CN113804775B - 一种基于质谱技术的广藿香指纹图谱的构建方法及多指标定量评价方法 - Google Patents

一种基于质谱技术的广藿香指纹图谱的构建方法及多指标定量评价方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于质谱技术的广藿香指纹图谱的构建方法及多指标定量评价方法,采用高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱法建立的广藿香HPLC‑Q‑TOF/MS指纹图谱，含有44个共有峰，鉴定了其中29个主要成分；确定绿原酸、新西兰牡荆苷、麦角甾苷、异麦角甾苷、壬二酸、芹菜素、鼠李柠檬素、藿香黄酮醇和广藿香酮等9个成分作为广藿香质控评价指标，采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱(UPLC‑MS/MS)建立同时测定该9个成分的多指标定量方法；结合层次分析法，赋予活性成分权重并建立评价方程，根据评分结果对广藿香药材质量进行评价。本发明较全面地定性和定量广藿香的难挥发性化学成分，可应用于广藿香药材质量评价，从而精确控制药材的质量。

Description

一种基于质谱技术的广藿香指纹图谱的构建方法及多指标定量评价方法
技术领域
本发明涉及中药分析测试及质量评价领域，特别是涉及一种基于质谱技术的广藿香指纹图谱的构建方法及多指标定量评价方法。
背景技术
广藿香为唇形科植物广藿香Pogostemon cablin(Blanco.)Benth.的干燥地上部分，主要分布于我国广东、海南、广西等地。广藿香味辛、微温，归脾、胃、肺经；具芳香化浊、和中止呕、发表解暑的功效，用于湿浊中阻，脘痞呕吐，暑湿表证，湿温初起，发热倦怠，胸闷不舒，寒湿闭暑、腹痛吐泻，鼻渊头痛等症。研究发现广藿香主要含有萜类、黄酮类、苯丙素类、甾体类、生物碱类和脂肪酸类等成分，具有抗病原微生物、抗炎镇痛、调节胃肠道功能和免疫等活性。
中药指纹图谱是采用现代分析技术反映中药或中成药的色谱或光谱信息的图谱，已成为国际公认的控制中药或中成药质量的有效手段。目前最为常用的是高效液相(HPLC)指纹图谱，紫外检测器是其主要的检测器，但仅具有共轭系统的化合物才有紫外吸收，故不能测定无紫外吸收的成分；同时，化学成分的紫外吸光度具有加和性，不能准确、真实地反映化学成分含量，因此紫外检测器具有明显的局限性。质谱检测器是一种高灵敏度、适用范围广泛的通用检测器，尤其适合多类型、多组分的复杂体系检测。高效液相色谱串联质谱法可全面定性和定量化学成分，目前已广泛应用于中药及中成药化学成分的定量和定性分析。因此，采用高效液相色谱串联质谱法建立中药及中成药的指纹图谱,并同时测定多种质控指标成分，能更真实地反映中药及中成药的化学成分组成。
目前广藿香的质量检测方法主要是依据《中国药典》(2020版)，将性状、显微鉴别、薄层色谱和百秋李醇的含量(不得少于0.10％)等作为主要检测指标。广藿香质量研究多采用GC-MS法测定挥发油组成、挥发油含量，同时采用GC-MS指纹图谱技术评价广藿香质量。而广藿香化学成分组成不仅含有挥发性成分，还含有大量难挥发性成分，因此仅对挥发性成分测定及表征不足以反映广藿香的内在质量。因此，需要开发一种可以对广藿香挥发性成分和难挥发性成分进行较全面定性和定量的质量检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种基于质谱技术的广藿香指纹图谱的构建方法及多指标定量评价方法，可较全面地表征和评价广藿香的质量，为广藿香的质量标准研究提供可靠依据。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
一种基于质谱技术的广藿香指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
(1)制备广藿香指纹图谱供试品溶液；
(2)采用高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用(HPLC-Q-TOF/MS)法测定广藿香指纹图谱供试品溶液；
(3)建立广藿香HPLC-Q-TOF/MS指纹图谱；
