CN113777252A - 药物体外溶血性的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种药物体外溶血性的检测方法。所述方法包括以下步骤：S1：将受试物样品、2％血红细胞悬液和5％葡萄糖注射液混匀；S2：在37±1℃环境下孵育并收集结果。对于适用于0.9％氯化钠溶液配制后进行溶血性试验的受试物，本发明可作为替代方法；对于不适用于0.9％氯化钠溶液配制后进行溶血性试验的受试物，以本发明的方法可检测受试物的溶血性。
Description
技术领域
本发明涉及药物安全性检测评价技术领域，具体是一种药物体外溶血性的检测方法。
背景技术
溶血(Hemolysis)为由机械、热、化学或生物因素引起的红细胞破裂和血红蛋白逸出的现象，又称红细胞溶解。溶血性是指药物制剂引起的溶血和红细胞凝聚等反应，根据有无抗原抗体反应分为免疫性溶血反应和非免疫性溶血反应。免疫性溶血反应是指相关抗原与红细胞表面相应抗体结合，引起红细胞的破裂性溶血；非免疫性溶血反应则是由于各种理化因素的影响，如药物为诱发因素导致的氧化性溶血和药物制剂引起的血液稳态的改变而出现的溶血和红细胞凝聚等。用于非血管内途径给药的注射剂，临床上主要引起免疫性溶血；用于血管内给药的注射剂既可引起人体内免疫性溶血，也可引起非免疫性溶血。
溶血性试验(Hemolytic test)是血液学检测一项非常有意义的筛选试验，是药物进入市场前进行的安全性评价中的重要部分，因此溶血相关试验的探讨和讨论至关重要。某些药物注射剂，由于含有溶血成分或理化及生物因素等方面的影响，在直接注入血管后可产生溶血作用，也有些注射剂中因含有杂质等成分，注入局部会引起胀痛，注入血管后可引起血细胞凝聚，从而引起毒性反应及血液循环功能障碍等不良反应，甚至促使形成血栓，因此，凡是注射剂和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反应的其他药物制剂均应进行溶血性试验。药物溶血性试验的目的是通过观察是否发生溶血现象及其程度，来判断药物或相关制剂对血液中红细胞、补体系统、凝血因子和各种酶的活性等的影响。
目前的溶血性试验一般按照2005年3月生效的“化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则”进行，并且2015年《中国药典》第四部“注射剂安全性检查法应用指导原则”中规定了化学药品及中药注射剂临床使用的安全性和制剂质量可控性，包括药物注射剂的溶血与凝聚检查(通则1148)。然而随着近些年来我国大量新药的出现和国外药物的引进，现有的溶血性试验方法无法适用于所有类别的药物，在实际应用过程中有一定的局限性，比如某些药物在用0.9％的氯化钠注射液配制后的溶血试验中有析出，导致无法客观地评价试验管是否发生溶血，使阴性对照和被测受试物的检测结果不够准确。
中国专利申请CN104090083B，公告日2015.9.30，公开了一种化学药物体外溶血性的检测方法，使阳性对照在较短时间内观察到血细胞溶血完全，建立起可靠的阳性对照，而阴性对照无溶血现象或细胞凝聚现象发生，从而获得更为准确的受试物的溶血性的检测结果。然而，部分药物不适用于采用生理盐水配制后的溶血性试验，无法客观地评价受试物是否发生溶血。中国专利申请CN104897589A，公布日2015.09.09，公开了一种定量评估药物溶血性指标的方法，用测得的OD545nm值替代了常规方法中眼观结果，准确度高，能够定量检测，并且可以同时进行多种不同供试药品溶血性的检测。然而，部分药物不适用于采用生理盐水配制后的溶血性试验，无法客观地评价受试物是否发生溶血。
目前，对于采用生理盐水配制的溶血性试验无法客观评价是否发生溶血的受试药物，亟需一种药物溶血性试验方法，评价受试药物的溶血性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中缺少评价部分药物溶血性的试验方法的不足，提供一种药物体外溶血性的检测方法。对于不适用于0.9％氯化钠溶液配制后进行溶血性试验的受试物，可适用本发明的检测方法。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明的第一方面涉及一种药物体外溶血性的检测方法，包括以下步骤：
