CN1137731C

CN1137731C - 非侵害性地定位哺乳动物体内的发光结合体

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Publication number: CN1137731C
Application number: CNB951980068A
Authority: CN
Inventors: C・H・孔塔格; C·H·孔塔格; 孔塔格; P·R·孔塔格; 贝纳龙; D·A·贝纳龙
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1995-11-17
Filing date: 1995-11-17
Publication date: 2004-02-11
Anticipated expiration: 2015-11-17
Also published as: CN1209753A

Abstract

本发明公开了用于检测并定位由哺乳动物发出的光线的方法和组合物。本发明还公开了定向地令选定区域发射光线以及跟踪检测哺乳动物体内某些实体的方法。此外还公开了某些疾病状态的动物模型，用于定位和跟踪动物体内疾病或病原的进程的方法，以及筛选可有效抑制疾病或病原的候选药物的方法。

Description

非侵害性地定位哺乳动物体内的发光结合体

发明领域

本发明涉及检测、定位和跟踪哺乳动物体内发光体及生物学过程的非侵害性方法和组合物。

发明背景

目前体外测和定量组织内检感染原的方法限制了监测感染性疾病进程的能力。感染原在宿主内的复制通常涉及第一、第二和第三复制位置。感染原的复制位置和其间的发展进程取决于接种途径、宿主方面编译的因素以及感染原的决定基。

有时，凭经验可能估计出某感染原的可能的复制位置及其发展过程。但是，更多的时候，对感染位置和疾病的发展速度要么是未知的，要么只能作出粗略的估计。而且，某种感染性疾病的进程即使在鼠的近交品系中也是具有个体差异的，因此需要对许多被感染的动物进行系列性体外分析才能够确定某种疾病在实验感染宿主中一般将遵循怎样的进程。

所以，人们需要一种能够在动物模型中跟踪感染进程的方法。较理想的是，这种跟踪是非侵害性的，这样可以根据需要对一个动物多次进行评价而不对其造成伤害。本发明的方法和组合物提供了一种检测、定位和跟踪活的宿主例如哺乳动物体内病原及其它实体的方法。

发明概述

在本发明实施例之一中，本发明包括一种检测受试哺乳动物内某种生物相容性实体的位置的非侵害性的方法。所述的实体可以是分子、大分子、细胞、微生物(包括病原)、颗粒之类。

所述的方法包括给受试者使用由实体与发光部分形成的结合体。发光部分通常是会发光的分子或大分子。它们会因为吸收辐射而发光(例如荧光分子或磷光分子)，或者因化学反应而发光(例如生物发光蛋白)。可例举的发光部分为生物发光蛋白，例如萤光素酶和水母蛋白；有色或荧光性蛋白，例如黄荧光蛋白和铁氧还蛋白IV。

发光部分可以利用多种技术与实体结合，其中包括在实体的合成过程中结合进去(例如化学合成或遗传合成，例如由抗体片段和发光蛋白形成的融合蛋白)，合成后的化学偶合，非共价连接(例如用脂质体进行包裹)，在实体内原位合成(例如在转化细胞内表达异源的生物发光蛋白)，或者由启动子诱导物原位激活转基因动物细胞内生物发光蛋白受启动子调控的表达(例如因病毒感染而激发的由干扰素激活的启动子)。

在一段时间后，期间结合体可在受试者内完成定位，将受试者在光检测装置的检测场中固定一段时间，以便能够(利用光检测装置)测定出足量的光子发射以便成像。可例举的光检测装置是与图像处理器偶联的增强电荷耦合照相机(ICCD)。如果能够在短时间内成像，即该时间与直至“未固定”受试者发生移动的时间相对而言较短，那么可以认为受试者在成像期间是“固定”的，预先就不需要特别注意固定化。然后根据光子发射参数成像。

通过在按选定的时间间隔重复造影步骤和相应地进行成像，上述方法可以用来跟踪实体在受试者内随时间的位置变化。

通过将定向部分固定、共轭或结合到实体上，上述方法可用于多种特殊的应用场合。定向部分可以是实体本身的一部分(例如抗体或抗体片段)，或者是共轭、固定或结合到实体上的(例如含抗体的脂质体)。定向部分的实例有抗体、抗体片段、酶抑制剂、受体结合分子、各种毒素等。定向部分的目标有发炎、感染位置，血凝块和肿瘤细胞。适合被定向部分识别的区分这些目标的标记是众所周知的。

此外，将病原(例如沙门氏菌(Salmonella))与发光部分结合成实体，可将上述方法用于在动物模型中检测和定位病原感染的位置。

在一相关实施例中，本发明包括用于检测受试哺乳动物体内某种生物相容性实体在一段时间内的水平的非侵害性方法。该方法与前述方法相似，但是被设计成用于检测受试者体内实体水平随时间的变化，因而不需要以图像的形式对实体进行定位。该方法对于监测抗生素等治疗性物质随时间对以发光细菌为例的某种实体的作用特别有用。

在另一实施例中，本发明包括一种监测转基因在受试哺乳动物内整合情况的非侵害性方法。该方法包括给受试者使用能够将转基因整合到哺乳动物细胞内的载体结构物。这样的结构物在本领域是众所周知的。除了有效整合所必需的元件之外，该结构物还包含转基因(例如某种治疗基因)，和发光蛋白的编码基因，后者位于特定的可激活启动子的调控之下。一段时间之后，期间结构物完成整合，激活启动子。例如，如果使用的是干扰素启动子，可以局部使用(例如足底注射)聚肌胞苷双链(聚IC)来激发干扰素的产生。然后将受试者放在光检测装置的检测场中，例如带上可加强光线的“夜视”镜，并测定或评价光子发射的水平。如果发射水平高于背景水平(即能够优先测得“激活”区域的光)，则受试者被判定为整合了转基因。

在一相关实施例中，本发明包括一种检测转基因或嵌合动物体内某种结构物的由启动子诱导活动的非侵害性方法，所述的结构物包含编码受可诱导启动子调控的发光蛋白基因。启动子诱导活动包括使用直接激活启动子的物质，使用激发内源性启动子活化剂产生的物质(例如利用RNA病毒感染激发干扰素的产生)，利用某种能够产生内源性启动子活化剂的条件(例如热休克或应激)等。激发所述的活动，然后如上所述对动物进行造影。

在另一实施例中，本发明包括用表达例如萤光素酶之类发光蛋白的基因转化的病原，例如沙门氏菌。

另一方面，本发明包括一种鉴定可有效抑制病原感染扩散的治疗性化合物的方法。该方法包括给对照和实验动物使用由病原和发光部分形成的结合体，用候选治疗化合物治疗试验动物，用前述方法定位对照和试验动物体内的发光病原，如果与对照动物相比，化合物能够显著抑制病原在试验动物体内的扩散或复制，则将化合物鉴定为具有治疗性。所述的结构物包括荧光标记的抗体、荧光标记的颗粒、荧光标记的小分子等。

另一方面，本发明包括透过不同浊度的介质定位与发光部分结合的实体的方法。该方法包括使用光检测装置透过介质检测发射出的光子，对时间进行光子的积分，然后根据积分后的信号成像。

在另一实施例中，本发明包括一种测定生物体内特殊位置特定物质，例如溶解氧或钙的浓度的方法。该方法包括含浓度传感器的细胞等实体，所述的浓度传感器即某种发光分子，其发光能力取决于特定物质的浓度。包含发光分子的实体在被使用后基本均匀地分布在动物体内，或者在特定的组织或器官系统(例如脾脏)内。对生物体进行造影，将光发射的强度和位置校正成特定物质的浓度和位置。或者，实体包含第二标记而不是浓度传感器，例如在某波长能够发光的分子。第二标记被用于对实体在宿主内分布上的任何不一致性进行标准化，由此能够更准确地测定特定物质的浓度。

另一方面，本发明包括鉴定可有效抑制肿瘤生长和/或转移性扩散的治疗性化合物的方法。该方法包括(i)给试验和对照动物组使用以发光部分标记或包含该部分的肿瘤细胞，(ii)用特定的化合物治疗试验组动物，(iii)用光检测装置对与肿瘤细胞相联的发光分子发出的光子进行造影，由此确定肿瘤细胞在动物体内的位置，(iv)如果与对照组相比，化合物能够在试验组动物中显著抑制肿瘤的生长和/或转移性扩散，则将化合物判定为具有治疗性。

在结合附图阅读了以下对本发明的详细说明后，将对本发明的以上及其它目的和特征具有更充分的理解。

附图说明

图1A，1B和1C是lux pCGLS1质粒的图，该质粒被用于转化沙门氏菌菌株SL1344，BJ66和LB5000而产生菌株SL1344lux，BJ66lux和LB5000lux。

图2A-E显示利用沙门氏菌菌株SL1344lux和BJ66lux测定巨噬细胞和HEp-2细胞被粘附和侵入的分析结果。图2A显示位于一测试盘上各孔中的发光细胞。将通过光子的一分钟积分而获得的拟色像(pseudo-color image)交叠在测试盘的灰度像上，形成了所示的“组合”像。图2B显示没有用庆大霉素处理的测试孔的相对光强。图2C显示从图2B中被造影的测试孔中分离出的每ml中的集落形成单位数(CFU)。图2D显示用庆大霉素处理过的测试孔的相对光强。图2E显示从图2D中被造影的测试孔中分离出的每ml中的集落形成单位数(CFU)。

图3A是含有LB5000lux细菌悬浮液稀释液的4根玻璃毛细管的组合像。通过30秒积分来测定发光量。每根毛细管内悬浮液的两端都存在空气囊。

图3B给小鼠腹膜内接种野生型SL1344lux后生物光的分布面。

图4是用于测试LB5000lux产生的光透过动物组织发射的试剂瓶的图样。

图5A-F显示Balb/c小鼠的组合像，小鼠分别口服接种了低毒性LB5000lux(图5A-B)，非侵害性BJ66lux(图5C-D)和毒性SL1344lux(图5E-F)沙门氏菌，造影时间如图所示。对光信号进行了5分钟的积分。

图6是用毒性SL1344lux(左侧的两个动物)或者低毒性LB5000lux(右侧的两个动物)菌株腹膜内注射(i.p.)32小时后，沙门氏菌在小鼠体内分布的组合像。

图7A和7B显示毒性沙门氏菌在抗全身性沙门氏菌感染小鼠(129×Balb/c，Ity^r/s)内的分布。图7A-第1天，图7B-第8天。

图8A-C显示口服接种7天后，减毒突变沙门氏菌(BJ66lux)的分布。图8A显示对发射光的从外部、非侵害性造影。图8B显示在剖腹手术后造影的同一动物。加标记的器官是C-盲肠，L-肝，I-小肠和Sp-脾。图8C显示在盲肠前和盲肠后的小肠内腔中注入空气后得到的剖腹术后的图像。

图9A，9B和9C显示腹膜内接种SL1344lux后，沙门氏菌SL1344lux在易感性Balb/c小鼠内的分布。图9A摄于腹腔打开之前，图9B摄于打开腹腔之后，图9C摄于将盲肠拉至左侧之后。