(4)确定色谱峰母离子的精确质量数和分子式，鉴定广藿香指纹图谱中共有成分的化学结构。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤(1)具体包括：将广藿香药材粉碎，过3号筛，精密称定1g粉末置具塞锥形瓶中，精密加入15mL浓度为60％的甲醇，称定重量；之后浸泡30min，再超声30min，放冷，再次称定重量；然后用浓度为60％的甲醇补足减失重量，摇匀；最后取适量溶液于离心机中离心10min，离心的转速为14000rpm/min，离心温度为10℃；离心后取上清液转移至进样瓶中，即得广藿香指纹图谱供试品溶液。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤(3)具体包括：将采集得到的HPLC-Q-TOF/MS数据导出并整理为txt格式，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版相似度软件，获得由44个共有色谱峰构成的广藿香HPLC-Q-TOF/MS指纹图谱。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤(4)具体包括：利用Agilent MassHunter软件处理数据，确定色谱峰母离子的精确质量数和分子式，检索Agilent PCDL、PubChem和MassBank数据库及现有文献进行质谱数据比对，人工解析其质谱裂解规律，再经对照品核对保留时间和质谱图确定化学结构，鉴定了广藿香29个共有成分。
作为上述方案的进一步改进，所述高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用(HPLC-Q-TOF/MS)的色谱、质谱条件为：
色谱柱为Agilent Poroshell 120EC C18柱，150mm×3.0mm，2.7μm，流动相A:B为0.1％甲酸+5mM乙酸铵水溶液:乙腈，梯度洗脱程序为0～5.00min，95→90％A；5.00～25.00min，90→80％A；25.00～35.00min，80→70％A；35.00～50.00min，70→55％A；50.00～60.00min，55→50％A；60.00～70.00min，50→35％A；70.00～73.00min，35→10％A；73.00～75.00min，10→2％A；75.00～77.00min，2％A；77.00～77.10min，2→95％A；77.10～80.00min，95％A；流速为0.35mL/min；柱温为30℃；进样量为10μL；
电喷雾离子源，负离子模式；毛细管电压：3500V；喷嘴电压：1000V；毛细管出口电压：150V；锥孔电压：65V；干燥气温度：300℃；干燥气流速：8L/min；鞘气温度：350℃；鞘气流速：12L/min；质量扫描范围：m/z 100～1000，碰撞能量梯度为10，20，40eV；参比离子为：m/z112.9856、966.0007。
本发明第二方面在于提供一种基于质谱技术的广藿香指纹图谱，所述广藿香指纹图谱由如上所述的基于质谱技术的广藿香指纹图谱的构建方法构建获得。
本发明第三方面在于提供一种基于质谱技术广藿香多指标定量评价方法，所述方法包括如下步骤：
(1)制备广藿香多指标定量供试品溶液；
(2)选定绿原酸、新西兰牡荆苷、麦角甾苷、异麦角甾苷、壬二酸、芹菜素、鼠李柠檬素、藿香黄酮醇和广藿香酮9个活性成分作为广藿香质量评价指标；
(3)采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱(UPLC-MS/MS)法建立同时测定9个活性成分的多指标定量方法；
(4)采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法测定步骤(2)的广藿香广藿香多指标定量供试品溶液；
(5)采用层次分析法将9个活性成分归为四类，赋予四类成分权重，获得广藿香质量评价方程：Y＝0.4871×1类+0.2732×2类+0.1335×3类+0.1061×4类，将步骤(4)测定的9种活性成分的含量根据分类结果代入方程，计算各批次广藿香分数并依此评价广藿香的质量；
其中1类为藿香黄酮醇和广藿香酮的含量之和，2类为麦角甾苷和异麦角甾苷的含量之和，3类为新西兰牡荆苷、鼠李柠檬素和芹菜素的含量之和，4类为绿原酸和壬二酸的含量之和，Y代表广藿香分数。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤(1)具体包括：将广藿香药材粉碎，过3号筛，精密称定1g粉末置具塞锥形瓶中，精密加入15mL浓度为60％甲醇，称定重量；之后浸泡30min，超声30min，放冷，再次称定重量，然后用浓度为60％的甲醇补足减失重量，摇匀，取适量溶液于离心机中离心10min，离心的转速为14000rpm/min，离心温度为10℃；离心后精密吸取适量上清液，用浓度为60％的甲醇分别稀释100倍和500倍，转移至进样瓶中，得到两种稀释倍数的广藿香多指标定量供试品溶液。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤(2)具体包括：基于鉴定的广藿香主要成分，结合广藿香化学成分的药理活性，选定绿原酸、新西兰牡荆苷、麦角甾苷、异麦角甾苷、壬二酸、芹菜素、鼠李柠檬素、藿香黄酮醇和广藿香酮9个活性成分作为广藿香质量评价指标。
