CN109085330A - 一种基于体外红细胞模型精准评价抗氧化健康效益的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于体外红细胞模型精准评价抗氧化健康效益的方法，包括以下步骤：(1)体外红细胞的制备；(2)分组、氧化应激诱导及供试品给药处理，建立模型组、空白对照组及供试组，孵育后离心收集红细胞；(3)测定上述各组的红细胞溶血率，并测量其中的辅酶浓度；(4)各组体外红细胞的IPDR值计算；(5)供试品的健康效益判别。本发明通过对该评价方法整体的方法流程设置，以及作为重要判定依据的辅酶种类等进行改进，与现有技术相比，可针对内源氧化‑还原网络的关键节点，在考虑外源抗氧化剂的细胞生理响应的情况下，综合外源抗氧化剂对细胞氧化‑还原平衡及细胞代谢的影响，从而得出能够全面反应被测物质抗氧化健康效益的HI值。

Description

一种基于体外红细胞模型精准评价抗氧化健康效益的方法

技术领域

本发明属于食品、药品药效及副作用评估技术领域，更具体地，涉及一种基于体外红细胞模型精准评价抗氧化健康效益的方法，该方法尤其可用于评价天然产物的抗氧化健康效益。

背景技术

当前“大健康”领域中，越来越提倡通过各种非药物途径预防慢性疾病，进一步提高生命质量、及延缓衰老，其中通过健康饮食的生活方式干预是其中最重要的途径之一。健康饮食既包括蔬菜水果为主的所谓“生机饮食”，也包括流传久远的中医食疗文化，既涉及疾病人群、也涉及广大的亚健康人群，相关领域的科学研究正得到极大的关注。但饮食如何改善健康？确实是一直以来的健康大命题。“健康食品”一般富含天然抗氧化成分，九成以上的健康食品通过体外检测具有“抗氧化”作用，但由于缺乏有效的评价方法，人们对这些“天然抗氧化剂”的体内健康效益及其作用的精确靶点或途径尚缺乏有效的认识，这也是导致目前民众对功能食品的接受度和认知度比较低的主要科技方面的原因。

氧化-还原的平衡是生命体维持正常新陈代谢、能量平衡及机体免疫的基础。目前评价膳食抗氧化剂健康效益基本上是基于“衰老及慢性病的自由基学说”，对提取物或单一成分进行抗氧化活性评价。常用的方法主要有体外的直接化学抗氧化测定和整体动物血液或肝脏抗氧化酶活性分析法。也有在前者的基础上，用体外肝癌细胞(例如HeGp2)或者红细胞做模型，考察抗氧化剂对化学自由基引发剂所产生的活性氧自由基(ROS)的清除及对细胞膜的保护能力，但这些方法要么未考虑外源抗氧化剂的细胞生理响应，要么未能针对内源氧化-还原网络的关键节点，因而不能代表外源抗氧化剂对细胞氧化-还原平衡及细胞代谢的影响，因而很难代表所测物质的健康效益。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种基于体外红细胞模型精准评价抗氧化效益的方法，其中通过对评价整体的方法流程设置，以及作为重要判定依据的辅酶种类等进行改进，与现有技术相比，可针对内源氧化-还原网络的关键节点，在考虑外源抗氧化剂的细胞生理响应的情况下，综合外源抗氧化剂对细胞氧化-还原平衡及细胞代谢的影响，从而得出能够全面反应被测物质(如膳食提取物、膳食成分、药品提取物或药品成分)其抗氧化健康效益的HI值。

为实现上述目的，按照本发明，提供了一种基于体外红细胞模型精准评价抗氧化健康效益的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)体外红细胞的制备：采集哺乳动物静脉血离心收集压积红细胞，将压积红细胞定量悬浮到红细胞等渗溶液稀释得到含红细胞8％-15％(V/V)的红细胞悬液；

(2)分组、氧化应激诱导及供试品给药处理：

分组具体是将所述红细胞悬液分为三组，并对它们进行氧化应激诱导及供试品给药处理从而得到模型组、空白对照组及供试组共三组，其中，

所述模型组具体是向红细胞悬液中加入红细胞氧化应激诱导剂，该红细胞氧化应激诱导剂为诱导剂与红细胞等渗溶液的混合物；

所述空白对照组具体是向红细胞悬液中仅加入红细胞等渗溶液；

所述供试组具体是向红细胞悬液中加入供试品与所述红细胞氧化应激诱导剂的混合物，所述供试品包括膳食提取物、经过纯化后的膳食单一抗氧化成分、或天然药物提取物中的至少一种；

所述模型组、所述空白对照组及所述供试组中，任意一组中压积红细胞的含量均在2-5％(V/V)，

将这三组在无菌条件下37℃孵育24-48h，然后离心收集红细胞；

(3)体外红细胞生化分析及样品制备：

测定上述各组的红细胞溶血率，若溶血率满足5-30％范围则分别收集上述各组红细胞，制备用于分析各组红细胞中NAD、NADH、NADP、及NADPH四个辅酶化合物浓度的样品；然后测量各组样品的辅酶浓度；

