CN113777188A - 戊二酸尿症1型检测装置、尿液有机酸含量检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例提供了戊二酸尿症1型检测装置、尿液有机酸含量检测方法及其应用。其检测方法包括:建立待检测有机酸的标准曲线,所述待检测有机酸包括:戊二酸、3‑羟基戊二酸以及戊烯二酸;确定所述待检测有机酸的特征离子;去除尿液样品中的尿素;对所述尿液样品进行肟化反应;在所述肟化反应后,萃取所述尿液样品中的有机酸;使用氮气吹干萃取液,获得有机酸样本;对所述有机酸样本进行硅烷化反应;通过气相色谱‑质谱联用法,定量检测所述有机酸样本中待检测有机酸的含量;其中,质谱的扫描模式为“单离子检测”的特征离子扫描模式。其优化了检测的过程,有效的将检测时间缩短为20分钟并且能够排除数据误解读而造成的误判,具有良好的应用前景。
Description
【技术领域】
本发明涉及体外检测技术领域,尤其涉及一种戊二酸尿症1型检测装置、尿液有机酸含量检测方法及其应用。
【背景技术】
戊二酸尿症1型(glutaricacidemiatypeⅠ,GA-Ⅰ)是一种常染色体隐性遗传有机酸尿症。其主要是由于细胞内戊二酰辅酶A脱氢酶(glutaryl-CoA dehydrogenase,GCDH)缺陷导致赖氨酸、羟赖氨酸及色氨酸代谢紊乱,造成体内大量戊二酸、3-羟基戊二酸、戊烯二酸堆积而致病。
其临床主要表现为大头畸形、进行性肌张力异常和运动障碍。在中枢神经系统尤为明显,可引起急性脑病危象。GA-1尿症的病理学显示纹状体损伤最为明显。
目前该病不可治愈,只能通过对症治疗来控制病情进展。患者需终身维持治疗,且药物副作用的发生率较高。其治疗方法是:根据诊疗指南多采用限制赖氨酸、色氨酸的摄入,补充核黄素、精氨酸、巴氯芬及谷氨酸受体拮抗剂等神经保护性药物。
其中,赖氨酸是一种人体必需氨基酸,用以帮助吸收钙并维持正常的激素,酶和抗体水平,长期缺少赖氨酸会使儿童出现生长停滞、反应淡漠、面色苍白、皮肤干燥、肌肉松弛、抵抗力降低等的问题,严重的还会影响智力发育。
巴氯芬具有较强的药物副作用,在药物用药过量的情况下表现为中枢神经抑制、嗜睡、意识混浊、呼吸抑制、昏迷及精神错乱、幻觉、调节紊乱、瞳孔反射消失,全身肌张力过低等。
鉴于药物副作用的发病率高,定期定量检测戊二酸尿症1型患者体内戊二酸、3-羟基戊二酸、戊烯二酸含量,对于确定临床用药量,降低药物副作用的发生率具有非常重要的意义。
目前,检测戊二酸尿症1型患者体内戊二酸、3-羟基戊二酸、戊烯二酸主要采用半定量的检测方法。
半定量检测方法得出的半定量检测结果是介于定性与定量之间的检测数据,其只能对检测物质定性无法准确计量待测物含量。而且,尿液有机酸检测采用气相色谱-质谱检测一个样本需要一个小时,检测通量低,检测成本高。
另外,现有的检测方法中采集的是患者尿液样本中所有化合物的质谱数据,导致数据解读难度提升,容易因数据解读造成假阳性。
【发明内容】
本发明实施例提供一种戊二酸尿症1型检测装置、尿液有机酸含量检测方法及其应用,旨在解决现有技术中戊二酸尿症1型患者体内贮积的化合物含量检测方法所存在的一个或多个缺陷。
为解决上述技术问题,本发明实施例提供以下技术方案:一种尿液有机酸含量检测方法。其中,该检测方法包括如下步骤:
建立待检测有机酸的标准曲线,所述待检测有机酸包括:戊二酸、3-羟基戊二酸以及戊烯二酸;
确定所述待检测有机酸的特征离子;
去除尿液样品中的尿素;
对所述尿液样品进行肟化反应;
在所述肟化反应后,萃取所述尿液样品中的有机酸;
使用氮气吹干萃取液,获得有机酸样本;
对所述有机酸样本进行硅烷化反应;
通过气相色谱-质谱联用法,定量检测所述有机酸样本中待检测有机酸的含量;其中,质谱的扫描模式为“单离子检测”的特征离子扫描模式。
可选地,所述去除尿液样品中的尿素,具体包括:
取1ml尿液样品;
在所述尿液样品中,加入40ul尿素酶并充分震荡;
在37℃的条件下,静置30分钟;
加入960ul超纯水定容至2ml。
可选地,所述对所述尿液样品进行肟化反应,具体包括:
向定容至2ml的尿液样品加入1ml,5%盐酸羟胺并充分摇匀;