作为上述方案的进一步改进，所述超高效液相色谱串联三重四级杆质谱(UPLC-MS/MS)法的色谱、质谱条件：
色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱，100mm×2.1mm，1.7μm，流动相A:B为0.2％甲酸水:乙腈，梯度洗脱程序为0～1.00min，80％A；1.00～2.50min，80→70％A；2.50～4.50min，70→65％A；4.50～4.80min，65→25％A；4.80～5.30min，25％A；5.30～5.80min，25→15％A；5.80～7.50min，15→5％A；7.50～9.50min，5％A；9.50～9.51min，5→80％A；9.51～11.00min，80％A；流速为0.25mL/min；柱温为30℃；进样量为2μL；
电喷雾离子源(ESI)，负离子模式；毛细管电压(Capillary)：2500V；干燥气温度(Gas temp)：325℃；干燥气流速(Gas Flow)：10L/min；雾化器压力(Nebulizer)：45psi；鞘气温度(sheath Gas temp)：350℃；鞘气流速(sheath Gas Flow)：11L/min；扫描方式为多重反应监测(MRM)；质谱参数如下表所示：
目标化合物定量分析的保留时间和质谱参数
Figure BDA0003188240180000051
Figure BDA0003188240180000061
注：*代表定量离子。
本发明采用HPLC-Q-TOF/MS构建广藿香指纹图谱，鉴定广藿香主要化学成分，结合文献报道的广藿香化学成分的药理活性，确定9种特征成分，并构建同时测定9个特征成分的UPLC-MS/MS多指标定量方法，可准确评价广藿香药材，提供精确的质量控制方法。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明所构建的广藿香HPLC-Q-TOF/MS指纹图谱，含有44个共有峰，鉴定了广藿香29个主要成分，与现有文献报道的HPLC指纹图谱相比，化学成分更丰富，并提供了色谱峰的定性信息，首次采用HPLC-Q-TOF/MS法揭示广藿香难挥发性化学成分组成；
2、构建了同时测定广藿香中绿原酸、新西兰牡荆苷、麦角甾苷、异麦角甾苷、壬二酸、芹菜素、鼠李柠檬素、藿香黄酮醇和广藿香酮9个活性成分的UPLC-MS/MS多指标定量方法(详见下述2.8UPLC-MS/MS方法的构建)，并结合层次分析法(AHP)建立广藿香的质量评价方程，根据9种活性成分含量的综合评分对广藿香药材质量进行评价，从而全面精确地表征和评价广藿香的质量，为广藿香的质量标准研究提供可靠依据。
附图说明
图1是本发明精密度实验的HPLC-Q-TOF/MS谱图；
图2是本发明重复性实验的HPLC-Q-TOF/MS谱图；
图3是本发明稳定性实验的HPLC-Q-TOF/MS谱图；
图4是本发明的20批次广藿香药材的HPLC-Q-TOF/MS谱图；
图5是本发明生成的HPLC-Q-TOF/MS谱图；
图6是本发明的广藿香药材聚类分析(HCA)图；
图7是本发明的广藿香混标MRM色谱图；
图8是本发明的广藿香药材MRM色谱图。
其中，图7中a为绿原酸；b为新西兰牡荆苷；c为麦角甾苷；d为异麦角甾苷；e为壬二酸；f为芹菜素；g为鼠李柠檬素；h为藿香黄酮醇；i为广藿香酮；IS为新橙皮苷；
图8中a为绿原酸；b为新西兰牡荆苷；c为麦角甾苷；d为异麦角甾苷；e为壬二酸；f为芹菜素；g为鼠李柠檬素；h为藿香黄酮醇；i为广藿香酮；IS为新橙皮苷。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
1.仪器与材料
1.1仪器
1290液相色谱-G6540系列四级杆-飞行时间质谱联用仪，1290液相色谱-G6470系列三重四级杆质谱联用仪(购自安捷伦科技有限公司)，配有ESI电喷雾离子源；TP-114型电子天平(购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；KQ2200型超声波清洗器(购自东莞市科桥超声波设备有限公司产品)；H1850R离心机(购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。