(4)各组体外红细胞的IPDR值计算：

将测得的辅酶浓度值代入公式(1)中，分别计算所述模型组、所述空白对照组及所述供试组的IPDR值，并分别记为Xm、Xc、Xi；

所述公式(1)中，NAD⁺代表测得的NAD辅酶浓度，NADH代表测得的NADH辅酶浓度，NADP⁺代表测得的NADP⁺辅酶浓度，NADPH代表测得的NADPH辅酶浓度；

(5)供试品的健康效益判别：

将Xm、Xc、Xi代入公式(2)计算HI，进行供试品的健康效益判别；

所述公式(2)中，Xmin为Xm与Xc中的小值，Xmax为Xm与Xc中的大值。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中，在采集哺乳动物静脉血后是先进行抗凝处理再进行离心收集压积红细胞；所述红细胞等渗溶液为所含葡萄糖终浓度为5mM的葡萄糖与质量百分浓度为1.4％的碳酸氢钠混合溶液、或所含葡萄糖终浓度为5mM的葡萄糖与生理盐水的混合溶液、或所含葡萄糖终浓度为5mM的葡萄糖与PBS缓冲液的混合溶液；

所述红细胞悬液还经过孵育处理，该孵育处理具体是在无菌条件下，37℃孵育2-10h。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中，分组处理时，任意一组均包括多个平行样品，任意一个样品均包含150-300μL的红细胞悬液，

对于所述模型组，加入的所述诱导剂能够满足使该模型组在无菌条件下37℃孵育24h内的溶血率控制在5-30％范围；

所述诱导剂与红细胞等渗溶液的混合物具体为所含葡萄糖终浓度为280mM的葡萄糖与质量百分浓度为1.4％的碳酸氢钠混合溶液、或者所含葡萄糖终浓度为150mM的葡萄糖与PBS缓冲液的混合溶液，或者所含葡萄糖终浓度为150mM的葡萄糖与生理盐水的混合溶液；

在所述供试品与所述红细胞氧化应激诱导剂的混合物中，所述膳食提取物和所述天然药物提取物均是按终浓度为1-10mg固体/ml的添加量溶解在红细胞氧化应激诱导剂中，所述经过纯化后的膳食单一抗氧化成分则是先用DMSO溶解，再用红细胞氧化应激诱导剂稀释至终浓度为10-100μM。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(3)中，所述辅酶浓度的测量方法为试剂盒法、HPLC法及UPLC-MS/MS方法中的任意一种，优选为UPLC-MS/MS方法；

该UPLC-MS/MS方法的制样处理过程主要包括以下步骤：

(a)将所述述步骤(2)中收集到的红细胞样品在-80℃和常温之间反复冻融2-5次，并进一步在4℃超声10-30秒，使红细胞完全破碎；

(b)取出150-300μL的细胞破碎液，向其中加入3倍体积的预冷提取液，该提取液是乙腈与乙酸铵浓度为50mM的乙酸铵水溶液按体积比3:1混合得到的混合液，然后涡旋震荡30秒-1min，充分混匀提取；

(c)在4℃温度下10000-12000rpm离心10-15min小心的吸取200-600μL上清，利用超低温真空浓缩仪真空冷冻干燥得到粗提物；

(d)向得到的粗提物中加入150-300μL预冷的乙酸铵浓度为50mM的乙酸铵溶液，然后涡旋震荡30秒-1min进行重新溶解，接着将溶解液在4℃、10000-12000rpm离心10-15min，取上清用0.45μm水相滤膜过滤，滤液用于采用UPLC-MS/MS方法分析NAD⁺、NADH、NADP⁺、NADPH含量。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(4)还包括统计学分析，所述模型组的IPDR值Xm与所述空白组的IPDR值Xc经统计学分析后呈现出差异，满足p≤0.05，优选满足p≤0.001。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中，分组处理时，所述供试组包括至少三个平行样品；所述步骤(4)还包括统计学分析，对于所述供试组中的IPDR值Xi，各个平行样品之RSD小于10％。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(4)得到的Xm、Xc满足Xm<Xc；所述步骤(5)中，对于所述公式(2)，所述模型组的IPDR值Xm定义为Xmin，所述空白对照组的IPDR值Xc定义为Xmax；