图10A-E显示环丙沙星治疗对口服接种SL1344Lux沙门氏菌小鼠内发出的生物光的影响。图10A显示的是经治疗和未治疗的动物的腹部区域的相对生物光强度图，是治疗开始后时间的函数。图10B和10D显示口服接种SL1344lux沙门氏菌后8天但在用环丙沙星治疗前小鼠的组合像。图10C和10E显示同一小鼠在接受治疗(图10E)或作为对照(不治疗，图10C)后5.5小时的合成像。

发明详述

I. 定义

除非另作说明，本文中术语的意义与本发明所属领域技术人员所知道的相同。

不透明的介质在本文中指“通常认为”不透明的，而不一定是绝对不透明的。所以，不透明的介质被定义为通常认为不透明而且不是半透明的介质，它包括例如木板、哺乳动物的肌肉和皮肤。

除非另作说明，萤光素酶包括原核生物和真核生物的萤光素酶，及其光学特性被改变的变异体，例如在红外区波长发光的萤光素酶。

生物相容性实体是可以给哺乳动物使用的实体。包括对哺乳动物有害的病原体。对细胞内包含了表达发光蛋白的转基因的动物来说，生物相容性实体指哺乳动物内的含有转基因的细胞。

发光被定义为能够通过化学反应或吸收辐射发出光线。

除非另作说明，光在此定义为波长在约300nm至1100nm的电磁辐射。

感染的扩散一般指病原在宿主内非最初感染位置的位置的扩散和形成集落。但是，它还可以包括病原在最初感染位置上大小和/或数量的增加。

lux-与萤光素酶和光子发射相关的原核生物基因。

luc-与萤光素酶和光子发射相关的真核生物基因。

启动子诱导活动指直接或间接诱导了特定的可激活启动子的活动。

异源基因指经转染进入宿主生物体的基因。通常，异源基因指并非来自被转染或转化的细胞本身的基因组DNA的基因。

II. 对本发明的总体评论

本发明包括有关非侵害性地造影和/或检测受试哺乳动物的内发光结合体的方法与组合物。结合体包含生物相容性实体和发光部分。生物相容性实体包括但不限于环状有机分子之类的小分子；蛋白质之类的大分子；病毒、细菌、酵母和真菌之类的微生物；真核细胞；各种类型的病原和病原性物质；以及微珠和脂质体之类的颗粒。另一方面，生物相容性实体可以是构成被造影的受试哺乳动物的全部或部分细胞。

实体因为结合了发光部分而具有发光能力。这样的发光部分包括荧光分子、荧光蛋白、发射光子的酶反应和生物发光蛋白之类的发光物质。结合方式包括化学偶合、融合蛋白遗传工程或转化细胞、微生物或动物以使之表达生物发光蛋白。例如，当实体是构成被造影的受试哺乳动物的细胞时，发光部分可以是与细胞“结合”的生物发光或荧光蛋白，这种蛋白由载体结构物定位、启动子调控性表达产生，所属的结构物通过制备转基因或嵌合动物被转导到细胞内。

通常，使用多种方法中的任意一种将发光结合体用于受试者，令其在受试者内定位，并进行造影。由于造影或者测定来自受试者的光子发射需要持续数十分钟，在造影过程中通常但不一定将受试者固定。

对发光实体进行造影涉及使用光检测仪，它能够检测出极微弱的光-较典型的是单光子活动-并能够将光子发射积分直至能够成像。这类敏感的光检测仪有例如加强单光子活动直至所述的活动能被照相机检测到的装置，和能够在检测系统本身的背景干扰下检测到单光子的照相机(例如利用液氮进行冷却)。

一旦形成了光子发射图像，通常将其交叠在受试者的“正常”反光像上，后者提供出光子的发射源的参照框架(即，确定发光结合体相对受试者的位置)。然后对这样的“组合”像进行分析，确定目标在受试者内的位置和/或量。

下文将详细说明上述步骤和实施方式。

III. 发光实体

A. 发光部分

根据用途，用于实施本发明的发光部分(LGM)、分子或结构物可以取任何形式。它们的共同特性是发光性，即，当它们由电子激发状态向低能量状态一般是基态过渡时，它们能够由原子或分子发出紫外(UV)、可见和/或红外(IR)区的电磁辐射。

发光部分的实例包括光致发光分子，诸如荧光分子，化学发光化合物，磷光化合物和生物发光化合物。

LGM与本发明密切相关的两个特征是它们的大小和光学特性。以下在对光学特性进行了一般性论述之后，就具体的发光部分类型对以上两者进行了说明。

1. 光学特性。本发明的一个重要方面是选择发光部分，它们发出的光能需够穿透动物的组织从而在体外被以一种非侵害性的方式测得。光穿透介质例如动物组织(主要由水构成)的能力主要决定于光的强度和波长。

单位体积内产生的光越强，光越容易被测得。如下所述，单位体积内产生的光强取决于具体的LGM的光谱特性以及单位体积内发光部分的浓度。所以，与只将单个LGM结合到实体上的那类结合方法相比，将高浓度的LGM结合到实体上或内部(例如脂质体的高效加载或在细胞内高水平地表达生物发光蛋白)通常生成较亮的发光结合体(LEC)，它们更容易透过较厚的组织被检测到。

决定LGM是否能够透过组织层被检测到的另一个因素是发射光的波长。因为大多数组织主要是由水构成的，所以可以用水来模拟动物组织的吸收特性。已知，与波长较短的光相比，水更容易透射波长较长的光(红区)。

所以，发光范围在黄区至红区(550-1100nm)的LGM比发射波长较短的LGM更好。下文中有些LGM的发光范围在此范围内。但是，必需注意，根据下文用于支持本发明的试验，用发射波长为486nm的LGM实施本发明可以获得优良的效果，尽管这并不是最佳发射波长。上述优良结果在某种程度上可能是由于试验中使用的LEC(转化沙门氏菌细胞)中LGM(萤光素酶分子)浓度较高的和使用了敏感的检测仪。可以理解，使用发射波长较为适宜的LGM，用LGM浓度较低的LGE就可以获得类似的结果。

2. 荧光部分。荧光是一种物质因单一的电子激发状态发出的光，它在去除辐射源后只维持很短的时间。荧光的发射波长长于激发波长(Stokes法则)，因为荧光分子将部分激发光转化成了热。

由于荧光分子必需接受光之后才能发光，所以它在本发明中的使用比生物发光分子复杂。需要特别注意的是遮蔽激发光，使之不至于干扰欲从受试者测得的荧光光子的信号。常见的预防措施包括象在荧光显微镜中那样在辐射源处放置激发光滤光器。适当选取的激发滤光器阻止大部分波长与荧光部分发出的光子近似的光子透过。同样，在检测仪中使用遮光滤光器可以筛选出大多数波长不等于荧光光子波长的光子。可向多家厂商获取上述滤光器，其中包括Omega Optical，Inc.(Brattleboro，VT)。.

或者，可以利用可产生波长接近合适的激发波长但远离发射波长的强光的激光来激发荧光部分。可能需要使用x-y翻译机制(x-y translation mechanism)来使激光能够扫描受试者，例如象在共焦显微镜中那样。

另一种预防措施是将辐射光源置于受试者背后将其遮蔽，这样，到达检测仪位置的辐射光子只是那些穿过受试者全程的那些。而且，还可以选用对激发荧光部分所用的光波长敏感性较低的检测仪。

谨慎地采用上述预防措施，根据本发明方法检测荧光性LGM是可能的。

荧光部分包括荧光素之类小荧光分子，以及绿荧光蛋白，2，4-二氧四氢喋啶和黄荧光蛋白(O’Kane等，1991，《PNAS》 88：1100-1104，Daubner等，1987，《PNAS》 84：8912-8916)之类荧光蛋白(Chalfie等，1994，《科学》(Science) 263：802-805，Morin和Hastings，1971，《细胞生理学杂志》(J.Cell.Physiol.) 77：313)。此外，某些就其荧光特性还未作出过评价的有色蛋白例如铁氧还蛋白IV(Grabau等，1991，《生物化学杂志》(J Biol.Chem.) 266：3294-3299)可能也是荧光性的，也可以用于本发明。铁氧还蛋白IV的可能性特别大，因为它的红色表明它可能在能够穿透组织的长波长处发摄荧光或者进行反射。而且，作为蛋白质而言其分子量较小(95个氨基酸)，因而可以与实体结合而只对它们的功能产生极小的影响。

与较大的发光部分相比，小荧光分子的优点之一在于它们不大会干扰与之固定的实体的生物活性。此外，具有各种适用于本发明的激发和发射光谱范围的荧光分子是可以购得的。例如，Molecular Probes(Eugene，OR)出售多种荧光团，其中包括Lucifer Yellow(吸收波长428nm，发射波长535nm)和Nile Red(吸收波长551nm，发射波长636nm)。而且，可以获得用多种基团衍生后用于多种结合方法的分子(例如得自Molecular Probes)。

3. 生物发光部分。对于化学发光(因化学反应而发光)和生物发光(由活性生物体发出的可见光)物质，人们已经就其各方面内容进行了广泛的研究(例如，Campbell 1988，《化学发光。在生物学和医学上的原理与应用》 (Chemiluminescence.Principles and Applications in Biology and Medicine)(Chichester，England：Ellis Horwood Ltd.和VCH VerlagsgesellschaftmbH))。以下简要综述其突出的特征。

生物发光分子与荧光分子的不同在于它们不需要吸收辐射能来发光。生物发光分子利用化学能例如ATP来发光。相对于荧光部分，生物发光部分的优点在于基本上没有背景信号。唯一被检测到的光是由异源生物发光部分产生的光。相反，用于激发荧光分子的光经常产生非目标物质的荧光。当“背景”象活性动物体内环境那样复杂时，情况尤其是这样。

已知有几种类型的生物发光分子。其中包括萤光素酶家族(例如，Wood等，1989，《科学》 244：700-702)和水母蛋白家族(例如，Prasher等，《生物化学》26：1326-1332)。在多种原核和真核生物体内都发现了萤光素酶家族的成员。已经从海洋细菌弧菌属(Vibrio)和发光细菌属(photobacterium)内，和陆地细菌Xenorhabdus中分离出了原核发光系统(lux)中涉及的萤光素酶及其它酶，及其对应的Lux基因。

具有萤光素酶系统(luc)的真核生物体实例之一是北美萤火虫Photinuspyralis。萤火虫萤光素酶已经被广泛地研究过并用于ATP分析中。编码另一种刺爪甲虫(click beetle)Pyrophorus plagiophthalamus的萤光素酶的cDNA已经被克隆并表达(Wood等，1989，《科学》 244：700-702)。这种甲虫的与众不同之处在于其中不同的成员发出不同颜色的生物光。共分离出同源性为95-99％的4种克隆。它们的发射波长为546nm(绿色)，560nm(黄绿色)，578nm(黄色)和593nm(橙色)。最后一种(593nm)特别适合用作本发明的发光部分，因为它发出的光其波长比短波长的光更容易穿透组织。