1.2材料
样品：广藿香药材20批次，其中3批次分别购自广州知名药店，如北京同仁堂(TRT)、采芝林(CZL)和大参林(DSL)，其余17批次委托佛山市南海区大沥镇黄岐联益贸易部于广东省湛江市(产品编号依次为ZJ201911,ZJ202001,ZJ202002,ZJ202003,ZJ202004,ZJ202005,ZJ202007,ZJ202008)和肇庆市(产品编号依次为ZQ201908,ZQ202001,ZQ202002,ZQ202003,ZQ202004,ZQ202005,ZQ202006,ZQ202008,ZQ202009)两个广藿香主要产区收集，所有广藿香药材均经广州中医院大学鉴定为真品。
质谱级甲醇和乙腈购自于德国Merck公司；蒸馏水购自于中国香港屈臣氏公司；质谱级甲酸购自于美国Fisher scientific公司；色谱级乙酸铵购自于美国Sigma-Aldrich公司。
对照品：绿原酸、新西兰牡荆苷、麦角甾苷、异麦角甾苷、壬二酸、芹菜素、异鼠李素、芹菜素-7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、广藿香酮、α-亚麻酸和亚油酸均购于成都瑞芬思生物科技有限公司，鼠李素、鼠李柠檬素、藿香黄酮醇购于上海源叶生物科技有限公司，所有对照品纯度均大于98％。
2.方法
2.1HPLC-Q-TOF/MS色谱质谱条件
色谱柱为Agilent Poroshell 120EC C18柱，150mm×3.0mm，2.7μm，流动相A:B为0.1％甲酸+5mM乙酸铵水溶液:乙腈，梯度洗脱程序为0～5.00min，95→90％A；5.00～25.00min，90→80％A；25.00～35.00min，80→70％A；35.00～50.00min，70→55％A；50.00～60.00min，55→50％A；60.00～70.00min，50→35％A；70.00～73.00min，35→10％A；73.00～75.00min，10→2％A；75.00～77.00min，2％A；77.00～77.10min，2→95％A；77.10～80.00min，95％A。流速为0.35mL/min；柱温为30℃；进样量为10μL。
电喷雾离子源(ESI)，负离子模式。毛细管电压(Capillary)：3500V。喷嘴电压(Nozzle voltage)：1000V；毛细管出口电压(Fragmentor)：150V；锥孔电压(Skimmer1)：65V；干燥气温度(Gas temp)：300℃；干燥气流速(Gas Flow)：8L/min；鞘气温度(sheathGas temp)：350℃；鞘气流速(sheath Gas Flow)：12L/min；质量扫描范围m/z 100～1000，碰撞能量梯度为10，20，40eV。参比离子正离子为：m/z 112.9856、966.0007。
2.2UPLC-MS/MS色谱质谱条件
色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱，100mm×2.1mm，1.7μm，流动相A:B为0.2％甲酸水:乙腈，梯度洗脱程序为0～1.00min，80％A；1.00～2.50min，80→70％A；2.50～4.50min，70→65％A；4.50～4.80min，65→25％A；4.80～5.30min，25％A；5.30～5.80min，25→15％A；5.80～7.50min，15→5％A；7.50～9.50min，5％A；9.50～9.51min，5→80％A；9.51～11.00min，80％A。流速为0.25mL/min；柱温为30℃；进样量为2μL。
电喷雾离子源(ESI)，负离子模式。毛细管电压(Capillary)：2500V；干燥气温度(Gas temp)：325℃；干燥气流速(Gas Flow)：10L/min；雾化器压力(Nebulizer)：45psi；鞘气温度(sheath Gas temp)：350℃；鞘气流速(sheath Gas Flow)：11L/min。扫描方式为多重反应监测(MRM)；质谱参数见表1：
表1-目标化合物定量分析的保留时间和质谱参数
Figure BDA0003188240180000091
Figure BDA0003188240180000101
注：*代表定量离子。
2.3溶液配制
2.3.1对照品溶液和标准工作液的制备