当依据所述公式(2)计算得到的HI>1时，赋值HI＝1；当依据所述公式(2)计算得到的HI<0时，则赋值HI＝0，使得HI的数值范围满足0～1。

本发明中一种基于体外红细胞模型精准评价抗氧化健康效益的方法，针对现有技术的空白建立了一种体外评价膳食或者天然药物中抗氧化成分(如各种天然抗氧化剂)其健康效益的方法体系，该体系所得的定量指标可以广泛的用于天然药物、功能食品、药食两用食品中混合物及单一成分的健康效益预测及科研分析，从而达到选择性精准提高内源抗氧化活性的目的，指导人们合理组方生产功能食品或者精良加工健康食品，现有技术中目前还没有基于这个角度去评价和筛选天然活性物质的思路和方法。

本发明一种基于体外红细胞模型精准评价抗氧化健康效益的方法，相关领域的难点在于一般方法或体外测定抗氧化能力的途径很难模拟被测提取物或成分的生物学效益，而本发明通过选择的体外特殊孵育的红细胞(即体外不同的氧化应激诱导及供试品给药处理条件下的红细胞)，观测其中对细胞代谢和氧化还原中起重要枢纽作用的二对辅酶的浓度变化，再通过理论预测建立的数学模型的推算，将受试红细胞的健康状态通过针对性的检测和分析建立有效的关联；同时，测定细胞中微量存在的四个辅酶浓度，通过对制样方法及分析技术进行进一步优选控制，能够有效确保测定准确度。因此，本发明所涉及的健康评价方法，从根本上不同于传统的体外抗氧化化学分析，也不同于体内抗氧化酶的分析，可以用来在体外评价供试品综合的红细胞健康效益。

考虑到细胞状态受各种因素影响，因此本发明采用同批次测定模型对照组和空白对照组的IPDR值进行相对比较；并且本发明在对各组体外红细胞的IPDR值进行计算时，还可优选通过统计学分析来验证，其中Xm与Xc经统计学分析呈现差异(即p≤0.05；尤其是显著差异，即p≤0.001)为实验建模成功的标志，Xi的平行样之RSD小于10％为实验精密度的标志。

依据本发明方法得到的供试品的HI其数值范围优选为0-1，在此范围内，HI值越大，健康效益越大，供试品对细胞氧化应激的综合性保护及平衡作用越强。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明中基于体外红细胞模型精准评价抗氧化健康效益的方法，概括来说，该方法是用体外孵育的哺乳动物红细胞，优选施加温和的氧化压力(温和氧化应激的诱导指标可以以24h内的溶血率控制在5-30％范围为主要条件)，以仅加入红细胞等渗溶液的红细胞作为模型对照组，以不加氧化诱导剂和膳食成分的红细胞等渗液为空白对照组，在10-30％溶血率条件下，与膳食提取物或成份的红细胞等渗溶液共同孵育24-48h，然后离心将红细胞收集。加入冰冷的提取液1(如，乙腈：50mM乙酸铵＝3:1体积比混合得到的提取液，其中50mM乙酸铵为乙酸铵浓度为50mM的乙酸铵水溶液)到红细胞样品中，在常温和-80度反复冻融三次，使红细胞在低温下彻底破碎，离心，上清液经减压冷冻干燥后，用溶液2(如，50mM的乙酸铵溶液)溶解，用于分析红细胞的NAD、NADH、NADP、及NADPH的浓度，这些辅酶浓度的测定方法可以选择试剂盒法、HPLC-荧光检测，及UPLC-MS方法，基于检测灵敏度的考虑优先采用UPLC-MS方法。将测得的辅酶浓度代入计算公式1，计算出IPDR值，得到实验所得的样品、模型对照组、空白对照组的IPDR值，记这三者的IPDR值分别为Xi、Xm、Xc，代入公式2，推算HI和进行健康效益判别。在同一批实验中，HI值越高，被测物质对细胞氧化应激及综合性保护作用越高，健康效益越高。

其中，公式1具体如下：

公式2具体如下：

公式(2)中，Xmin为模型对照组IPDR值Xm与空白对照组IPDR值Xc两者中的小值，Xmax为模型对照组IPDR值Xm与空白对照组IPDR值Xc两者中的大值；优选的，Xm＝Xmin，Xc＝Xmax。

更具体的话，该方法可以包括以下具体步骤：

(1)体外红细胞制备与孵育，其中所述体外红细胞可以是采集哺乳动物静脉血5ml左右经过抗凝处理，离心后所收集的压积红细胞层。将压积红细胞定量悬浮到红细胞等渗溶液稀释至诸如含红细胞10％(V/V)，无菌条件下，37℃孵育10h左右。

所述的红细胞等渗溶液为所含葡萄糖终浓度为5mM的葡萄糖与质量百分浓度为1.4％的碳酸氢钠混合溶液、或所含葡萄糖终浓度为5mM的葡萄糖与生理盐水的混合溶液、或所含葡萄糖终浓度为5mM的葡萄糖与PBS缓冲液的混合溶液中的至少一种；