萤光素酶和水母蛋白样分子需要有能量来源，例如ATP、NAD(P)H等，以及底物，例如萤光素或coelentrizine和氧。

必需向萤光素酶提供作为底物的萤光素来使它发光。当被引入的萤光素酶是包含编码lux萤光素酶的cDNA的载体的表达产物时，提供萤光素的较好的方法是不仅表达萤光素酶而且同时表达合成萤光素的生物合成酶。在用上述结构物转化的细胞内，氧是生物发光所需的唯一外在要求。上述方法，在实施例1中有详细说明，被用于产生lux-转化的沙门氏菌，后者被用作后文详细说明的用于支持本发明的试验中。

编码来自土壤细菌Xenorhabdus luminescens的lux操纵子的质粒结构物(Frackman等，1990，《细菌杂志》(J.Bact.) 172：5767-5773)通过表达异源二聚体萤光素酶和三个辅助蛋白使得被转化的大肠杆菌具有发射光子的能力(Frackman等，1990)。与真核以及其它原核发光生物的萤光素酶适宜低温(Campbell，1988，《化学发光。在生物学和医学上的原理与应用》(Chemiluminescence.Principles and Applications in Biology and Medicine)(chichester，England：Ellis Horwood Ltd.和VCH Verlagsgesellschaft mbH))相反，表达X.luminescense的lux基因的大肠杆菌其生物发光的最佳温度被发现是37℃(Szittner和Meighen，1990《生物化学杂志》 265：16581-16587，Xi等，1991细菌杂志(J.Bait) 173：1399-1405)。所以，来自X.luminescense的萤光素酶很适合用作动物研究的标记物。

例如以上和实施例1中所述的萤光素酶载体结构物(luc结构物)可以经调整后用于转化多种宿主细胞，其中包括大部分细菌和许多真核细胞。此外，某些病毒，例如疱疹病毒和牛痘病毒可以经遗传工程改进后表达萤光素酶。例如，Kovacs Sz和Mettenlieter在1991年的《遗传病毒学杂志》(J.Gen.Virol.) 72：2999-3008中讲述了编码萤火虫萤光素酶的基因在疱疹病毒中的稳定表达。Brasier和Ron在1992年的《酶学方法》(Meth.in Enzymol.) 216：386-396中讲述了萤光素酶基因结构物在哺乳动物细胞内的使用。人们已经利用CCD造影法对培养中的哺乳动物细胞内萤光素酶的表达进行了宏观(Israel和Honigman，1991《基因》(Gene) 104：139-145)和微观的(Hooper等，1990，《生物发光和化学发光杂志》(J.Biolum.and Chemilum) 5：123-130)研究。

B. 实体

本发明包括通过改变或结合后包含了例如以上所述的发光部分、结构或分子的实体。这样结合或改变后的实体被称为发光实体，发光结合体(LEC)或简单地称为结合体。实体本身的形式可以是例如分子、大分子、颗粒、微生物或细胞。用于将发光部分与实体结合的方法取决于发光部分和实体的性质。下文实体部分将举例说明结合的方法。

1.小分子。可用于实施本发明的小分子实体包括与某种病原或内源配体或内源受体发生特异性反应的化合物。这类分子的实例包括但不限于药物或治疗性化合物；毒素，例如有毒生物的毒腺中的毒素，这些生物包括某些蜘蛛、蛇、蝎、甲藻、海蜗牛(marine snails)和细菌；生长因子，例如NGF、PDGF、TGF和TNF；细胞因子；和生物活性肽。

最好将小分子与对其生物活性的影响尽可能小的发光部分结合，例如前述的小荧光分子。结合方式就性质而言一般是化学结合，并可以利用多种本领域已知的方法来进行。

也可以通过合成使小分子实体包含发光部分，从而不再特地需要结合过程。或者，可以合成具有能与发光部分反应的活性基团的小分子实体，或者反过来。

本发明与发光部分结合的小分子可以用于人类疾病的动物模型中，或者直接用于接受治疗的人受试者。例如，以高亲和性与肿瘤细胞表达的受体结合的小分子可以用于动物模型来定位肿瘤和估计其大小，并监测在用某种候选治疗药物治疗引起的肿瘤生长或转移的改变。如上所述，这些分子还可以用于在癌症患者中用于监测肿瘤的特性。

2. 大分子。大分子，例如聚合物和生物聚合物构成了用于实施本发明的另一类实体实例。可例举的大分子包括抗体、抗体片段、融合蛋白和某些载体结构物。

购买或用本领域已知方法制备的(Harlow等，1988，抗体：实验室手册 (Antibodies：A Laboratory Manual)第10章，p.402，Cold Spring Harbor Press)抗体或抗体片段可以用于定位在哺乳动物体内的它们的抗原，即通过将抗体与发光部分结合，然后通过例如注射将该结合体给受试者使用，任结合体定位在抗原位置，然后对结合体造影。

将抗体和抗体片段用作本发明的实体具有数条优点。由于它们的性质，它们构成了自身的定向部分。此外，它们的大小使它们适合与包括小荧光分子和荧光及生物发光蛋白在内的多种发光部分结合，而它们的扩散比细胞或脂质体之类更快。

发光部分可以直接或利用荧光性第二抗体而间接地与抗体或其片段结合。直接结合可以通过标准化学偶合过程来完成，例如将荧光团与抗体或抗体片段偶合，或者通过遗传工程来完成。可以构建出包含与荧光或生物发光蛋白偶合的抗体或抗体片段的嵌合或融合蛋白。例如，Casadei等在1990年的《PNAS》 87：2047-2051中说明了制造一种载体的方法，该载体能够在哺乳动物细胞内表达水母蛋白和某种抗体基因的融合蛋白。

含抗体的结合体在本发明中具有多种用途。例如，标记过的在炎症位置表达的抗E选择(E-selection)的抗体可用于确定炎症的位置和检测候选消炎药的效果。

载体本身也可以构成适用于本发明的大分子实体。例如，可以构建这样的真核表达载体，它包含位于特定启动子(即在治疗基因所针对的细胞内表达的启动子)调控下的某种治疗基因和编码发光分子的基因。利用本发明方法测得的发光分子的表达可以被用于确定治疗基因表达的位置和水平。当治疗基因在接受治疗的个体或动物模型中的表达没有直接的表现型时，这种方法尤其有用。

3. 病毒。适用于本发明某些方面的另一种实体是病毒。由于许多病毒是感染哺乳动物宿主的病原，可以将病毒与发光部分结合后用于研究感染的最初位置和扩散速度。此外，用发光部分标记的病毒可以用于筛选能够抑制感染或感染扩散的药物。

病毒可以被间接标记，即利用与发光部分结合的抗体，或者通过例如将病毒生物素化(例如利用Dhawan等在1991年《免疫杂志》(J.Immunol.) 147(1)：102中所述的方法)后再接触与荧光分子之类可测部分连接的链霉亲和素。

或者，可以使用例如Fan等在1992年《临床微生物杂志》(J.Clin.Micro.) 30(4)：905中所述的方法，用罗丹明之类荧光团直接标记病毒体。还可以利用遗传工程令病毒表达某种发光蛋白。某些病毒的基因组，例如疱疹和牛痘的基因组大得足以容纳用于支持本发明的试验中使用的lux或luc基因那样大的基因。

标记后的病毒可以用于定位和监测动物模型内感染的进程，以及筛选能够抑制感染扩散的药物。例如，虽然疱疹病毒感染表现为皮肤损伤，但是该病毒也能导致疱疹性脑炎。通过各种本发明的方法可以利用标记过的病毒对这种感染进行定位和监测，并可以测试多种抗病毒药物对中枢神经系统(CNS)感染的效果。

4. 颗粒。颗粒，包括微珠、脂质体等，构成本发明所用的另一类实体。由于它们较大，与例如小分子相比，颗粒可以与更多的发光分子结合。这使得发射光的浓度更高，高浓度的发射光可以在更短的暴露时间或透过更厚的组织层被检测到。此外，可以将脂质体构建成在表面包含基本纯的定向部分或配体，例如抗原或抗体。而且，可以给脂质体加载浓度较高的生物发光蛋白分子(Campbell，1988，《化学发光。在生物学和医学上的原理与应用》(Chemiluminescence.Principles and Applications in Biology and Medicine)(chichester，England：Ellis Horwood Ltd.和VCH Verlagsgesellschaft mbH))。

而且，可以将两种脂质体定向于同一种细胞，从而只有在两种脂质体都存在时才会发光。例如，脂质体之一带有萤光素酶，另一个带有萤光素。脂质体可能带有定向部分，两种脂质体上的定向部分可以相同或不相同。可以用被感染细胞上的病毒蛋白来确定被感染的组织或器官。使用单个或多个细胞表面标记可以定位免疫系统细胞。

脂质体表面最好被例如磷脂-聚乙二醇的结合体所包裹，由此延长血液循环时间，从而通过血流来更好的定向。这类脂质体是众所周知的。

5. 细胞。原核和真核细胞共同构成了实施本发明所用的另一类实体。和颗粒一样，可以给细胞加载较高浓度的发光部分，但是其优点在于，发光部分可以来自例如用于转染细胞的异源遗传结构物。此外，可以挑选这样的细胞，即表达“定向部分”或能够将它们定向于受试者内要求位置的分子。或者，可以用表达某合适的定向部分的载体结构物转染细胞。

使用的细胞类型取决于用途。例如，如下所述，细菌细胞，例如沙门氏菌，可以用于以较高的时间和空间精度研究感染过程和评价药物或治疗剂对感染过程的效果。

细菌细胞可构成有效的实体。例如，可以方便地转染细菌细胞，使之表达高浓度的发光部分和高浓度的定向蛋白。此外，有可能获得大肠杆菌文库，其中包含表达某种表面结合抗体的细菌，这些抗体能够经筛选后用于确定表达抗某种特定抗原的抗体的集落(Stratagene，La Jolla，CA)。然后可以用包含发光蛋白基因的第二质粒转化来自该集落的细菌，转化子可被用于上述本发明的方法来定位哺乳动物宿主内的抗原。

可以将病原性细菌与发光部分结合，然后用在动物模型中活体跟踪感染过程，以及用于评价有效的抗感染药物例如新的抗生素在抑制感染方面的效果。后文用于支持本发明而进行的试验中对这一用途的实例进行了说明。

真核细胞也可以用作本发明的实体。含有所需的调控元件的合适的表达载体是可以购得的。这些载体可以用来生成能够在多种真核细胞，其中包括原代培养细胞、体细胞、淋巴细胞等中表达所需的发光蛋白的结构物。这些细胞可以用于临时表达的研究，或者，如果是细胞系，则用于选择出稳定的转化子。

转化细胞内发光蛋白的表达可以利用多种启动子中的任何一种来进行调控。例如，如果细胞是被用作利用被表达的配体或受体定向于受试者体内某一位置的发光实体，可以使用组成性-活性启动子，例如CMV或SV40启动子。用上述结构物转化的细胞还可以用来分析抑制发光的化合物，例如通过杀死细胞。

或者，可以令转化细胞在被使用后均匀分布于受试者体内，而且只在特定条件下才表达发光蛋白，这些条件例如被病毒感染或受细胞因子刺激。应答于与上述及其它刺激相关的因素的启动子是本领域已知的。与此相关的是，可诱导启动子，例如Tet系统(Gossen和Bujard，1992，《PNAS》 89：5547-555 1)可以用于发光蛋白的瞬时激活表达。