分别精密称取对照品于10mL容量瓶中，加入色谱级甲醇溶解及定容，分别配制绿原酸、新西兰牡荆苷、麦角甾苷、异麦角甾苷、壬二酸、芹菜素、鼠李素、鼠李柠檬素、藿香黄酮醇、异鼠李素、芹菜素-7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、广藿香酮、α-亚麻酸、亚油酸和新橙皮苷的单一对照品储备液，再分别吸取适量上述除新橙皮苷外的单一对照品并混合，再加入色谱级甲醇制得浓度为10-50μg/mL的混合对照品溶液；分别精密量取适量绿原酸、新西兰牡荆苷、麦角甾苷、异麦角甾苷、壬二酸、芹菜素、鼠李柠檬素、藿香黄酮醇和广藿香酮单一对照品溶液，制得混合对照品溶液，加入HPLC级甲醇逐级稀释得到一系列浓度的标准工作液，精密量取新橙皮苷单一对照品储备液，加HPLC级甲醇稀释制得内标工作液。
2.3.2供试品溶液的制备
将广藿香药材粉碎，过3号筛，取1g粉末，精密称定，置于50mL具塞锥形瓶中，加入15mL浓度为60％的乙醇，称定重量，浸泡30min；超声提取45min,之后冷却至室温，用浓度为60％的乙醇补足减失重量，摇匀后取1mL溶液于2mL EP(eppendorf)管中，置离心机中以14000rpm/min的转速离心10min，离心温度10℃，之后转移上清液于进样瓶中，即得指纹图谱供试品溶液；取适量指纹图谱供试品溶液，分别稀释100倍(D100)和500倍(D500)，即得D100和D500两种稀释倍数的多指标定量供试品溶液。
2.4HPLC-Q-TOF/MS方法的构建
2.4.1精密度实验
取广藿香药材约1g，精密称定，按照“2.3.2”项制备广藿香供试品溶液，在“2.1”和“2.2”项条件下连续进样6次，构建得到如图1所示的HPLC-Q-TOF/MS指纹谱图，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)进行评价，评价结果见表2。
表2-精密度相似度结果
Figure BDA0003188240180000111
由表2可见，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度≥0.999，结果表明仪器的精密度良好。
2.4.2稳定性实验
取广藿香药材约1g，精密称定，按照“2.3.2”项制备广藿香供试品溶液，在“2.1”和“2.2”项条件下分别于0、2、4、6、8、12、24h进样，构建得到如图3所示的HPLC-Q-TOF/MS指纹谱图，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)进行评价，评价结果见表3。
表3-稳定性相似度结果
Figure BDA0003188240180000121
由表3可见，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度≥0.999，结果表明供试品溶液放置24h内稳定。
2.4.3重复性实验
取广藿香药材约1g，精密称定，平行取6份，按照“2.3.2”项制备广藿香供试品溶液，在“2.1”和“2.2”项条件下分别进样，构建得到如图2所示的HPLC-Q-TOF/MS指纹谱图，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)进行评价，评价结果见表4。
表4-重复性相似度结果
Figure BDA0003188240180000122
Figure BDA0003188240180000131
由表4可见，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度≥0.999，结果表明方法的重复性良好。
2.5指纹图谱的测定
取20批次广藿香药材作为样本进行指纹图谱研究，将20批次药材的指纹图谱数据整理为txt格式，再导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A)版相似度软件。采用平均数法，经多点校正后，生成广藿香药材对照指纹图谱；对色谱峰进行峰匹配，确定了44个主要的色谱特征峰；最后将20批次广藿香药材指纹图谱(如图4所示)与对照指纹图谱(如图5所示)进行相似度评价，结果见表5。由广藿香药材相似度评价结果可以看出，20批次广藿香药材与对照指纹图谱间的相似度大于0.9，符合指纹图谱技术要求。
表5-20批次广藿香药材相似度评价结果
Figure BDA0003188240180000141
Figure BDA0003188240180000151
2.6色谱峰的鉴定
利用Agilent MassHunter软件处理数据，确定色谱峰母离子的精确质量数和分子式，检索Agilent PCDL、PubChem和MassBank等数据库及现有文献进行质谱数据比对，人工解析其质谱裂解规律，再经对照品核对保留时间和质谱图确定化学结构，鉴定了广藿香HPLC-Q-TOF/MS指纹图谱中29个共有成分，结果见表6。