在20-26℃的温度下,反应20分钟;
加入550ul纯盐酸后密封、避光保存直至检测到pH值为3。
可选地,所述萃取所述尿液样品中的有机酸,具体包括:
向所述肟化反应后的尿液样品加入3ml乙酸乙酯并振荡混匀;
在振荡混匀后,以预设的离心转速进行离心;
获取离心后的上清液。
可选地,所述萃取所述尿液样品中的有机酸,具体包括:
对所述肟化反应后的尿液样品进行两次或以上的离心萃取操作;
合并每次离心萃取操作获得的上清液。
可选地,所述对所述有机酸样本进行硅烷化反应,具体包括:
在氮气吹干后的有机酸样本中加入100ul硅烷化试剂,在恒温70℃下,反应30分钟;所述硅烷化试剂为BSTFA:TMCS(99:1)。
可选地,所述气相色谱的工作条件具体如下:
进样方式:分流模式;
分流比:10:1
进样口温度:280℃;
升温程序:140℃保持1分钟,以6℃/分钟的升温速率升至200℃,保持2分钟;
流量控制模式:恒线速度。
所述质谱的工作条件具体如下:
离子源温度:200℃;
接口温度:280℃;
采样方式:单离子检测;
间隔:0.30s;
扫描速度:1000;
采集质荷比:261;158;259;230;349;259。
为解决上述技术问题,本发明实施例还提供以下技术方案:如上所述的尿液有机酸含量检测方法在戊二酸尿症1型检测中的应用。
为解决上述技术问题,本发明实施例还提供以下技术方案:一种戊二酸尿症1型的检测装置。其中,该检测装置包括:
存储器,所述存储器用于记录戊二酸、3-羟基戊二酸以及戊烯二酸的标准曲线;
样品处理试剂盒,包括若干种试剂,所述样品处理试剂盒用于:去除尿液样品中的尿素;对所述尿液样品进行肟化反应;在所述肟化反应后,萃取所述尿液样品中的有机酸;使用氮气吹干萃取液,获得有机酸样本;对所述有机酸样本进行硅烷化反应;
气相色谱-质谱模块,用于通过气相色谱-质谱联用法,定量检测所述有机酸样本中待检测有机酸的含量;
其中,质谱的扫描模式为“单离子检测”的特征离子扫描模式。
与现有技术相比较,本发明实施例提供了一种针对戊二酸尿症1型患者的尿液有机酸含量检测方法。该检测方法利用SIM特征离子扫描模式,优化了检测的过程,有效的将检测时间缩短为20分钟,具有增加样本检测通量,节约检测时间的优势,并且能够排除数据误解读而造成的误判,具有良好的应用前景。
【附图说明】
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明,这些示例性说明并不构成对实施例的限定,附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件,除非有特别申明,附图中的图不构成比例限制。
图1为本发明实施例1提供的尿液有机酸检测方法的方法流程图;
图2a为本发明实施例1提供的戊二酸标准品的气相色谱质谱图;
图2b为本发明实施例1提供的3-羟基戊二酸标准品的气相色谱质谱图;
图2c为本发明实施例1提供的戊烯二酸标准品的气相色谱质谱图;
图3为本发明实施例2提供的尿液有机酸检测方法的方法流程图;
图4a为本发明实施例2提供的戊二酸标准品建立的标准曲线质谱图;
图4b为本发明实施例2提供的戊烯二酸标准品建立的标准曲线质谱图;
图4c本发明实施例2提供的3-羟基戊二酸标准品建立的标准曲线质谱图;
图5a为本发明实施例2提供的戊二酸尿症I型样本NS001质谱图;
图5b为本发明实施例2提供的戊二酸尿症I型样本NS002质谱图;
图5c为本发明实施例2提供的戊二酸尿症I型样本NS003质谱图;
图5d为本发明实施例2提供的戊二酸尿症I型样本NS004质谱图;
图6为本发明实施例3提供的戊二酸尿症1型检测装置的结构示意图。
【具体实施方式】