例如，可以用含tat应答性HIV LTR元件的结构物转化CD4+淋巴细胞，然后用作对HIV引起的感染的分析(Israel和Honigman，1991，《基因》 104：139-145)。可以将用所述的结构物转化的细胞引入SCID-hu小鼠内(McCune等，1988，《科学》 241：1632-1639)，然后用作人HIV感染和AIDS的动物模型。

用例如组成性活性启动子的上述结构物转化的肿瘤细胞系可以用来监测肿瘤的生长和转移。可以将转化后的肿瘤细胞注射到动物模型中，令其形成肿瘤体，然后在使用试验性生长或转移抑制剂进行治疗的过程中监测肿瘤的大小和转移。

还可以由用含有可调控启动子的结构物转化的细胞来产生肿瘤细胞，所述启动子的活性对多种感染原或治疗化合物敏感。

6. 细胞转化。转化原核细胞和真核细胞的方法在本领域都是众所周知的(Sambrook等，1989，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Vol.2)。含有合适的调控元件和多克隆位点的载体很容易购得(例如Stratagene，La Jolla，CA，Clontech，Palo Alto，CA)。IV. 含有编码发光蛋白的基因的转基因动物

另一方面，本发明包括转基因动物，它们具有编码发光蛋白或蛋白复合物的异源基因结构物。结构物受特定启动子的驱动，可以包含例如功能性地表达发光蛋白所需的各种辅助蛋白，选择标记和加强元件。

启动子的激活使得编码发光分子和辅助蛋白的基因的表达被加强。启动子的激活是通过特定的生物相容性实体或实体的某些部分与启动子元件之间的相互作用而实现的。如果这种激活只发生在动物的某个部位，那么只有这一部位内的细胞会表达发光蛋白。

例如，可以使用干扰素-诱导性启动子，例如3’-5’聚A合成酶的启动子，来检测许多不同的RNA病毒对转基因细胞的感染。

与此相关的是，在特定病例状态下表达的启动子可以用来标记出转基因动物内患病区域，而发光部分的表达则可用于监测对这种病例状态的治疗方法的效果。例如，E选择表达于体内炎症位置(Pober和Cotran，1991，《实验室研究》(Lab.Invest.) 64：301-305)。所以，可以分离出E选择的启动子用于驱动萤光素酶基因的表达。

还可以使用组织特异性启动子来实施本发明的方法。这样就能够，例如，筛选出可有效抑制导致体内特定器官或组织衰退的疾病的进程的化合物，并可以，例如，跟踪监测正在发育的动物体内的细胞(例如神经元)。

许多可用于本发明的启动子在本领域是已知的。此外，利用基因的cDNA的信息来分离含基因组DNA的，由此分离被克隆基因的启动子的方法也是已知的。V. 发光结合体的造影

可以用多种方法对定位于目标位置的发光结合体进行造影。下文将说明这类造影方法的准则以及具体的实例。

A. 发光结合体的定位

在“被定向”实体中，即实体包含定向部分-令实体在受试者或动物内定位于特定位置的分子或特征，定位指这样一种状态，即结合的，“定位的”和非结合的，“游离的”实体在受试者体内基本达到平衡。达到所述平衡的速度取决于给药途径。例如，通过静脉注射结合体来定位血栓可能在注射后的几分钟内完成定位或在血栓处的累积。另一方面，通过口服结合体来定位肠道感染可能需要几小时才能完成。

或者，定位可能只是表示被使用后的特定时刻，实体在受试者或动物体内的位置。例如，在本文所述的一个实验中，给受试者使用(口服)沙门氏菌，然后跟踪它们随时间的扩散。此时，因为实体在使用后就标记出被使用细菌最初的位置，所以可以在在口服后马上对实体进行“定位”，并可以通过造影来跟踪此后细菌的扩散或减少(也称为“定位”)。

与此相关的是，定位经注射的表达发光部分的肿瘤细胞可能包括细胞在定位体内某位置的集落并形成肿瘤体。

根据另一实施例，实体被在使用并随继分布之后完成定位。例如，如果使用复合体来测定受试者或动物体内全部器官中的氧浓度，当实体在受试者或动物体内基本达到稳定的分布状态后，复合体就变成了“定位的”或是可提供信息的。

在上述所有情况，本领域的专业人员即可较好地估算出达到定位的时间。而且，根据本发明的方法对发光结合体造影可得到时间与定位状态的函数

B. 光检测装置

本发明的一个重要方面是选择光检测装置，该装置必须具有足够高的灵敏度，从而能够在适当的时间，最好在约30分钟之内，对哺乳动物体内的微弱的光造影，并能够利用来自所述装置的信号构成图像。

如果能够使用很亮的发光部分，并/或是检测定位在靠近被摄受试者或动物表面的发光结合体，可以使用一对“夜视”镜或标准高灵敏度造影机，例如硅增强管(Silicon Intesified Tube)(SIT)照相机(例如Hamamatsu Photonic Systems，Bridgewater，NJ)。但是，更多情况下需要更灵敏的光检测方法。

在光强极其微弱的时候，例如在本发明中，单位面积的光子通量低到使得被造影像不能成为连续的。相反，它由在时间和空间上都彼此割裂的单个光子来表示。如果在监测仪上进行观察，这样的影像是一些闪烁的光点，每一点代表一个被测得的光子。

在数字图像处理器上将一段时间内测得的这些光子进行累积，就可以获得并构成图像。与给每一个像点的信号赋予强度值的传统照相机相反，在光子计数成像法中，信号的强度是不重要的。该方法的目标只是检测信号(光子)的存在，并计算一段时间内某位置的信号发生频率。

如下所述，至少有两种光检测装置可以检测到单个光子并产生可以用图像处理器来分析的信号。

1. 低干扰光检测装置。第一种是通过降低光子检测器中的背景干扰而不是放大光子信号来提高灵敏度的装置。干扰的降低主要是通过冷却整套检测器。所述的装置包括电荷耦合照相机(CCD)，又称“薄背”冷却CCD照相机。在更灵敏的仪器中，冷却是利用例如液氮来进行的，它可以使得整套CCD的温度降至约-120℃。“薄背”是指极薄的基板，它缩短了光子要被检测到所需通过的路径长度，由此提高了光子效率。具体的一种灵敏薄背低温CCD相机是“TECH 512”，Photometrics Ltd.(Tucson，AZ)的200系列相机。

2. 光子放大装置。第二类灵敏光检测仪包括在光子击中检测屏之前将其放大的装置。其中包括具有增强器，例如微通道增强器(microchannel intensifier)的CCD相机。微通道增强器通常包括垂直于相机的检测屏并随之展开的一排金属通道。微通道排列位于被摄的样品、受试者或动物与相机之间。大多数进入通道的光子在出通道之前都会与通道的侧壁接触。穿过列阵的电压使得光子的每一次碰撞都释放出大量电子。来自这种碰撞的电子以“鸟枪”方式射出作为原点的所在通道，然后被相机检测到。

如果连续设置多个增强微通道列阵，在第一阶段产生的电子就会依次在第二阶段变成被放大的电子信号，由此将获得更高的灵敏度。但是，灵敏度的提高是以空间辨析率为代价的，辨析率随着逐级放大而降低。

微通道增强器单光子检测装置的一个实例是C2400系列，可购自Hamamatsu。

3. 图像处理器。要构成能够，例如，展示在监视器或打印在影印机上的图像，由光检测仪通过计数光子而产生的信号需要经图像处理器处理。这样的图像处理器一般是作为包含上述灵敏光子计数相机的系统的部件出售的，所以，它们可以购自同一来源(例如Photometrics，Ltd.和Hamamatsu)。也可以使用其它厂商的图像处理器，但这通常需要较多的功夫调试系统来使它工作。

图像处理器一般与个人电脑相联，例如IBM-兼容PC机或AppleMacintosh(Apple Computer，Cupertino，CA)，个人电脑可能作为也可能不作为购买的造影系统的部件。当图像成为数字文件后，就可以利用多种图像处理程序(例如“ADOBE PHOTOSHOP”，Adobe Systems，Adobe Systems，Mt.View，CA)对其继续处理和打印。

C. 将受试者固定在装置的检测场中

1. 装置的检测场。装置的检测场为可以连续测量光子发射的区域。如果是使用光学透镜的相机，检测场就是由相机的透镜看到的区域。同样，如果光检测仪是一对“夜视”镜，检测场就是镜头视野所及的区域。

或者，检测场可能是紧密排列的光纤电缆的末端形成的表面。所述的列阵被构建成令电缆末端覆盖的区域尽可能大而电缆之间的空间尽可能小，并将其靠近受试者放置。例如，可以将树脂玻璃之类的透明物质靠近受试者放置，而将列阵靠近透明物质固定在受试者的对面。

列阵对面的光纤电缆末端可以与检测或增强装置，例如微通道增强器的输入端直接相连，从而不需要透镜。

该方法的优点之一是由于大大缩减了受试者与检测仪之间的空间和/或取消了透镜，减少了光子的散射和/或损失。即使是高透视性透镜，例如用于支持本发明的实验中使用的60mm AF Nikkor大透镜也只透过到达透镜正面的光线中的一部分。

使用高强度LGM时，可以使用光二极管列阵来测量光子发射。可以将光二极管列阵加到较柔软的薄膜上，使得使用者可以用列阵部分“包裹”受试者。并且该方法尽可能减少了光子的损失，而且还是一种获得生物光三维图像的方法。

其它方法也可以用来形成三维图像，其中包括在受试者周围放置多个检测仪，或使用一个或多个扫描检测仪。

可以理解，不必令整个动物或受试者处于光检测装置的检测场中。例如，如果要测定已知位于受试者某特定区域的发光结合体，要获得所需的信息，只需要来自所述区域的光和足够的背景“暗”区。

2. 固定受试者。如果要获得受试者的二维或三维图像，在测定光子发射期间，可将受试者固定在光检测装置的检测场中。如果信号足够亮以致能用约20毫秒内测得的光子成像，而且受试者并非特别不安定，那么可能就不需要特别注意固定化，而只需保证受试者在测量开始时处于检测装置的检测场中。

相反，如果对光子发射的检测超过约20毫秒，而且受试者很不安定，要保存形成的图像中的空间信息就必需根据受试者的激动程度注意保证在光子测量期间将受试者固定化。例如，如果受试者是人，光子发射的测定需要几秒钟，只需要求受试者在光子发射测定(造影)期间尽可能保持静止。相反，如果受试者是动物，例如小鼠，就需要利用例如麻醉或机械强制装置固定受试者。

可以构造多种控制装置。例如，能够在几十秒至几分钟内使小鼠固定的一种强制装置是将树脂玻璃板固定在一个泡沫垫上构成的。在垫子的一端有一个配合动物头部的凹陷。将动物放在树脂玻璃板下，其头部位于凹陷上，使得它能够自由呼吸但是身体的运动受到泡沫垫的限制。