表6-色谱峰鉴定结果
Figure BDA0003188240180000161
Figure BDA0003188240180000171
2.7聚类分析(HCA)
将20批次广藿香药材的44个共有色谱峰的峰面积整理为20x44阶原始数据矩阵，采用SPSS软件对其进行聚类分析。聚类分析将20批次广藿香药材分为2大类，可判定广藿香内在质量具有差异性。聚类分析谱系图见图6，20批样品分为2类，其中样品号为ZQ201908,ZQ202001,ZQ202002,ZQ202003,ZQ202004,ZQ202005,ZQ202006,ZQ202008,ZQ202009,ZJ201911，ZJ202001，ZJ202002，ZJ202003，ZJ202004，ZJ202005，ZJ202007，ZJ202008的样品属于Ⅰ类，样品号为TRT，CZL，DSL的样品属于Ⅱ类。
2.8UPLC-MS/MS方法的构建
经HPLC-Q-TOF/MS分析，发现广藿香主要含有黄酮类、苯丙素类和有机酸类等成分。鼠李柠檬素、藿香黄酮醇、芹菜素和新西兰牡荆苷归属于黄酮类成分，麦角甾苷和异麦角甾苷归属于苯丙素类成分，绿原酸和壬二酸归属于有机酸类成分，广藿香酮归属于其他类成分。研究发现广藿香酮和藿香黄酮醇是广藿香的特征性成分，具有显著的抗菌作用；鼠李柠檬素具有抗氧化、抗炎和抗动脉粥样硬化活性；芹菜素作为治疗HIV和其他病毒感染的抗病毒药物，同时具有抗氧化、镇静安神和抗炎活性；新西兰牡荆苷具有抗氧化和促进癌细胞凋亡作用；麦角甾苷和异麦角甾苷具有免疫调节、抗疲劳、神经保护和抗氧化活性；绿原酸具有显著抗菌和抗病毒作用，壬二酸则具有抗菌活性和护肤作用。其中麦角甾苷、异麦角甾苷、壬二酸、鼠李柠檬素、藿香黄酮醇和广藿香酮是HPLC-Q-TOF/MS指纹图谱的主要共有成分，而绿原酸和新西兰牡荆苷在个别批次中含量较低，色谱峰信号较弱，未选择作为共有峰。因此，本发明基于广藿香指纹图谱共有峰鉴定结果和化学成分的药理活性，确定绿原酸、新西兰牡荆苷、麦角甾苷、异麦角甾苷、壬二酸、芹菜素、鼠李柠檬素、藿香黄酮醇和广藿香酮9个活性成分作为广藿香质量控制评价的指标。上述9个成分在UPLC-MS/MS方法中的MRM色谱图分别见图7和图8。
2.8.1线性范围和定量下限
取广藿香系列标准工作液，按“2.2”项测定。以待测成分浓度为横坐标，待测成分与内标的峰面积比为纵坐标，采用加权最小二乘法回归计算，权重系数为1/X，标准曲线、相关系数、线性范围、定量下限(LLOQ)结果见表7，结果显示待测成分在各自浓度范围内具有良好线性关系。
表7-质控指标成分的标准曲线、相关系数、线性范围和定量下限
Figure BDA0003188240180000181
Figure BDA0003188240180000191
2.8.2精密度实验
配制广藿香低、中、高三个浓度的质量控制样品(QC)，每一个浓度进行3样本分析，按“2.2”项进行，日内连续进样，连续测定3d，计算日内、日间精密度，结果见表8，表明仪器的精密度良好。
表8-方法的日内、日间精密度
Figure BDA0003188240180000192
2.8.3重复性实验
取平行6份广藿香供试品溶液，按“2.2”项条件分别测定，结果见表9，表明该方法重复性良好。
2.8.4稳定性实验
取同一广藿香供试品溶液，按“2.2”项条件进行，分别于制备后0、2、4、8、12、24h进样分析，结果见表9，表明广藿香供试品溶液中9种质控指标成分在24h内稳定。
表9-方法的重复性和稳定性
Figure BDA0003188240180000201
2.8.5加样回收率实验
取已知含量的广藿香粉末9份，每份1g，精密称定，按低、中、高浓度(0.5倍、1倍、1.5倍)，分别按“2.3.2”项方法制备9份供试品溶液，按“2.2”项条件进行分析，结果见表10，表明回收率试验符合要求。
表10-质控指标成分的加样回收率
Figure BDA0003188240180000202
Figure BDA0003188240180000211
2.8.6样品测定
按“2.3.2”项方法制备20批次广藿香样品溶液，按“2.2”项条件分别测定质控指标成分的含量，见表11。从表11中可知，20批次广藿香样品中各化合物的含量范围较大，表明不同来源的广藿香样品成分存在明显差异，其中，广藿香酮含量最高，新西兰牡荆苷、麦角甾苷、藿香黄酮醇、异麦角甾苷次之，绿原酸、鼠李柠檬素和壬二酸依此减少，芹菜素含量最低。
表11-广藿香样品中9种成分含量(mg/g)测定结果(n＝20)
Figure BDA0003188240180000221
2.9广藿香药材评价