为了便于理解本发明,下面结合附图和具体实施例,对本发明进行更详细的说明。需要说明的是,当元件被表述“固定于”另一个元件,它可以直接在另一个元件上、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。当一个元件被表述“连接”另一个元件,它可以是直接连接到另一个元件、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。本说明书所使用的术语“上”、“下”、“内”、“外”、“底部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系,仅是为了便于描述本发明和简化描述,而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作,因此不能理解为对本发明的限制。此外,术语“第一”、“第二”“第三”等仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性。
除非另有定义,本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
此外,下面所描述的本发明不同实施例中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
“气相色谱-色谱联用”(以下实施例中简称为GC-MS)是由色谱分析和质谱分析组成的检测法分析方法。其基本原理是首先利用气相色谱仪的分离能力将混合物中的各个组分分离,然后令各个组分进入到质谱分析仪中进行组分鉴定(定性分析)并计算组分的含量(定量分析)。
在质谱分析过程中,进入到质谱分析仪的待检测物质在离子室中被电离,形成各种质荷比(m/z)不同的,具有特征性的碎片离子。通过质量检测器可以得到各个碎片离子的质量数的分布图作为质谱图。
“全扫描”工作模式(Fullscan,以下实施例中简称为SCA)是一种质谱分析仪的工作模式。在该工作模式下,质谱分析仪会在用户设定的扫描范围内进行采集或者扫描,获得在该设定的扫描范围内的全部碎片离子的质谱图。
“单离子检测”(singleionmonitor以下实施例中简称为SIM)是质谱分析仪的另一种工作模式。相对于“全扫描”工作模式(Fullscan,以下实施例中简称为SCA)而言,其没有设置一个较宽的扫描范围而仅针对一个或者几个特定的碎片离子进行扫描。
实施例1:
图1为本发明实施例提供的尿液有机酸检测方法的方法流程图。在本实施例中,尿液样品中的待检测有机酸包括:戊二酸、3-羟基戊二酸以及戊烯二酸。如图1所示,该尿液有机酸检测方法可以包括如下步骤:
S100、建立戊二酸、3-羟基戊二酸以及戊烯二酸的标准曲线。
其中,该标准曲线是指根据不同浓度的标准品及其峰面积作为参考点,使用最小二乘法及类似的回归分析方法,建立形成的浓度-峰面积曲线。实际样本基于质谱分析获得的峰面积和已知的标准曲线,即可计算与该峰面积对应的浓度,从而实现待检测有机酸的定量分析。
S200、确定待检测有机酸的特征离子。
其中,图2a至2c分别为戊二酸、3-羟基戊二酸以及戊烯二酸的标准品的气相色谱质谱图。如图2a至2c所示,通过谱库可以确定:戊二酸的特征离子为261和158(261为戊二酸母离子);3-羟基戊二酸的特征离子为349和259(349为3-羟基戊二酸母离子);戊烯二酸的特征离子为259和230(259为戊烯二酸母离子)。
S300、去除尿液样品中的尿素。
其中,在进行GC-MS上机分析前,可以通过加入尿素酶的方式,对尿液样品进行前处理,去除尿素以避免对后续的GC-MS上机分析造成干扰。
S400、对所述尿液样品进行肟化反应。
其中,“肟化反应”是含有羧基的化合物与加入的羟胺分子,经过加成、失水过程而生成肟(含有C=NOH基团的化合物)的反应。C=NOH基团可以作为待检测有机酸的羧基的保护基,起到稳定和保护的作用。
S500、在所述肟化反应后,萃取所述尿液样品中的有机酸。
其中,“萃取”是基于相似相溶原理,将能够溶于有机溶剂的有机酸成分保留的同时剔除那些不能溶于有机溶剂的成分(如氨基酸)的分离操作。
具体可以通过乙酸乙酯或者类似的有机溶剂进行一次或者多次的萃取操作,将有机酸成分从尿液样品中分离提取。在较佳的实施例中,可以对尿液样品进行两次或以上的萃取操作,以尽可能的提高有机酸成分的提取率。
S600、使用氮气吹干上清液,获得有机酸样本。
其中,萃取后保留在上清液中的有机酸成分可以在氮吹仪或者类似的设备中,将氮气连续,可控的吹向上清液,以使水分快速蒸发直至干燥。
S700、对所述有机酸样本进行硅烷化反应。