如果只需要测定来自受试者或动物的光的总量，即使测量光子发射的时间很长，也不需要将受试者固定。需要的只是在造影期间将受试者限制在光检测仪的检测场中。但是，可以理解的是，在所述的测量期间固定受试者将提高获得的结果的一致性，因为，这样的话，测得的光子所通过的组织厚度就不同的动物个体而言将更统一。

D. 造影期间的其它考虑因素

1. 荧光产生部分。要看到荧光产生部分需要有激发光源和光检测仪。而且，我们知道，在测定来自发光部分的光子发射期间，激发光源是打开的。

正如在前文荧光产生部分所述，正确选择荧光团、放置光源和选择并放置滤光器都将有利于形成可提供信息的图像。

2. 高分辨率图像。组织对光子的散射限制了通过测定总光子发射对LGM造影可获得的分辨率。我们知道，本发明还包括这样的实施例，其中LGM的光发射与某种外源是同时的，它们可聚焦在受试者内某特定点但在组织中没有明显的散射，由此可以形成高分辨率图像。例如，可以利用聚焦超声波信号对被摄受试者进行三维扫描。利用超声波赋予的特殊的振动特性，可以从其它光子发射中分辨出超声波焦点区域发出的光(例如Houston和Moerner，美国专利4,614,116，1986年9月30日)。

E. 形成光子发射图像

如果因为使用很亮的发光部分和/或发光结合体的位置靠近受试者的表面而使用了一对“夜视”镜或高灵敏度摄像机来获取图像，那就可以方便地在图像监视器上观察或展示图像。如果需要，可以将来自摄像机的信号通过图像处理器进行转化，后者可以将单幅图像保存在内存中以备分析或打印，并/或能够将图像数字化以备在计算机上分析或打印。

或者，如果使用的是光子计数法，对光子发射的测定在图像处理器中产生一数字列阵，代表着在图象处理器中各象素位置测得的光子数。通常如下用这些数字来形成图像，即将光子数标准化(标准化成为固定的、预先选定的值，或者是在任意象素位置测得的最大值)，然后将标准化后的数字转化成展示在监视器上的亮度(灰度)或颜色(拟色)。在拟色展示中，颜色通常是如下设定的。光子数为零的象素为黑色，数值较低的为蓝色，数值越高颜色的波长越长，直至最高的光子数为红色。颜色在监视器上的位置代表了光子发射的分布，因此也就是发光结合体的位置。

为了提供结合体的参照系，通常制作发射光子的被摄受试者(固定的)的灰度像。这样的像可以如下制作，例如在暗室光下打开造影室或盒的门，然后测定反射的光子数(测定时间通常为测定光子发射所需时间的一部分)。灰度像可以在测定光子发射之前或之后制作。

通常将光子发射图像重迭在灰度像上形成受试者的光子发射组合像。

如果需要随时间跟踪位置的变化和/或来自发光结合体的信号，例如记录治疗方法对特定的生物相容性部分的分布和/或位置的作用，可以在选定的时间间隔重复对光子发射的测定或造影，由此形成一系列图像。时间间隔可以短至几分钟，也可以长达几天或几周。VI. 对光子发射图像的分析

使用本发明组合物和/或通过本发明方法形成的图像可以用多种方法进行分析。其中包括简单的目测检视、分析和/或硬拷贝(hardcopy)打印，直至复杂的数字图像分析。对分析获得的信息的解释取决于观察到的现象和使用的实体。

后文实施例说明了本发明的一种用途-跟踪活鼠体内的沙门氏菌感染-以及如何对利用本发明获得的图像进行分析。VII. 对活鼠体内的发光沙门氏菌的造影

用于支持本发明的实验显示了小鼠伤寒沙门氏菌感染在作为人伤寒动物模型的小鼠体内的分布。用含lux操纵子的质粒分别标记对鼠致命的鼠伤寒沙门氏菌菌株SL1344(Hoiseth和Stocker，1981，《自然》291：238-239)，SL1344的非侵害性突变株BJ66和沙门氏菌的低毒性LT-2菌株LB5000，然后将它们用于定位小鼠体内的沙门氏菌感染的实验中。

A. 发光沙门氏菌的构建

1. 沙门氏菌菌株。限于通过口服或腹膜内注射给小鼠接种的三种不同毒性表型的鼠沙门氏菌菌株被选用来转化。

本发明使用的最毒的表型是SL1344，这是最早从牛犊的致命性感染中获得的一种鼠的菌株(Hoiseth和Stocker，1981，《自然》291：238-239)。给鼠口服接种上述菌株后，细菌借助于淋巴系统全身性扩散，最后聚集在肝、脾和骨髓(Carter和Collins，1974，《实验医学杂志》 139：1189-1203；Finlay和Falkow，1989，《分子微生物学》 3：1833-1841和Hsu，1989，《微生物学评论》 53：390-409)。

本发明还评价了SL1344的一种非侵害性突变株BJ66。口服接种BJ66一般不造成鼠的全身性感染，但是通过腹膜内注射接种可造成全身性感染。

另外还检测了沙门氏菌的低毒性LT-2菌株LB5000。已知LT-2菌株是对鼠低毒或具有差异毒性的实验室菌株。LB5000具有多种营养缺陷性突变，抗链霉素，并可以在口服或腹膜内注射接种后从小鼠体内清除。

2. 用lux操纵子转化沙门氏菌。如实施例1所述，用含有编码lux操纵子的质粒转化以上三种菌株。来自土壤菌Xenorhabdus Luminesens(Frackman等，1990)的所述质粒通过表达异源二聚体萤光素酶的两个亚基和三个辅助蛋白luxC、luxD和luxE，使得大肠杆菌具有产生光子的能力。

质粒中包含luxC、luxD和luxE就不必再向表达萤光素酶的细胞提供脂肪醛底物萤光素。因为在本文所述的活体系统中向真核生物的萤光素酶提供其底物可能很困难，所以使用完整的X.Luminesens的lux操纵子。该操纵子还编码生物合成脂肪醛底物的酶。

X.Luminesens萤光素酶，为一种α-β异源二聚混合功能氧化酶，在将还原黄素和长链醛转化成氧化黄素和相应的长链脂肪酸的氧化反应中起催化作用。由脂肪酸形成醛并再循环需要脂肪酸还原酶复合物，还原黄素由NAD(P)H：黄素氧还酶提供。

表达X.Luminesens的lux基因的的大肠杆菌在37℃生物发光最佳(Szittner和Meighen，1990，《生物化学杂志》 265：16581-16587，Xi等，1991，《细菌杂志》 173：1399-1405)。相反，来自真核及其它原核发光生物的萤光素酶一般适合较低的温度(Campbell，1988，) 《化学发光。在生物学和医学上的原理与应用》 (Chemiluminescence.Principles and Applications in Biology and Medicine)(chichester，England：Ellis Horwood Ltd.和VCH VerlagsgesellschaftmbH))。所以，来自X.Luminesens的萤光素酶非常适合在动物研究中用作标记。

三种菌株用质粒pGSL1通过电穿孔进行转化，所述的质粒包含完整的X.Luminesens的lux操纵子，并使沙门氏菌抗氨苄青霉素和羧苄青霉素(Frackman等，1990)。X.Luminesens的lux操纵子包含基因luxA、luxB、luxC、luxD和luxE(Frackman等，1990)。luxA和B编码异源二聚体萤光素酶的两个亚基。luxC和D编码萤光素酶底物的生物合成酶，luxE是调控基因。与在培养物中从外部向细胞提供萤光素底物或用底物处理动物相比，将生物合成底物的基因包括在内是一种向萤光素酶提供底物的便利方法。

B. 转化沙门氏菌的体外鉴定

1. 粘附性和侵害性。利用Finlay和Falkow在1989《分子微生物学》3：1833-1841中所述的标准侵害性分析法，在培养物中就三种含Lux质粒的沙门氏菌菌的粘附性和侵害性进行相互比较，并与各自的不发光亲本株进行比较，在实施例2中有详细说明。

在所述分析法中，在与上皮细胞系和腹膜巨噬细胞培养后定量分析粘附细菌和细胞内细菌。同时利用来自活细胞的光子发射和在裂解细胞并将裂解液平板培养在含羧苄青霉素的平板上后的集落形成单位法检测并定量粘附细菌和细胞内细菌。

部分分析实验的结果显示在图2A和2E中，并在实施例8中进行了论述。与亲本沙门氏菌菌株相比，用表达lux的质粒转化后，三种菌株的表型没有明显的改变。而且，来自HEp-2细胞和巨噬细胞的生物发光强度与CFU之间具有良好的关联性。结果显示，作为细胞内细菌的指示剂的发光性是在培养物中分析细菌的侵害性的快捷方法。

BJ66对HEp-2细胞表现的粘附性比SL1344低，但是，两种菌株在鼠腹膜巨噬细胞亲代培养物中的粘附性相当。

2. 光发射。为了评价系统的氧需求，将细菌的10倍连续稀释液装在玻璃毛细管内并造影，象实施例3中所述。

图3显示了此类实验之一产生的图像。即使在介质中含少量细菌的空气饱和(5L中饱和0.1ml空气饱和缓冲液时的最终O₂浓度为5nM)的毛细管中也只在气-液界面检测到发光。

根据以上结果，氧显然是生物发光的一个制约因素。

3. 穿过动物的组织的光透射。为了确定光穿透动物组织的程度，利用闪烁计数器，同时关闭快速同步检测仪(fast coincidence detector)检测单光子，由此定量发光沙门氏菌发射并透过组织的光。在这种检测中，光放大管的暗流(dark current)造成的背景很严重，这使得实验只适用于光子发射很强的样品。

用此方法比较了不透明性各不相同的4种组织：鸡胸部的肌肉，鸡胸部的皮肤，羊羔的肾和羊羔肾的肾髓质。能检测到的透过组织的光子数量比不含组织的对照少约10倍。

4. 对lux沙门氏菌的活体鉴定

a：口服。经口接种是鼠或人受沙门氏菌感染的一种自然途径，会造成较长的病程。为了研究以这种途径接种后沙门氏菌感染的进程，用以上三种沙门氏菌感染了两种小鼠。在后文中，用抗性动物获得的结果被冠以“抗性小鼠内的感染”。

如实施例5所述，用毒性SL1344lux、非侵害性BJ66lux和低毒LB5000lux沙门氏菌的混悬液经口感染Balb/c小鼠。通过在8天内从外部进行造影来跟踪感染的发展(材料与方法)。

图5A-F显示了代表性的图像。接种后(p.i.)24小时，在全部被感染的动物中，生物光信号集中在一个焦点(图5A、5C和5E)。接种后不到7天，所有以低毒LB5000lux接种的动物体内的生物光消失(图5B)。相反，用毒性SL1344lux感染的动物表现出扩散到腹腔大部分的毒性感染(如5F)，尽管开始扩散的时间随动物个体有很大不同。BJ66lux的感染一般保持集中在一个位置(图5D)。

b. 腹膜内(I.P.)接种。为了确定在沙门氏菌的复制位置是否有足够的氧以供萤光素氧化和发光所需(Campbell，1988，《化学发光。在生物学和医学上的原理与应用》(Chemiluminescence.Principles and Applications in Biology and Medicine)(chichester，England：Ellis Horwood Ltd.和VCH VerlagsgesellschaftmbH))，测定了来自有呼吸的动物组织的光子发射。给两组Balb/c小鼠腹腔接种发光的SL1344 Lux和LB5000lux。接种后(p.i.)32小时，对透射的光子进行造影(图6)。