(2)分组、氧化应激诱导及供试品给药处理，所述分组是指将上述10％红细胞悬液分为模型组、空白对照组及供试组，每组可以有三个平行样，每个样品可以包含150-300μL压积红细胞，红细胞在等渗溶液中的含量在2-5％(V/V)，温和氧化应激的诱导指标以24h内的溶血率控制在5-30％范围为主要条件；

所述模型组是指加入红细胞温和氧化应激诱导剂的红细胞对照组，其中红细胞氧化应激诱导剂是指诱导剂与红细胞等渗溶液的组合，可以是组合1(葡萄糖+PBS，最终的葡萄糖浓度为150mM)、组合2(葡萄糖+1.4％碳酸氢钠，最终的葡萄糖浓度为280mM)、或组合3(葡萄糖+生理盐水，最终的葡萄糖浓度为150mM)中的一种；以不加诱导剂及供试品的红细胞等渗溶液为空白对照组。模型组中，诱导剂种类和含量都会很大影响造模结果，本发明优选以加入诱导剂能够满足使该模型组在无菌条件下37℃孵育24h内的溶血率控制在5-30％范围为判断及格的标准，并优选上述3个组合中的任意一个。

所述供试组是指包括有待测物(该待测物可以是膳食提取物、经过纯化后的膳食单一抗氧化成分、或天然药物提取物中的至少一种)；提取物添加量为1-10mg固体/ml溶解在红细胞等渗液，经过纯化后的膳食单一抗氧化成分先用DMSO溶解，再用红细胞等渗液稀释至终浓度为10-100μM；无菌条件下37℃孵育24-48h，然后离心将红细胞收集。

(3)体外红细胞生化分析及样品制备。先测定上述各组红细胞溶血率，若溶血率满足5-30％范围，则分别收集上述各组红细胞，制备用于精确分析红细胞中四个辅酶化合物NAD、NADH、NADP、及NADPH浓度的样品。这些辅酶浓度的测定方法可以选择试剂盒法、HPLC法，及UPLC-MS方法，基于检测灵敏度的考虑优先推荐UPLC-MS方法。

通过溶血率判断细胞体系的细胞活性，是建模和评价的前提，若溶血率不满足5-30％范围，则需要调整上述步骤(1)、(2)中的条件参数设置，直到满足要求。

(4)各组体外红细胞的IPDR值计算及统计学分析

代入公式(1)，推算模型组、空白对照组及供试组的IPDR值，分别记为Xm，Xc，Xi。

(5)供试品健康效益判别。

代入公式(2)计算HI，进行健康效益判别。

以下为具体实施例：

实施例一：类黄酮化合物的健康效益评价

选取槲皮素、槲皮苷、金丝桃苷、芦丁、儿茶素、表儿茶素等六个类黄酮天然产物作为评价对象，它们的结构亚类分别代表黄酮、黄酮苷、及黄烷-3--醇。

评价方法具体包括以下步骤：

1.体外红细胞制备与孵育

采集新西兰大白兔耳静脉血5ml左右，用涂布了抗凝剂的采血管收集血液，900g、4℃离心10min，除去上层血浆及泡沫细胞，收集红细胞层。压积的红细胞用生理盐水(0.9％的氯化钠溶液)和含葡萄糖5mM的混合溶液作为等渗溶液稀释至含红细胞10％(V/V)，无菌条件下，37℃孵育10h左右。

2.分组、氧化应激诱导及供试品给药处理

将红细胞分为模型组、空白对照组及供试组，每组三个平行样，每个样品包含150μL红细胞。以葡萄糖终浓度为150mM的PBS溶液为氧化应激诱导剂，加入诱导剂的红细胞作为模型对照组，使得红细胞在PBS等渗液的含量在5％(V/V)，孵育20h，测定体外红细胞的溶血率；以不加诱导剂及供试品的红细胞等渗溶液为空白对照组；上述类黄酮化合物添加到红细胞模型后的共孵育组为供试组，将类黄酮溶解在DMSO水溶液(1:2，V/V)中，再用PBS等渗液稀释后添加到红细胞模型中，使各化合物的终浓度量为50μM；无菌条件下37℃孵育24h，然后900g、4℃离心10min，上清用于分析溶血率，下层红细胞收集备分析。

3.体外红细胞生化分析及样品制备

3.1红细胞溶血率分析

上述上清液用PBS溶液稀释一倍，然后在540nm处测定吸光度OD值。以540nm处的PBS溶液OD值为空白对照。

红细胞溶血率(％)＝(实验组OD值-空白组OD值)/(完全溶血组OD值-空白组OD值)×100％

这里，完全溶血组是指150μL的红细胞，直接加入去离子水，将其体积补充到和受试组相同，测定10min后的540nm处OD值。

3.2用于四个辅酶化合物分析的样品制备方法

(1)将上述步骤2中收集到的红细胞样品在-80℃和常温之间反复冻融3次，并进一步在4℃超声30秒，使红细胞完全破碎；

(2)取出150μL的细胞破碎液，向其中加入3倍体积的预冷提取液(乙腈：50mM乙酸铵＝3:1)，涡旋震荡1min，充分混匀提取(所有操作均需要保持在温度不超过例如4℃的低温状态)；