其中,“硅烷化反应”是对有机酸样本进行衍生化处理的其中一种方式。其通过加入特定的硅烷化试剂,使硅烷基取代有机物基团上的活泼氢。有机酸成分在硅烷化反应后可以达到增强挥发性等的效果,改善了待测物的气相色谱性质,有利于得到较为理想的检测结果。
S800、通过气相色谱-质谱联用的方法,定量检测所述有机酸样本中待检测有机酸的含量。
其中,待硅烷化反应后的有机酸样本冷却至室温时,可以通过自动进样器等设备,进入任何合适类型的气相色谱仪以及质谱仪,实现对有机酸样本的定量分析。
在本实施例中,上机分析时质谱的扫描模式为SIM特征离子扫描模式。使用SIM特征离子扫描模式可以针对性的对目标检测物的特征离子进行扫描检测,灵敏度和特异性较好,针对性强。
而且,相对于全扫描SAN模式而言,不需要使用软件或者人工对检测数据进行解读,很好的避免或者排除了因检测数据解读而造成的误判,提升了检测的准确性。
实施例2:
本发明实施例还进一步提供了关于尿液有机酸检测方法的具体实例。如图3所示,其具体检测过程如下:
11)建立标准曲线:
使用超纯水复溶建立戊二酸尿症I型的三个特征目标物(戊二酸、3-羟基戊二酸、戊烯二酸)的标准曲线。
其中,如图4a所示,戊二酸标准品浓度点设置为如下的6个:30mg/L,80mg/L,150mg/L,250mg/L,400mg/L,500mg/L。其相关系数R2=0.999;
如图4b所示,戊烯二酸标准品浓度点设置为如下的6个:0.2mg/L,1.0mg/L,2.0mg/L,5.0mg/L,8.0mg/L,10mg/L。其相关系数R2=0.999。
如图4c所示,3-羟基戊二酸标准品浓度点设置为如下的6个:
1mg/L,8mg/L,16mg/L,40mg/L,64mg/L,86mg/L。其相关系数R2=0.999。
12)以mg/ml作为尿液样品的定量单位,去除尿素:
首先,取1ml尿液样品,并加入40ul尿素酶充分震荡。然后,在37℃的条件下,静置30分钟,以使尿素酶进行反应去除尿素。最后,加入960ul超纯水并定容至2ml。
13)肟化反应:
首先,向被盛装在塑料离心管的尿液样品中加入1ml盐酸羟胺(5%)。然后,将塑料离心管的管盖盖好密封,放置在漩涡振荡器上振荡60s以充分摇匀。在充分摇匀后,在20-26℃的室温下反应20分钟。最后,加入550ul纯盐酸(6N)后密封、避光保存。
在进行pH值检测时,可以将其置于漩涡振荡器上,振荡60s充分混匀后,使用广泛pH试纸进行检测。将广泛pH试纸与比色卡比对观察,确定试纸呈玫红色(pH值=3)。
14)分离萃取操作:
首先,向肟化反应后的样本加入3ml乙酸乙酯,振荡60s以充分混匀。然后,将充分摇匀后的样本置于台式低速离心机中离心,台式低速离心机设置的离心转速为4000r/min,离心时间5min。最后,将离心后分层的上清液转移至10ml离心管中备用。
上述分离萃取操作可以重复进行一次或者两次,通过二次或者多次萃取来提高尿液样品中的有机酸提取率。
15)氮气吹干:
将分离萃取操作后获得的上清液放置在氮吹仪上,在60℃的条件下,氮吹30分钟左右。
16)硅烷化反应:
首先,将有机酸样品从氮吹仪中取出并加入100ulBSTFA:TMCS(99:1)硅烷化试剂。
然后,将其放置在电热恒温培养箱内,在70℃的条件下,反应30分钟,进行衍生化反应。
17)转移上机:
首先,待硅烷化反应完成的样本冷却至室温后,转移样本至1.5ml进样瓶中的玻璃内插管,并放置到自动进样器托盘上。其中,在自动进样器托盘1号位放入空白试剂进样瓶,2号位放入校正品,上机分析。
该校正品可以选择使用正构烷烃(C9-C40)其用于根据基于已知保留指数以校正有机酸目标物保留时间。
其中,气相色谱-质谱联用(GC-MS)的工作条件具体如下表格所示:
令人惊喜的发现,通过对质谱分析过程的优化和样品前处理操作的调整,在实施例2中,对戊二酸、3-羟基戊二酸以及戊烯二酸在尿液样品中含量的整个检测周期只需要20分钟。与传统的有机酸半定量检测方法至少需要1小时的检测时间相比,极大的缩短了检测时间,有利于提升检测通量。而且,质谱部分采用SIM特征离子扫描模式,排除了数据解读容易造成假阳性的问题。