在SL1344lux感染的小鼠中(图左)，在大表面积上可以看到透射的光子，以及可见的不同强度的焦点。以上图像表明感染已扩散，这与在可能包括肝脏和肠系淋巴结在内的内脏中的广泛分布是一致的。相反，LB5000lux感染的动物的透射光子的分布则很有限，这表明感染是有限的。

LB5000lux感染的小鼠在接种后数周仍然是健康的，而SL1344lux感染的小鼠在接种后4天就已经濒死或死亡。

以上实验表明，血液和/或组织内的O₂足以满足沙门氏菌表达的lux萤光素酶生物发光所需。而且，以上实验结果与毒性菌株SL1344与低毒实验室菌株LB5000相比的侵害性是一致的。

c. 抗性小鼠内的感染。在Ity基因座杂合(Ityr/s)的小鼠对鼠伤寒沙门氏菌的全身性感染具有抗性(Plant和Glynn，1976，《传染病杂志》 133：72-78)。该基因座又称Bcg(Gros等，1981，《免疫学杂志》 127：2417-2421)或Lsh(Bradley，1977，《临床和实验免疫学》 30：130-140)，它调控某些细胞内病原的病理过程，例如鼠麻风分支杆菌(Forget等，1981，《感染免疫学》 32：42-47)，牛分支杆菌(Skamene等，1984，《免疫遗传学》 19：117-120；Skamene和Pietrangeli，1991，《自然》297：506-509)和胞内分支杆菌(Goto等，1989，《免疫遗传学》) 30：218-221)。人也具有类似的对胞内病原抗性和易感性的遗传调控(结核分支杆菌(Stead，1992，《国际医学学报》 116：937-941，Stead等，1990，《新英格兰医学杂志》322：422-427)和麻风分支杆菌)。

Ity基因座位于鼠的第1染色体上，有两种等位基因形式，Ity^r(抗性，显性)和Ity^s(敏感，隐性)。Ity基因座处编码的基因显然影响着巨噬细胞干扰内化病原的能力(Blackwell等在1991年的《Immunol.Lett.》 30：241-248上有所论述；同时参见Skamene等，1984，《免疫遗传学》 19：117-120，Skamene和Pietrangeli，1991，《自然》 297：506-509)，继而影响着下游功能，即被感染宿王体内原定由巨噬细胞介导的病原向其它位置的转移。Balb\c小鼠是Ity^s/s，129小鼠是Ity^r/r。本文详细说明的实验中使用的是杂合的Balb\c×129小鼠(Ity^r/s)。

如实施例7所述，给抗性129×Balb\c(Ity^r/s)小鼠经胃内接种1×10⁷的SL1344lux沙门氏菌造成感染。在注射后8天(d.p.i.)内，每日给动物造影。

结果显示在图7A(第1天)和7B(第8天)中。由外部造影测得的发光在接种后24小时时很明显，而且似乎在全部动物中都集中在一个位置。在实验全过程(直至接种后第8天)中都能够看到光信号。光强和光源位置在同一个鼠内随时间而有所改变并在不同的鼠内有所不同。被感染动物体内的发光组织都是盲肠(见下文)，位置以及可能的光强改变很可能是因为鼠的内部器官并不是牢固固定在一个位置上的。

在这些动物中观察到的明显的局部感染支持这样的解释，即Ity限制阻断了巨噬细胞的转运。但是，所述的感染持续了10天，表明病原粘附在肠粘膜上，而且延长了细菌脱落后随动物的粪便排出的时间，这一点可以由发光性粪便颗粒来证明。以上结果表明，在Ity限制性动物中，体内沙门氏菌的发光表型可保持8天，而且病原在经口接种后能够发生定位。

d. 经口接种后的体内造影。为了讲一步确定腹腔中光信号的位置，被感染的小鼠在剖腹后进行造影(实施例8)。在全部经口感染的动物中，主要的疾病表征是肿大的盲肠(图8A-C)。“外部”造影(图gA)显示一个发光焦点，该焦点在剖腹后造影(图8B)中被证明是盲肠。

在肠道中注入空气证明在消化道其它区域也存在细菌。位于结肠和直肠内的细菌也可能表达萤光素酶，但是低氧浓度可能限制了这些位置的光发射。

经口接种研究获得的图像表明，除了LB5000lux感染的动物之外，在接种后第2天和第7天，光信号都几乎完全集中在各个动物的盲肠(Popesko等，1990，小型实验动物的彩色解剖图第二卷：大白鼠，小白鼠，仓鼠(A colour Atlas of Anatomy of Small Laboratory Animal Vol.Two：Rat Mouse Hamster)(LondonEngland：Wolfel))。某些动物结肠内也发光。接种后7天内，在LB5000lux感染的动物内没有可以测得的发光。在接种后第2天和第5天，测定了这些小鼠的器官内的CFU。

在经胃感染了侵害性SL1344lux菌株的动物内，盲肠内的发光出现得较早，并且随后发生全身性的感染。相反，非侵害性BJ66lux菌株的感染造成盲肠的持续发光，在部分动物体内，这样的发光在整个检测过程(8天)中持续。在接种后第8天，在腹表面的大部分区域都检测到了发光，这与SL1344lux感染的小鼠在i.p.接种后的光子分布类似。

正如预计的，随着从不断增大的表面积发出的光子不断增多，SL1344lux感染表现为转变成了全身性的。发光似乎集中在用各种菌株感染后的腹部而在腹部以外的区域几乎测不到发光。大量的透射光子集中在腹部这一单一焦点表明，虽然感染可能是全身性的，最大量的复制发生在肠道周围区域。

发光集中在盲肠不仅表明在肠道的这一区域存在大量的细菌，而且表明沙门氏菌与粘膜的细胞结合从而能够获得发光所需的足够的氧。萤光素酶发射光子依赖于氧，而盲肠或肠腔内的预计氧浓度一般低于发光所需的水平。肠道内的萤光素酶不可能发生反应，除非细菌能够从肠道上皮细胞获得氧。

所以，全身性感染似乎与侵害性表型相关，而不是简单地由于与肠道上皮细胞的粘附。以上实验提示，盲肠在病理过程中起一定的作用，或者处于载体状态，或者作为扩散位置。

监测不同组织的感染过程将大大有助于理解病理过程中的这些步骤，并能够筛选出能够在特定步骤抑制病原的化合物。

e. I.P.接种后的体内造影。在剖腹前和剖腹后对经腹膜内感染SL1344lux的小鼠进行造影(实施例9)。结果显示在图9中。照片显示，腹部的大部分区域发光，有多处透射光子焦点。盲肠内似乎没有发光沙门氏菌。以上实验结果表明，在感染的早期阶段，各沙门氏菌菌株都具有发光所需的足够的O₂。但是，因为只在SL1344lux感染小鼠内表现后期的全身性感染，沙门氏菌进入粘膜细胞和随后的全身性感染似乎仅限于侵害性菌株的感染。

f. 环丙沙星对沙门氏菌感染的效果。如实施例10所述进行实验，以证明非侵害性造影可以用于跟踪感染对药物的反应。小鼠经口接种SL1344lux，并用100mg环丙沙星治疗，后者是一种能够抗沙门氏菌感染的抗生素。在治疗后按选定的时间间隔对小鼠进行造影，并通过测定光子的发射来定量感染的程度。将治疗后小鼠的光子发射与治疗前的值，与被感染但未经治疗的对照小鼠的值相比。图10A至E显示此类实验之一的结果，并在实施例10中进行了论述。与治疗小鼠零时的病原水平和对照动物治疗全过程中的病原水平相比，以抗生素治疗的小鼠体内的感染显著地减少。

g. 羧苄青霉素选择的作用。Ducluzeau等在1970年在《Zeut.Bakt》 5313：533-548中证明，用抗生素治疗动物促使沙门氏菌集中在盲肠。对本实验的小鼠持续进行抗生素治疗，即为了选择含有萤光素酶克隆的Amp^r沙门氏菌而肌肉注射羧苄青霉素。这一治疗可能会改变胃肠道感染的过程，但是沙门氏菌能够与盲肠上皮细胞结合，这一结果表明发光所需的氧是可以获得的。该结果十分重要，因为盲肠腔通常被认为是一个无氧环境。

VIII. 用途

生物发光技术在多种宿主病原系统中具有广泛的用途，而且能够对其它生物活动，例如活动物体内肿瘤的发展和基因的表达，进行时间和空间上的评价，并且可用在药物开发和筛选上。病原的活体造影的广泛使用将减少病理实验和/或实时研究抗微生物药所需的动物数量和时间。而且，尽管发光细菌是被用于环境分析的，生物发光的生物体可能可以在动物活体内用作生物传感器。Korpela等证明，胃肠道腔体内有限的氧供应使得生物发光仅限于沙门氏菌能够获得氧的位置，可能直接从上皮细胞或其它类型细胞获得。Korpela等，1989，《生物发光和化学发光杂志》 4：551-554。这一氧需求可能可以用作的细胞-细胞密切的相互作用的指示，或者用作研究动物活体内不同位置的氧浓度的生物传感器。后文举例说明了几个这一技术的用途，其目的是为了说明而不是限制本发明的范围。

A. 测定氧水平

由上述实验证明的萤光素酶发光的氧需求表明，本发明可以作为一种测定受试者体内氧浓度的空间梯度的方法。发光细菌已被用于测定10至1mM的氧水平。研究预计，0.1nM将是监测的下限(Campbell，1988，《化学发光。在生物学和医学上的原理与应用》(Chemiluminescence.Principles and Applications in Biology and Medicine)(chichester，England：Ellis Horwood Ltd.和VCHVerlagsgesellschaft mbH))。本发明所述的造影法可以用来研究动物活体内不同位置的氧水平。例如，尽管发光细菌目前被用作环境分析中(Guzzo等，1992，《Tox.Lett.》 64/65：687-693，Korpela等，1989，《生物发光和化学发光杂志》4：551-554，Jassim等，1990，《生物发光和化学发光杂志》 5：115-122)，经改变后能够以O₂或Ca²⁺依赖性方式发光的微生物可以用作受试者体内的生物传感器。与O₂探头相比，与O₂浓度相关的发光的动态范围要宽得多，能够测得更低的O₂浓度(Campbell，1988，《化学发光。在生物学和医学上的原理与应用》 (Chemiluminescence.Principles and Applications in Biology and Medicine)(chichester，England：Ellis Horwood Ltd.和VCH VerlagsgesellschaftmbH))。而且，在30nM至8mM范围内，光发射与O₂浓度成线性比例关系，最大发光的1/2所需的O₂浓度是9mM。