(3)在4℃温度下12000rpm离心15min小心的吸取400μL上清，利用超低温真空浓缩仪真空冷冻干燥得到粗提物。

(4)向得到的粗提物中加入150μL预冷的50mM的乙酸铵溶液，涡旋震荡1min进行重新溶解，溶解液在4℃、12000rpm离心15min，取上清用0.45μm水相滤膜过滤，滤液用于UPLC-MS/MS方法分析NAD⁺、NADH、NADP⁺、NADPH含量。

3.3四个辅酶化合物NAD、NADH、NADP、及NADPH浓度的精确分析

可以利用UPLC-MS/MS方式进行，检测系统可以选择AB Sciex Triple Quad^TM4500LC-MS分析系统(AB Sciex pte.Ltd)，UPLC色谱柱可以为Aglent C18 ZORBAX SB-Aq 2.1×100mm，1.8μm，选择25mM氨水溶液作为A相，B相选择乙腈，洗脱程序为：0min 99％A 1％B；3min 96％A 4％B；3.1min 96％A 4％B；4min 99％A 1％B；5min 99％A 1％B，检测波长为260nm 340nm，进样体积5μL，流速设定为0.2mL/min。用MS/MS的多反应监测正离子模式检测对两对辅酶。定量的条件依次是NAD⁺母离子m/z664，子离子m/z 542.1；NADH母离子m/z666，子离子m/z 649.2；NADP⁺母离子m/z 744，子离子m/z 603.9；NADPH母离子m/z 746，子离子m/z 729。

4.各组体外红细胞的IPDR值计算及统计学分析

将测定所得NAD、NADH、NADP、及NADPH浓度代入公式(1)，推算各自的IPDR值，分别记为Xm，Xc，Xi，可采用SPSS16.0统计软件，进行单因素方差分析(ANOVA)。Dunnett法可用来比较各处理组与对照组的差异，各组间两两比较采用LSD、SNK法(方差齐)，或Dunnett’s T3法(方差不齐)。每个实验均重复3次以上，数据表现采用平均值±标准差的形式，p≤0.05表示有统计学差异。其中Xm与Xc经统计学分析呈现显著差异(如，p≤0.001)，Xi的平行样RSD小于10％；

5.供试品健康效益判别。

将IPDR值代入公式(2)计算HI，进行健康效益判别。定义Xm＝Xmin，Xc＝Xmax，当供试样HI>1时，赋值HI＝1；当HI<0时，赋值HI＝0。供试品的HI的数值范围为0-1，在此范围内，HI值越大，健康效益越大，供试品对细胞氧化应激的综合性保护及平衡作用越强。

6.供试品与细胞结合分析

取200μL红细胞，用PBS溶液稀释成10％的红细胞悬液(v/v)，加入上述类黄酮化合物的PBS溶液，使类黄酮的终浓度为50μM。37℃的培养箱孵育10min，然后1000g、4℃下离心10min，分别收集上清和红细胞层进行制样，分析多酚浓度。

上清液用3倍体积的预冷的乙酸乙酯萃取其中没有结合的多酚，重复萃取操作2遍，把得到的乙酸乙酯萃取液低温真空挥干待测。红细胞沉淀经过离心洗涤2次(10倍于红细胞体积的PBS，1000g，4℃，5min离心)，用于分析结合到红细胞上的多酚。红细胞用1倍体积的PBS悬浮，反复冻融充分裂解3遍，与红细胞结合的多酚单体用3倍体积的冷的乙酸乙酯萃取3遍，合并三次萃取的乙酸乙酯低温真空挥干。

向挥干后的样品加入200μL 10％乙醇溶液，充分震荡让提取物最大程度的溶解在乙醇溶液中，向再次溶解的提取物中加入50μL Folin reagent，5min后加入150μL，25％碳酸钠，室温放置10min分钟，4℃，1800g离心5min，取上清液在760nm下测定吸光度，利用200μL 10％乙醇溶液加入50μL Folin reagent和150μL，25％碳酸钠作为空白对照，利用没食子酸标准曲线来计算出类黄酮单体的浓度。