图5a至图5d是利用上述前处理方法及质谱分析参数进行真实阳性样本检测的检测结果。其中,图5a是样本编号为NS001的真实阳性样本的质谱图,图5b是样本编号为NS002的真实阳性样本的质谱图,图5c是样本编号为NS003的真实阳性样本的质谱图,图5d是样本编号为NS003的真实阳性样本的质谱图。对4例戊二酸尿症I型阳性样本检测后,特征指标绝对定量结果如下表所示:
实施例3:
基于实施例1和实施例2提供的尿液有机酸含量检测方法,本发明实施例还进一步提供了一种戊二酸尿症1型的检测装置。图6为本发明实施例提供的检测装置的结构示意图。
如图6所示,该检测装置400包括:存储器410、样品处理试剂盒420、气相色谱-质谱设备430。
其中,存储器410是用于存储戊二酸、3-羟基戊二酸以及戊烯二酸的标准曲线的硬件设备。其可以包括任何合适类型的非易失性存储介质、数据库或者云端分布式存储平台,只需要能够提供满足数据存储要求的功能即可。
较佳的,该存储器410还可以耦合至一种或者多种用户交互设备(如鼠标、键盘或者触摸屏),用以接收用户输入的数据(如戊二酸、3-羟基戊二酸以及戊烯二酸不同浓度标准品对应的峰面积)。
样品处理试剂盒420包含多种预先配置好的试剂,用以进行尿液样品在上机分析前的若干个前处理步骤。这些前处理步骤可以包括:肟化反应、分离萃取操作、氮气吹干以及硅烷化反应等。
具体的,该样品处理试剂盒420具体包含的试剂可以由实际使用的前处理步骤所决定。以实施例2提供的尿液有机酸含量检测方法为例,样品处理试剂盒包括:尿素酶、盐酸羟胺、纯盐酸、乙酸乙酯以及硅烷化试剂“BSTFA:TMCS(99:1)”。
在一些实施例中,样品处理试剂盒内还可以进一步包括:广泛pH值试纸,用于盛装液体样品的离心管等一些与尿液样品的前处理步骤相关的器材。
气相色谱-质谱设备430是由任何合适类型的气相色谱仪和质谱仪组成的,用于通过气相色谱-质谱联用,定量检测所述有机酸样本中待检测有机酸的含量的相关设备。其中,该气相色谱-质谱设备330进行质谱分析的部分,选择使用“单离子检测”的特征离子扫描模式,以实现对上机样品的戊二酸、3-羟基戊二酸以及戊烯二酸的含量的定量快速检测。
在该检测装置400的实际使用过程中,根据不同浓度的戊二酸、3-羟基戊二酸以及戊烯二酸标准品建立的标准曲线可以被输入存储到存储器410中。
对于待检测的尿液样品,可以使用样品处理试剂盒420中包含的试剂和器材,结合漩涡振荡器、台式低速离心机、电热恒温培养箱以及移液枪等实验设备,依次进行肟化反应、分离萃取操作、氮气吹干以及硅烷化反应的处理步骤。
处理完毕的尿液样品通过自动进样器等类似的设备,转移到气相色谱-质谱设备430中,通过气相色谱-质谱联用的方法鉴定并检测戊二酸、3-羟基戊二酸以及戊烯二酸。
其中,质谱分析部分使用SIM模式,以在先根据谱库确定的戊二酸、3-羟基戊二酸以及戊烯二酸的特征离子作为采样点,定性检测戊二酸、3-羟基戊二酸以及戊烯二酸并获取三种有机酸的峰面积。
基于检测获得的峰面积,利用在存储器410存储的标准曲线,可以相应的换算得到戊二酸、3-羟基戊二酸以及戊烯二酸的浓度或者含量。
本发明实施例提供的戊二酸尿症1型的检测装置优化了对质谱分析部分的检测步骤进行了优化。其通过SIM模式中的单个离子采样的方式替代传统的在一定范围内进行全扫描的SCA模式,能够起到缩短检测时间的良好效果,有利于增加检测通量。
而且,在采用全扫描的SCA模式检测时,会检测获得尿液样品中所有处于设定的扫描范围内的有机酸化合物的丰富数据,需要利用分析软件或者特定的分析方法来对这些数据进行解析。
而在采用单个离子扫描的模式时,在质谱图中的数据较为简单。由此,可以很好的排除数据分析软件容易因分析错误而造成假阳性结果。
实施例4:
基于上述实施例提供的尿液有机酸检测方法,本发明实施例还进一步提供该尿液有机酸检测方法在戊二酸尿症1型检测中的应用。
该方法应用于戊二酸尿症1型检测时,可以快速检测患者尿液样本中的戊二酸、3-羟基戊二酸以及戊烯二酸含量,帮助确定患者的病情并及时调整治疗方案。