B. 肿瘤细胞的定位

利用本发明的方法和组合物可以监测受试者体内肿瘤的生长和转移扩散。具体地说，如果某个体被诊断患有原发性肿瘤，可以使用抗肿瘤细胞的LEC以同时确定肿瘤的边界和来自原发肿瘤的细胞是否迁移和集中到较远的位置。

例如，可以给受试者使用LEC，例如含有抗肿瘤抗原的抗体并加载了LGM的脂质体，任其与受试者体内的肿瘤细胞结合，对其进行造影，由此可以将发射光子的区域与肿瘤细胞区域关联起来。

与此相关的是，可以在选定的时间间隔利用例如前文所述的那些定位肿瘤的LEC进行造影，以便随时间监测肿瘤在受试者体内的生长、发展和转移。这样的监测可以用来记录抗肿瘤治疗的结果，或者参与筛选可抑制肿瘤生长或转移的候选治疗性化合物。

或者，如上所述，可以用受组成性活性启动子调控的萤光素酶结构物转化肿瘤细胞，并将所述细胞用于在动物模型中诱导发光的肿瘤。这样的动物模型可以用来评价候选抗肿瘤化合物的效果。

C. 定位炎症反应

与上述方式类似，本发明的组合物和方法可以用来确定炎性反应的位置，随时间监测炎性反应，和/或筛选有效的消炎化合物。用于定向于炎症位置的分子包括ELAN族蛋白质，后者与选择作用向结合。可以将一个ELAN分子结合在本发明实体内作为定向部分，用于寻找炎症位置。

或者，可以通过令动物成为表达受E-选择启动子调控的萤光素酶的转基因动物来制备研究候选消炎物质的动物模型。由于E-选择在炎症位置表达，炎症位置的转基因细胞将表达萤光素酶。

所述的系统可以用来筛选消炎物质。可以给对照和实验动物使用炎症刺激剂，与对照动物相比，评价候选消炎化合物对被治疗动物体内诱导产生的发光的作用。

D. 定位感染

如支持本发明的实施例所说明和上文所概括的，LGC可能可以有效地用于跟踪病原对受试者的感染过程。在本文的具体实验中，LGC是为了表达萤光素酶而被转化的病原细胞(沙门氏菌)。这样的系统对于研究人疾病的动物模型内的感染和随后的感染扩散十分理想。它提供了在病理研究中利用感染和疾病发展的位置而不是例如高烧、水肿等常规的全身性症状来监测感染性疾病进程的能力。

使用外部造影法监测抗感染效果可以进行在动物活体内的时间和空间上的评价，由此减少病理研究和/或消炎药研究所需的动物数量。

以下实施例是对本发明的说明而非限定。

材料与方法

A. 细胞

沙门氏菌菌株SL1344和LB5000由B.A.D.Stocker提供(Stanford University；Hoiseth和Stocker，1981，《自然》291：238-239)。沙门氏菌菌株BJ66由B.D.Jones提供(Stanford University)。

HEp-2细胞由美国典型培养物保藏中心提供(ATCC；12301 Parklawn Dr.，Rockville MD；保藏号CCL-23)。

鼠腹膜内巨噬细胞通过用7ml生长培养基对无痛致死后的Balb/c小鼠进行腹膜内灌洗而获得(Maximow和Bloom，1931，《组织学课本》(Textbook of Histology)，Saunders，Philadelphia)。

B. 静态培养物

在3ml含有100mg/ml羧苄青霉素的LB肉汤中接种6μl来自静止期培养物的细菌悬浮液，然后令细菌在静止的7ml培养试管内于37℃生长，如此制得低氧(静态)培养物。

C. 小鼠

Balb/c(Ity^s/s)小鼠由斯坦福大学肿瘤学系提供。129×Balb/c(Ity^r/s)小鼠由斯坦福大学转基因动物所(Stanford，CA)提供。在斯坦福大学研究动物所(Stanford，CA)，所有动物均在相同的光照时间，喂养方法和温度等条件下笼养。

通过给动物腹膜内注射(i.p.)33μg/kg体重戊巴比妥钠(nembutal)进行麻醉。

无痛致死是按照斯坦福学研究动物所建议的方法在CO₂中窒息或造成颈部脱臼进行的。颈部脱臼用在窒息造成的生理变化会影响到实验结果的实验中。

用lux转化的沙门氏菌感染的小鼠每日肌内注射(i.m.)羧苄青霉素(125mg/kg体重)，以便为了保留含lux操纵子的Amp^r质粒而维持对发光沙门氏菌的选择压力。

D. 造影

被摄动物或物体被固定在一个避光盒(light-tight box)中，盒子有一扇门和一个电荷耦合装置(CCD)相机，相机配有二级微通道增强器头(C2400-40型，Hamamatsu)。相机通过从盒子中延伸出来的电缆与“ARGUS 50”图像处理器(Hamamatsu)相连。

上述ICCD系统在达到10-30个光子的阈值后，能够监测单光子。根据信号的强度，以上系统信号与干扰之比在2∶1至1×10⁴∶1之间。

灰度像的获得是通过在暗室光下打开光盒的门，然后进行8至64帖的积分。灰度像的增益(gain)被设定在能够获得最佳的图像-其范围为0至10,000伏特，通常设定在3000伏特。

生物发光数据是在没有外源光的条件下获得的。曝光设定如下：黑度(blacklevel)由相机/图像处理器自动设定，增益由增强器调节器自动调节，f-终止(f-stop)设定为2.8。使用了一个60mm“AF NIKKOR”大透镜(Nikon Inc.，Melville，NY)。

生物发光图像是通过对光子进行一段选定时间，通常为5分钟的积分而形成的。对所有动物均用每象素0至3比特的最低比特范围(bitrange)表示数据。对于其它物体，例如24孔实验板，在0至3的比特范围内无法获得生物发光信号的分辨率时，可以扩大该范围直至能够确定生物发光信号的位置，通常为1至7.如果造影5分钟无法获得更多的信息，可以缩短对物体的造影时间。

外部造影指对动物的非侵害性造影。内部造影指在部分肢解动物，通常是在解剖后造影。内部造影只对选定的动物进行，用于验证由外部造影确定的光子发射源。

生物发光图像以代表测得光子的强度的拟色发光图像来表现。通常使用6级强度水平，从蓝色(低强度)至红色(高强度)。

为了形成本文提供的附图，我们利用图像处理器将灰度像与生物发光像重迭，由此形成可提供空间参照系的组合像。

合成像被展示在RGB CRT(红、绿、蓝；阴极射线管)计数器上，再拍摄计数器产生硬拷贝。还可以如下形成硬拷贝，将图像处理器中的图像保存为数字文件，将该文件转移到计算机中，然后通过与计算机相连的彩色打印机打印。或者，可以直接用摄像打印机直接打印摄像信号来形成硬拷贝。

实施例1

用pCGLS1 lux质粒转化沙门氏菌

A. pCGLS1质粒

图1A、1B和1C显示了pCGLS1质粒的图示。该质粒是通过将约11kb的含来自土壤细菌Xenorhabdus luminescens的lux基因区域(图1A；Frackman等，1990)克隆在pUC18(图1C；Clontech，Palo Alto，CA)的Bam HI位置(图1B)构建而成的。Frackman等(1990)说明了载体的构建方法。

图1A中的限制性酶切位置是如下表示的：Bs，Bst EII；C，Cla I；E，Eco RI；H，Hind III；M，Mlu I；S，Sca I；X，Xba I；B/Sa，Bam HI和Sau 3A接头。图1B是包含在多克隆位置(MCS)内的一段序列，其中的Bam HI位置以粗体表示。

图1C显示的是没有插入片段的pUC18载体。标记元件包括氨苄青霉素抗药性基因(Ap)，lac Z基因(lac Z)和大肠杆菌的复制起始区(Ori)。原pUC18载体长约2.7kb。

B. 沙门氏菌的转化

用标准法(Sambrook等，1989，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning： A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Vol.2)制备沙门氏菌SL1344，BJ66和LB5000的电感受态细胞，在使用前将其保存在-80℃。如下进行电穿孔：将1μl质粒(0.2μg/ml)加入40μl悬浮于10％甘油中的冰冻电感受态细胞。温和搅拌悬浮液1分钟，将其装入间隔为1mm的电穿孔透明试管中，用Bio-Rad Gene-Pulser(Bio-Rad实验室，Hercules，CA)进行电穿孔。条件设定为2.5千伏，400欧姆，25微法。

在Luria Bertini(LB)肉汤中于37℃搅拌培养1小时后，将细胞平板培养在含100μg/ml羧苄青霉素的(LB)琼脂板上，令其生长过夜。

为了尽可能加强标记沙门氏菌的生物光，lux操纵子被保留在高拷贝数的质粒上，而不是以单拷贝基因的形式整合。但是，质粒会受到细菌细胞的修饰，尤其是在recA菌株中，如本文使用的SL1344和BJ66。recA基因座编码一个重组酶和β-内酰胺酶，前者可以删除质粒中含有lux操纵子的区域。所以，用从培养细胞中回收的沙门氏菌同时进行有和无羧苄青霉素的平板培养，并造影测定生物光丢失的频率。从庆大霉素处理过的裂解HEp-2细胞和巨噬细胞中回收的所有集落都是氨苄青霉素抗性的(Amp^r)并且是生物发光的。所以，在与哺乳动物细胞共培养的过程中，lux基因似乎并未丢失。

在暗房内通过目测分析集落的发光性。鉴定出了5个具有高水平发光性的转化子。其中3个，分别来自SL1344，BJ66和BL5000，被选择用于后面的实验。它们分别被称为SL1344lux，BJ66lux和BL5000lux。

实施例2

普通和转化沙门氏菌的侵害性

用细菌粘附性和进入性分析法测定了6种沙门氏菌菌株(SL1344lux，BJ66lux，BL5000lux，SL1344，BJ66，BL5000)的侵害性。基本上按照已知方法(Finlay和Falkow，1989，《分子微生物学)》 3：1833-1841)略加改动(Lee等，1990，《PNAS》 87：4304-4308)来进行集落形成单位(CFU)分析。生物发光分析的方法与CFU分析基本相同，所不同的是利用生物光而不是CFU来定量细胞数。

简而言之，将HEp-2细胞和亲代鼠腹膜内巨噬细胞接种在24孔组织培养盘上，细胞悬浮在补充了20mM谷氨酸(Bibco/BRL)和5％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的RPMI(Bibco/BRL，Grand Island，NY)中，每孔接种1×10⁵个细胞。在细胞接种后24小时(HEp-2)或7天(巨噬细胞)，按照每孔1×10⁶(10次重复感染(m.o.i.))或1×10⁷(100次m.o.i.，图2B至E中的右柱)接种以静态培养(参见前文的“材料与方法”)的细菌，并在Beckman临床离心机(Beckman Instruments，Columbia，MD)内以1000rpm(185×g)的速度离心5分钟，将其离心到细胞单分子层之上。用含有(进入性分析)或不含(粘附性分析)庆大霉素(100mg/ml)的RPMI培养基(Gibco/BRL)置换培养基。将此共培养物在5％CO₂中，在35℃培养3.5小时。