类黄酮化合物在红细胞上的结合率＝结合的类黄酮化合物的量/(未结合的类黄酮化合物的量+结合的类黄酮化合物的量)×100％。

7.实验结果

7.1类黄酮化合物对红细胞溶血的保护作用

表1类黄酮化合物对红细胞溶血的保护作用结果

7.2四个辅酶化合物浓度及比例分析结果

表2类黄酮化合物对体外红细胞四个辅酶化合物浓度及比例影响结果

7.3IPDR计算结果及统计分析

表3类黄酮化合物对体外红细胞辅酶的IPDR影响结果

其中空白组与模型组的IPDR值呈现极显著差异(P<0.001),各平行样的RSD均小于10％，表明造模成功，数据可靠。

7.4六个类黄酮化合物在本实验模型中的HI计算结果健康效益评价结果

表4六个类黄酮化合物健康效益评价结果

由表3、表4可以看出，六个类黄酮化合物在本实验模型中的IPDR值与HI健康效益排序一致，其中槲皮素和槲皮苷的HI值最大，从HI值判断的六个类黄酮的健康效益排序为槲皮素＝槲皮苷、金丝桃苷、儿茶素、芦丁、表儿茶素。

7.6六个类黄酮化合物在细胞上结合特性分析

表5六个类黄酮化合物在体外红细胞上的结合率分析结果

由表5可以看到，不同亚结构的类黄酮化合物在红细胞膜上的结合率呈现明显的差异，槲皮素及其单糖苷——槲皮苷和金丝桃苷的结合率最强，芦丁为槲皮素的二糖苷，结合力次之，黄烷-3-醇(儿茶素及表儿茶素)的结合率次之。这个结合规律基本上与文献报道相一致(Fiorani,2005)，尽管我们选择的类黄酮与该文献所涉及的类黄酮不完全一样，例如，我们选择了槲皮苷和金丝桃苷，他们的实验中并未涉及糖苷，槲皮素、芦丁、儿茶素在本实验中的结合率大小规律与他们相同，即，黄酮类结合率大于黄烷类。

7.7类黄酮化合物在本模型中的健康效益与它们的红细胞结合特性的关系

Fiorani(2005)等人的报道也显示，类黄酮的红细胞结合能力与它们的红细胞跨膜总供电子能力正相关，而细胞膜结合率又与类黄酮化合物各自的结构直接相关，这样，类黄酮化合物的红细胞跨膜总供电子活性的大小根本上起源于它们与细胞膜选择性的结合能力。

本实施例通过类黄酮添加到体外红细胞氧化应激模型的试验，进一步分析红细胞中辅酶响应的含量变化，整合的IPDR值规律与这些类黄酮在细胞膜上的结合率特性呈一致，将氧化-还原的作用途径与细胞代谢直接关联起来，可能的机制为：对于一定氧化压力状态下的红细胞，类黄酮通过与红细胞膜的选择性结合进而影响膜内侧辅酶的氧化-还原状态的改变，而辅酶氧化型与还原型比例的变化最终会影响糖酵解、三羧酸循环及磷酸戊糖途径的流向及线粒体供能的状态，影响细胞能量利用与消耗，因此，本模型一定程度上能够反映被测天然类黄酮的健康效益。

实施例二：氧化压力下维生素C的保护作用及在本评价模型中的评估结果

维生素C是人体最重要的水溶性抗氧化维生素，人体本身不能合成，需要通过饮食途径获取。维生素C重要的生理功能是维持血液的氧化还原生理平衡，维生素C同样可以防止过多的自由基对细胞膜的氧化损伤，对红细胞具有保护作用。但维生素C能否通过影响吡啶二核苷酸辅酶途径发挥作用？维生素C对氧化应激下红细胞溶血的保护作用与本研究模型所获得的健康效益评分是否有完全一致性的结果？本实施例将重点讨论以上问题。

本实施例的具体步骤如下：

1.体外红细胞制备与孵育：同实施例一

2.分组、氧化应激诱导及供试品给药处理：受试组用10、50、及100μM维生素C，其它同实施例一

3.体外红细胞生化分析及样品制备：同实施例一

4.各组体外红细胞的IPDR值计算及统计学分析：同实施例一

5.供试品健康效益判别：同实施例一

6.结果

6.1维生素C对红细胞溶血的保护作用

表6维生素C对红细胞溶血的保护作用结果

6.2维生素C对体外红细胞四个辅酶化合物浓度及比例分析结果

表7维生素C对体外红细胞四个辅酶化合物浓度及比例影响结果

6.3维生素C对体外红细胞辅酶IPDR计算结果及统计分析

表8维生素C对体外红细胞辅酶的IPDR影响结果

可见，IPDR值与供试浓度关系不大

6.4维生素C在本实验模型中的HI计算结果健康效益评价结果

表9维生素C健康效益评价结果

50μM浓度的维生素C代表在血浆中正常的生理浓度，100μM和300μM浓度的维生素C分别代表中、高浓度水平，从表7,8,9的数据结果看，最终的HI得分为0.33-0.35，说明对于氧化压力下的辅酶浓度有一定优化调节作用，但不同浓度时的维生素C对辅酶浓度的影响在组间没有变化，低、中、高浓度对IPDR值及HI值的作用结果几乎相同，说明维生素C对红细胞的氧化应激保护主要通过结构非特异性地影响氧化-还原电势的作用途径，这一点也通过表6红细胞溶血的保护作用得到佐证，不同浓度的维生素C对红细胞溶血的保护作用有显著差异，呈浓度依赖性。这个实施例也间接说明了本实验模型的评价结果比单纯溶血保护结果的评估能更灵敏地反映供试的天然产物对细胞代谢和氧化还原状态的综合作用，因而能较好地应用于评估天然产物的抗氧化健康效益。