而且,该方法可以排除数据软件解读造成的误判,相对于传统的半定量检测方法而言,检测耗费时间从1小时缩短至20分钟,具有节省检测时间,增加样本检测通量,节约仪器耗材成本的优势。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;在本发明的思路下,以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合,步骤可以以任意顺序实现,并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化,为了简明,它们没有在细节中提供;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种尿液有机酸含量检测方法,其特征在于,包括:
建立待检测有机酸的标准曲线,所述待检测有机酸包括:戊二酸、3-羟基戊二酸以及戊烯二酸;
确定所述待检测有机酸的特征离子;
去除尿液样品中的尿素;
对所述尿液样品进行肟化反应;
在所述肟化反应后,萃取所述尿液样品中的有机酸;
使用氮气吹干萃取液,获得有机酸样本;
对所述有机酸样本进行硅烷化反应;
通过气相色谱-质谱联用法,定量检测所述有机酸样本中待检测有机酸的含量;其中,质谱的扫描模式为“单离子检测”的特征离子扫描模式。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述去除尿液样品中的尿素,具体包括:
取1ml尿液样品;
在所述尿液样品中,加入40ul尿素酶并充分震荡;
在37℃的条件下,静置30分钟;
加入960ul超纯水定容至2ml。
3.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于,所述对所述尿液样品进行肟化反应,具体包括:
向定容至2ml的尿液样品加入1ml,5%盐酸羟胺并充分摇匀;
在20-26℃的温度下,反应20分钟;
加入550ul纯盐酸后密封、避光保存直至检测到pH值为3。
4.根据权利要求3所述的检测方法,其特征在于,所述萃取所述尿液样品中的有机酸,具体包括:
向所述肟化反应后的尿液样品加入3ml乙酸乙酯并振荡混匀;
在振荡混匀后,以预设的离心转速进行离心;
获取离心后的上清液。
5.根据权利要求3所述的检测方法,其特征在于,所述萃取所述尿液样品中的有机酸,具体包括:
对所述肟化反应后的尿液样品进行两次或以上的离心萃取操作;
合并每次离心萃取操作获得的上清液。
6.根据权利要求4或5所述的检测方法,其特征在于,所述对所述有机酸样本进行硅烷化反应,具体包括:
在氮气吹干后的有机酸样本中加入100ul硅烷化试剂,在恒温70℃下,反应30分钟;所述硅烷化试剂为BSTFA:TMCS(99:1)。
7.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于,所述气相色谱的工作条件具体如下:
进样方式:分流模式;
分流比:10:1
进样口温度:280℃;
升温程序:140℃保持1分钟,以6℃/分钟的升温速率升至200℃,保持2分钟;
流量控制模式:恒线速度。
8.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于,所述质谱的工作条件具体如下:
离子源温度:200℃;
接口温度:280℃;
采样方式:单离子检测;
间隔:0.30s;
扫描速度:1000;
采集质荷比:261;158;259;230;349;259。
9.如权利要求1-8任一项所述的尿液有机酸含量检测方法在戊二酸尿症1型检测中的应用。
10.一种戊二酸尿症1型的检测装置,其特征在于,包括:
存储器,用于存储记录,戊二酸、3-羟基戊二酸以及戊烯二酸的标准曲线;
样品处理试剂盒,包括若干种试剂,所述样品处理试剂盒用于:去除尿液样品中的尿素;对所述尿液样品进行肟化反应;在所述肟化反应后,萃取所述尿液样品中的有机酸;使用氮气吹干萃取液,获得有机酸样本;对所述有机酸样本进行硅烷化反应;
气相色谱-质谱设备,用于通过气相色谱-质谱联用法,定量检测所述有机酸样本中待检测有机酸的含量;
其中,质谱的扫描模式为“单离子检测”的特征离子扫描模式。
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