S1：将受试物样品、2％血红细胞悬液和5％葡萄糖注射液混匀；
S2：在37±1℃环境下孵育并收集结果。
所述的2％中的百分比为血液占血红细胞悬液的体积百分比。
所述的5％中的百分比为葡萄糖占葡萄糖注射液的质量百分比。
较佳地，步骤S1中还包括取2％血红细胞悬液和5％葡萄糖注射液的混合物为阴性对照，所述的5％葡萄糖注射液与所述的2％血红细胞悬液的体积比为1:(1～1.25)；优选为1:1。
较佳地，步骤S1中还包括取2％血红细胞悬液和去离子水的混合物作为阳性对照，所述的去离子水与所述的2％血红细胞悬液的体积比为1:(0.9～1.2)；优选为1:1。
本发明中，步骤S1中所述的取2％血红细胞悬液和5％葡萄糖注射液的混合物为阴性对照，所述的5％葡萄糖注射液与所述的2％血红细胞悬液的体积比为1:1.25时，缓冲体系总体积减少10％，在公认的±15％范围(毒理学试验体积误差范围公认为±15％)以内。
本发明中，所述的受试物为本领域常规所指的需要进行溶血性检测的血管内途径给药或非血管内途径给药的各类药物。同本领域常规一样，除另有规定外，临床用于非血管内途径给药的注射剂，以各药品使用说明书规定的临床使用浓度，用葡萄糖注射液1:3稀释后作为受试物溶液；用于血管内给药的注射剂以使用说明书规定的临床使用浓度作为受试物溶液。
同本领域常规一样，所述的用于体外溶血性试验的血红细胞悬液较佳地为取自兔的血红细胞悬液，所述兔优选新西兰白兔。
所述新西兰白兔的血红细胞悬液的制备方法如下：
(1)将新西兰白兔用3％戊巴比妥钠进行麻醉，然后对动物进行心脏采血，随后放血处以安乐死；
(2)采集5mL兔血，放入盛有玻璃珠的三角烧瓶中轻轻振摇10分钟，除去纤维蛋白，使之成脱纤维蛋白血；
(3)将制备好的脱纤维蛋白血转移至试管中，加入约10倍体积的5％葡萄糖注射液，混匀，室温下1500rpm离心15分钟，弃去上清液，如此反复数次，直至上清液不呈红色为止；
(4)将上清液倒去，量取红细胞的容积，加入5％葡萄糖注射液将所得红细胞稀释为2％红细胞悬液供试验用。
步骤S1中所述的受试物样品如本领域常规所述，如可以按照2005年3月生效的《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》，选取若干个体积的受试物样品和相对于的血红细胞悬液和葡萄糖注射液的体积，使各浓度梯度的样品混合液的最终总体积一致；另外，阴性对照和阳性对照也包括相同体积的血红细胞悬液及葡萄糖注射液或去离子水，以保持与样品混合液的总体积一致。
步骤S1中，在所述的向加入受试物样品的试管中依次加入2％血红细胞悬液和葡萄糖注射液的操作中，所述的受试物样品包括n个体积，分别为X、2X、…、nX，所述的5％葡萄糖注射液的体积分别为24X、23X、…、(25-n)X，所述的2％血红细胞悬液的体积均为25X；在所述的取2％血红细胞悬液和5％葡萄糖注射液的混合物作为阴性对照的操作中，所述的5％葡萄糖注射液和2％血红细胞悬液的体积均为25X；在所述的取2％血红细胞悬液和去离子水的混合物作为阳性对照的操作中，所述的去离子水和2％血红细胞悬液的体积均为25X。
其中，所述的n为大于等于3并且小于等于20的整数；
所述的X为0.1～0.2mL。
较佳地，在所述的向加入受试物样品的试管中依次加入2％血红细胞悬液和5％葡萄糖注射液的操作中，所述的受试物样品包括5个体积，分别为X、2X、3X、4X和5X，所述的5％葡萄糖注射液的体积分别为24X、23X、22X、21X、20X，所述的2％血红细胞悬液的体积均为25X；在所述的取2％血红细胞悬液和5％葡萄糖注射液的混合物作为阴性对照的操作中，所述的5％葡萄糖注射液和2％血红细胞悬液的体积均为25X；在所述的取2％血红细胞悬液和去离子水的混合物作为阳性对照的操作中，所述的去离子水和2％血红细胞悬液的体积均为25X，所述的X为0.1mL。
较佳地，步骤S2中所述的孵育的温度为37℃。
步骤S2中所述的收集结果为通过观察获得结果并收集；
较佳地，所述观察为在孵育过程中每隔一定时间肉眼观察各试管的溶血情况并记录观察时间和观察结果。