采用权重分析法(AHP)确定成分的权重系数。经文献及化学数据库检索可知，藿香黄酮醇和广藿香酮是广藿香的特征性成分，且药理活性与广藿香药材密切相关，最为重要，归为1类，矩阵因子为1；麦角甾苷和异麦角甾苷两个苯丙素类在广藿香药材中含量较高，具有显著免疫调节、抗疲劳、神经保护和抗氧化活性，十分重要，因此归为2类，矩阵因子为2；新西兰牡荆苷、鼠李柠檬素和芹菜素三个黄酮类成分，因在其他药材中广泛存在，因此归为3类，矩阵因子设为3；壬二酸和绿原酸两个有机酸类成分，同样广泛分布于其他药材中，且含量较低，故归为4类，矩阵因子设为5。上述四类成分形成的判断矩阵，见表12。
表12-广藿香四类成分矩阵
Figure BDA0003188240180000231
采用AHP分析软件(yaahp，version 10.3)进行计算，求得1类、2类、3类和4类的权重系数分别为0.4871、0.2732、0.1335和0.1061。一致性比例CR＝0.012小于0.1，表明权重计算正确。得广藿香质量评价方程：Y＝0.4871×1类+0.2732×2类+0.1335×3类+0.1061×4类。
将表11中9个成分含量代入广藿香质量评价方程，计算出各批次的广藿香分数，数据见表11。根据表11，将20批次广藿香的9个成分均值代入广藿香质量评价方程，计算广藿香均值分数为1.2852。20批次中CZL(2.0964)、DSL(1.9102)、ZJ201911(1.4784)、TRT(1.4677)、ZJ202008(1.4525)、ZQ202006(1.4351)、ZJ202003(1.4144)、ZQ202004(1.2993)共计8个批次的广藿香分数高于均值分数1.2852，表明这8批广藿香的药材质量较好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种基于质谱技术的广藿香指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备广藿香指纹图谱供试品溶液：将广藿香药材粉碎，过3号筛，精密称定1 g粉末置具塞锥形瓶中，精密加入15 mL浓度为60%的甲醇，称定重量；浸泡30 min，再超声30 min，放冷，再次称定重量；之后用浓度为60%的甲醇补足减失重量，摇匀；最后取适量溶液于离心机中离心10min，离心的转速为14000 rpm/min，离心温度为10℃；离心后取上清液转移至进样瓶中，即得广藿香指纹图谱供试品溶液；
(2)采用高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用法测定广藿香指纹图谱供试品溶液，所述高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用法的色谱、质谱条件为：
色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC C18柱，150 mm×3.0 mm，2.7μm，流动相A:B为0.1%甲酸+5 mM乙酸铵水溶液:乙腈，梯度洗脱程序为0～5.00 min，95→90% A；5.00～25.00 min，90→80% A；25.00～35.00 min，80→70% A；35.00～50.00 min，70→55% A；50.00～60.00 min，55→50% A；60.00～70.00 min，50→35% A；70.00～73.00 min，35→10% A；73.00～75.00 min，10→2% A；75.00～77.00 min，2% A；77.00～77.10 min，2→95%A；77.10～80.00 min，95% A；流速为0.35 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为10 μL；
电喷雾离子源，负离子模式；毛细管电压：3500 V；喷嘴电压：1000 V；毛细管出口电压：150 V；锥孔电压：65 V；干燥气温度：300 ℃；干燥气流速：8 L/min；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：12 L/min；质量扫描范围：m/z 100～1000，碰撞能量梯度为10，20，40 eV；参比离子为：m/z 112.9856、966.0007；
(3)建立广藿香HPLC-Q-TOF/MS指纹图谱；
(4)确定色谱峰母离子的精确质量数和分子式，鉴定广藿香指纹图谱中共有成分的化学结构。