实施例三：富含花青素的植物提取物的健康效益评价

该实施例包括以下步骤：

1.体外红细胞制备与孵育：同实施例一

2.分组、氧化应激诱导及供试品给药处理：用槲皮素、花青素及其糖苷化合物做阳性对照组，类黄酮化合物的稀释和浓度同实施例一；以富含花青素的火棘果提取物作供试组，供试组提取物先用DMSO溶解，再用生理盐水稀释，使提取物的终浓度分别为低、中、高剂量对应含提取物固体分别为1、3、5mg/ml，红细胞孵育48小时，其它同实施例一。

3.体外红细胞生化分析及样品制备：同实施例一

4.各组体外红细胞的IPDR值计算及统计学分析：同实施例一

5.供试品健康效益判别：同实施例一

6.结果

6.1富含花青素的植物提取物对红细胞溶血的保护作用

表10火棘果提取物对红细胞溶血的保护作用结果

6.2四个辅酶化合物浓度及比例分析结果

表11富含花青素的植物提取物对体外红细胞四个辅酶化合物浓度影响结果

6.3 IPDR计算结果及统计分析

表12富含花青素的植物提取物对体外红细胞辅酶的IPDR影响结果

其中空白组与模型组的IPDR值呈现及显著差异(如P<0.001),各平行样的RSD均小于10％，表明造模成功，数据可靠。

由表12可以看出，火棘果提取物比模型组的IPDR值有极显著差异，三个剂量组的IPDR值呈剂量依赖性的增加，都接近空白对照组并高于各阳性对照组。

6.4花青素在本实验模型中的HI计算结果健康效益评价结果

表13富含花青素的植物提取物健康效益评价结果

6.5火棘果提取物中类黄酮单体含量结果

表14火棘果提取物中类黄酮单体含量数据

结合表13，14可以看出，火棘果提取物的健康效益与它们含的类黄酮单体(比如槲皮素及其糖苷)含量正相关；同时，提取物中的多种类黄酮成分可能发挥协同作用，使得即使活性成分比单独作用浓度较低的情况下，仍有较高的抗氧化健康效益。

本发明所采用的各种材料均可以由商业购得，或根据现有技术的相关手段自行准备。本发明中红细胞等渗溶液为所含葡萄糖终浓度为5mM且碳酸氢钠质量浓度为1.4％的葡萄糖与碳酸氢钠的混合溶液、或所含葡萄糖终浓度为5mM的葡萄糖与生理盐水的混合溶液、或所含葡萄糖终浓度为5mM的葡萄糖与PBS缓冲液的混合溶液。本发明中的常温满足常规定义，即20℃～25℃。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于体外红细胞模型精准评价抗氧化健康效益的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)体外红细胞的制备：采集哺乳动物静脉血离心收集压积红细胞，将压积红细胞定量悬浮到红细胞等渗溶液稀释得到含红细胞8％-15％(V/V)的红细胞悬液；

(2)分组、氧化应激诱导及供试品给药处理：

分组具体是将所述红细胞悬液分为三组，并对它们进行氧化应激诱导及供试品给药处理从而得到模型组、空白对照组及供试组共三组，其中，

所述模型组具体是向红细胞悬液中加入红细胞氧化应激诱导剂，该红细胞氧化应激诱导剂为诱导剂与红细胞等渗溶液的混合物；

所述空白对照组具体是向红细胞悬液中仅加入红细胞等渗溶液；

所述供试组具体是向红细胞悬液中加入供试品与所述红细胞氧化应激诱导剂的混合物，所述供试品包括膳食提取物、经过纯化后的膳食单一抗氧化成分、或天然药物提取物中的至少一种；

所述模型组、所述空白对照组及所述供试组中，任意一组中压积红细胞的含量均在2-5％(V/V)，

将这三组在无菌条件下37℃孵育24-48h，然后离心收集红细胞；

(3)体外红细胞生化分析及样品制备：

测定上述各组的红细胞溶血率，若溶血率满足5-30％范围则分别收集上述各组红细胞，制备用于分析各组红细胞中NAD、NADH、NADP、及NADPH四个辅酶化合物浓度的样品；然后测量各组样品的辅酶浓度；