较佳地，在孵育的第1小时每15分钟观察1次，1小时后，每隔1小时观察1次，孵育结束的同时结束观察。一般来说，孵育3小时，观察3小时即可。
所述溶血情况的判断原则依据本领域常规进行，如可以按照2005年3月生效的《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》，即当阴性对照无溶血和凝聚发生，阳性对照有溶血发生时，若受试物溶液在3小时内不发生溶血和凝聚，则受试物可以注射使用；若受试物溶液在3小时内发生溶血或凝聚，受试物则不宜注射使用。
对于所述溶血和凝聚的判断，可以依照下述原则进行：若试验中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，表明有溶血发生；如红细胞全部下沉，上清液体无色澄明，表明无溶血发生。若溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散，表明有红细胞凝聚发生。如有红细胞凝聚的现象，可按下法进一步判定是真凝聚还是假凝聚。若凝聚物在试管振荡后又能均匀分散，或将凝聚物放在载玻片上，在盖玻片边缘滴加2滴0.9％氯化钠溶液，置显微镜下观察，凝聚红细胞能被冲散者为假凝聚，若凝聚物不被摇散或在玻片上不被冲散者为真凝聚。
本发明的第二方面涉及一种葡萄糖注射液在制备药物体外溶血试验试剂中的应用。
所述的葡萄糖注射液为5％葡萄糖注射液。
所述的百分比为葡萄糖占葡萄糖注射液的质量百分比。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：对于适用于0.9％氯化钠溶液配制后进行溶血性试验的受试物，本发明可作为替代方法；对于不适用于0.9％氯化钠溶液配制后进行溶血性试验的受试物，以本发明的方法可检测受试物的溶血性。在较佳实施方案中，使阳性对照观察到血细胞溶血完全，而阴性对照无溶血现象或细胞凝聚现象发生，从而获得更为准确的受试物体外溶血性试验的检测结果。
附图说明
图1为实施例1实验结果示意图。
图2为对比例1实验结果示意图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例和对比例中所用的葡萄糖注射液购自安徽双鹤药业有限责任公司，批号：19102605V，失效期：2022.10.01；受试物为盐酸莫西沙星注射液购自成都天台山制药有限公司，为黄色的澄明液体，批号：11190724，失效期：2021.07.10；所用的0.9％氯化钠注射液购自安徽双鹤药业有限责任公司，批号：190212，失效期：2022.02.01。
实施例1
1.取新西兰白兔兔血5mL(邳州市东方养殖有限公司，SPF级，白色(毛色)，品系102)，放入盛有玻璃珠的三角烧瓶中轻轻振摇10分钟，除去纤维蛋白，使之成脱纤维蛋白血；加入约10倍体积的5％葡萄糖注射液，混匀，室温下1500rpm离心15分钟，弃去上清液，如此反复数次，直至上清液不呈红色为止；将上清液倒去，加入5％葡萄糖注射液将所得红细胞稀释为2％红细胞悬液供试验用。
2.取试管7支，分别编号1～7，分别按表1加入各种溶液混合。其中，1～5为受试物样品管，6为阴性对照管，7为阳性对照管。
表1
3.将各管混匀，置于恒温37℃水浴中孵育3小时，按照表2时间点进行肉眼观察并记录结果。结果发现：管1～6(受试物管和阴性对照管)上层液体澄清，未发生溶血，管7(阳性对照管)未见红细胞，溶血完全，具体的溶血情况如图1所示。
表2
注：“-”：不溶血及红细胞不凝聚；“+”：溶血(溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留)；“△”：凝聚。
对比例1
1.取兔血5mL，放入盛有玻璃珠的三角烧瓶中轻轻振摇10分钟，除去纤维蛋白，使之成脱纤维蛋白血；加入约10倍体积的5％葡萄糖注射液或0.9％氯化钠注射液，混匀，室温下1500rpm离心15分钟，弃去上清液，如此反复数次，直至上清液不呈红色为止；将上清液倒去，加入5％葡萄糖注射液或0.9％氯化钠注射液将所得红细胞稀释为2％红细胞悬液供试验用。
2.取试管4支，分别编号1～4，分别按表3加入各种溶液。其中，1、2为阴性对照管，3、4为阳性对照管；1、3为0.9％氯化钠注射液处理组，2、4为5％葡萄糖注射液处理组。
表3