2.根据权利要求1所述的基于质谱技术的广藿香指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括：将采集得到的HPLC-Q-TOF/MS数据导出并整理为txt格式，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版相似度软件，获得由44个共有色谱峰构成的广藿香HPLC-Q-TOF/MS指纹图谱。
3.根据权利要求1所述的基于质谱技术的广藿香指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括：利用Agilent MassHunter软件处理数据，确定色谱峰母离子的精确质量数和分子式，检索Agilent PCDL、PubChem和MassBank数据库及现有文献进行质谱数据比对，人工解析其质谱裂解规律，再经对照品核对保留时间和质谱图确定化学结构，鉴定了广藿香29个共有成分。
4.一种基于质谱技术的广藿香多指标定量评价方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备广藿香多指标定量供试品溶液：将广藿香药材粉碎，过3号筛，精密称定1g粉末置具塞锥形瓶中，精密加入15 mL浓度为60%的甲醇，称定重量；之后浸泡30 min，超声30min，放冷，再次称定重量，然后用浓度为60%的甲醇补足减失重量，摇匀，取适量溶液于离心机中离心10 min，离心的转速为14000 rpm/min，离心温度为10 ℃；离心后精密吸取适量上清液，用浓度为60%的甲醇分别稀释100倍和500倍，转移至进样瓶中，得到两种稀释倍数的广藿香多指标定量供试品溶液；
(2)选定绿原酸、新西兰牡荆苷、麦角甾苷、异麦角甾苷、壬二酸、芹菜素、鼠李柠檬素、藿香黄酮醇和广藿香酮9个活性成分作为广藿香质量评价指标；
(3)采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法建立同时测定9个活性成分的多指标定量方法，所述超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法的色谱、质谱条件：
色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱，100 mm×2.1 mm，1.7μm，流动相A:B为0.2%甲酸水:乙腈，梯度洗脱程序为0～1.00 min，80% A；1.00～2.50 min，80→70% A；2.50～4.50 min，70→65% A；4.50～4.80 min，65→25% A；4.80～5.30 min，25% A；5.30～5.80min，25→15% A；5.80～7.50 min，15→5% A；7.50～9.50 min，5% A；9.50～9.51 min， 5→80% A；9.51～11.00 min，80% A；流速为0.25 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为2 μL；
电喷雾离子源，负离子模式；毛细管电压：2500 V；干燥气温度：325℃；干燥气流速：10L/min；雾化器压力：45 psi；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：11 L/min；扫描方式为多重反应监测；质谱参数如下表所示：
*代表定量离子；
(4)采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法测定步骤(1)的广藿香广藿香多指标定量供试品溶液中的9个活性成分；
(5)采用层次分析法将9个活性成分归为四类，赋予四类成分权重，获得广藿香质量评价方程：Y=0.4871×1类+0.2732×2类+0.1335×3类+0.1061×4类，将步骤(4)测定的9个活性成分的浓度换算为含量，根据分类结果代入方程，计算各批次广藿香分数并依此评价广藿香的质量；
其中1类为藿香黄酮醇和广藿香酮的含量之和，2类为麦角甾苷和异麦角甾苷的含量之和，3类为新西兰牡荆苷、鼠李柠檬素和芹菜素的含量之和，4类为绿原酸和壬二酸的含量之和，Y代表广藿香分数。
5.根据权利要求4所述的一种基于质谱技术的广藿香多指标定量评价方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：基于鉴定的广藿香主要成分，结合广藿香化学成分的药理活性，选定绿原酸、新西兰牡荆苷、麦角甾苷、异麦角甾苷、壬二酸、芹菜素、鼠李柠檬素、藿香黄酮醇和广藿香酮9种活性成分作为广藿香质量评价指标。
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