(4)各组体外红细胞的IPDR值计算：

将测得的辅酶浓度值代入公式(1)中，分别计算所述模型组、所述空白对照组及所述供试组的IPDR值，并分别记为Xm、Xc、Xi；

所述公式(1)中，NAD⁺代表测得的NAD辅酶浓度，NADH代表测得的NADH辅酶浓度，NADP⁺代表测得的NADP⁺辅酶浓度，NADPH代表测得的NADPH辅酶浓度；

(5)供试品的健康效益判别：

将Xm、Xc、Xi代入公式(2)计算HI，进行供试品的健康效益判别；

所述公式(2)中，Xmin为Xm与Xc中的小值，Xmax为Xm与Xc中的大值。

2.如权利要求1所述基于体外红细胞模型精准评价抗氧化健康效益的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在采集哺乳动物静脉血后是先进行抗凝处理再进行离心收集压积红细胞；所述红细胞等渗溶液为所含葡萄糖终浓度为5mM的葡萄糖与质量百分浓度为1.4％的碳酸氢钠混合溶液、或所含葡萄糖终浓度为5mM的葡萄糖与生理盐水的混合溶液、或所含葡萄糖终浓度为5mM的葡萄糖与PBS缓冲液的混合溶液；

所述红细胞悬液还经过孵育处理，该孵育处理具体是在无菌条件下，37℃孵育2-10h。

3.如权利要求1所述基于体外红细胞模型精准评价抗氧化健康效益的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，分组处理时，任意一组均包括多个平行样品，任意一个样品均包含150-300μL的红细胞悬液，

对于所述模型组，加入的所述诱导剂能够满足使该模型组在无菌条件下37℃孵育24h内的溶血率控制在5-30％范围；

所述诱导剂与红细胞等渗溶液的混合物具体为所含葡萄糖终浓度为280mM的葡萄糖与质量百分浓度为1.4％的碳酸氢钠混合溶液、或者所含葡萄糖终浓度为150mM的葡萄糖与PBS缓冲液的混合溶液，或者所含葡萄糖终浓度为150mM的葡萄糖与生理盐水的混合溶液；

在所述供试品与所述红细胞氧化应激诱导剂的混合物中，所述膳食提取物和所述天然药物提取物均是按终浓度为1-10mg固体/ml的添加量溶解在红细胞氧化应激诱导剂中，所述经过纯化后的膳食单一抗氧化成分则是先用DMSO溶解，再用红细胞氧化应激诱导剂稀释至终浓度为10-100μM。

4.如权利要求1所述基于体外红细胞模型精准评价抗氧化健康效益的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述辅酶浓度的测量方法为试剂盒法、HPLC法及UPLC-MS/MS方法中的任意一种，优选为UPLC-MS/MS方法；

该UPLC-MS/MS方法的制样处理过程主要包括以下步骤：

(a)将所述述步骤(2)中收集到的红细胞样品在-80℃和常温之间反复冻融2-5次，并进一步在4℃超声10-30秒，使红细胞完全破碎；

(b)取出150-300μL的细胞破碎液，向其中加入3倍体积的预冷提取液，该提取液是乙腈与乙酸铵浓度为50mM的乙酸铵水溶液按体积比3:1混合得到的混合液，然后涡旋震荡30秒-1min，充分混匀提取；

(c)在4℃温度下10000-12000rpm离心10-15min小心的吸取200-600μL上清，利用超低温真空浓缩仪真空冷冻干燥得到粗提物；

(d)向得到的粗提物中加入150-300μL预冷的乙酸铵浓度为50mM的乙酸铵溶液，然后涡旋震荡30秒-1min进行重新溶解，接着将溶解液在4℃、10000-12000rpm离心10-15min，取上清用0.45μm水相滤膜过滤，滤液用于采用UPLC-MS/MS方法分析NAD⁺、NADH、NADP⁺、NADPH含量。

5.如权利要求1所述基于体外红细胞模型精准评价抗氧化健康效益的方法，其特征在于，所述步骤(4)还包括统计学分析，所述模型组的IPDR值Xm与所述空白组的IPDR值Xc经统计学分析后呈现出差异，满足p≤0.05，优选满足p≤0.001。

6.如权利要求1所述基于体外红细胞模型精准评价抗氧化健康效益的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，分组处理时，所述供试组包括至少三个平行样品；所述步骤(4)还包括统计学分析，对于所述供试组中的IPDR值Xi，各个平行样品之RSD小于10％。

7.如权利要求1所述基于体外红细胞模型精准评价抗氧化健康效益的方法，其特征在于，所述步骤(4)得到的Xm、Xc满足Xm<Xc；所述步骤(5)中，对于所述公式(2)，所述模型组的IPDR值Xm定义为Xmin，所述空白对照组的IPDR值Xc定义为Xmax；

当依据所述公式(2)计算得到的HI>1时，赋值HI＝1；当依据所述公式(2)计算得到的HI<0时，则赋值HI＝0，使得HI的数值范围满足0～1。