3.将各管混匀，置于恒温37℃水浴中孵育3小时，按照表4时间点进行肉眼观察并记录结果。结果发现：管1和2(阴性对照管)上层液体澄清，未发生溶血，管3和4(阳性对照管)未见红细胞，溶血完全，具体的溶血情况如图2所示。
表4
注：“-”：不溶血及红细胞不凝聚；“+”：溶血(溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留)；“△”：凝聚。
实施例1和对比例1的结果说明，应用0.9％氯化钠注射液和5％葡萄糖注射液配制后进行体外溶血性试验，阴性对照无溶血现象或细胞凝聚现象发生，阳性对照未见红细胞，且溶血完全，表明应用5％葡萄糖注射液体系进行溶血试验与0.9％氯化钠体系阴性和阳性对照结果相同，从而使受试物体外溶血性试验的检测体系更为全面。
Claims (10)
1.一种药物体外溶血性的检测方法，其特征是，包括以下步骤：
S1：将受试物样品、2％血红细胞悬液和5％葡萄糖注射液混匀；
S2：在37±1℃环境下孵育并收集结果；
所述的2％中的百分比为血液占血红细胞悬液的体积百分比；
所述的5％中的百分比为葡萄糖占葡萄糖注射液的质量百分比。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征是，步骤S1中还包括取2％血红细胞悬液和5％葡萄糖注射液的混合物为阴性对照；
较佳地，所述的5％葡萄糖注射液与所述的2％血红细胞悬液的体积比为1:(1～1.25)；优选为1:1。
3.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征是，步骤S1中还包括取2％血红细胞悬液和去离子水的混合物作为阳性对照；
较佳地，所述的去离子水与所述的2％血红细胞悬液的体积比为1:(0.9～1.2)；优选为1:1。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征是，步骤S1中所述的2％血红细胞悬液和5％葡萄糖注射液依次加入受试物样品中；
较佳地，所述的受试物样品包括n个体积，分别为X、2X、…、nX，所述的5％葡萄糖注射液的体积分别为24X、23X、…、(25-n)X，所述的2％血红细胞悬液的体积均为25X；
所述的2％血红细胞悬液和5％葡萄糖注射液在阴性对照的操作中体积均为25X；
所述的2％血红细胞悬液和去离子水在阳性对照的操作中体积均为25X；
其中，所述的n优选为大于等于3并且小于等于20的整数；
所述的X优选为0.1～0.2mL。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征是，所述的n为5，所述的X为0.1mL。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征是，所述的2％血红细胞悬液为取自兔的血红细胞悬液；优选为取自新西兰白兔的血红细胞悬液；
和/或，所述的2％血红细胞悬液的制备方法包括：将兔的成脱纤维蛋白血用10倍体积的5％葡萄糖注射液混匀、离心、洗涤后制成2％血红细胞悬液。
7.如权利要求1～6任一项所述的检测方法，其特征是，步骤S2中，所述的孵育的温度为37℃。
8.如权利要求1～6任一项所述的检测方法，其特征是，步骤S2中，所述的收集结果为通过观察获得结果并收集；
较佳地，所述的观察为：在孵育的第1小时内每15分钟观察1次；1小时后，每隔1小时观察1次，孵育结束的同时结束观察；
更佳地，所述的孵育的时间为3小时。
9.一种葡萄糖注射液在制备药物体外溶血试验试剂中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征是，所述的葡萄糖注射液为5％葡萄糖注射液；
所述的百分比为葡萄糖占葡萄糖注射液的质量百分比。
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2020
- 2020-07-13 CN CN202010669860.XA patent/CN113777252A/zh active Pending
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