMe、H；
R1至R6分别是：H、OMe、H、OH、OMe、H；
R1至R6分别是：OH、OMe、H、OH、OMe、H；或者
R1至R6分别是H、OMe、H、OH、OMe、OH；
Figure FDA0003355922220000013
2.根据权利要求1所述的山菅根新黄烷类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
S1)提取：山菅根干燥粉碎物，用95％质量浓度的乙醇溶液，室温浸泡12h后，渗漉提取4次，过滤，合并三次滤液，减压浓缩成干燥浸膏；
S2)萃取处理：上述浸膏加入水混悬，并依次用等体积的石油醚，氯仿和正丁醇各萃取三次，回收萃取液，减压浓缩，得各部位浸膏；
S3)分离纯化：取氯仿部位浸膏，用氯仿-甲醇混合溶剂溶解，进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，得到十六个流分，分别以数字1～16表示，即是流分1～流分16；把流分10用1.5倍硅胶干法拌样，进行二次硅胶柱层析，用氯仿-丙酮梯度洗脱，得到10a～10e五个流分；把流分10a进行高效液相色谱制备分离，用70％甲醇-水在ODS制备柱上等度洗脱，得到式(I)、式(II)、其中R1至R6分别是OH、OMe、OH、H、OMe、H的式(III)的山菅根新黄烷类化合物。
3.根据权利要求1所述的山菅根新黄烷类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
S1)提取：山菅根干燥粉碎物，用95％质量浓度的乙醇溶液，室温浸泡12h后，渗漉提取4次，过滤，合并三次滤液，减压浓缩成干燥浸膏；
S2)萃取处理：上述浸膏加入水混悬，并依次用等体积的石油醚，氯仿和正丁醇各萃取三次，回收萃取液，减压浓缩，得各部位浸膏；
S3)分离纯化：氯仿部位浸膏用氯仿-甲醇混合溶剂溶解，进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，得到十六个流分，分别是流分1～流分16，流分6进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，用纯甲醇洗脱，洗脱液减压浓缩，进行高效液相色谱制备分离，用75％甲醇-水在ODS制备柱上等度洗脱，得到其中R1至R6分别是：OH、OMe、H、H、OMe、H；或者，R1至R6分别是：H、OMe、H、OH、OMe、H的式(III)的两种山菅根新黄烷类化合物。
4.根据权利要求1所述的山菅根新黄烷类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
S1)提取：山菅根干燥粉碎物，用95％质量浓度的乙醇溶液，室温浸泡12h后，渗漉提取4次，过滤，合并三次滤液，减压浓缩成干燥浸膏；
S2)萃取处理：上述浸膏加入水混悬，并依次用等体积的石油醚，氯仿和正丁醇各萃取三次，回收萃取液，减压浓缩，得各部位浸膏；
S3)分离纯化：氯仿部位浸膏，用氯仿-甲醇混合溶剂溶解，进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，得到十六个流分，分别是流分1～流分16，取流分12进行中低压柱层析，用ODS柱分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到流分12a～12e五个流分；流分12b进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，用纯甲醇-氯仿洗脱，得到流分12b1～12b3三个流分；流分12b2进行高效液相色谱制备分离，用70％甲醇-水在ODS制备柱上等度洗脱，得到其中R1至R6分别是：OH、OMe、H、OH、OMe、H的式(III)的山菅根新黄烷类化合物。
5.根据权利要求1所述的山菅根新黄烷类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
S1)提取：山菅根干燥粉碎物，用95％质量浓度的乙醇溶液，室温浸泡12h后，渗漉提取4次，过滤，合并三次滤液，减压浓缩成干燥浸膏；
S2)萃取处理：上述浸膏加入水混悬，并依次用等体积的石油醚，氯仿和正丁醇各萃取三次，回收萃取液，减压浓缩，得各部位浸膏；
S3)分离纯化：氯仿部位浸膏730g，用氯仿-甲醇混合溶剂溶解，进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，得到十六个流分，分别是流分1～流分16，流分14进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，得到14a～14f六个流分，流分14c，进行中低压柱层析，用ODS柱分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到14c1～14c9九个流分；流分14c7用高效液相色谱制备分离，用70％乙腈-水在ODS制备柱上等度洗脱，得到其中R1至R6分别是H、OMe、H、OH、OMe、OH的式(III)和(IV)的山菅根新黄烷类化合物。
6.权利要求1所述的山菅根新黄烷类化合物用于制备治疗缺血性血管疾病的药物的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，缺血性血管疾病为缺血性心肌梗死或脑梗死。
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