培养基中的庆大霉素杀死了没有被HEp-2细胞内化的细菌，包括粘附在HEp-2细胞表面上的那些。所以，粘附性分析(不含庆大霉素)中的信号代表了粘附的和被内化的细菌，而进入性分析(含庆大霉素)中的信号只代表被内化的细菌。

通过在3个时刻-接种后的1.5、3.0和3.5小时-造影发光的细菌细胞来分析粘附性和进入性。在第一次造影前，细胞分子层以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次以去除未固着的细菌，并加入一份新鲜的RPMI培养基。用30秒的曝光时间记录发光。利用同样的曝光时间来获得第二次和第三次的图像，但不用象第一次那样洗涤细胞。

图2A显示了最后一次记录的数据，它被展示成重迭在培养盘测试孔的灰度像上的拟色发光图像。图中说明了细胞类型、沙门氏菌菌株和庆大霉素的使用。数据还被概括成光子计数的相对强度显示在图2B和2D中。

在第3.5小时造影后，组织培养细胞用PBS洗涤3次，并用含0.2％“TRITONX-10”的PBS溶液裂解细胞。将裂解后释放出来的粘附和/或胞内细菌平板培养在LB或LB-羧苄青霉素琼脂板上，在35℃培养18小时。通过计数集落形成单位(CFU，Finlay和Falkow，1989《分子微生物学》 3：1833-1841，Lee等，1990《PNAS》 87：4304-4608)来测定每个测试孔中释放的细菌个数。以上数据被表示为每毫升加或不加庆大霉素培养3.5小时后的共培养物回收液的总细菌集落数，并将其概括在图2C和2E中。

生物发光分析和CFU分析的数据都显示，(i)用lux基因转化的沙门氏菌具有与亲代相同的感染性，(ii)根据发光监测和CFU估计，两种沙门氏菌在HEp-2细胞和巨噬细胞内的侵害性相当。巨噬细胞培养物中的生物发光与CFU之比较低，这可能是因为沙门氏菌进入巨噬细胞时进入了亚细胞区室。

实施例3

转化沙门氏菌的体外发光

将4份10μl的LB5000lux沙门氏菌10倍连续稀释液(从每毫升10⁶个细胞至每毫升10³个细胞)装入4根100μl的玻璃毛细管(Clay-Adams div.of BectonDickinson，Parsippany，NJ)内。细菌悬浮液在管内形成液柱，而两端为空气穴。每根毛细管的一端用critoseal(Clay-Adams)密封。制成稀释液的培养基通过与空气接触被O₂饱和。

用透明的塑料薄膜包裹毛细管，并如前文所述进行30秒钟的造影来测定发光。图3A显示了一个图像实例。对4根毛细管进行了造影。他们包含(从上至下)每毫升10⁶、10⁵、10⁴和10³个沙门氏菌细胞(每管10⁴、10³、10²和10个细胞)。可以在包含少至每毫升10⁴个细胞(100个细胞)的悬浮液中测得发光。但是，发光只限于气/液界面，这表明发光反应需要较高的氧水平。由于许多细菌被认为存在在液柱中而不在气/液界面，数据显示，提供图3A所示毛细管内的发光的细胞大大少于每根毛细管内细胞的总数。

实施例4

体外检测透过动物组织的光

如实施例3所述，用内径3.5mm的玻璃毛细管制备微试管，其中含有LB50001ux沙门氏菌的连续稀释液。但是，在本实施例中，细菌悬浮液与毛细管的密封端接触，只有上端与空气接触。毛细管被放在半透明塑料闪烁瓶中，并以以下组织中的一种包围：鸡胸肉，鸡皮，羊羔肾或羊羔的肾髓质。以上组织都来自当地某超市的肉品部(Safeway，Mountain View，CA)。

图4显示了一个包含了被组织包围的毛细管的小瓶。小瓶1的直径约1.4cm，并有一个盖子2。小瓶的上部3被包以不透明材料(例如黑色胶带)。动物组织4被放在小瓶内，使得它从瓶底起正好延伸至不透明包被3的下缘。微试管5在底部以塞子7(例如crytoseal塞)密封，并径向地位于瓶的中心，加塞的一端接触或靠近瓶底。细菌悬浮液6从试管底起约高1cm。

用液体闪烁计数器(1219Rackbeta型，LKB/Wallac，Gaitherburg，MD)，关闭快速同步鉴别器(fast coincedence discriminator)，分别对加有组织和没有组织，有细菌和没有细菌的小瓶发出的光子计数。

对没有组织的对照组的分析是将细菌悬浮液直接放在闪烁瓶中进行的。全部实验均进行一式三份。

在每一次实验中，对小瓶计数2至3次，每次计数将瓶转过90°，以控制因组织厚度可能不均匀而造成的影响。检测中没有发现明显的差异。

表1概括了实验结果。

表1

透过组织的光子透射
透过组织的光子透射					样品	鸡皮	鸡肉	羊羔肾	羊羔肾髓质
仅有小瓶	2.1×10⁴	1.3×10⁴	1.0×10⁴	1.0×10⁴	样品	鸡皮	鸡肉	羊羔肾	羊羔肾髓质
仅有小瓶	2.1×10⁴	1.3×10⁴	1.0×10⁴	1.0×10⁴	仅有组织	N.D.	1.5×10⁴	9.4×10³	8.5×10³
组织加LB5000lux^*	2.7×10⁵	2.3×10⁵	1.6×10⁴	1.5×10⁵	仅有组织	N.D.	1.5×10⁴	9.4×10³	8.5×10³
组织加LB5000lux^*	2.7×10⁵	2.3×10⁵	1.6×10⁴	1.5×10⁵	仅有LB5000lux^*	2.0×10⁶	1.7×10⁶	4.8×10⁶	4.8×10⁶

计数结果是一式三份测量的平均值，组织透过路径为1cm。^*-1×10⁷个细胞。

在闪烁计数器内使用光放大管(PMT)时，来自被肾组织包围的1×10³LB5000lux的信号接近背景水平。这种检测中的背景水平是由于PMT的暗流造成的，造成只能研究分析较强的信号。

透过0.5cm的禽肉、禽皮、羊肾髓质和羊肾，可以测得约1×10⁷LB5000lux的生物光。以上结果表明，透过不同不透明度的动物组织可以测得由被标记的沙门氏菌发出的生物光。由于毛细管内的氧可能很有限(如图3A所示)，很可能，透过组织能够被测得的生物发光的沙门氏菌要比本实验说明的少。

实施例5

活体检测生物发光的沙门氏菌

为了估计在感染过程中沙门氏菌的氧可得性，在BALB/c小鼠的腹腔内接种(i.p.)野生型SL1344lux。在接种24小时后，用增强CCD相机从外部检测被麻醉的小鼠体内细菌发出并透过腹腔壁的光子，并确定在体内的位置(图3B)。全身性沙门氏菌感染被认为涉及到在淋巴结、脾脏和肝脏的集落。用野生型SL1344lux经i.p.接种感染的小鼠的腹部造影显示在大部分腹部表面上透射出光子，并有不同的强度的焦点(图3B)。以上结果与脏器内的广泛分布的集落是一致的，其中可能包括肝脏和肠系淋巴结，以上结果还表明，部分组织中可利用的氧水平足够从体外检测由标记病原发出的生物光所需。

实施例6

检测BALB/c小鼠内口服的lux沙门氏菌

Balb/c小鼠经口喂以50μl1×10⁷毒性SL1344lux、非侵害性BJ66lux和低毒性LB5000lux沙门氏菌悬浮液(Stocker等)。每日以5分钟的积分时间(测量5分钟的光子发射)对感染时为4至6周龄的小鼠进行造影。在造影前，用33μg/kg体重的戊巴比妥钠将小鼠麻醉。

图5A至F是代表性照片。在接种后(p.i.)24小时，全部被感染动物内的生物光信号都集中在一个焦点(图5A、5C和5E)。接种后不到7天，所有感染低毒性LB5000lux的动物内的生物光都消失(图5B)。在感染野生型SL1344lux的Balb/c小鼠内，在整个实验过程中都能检测到生物光，在第8天有多个光子焦点。在这些动物体内，感染通常扩散到腹腔体的大部分区域(图5F)。这些动物中三分之一在第8天在大部份腹部区域上可以看到发出的光子，这类似于i.p.接种后的光子分布(见图3B和5F)。BJ66lux感染的扩散更不一致，但是这些感染通常能够持续并保留在初始位置(图5D)。

在用野生型SL1344lux感染抗性Balb/c×129小鼠后，在一组10个小鼠中，生物光信号在整个研究过程中保持集中并能够持续。该结果与在被SL1344lux感染的易感性小鼠(Ity^r/s)内观察到的生物光扩散相反(参见实施例8和图7A和7B)，但是与感染低侵害性BJ66lux的易感性BALB/c小鼠的持续性感染类似。作为对照，培养来自持续感染的抗性BALB/c×129小鼠的沙门氏菌，第8天回收的集落中有80％至90％是Amp^r的。其中，90％是生物发光的，这表明观察到的差异不是因为lux质粒的大量丢失，而是由于实际的菌株病原性差异。

实施例7

用毒性和低毒性沙门氏菌菌株I.P.接种后对感染的检测

经腹膜内(i.p.)给BALB/c小鼠接种每100μl悬浮液含1×10⁷细菌细胞的毒性(SL1344lux)或低毒(LB5000lux)沙门氏菌，不同时注射空气。

接种后(p.i.)第32小时，如上所述将小鼠麻醉并进行造影。结果显示在图6中。在图左感染毒性SL1344lux的两个小鼠中可以看到分布广泛的感染。相反，图右注射低毒LB5000lux菌株的小鼠内几乎检测不到发光。

实施例8

检测经口接种沙门氏菌后对抗性小鼠体内的全身性感染

给抗性129×Balb/c(Ity^r/s)活鼠经胃接种1×10⁷SL1344lux沙门氏菌。细菌是在麻醉状态下经胃管引入的。在输注后的8天内每日给动物造影(d.p.i)。

结果显示在图7A和7B中。相同的3只小鼠被感染并在8天内每日被拍照。显示的是第1天(图7A)和第8天(图7B)的代表性照片。数据显示，抗全身性感染的小鼠发生了位于盲肠的慢性感染，但是感染并不扩散到腹腔内。

实施例9

经口接种沙门氏菌后的剖腹后造影

在经口接种沙门氏菌后进行解剖，以准确确定光信号在腹腔内的位置，以及由此获得的位置与用非侵害性造影法获得的相比较。动物的接种如实施例8所述。在一段选定时间后，一般为7天，如前所述将鼠麻醉并从外部造影。图8A显示了一例照片。在外部造影之后，打开腹腔再次给动物造影，如图8B所示。有时，在盲肠前和盲肠后的肠腔内注入空气后第三次给鼠拍照(C)(图8C)。在最后一次拍照之后，立刻将小鼠无痛致死。

如果在易感性小鼠体内观察到经口接种后感染早期的聚焦形式的生物光时，光子总是几乎完全来自盲肠，而确切位置和聚焦生物光强度的差异则是因为盲肠位置的差异。在抗感染BLAB/c×129小鼠内观察到的聚焦形式的生物光也同样集中在盲肠。相反，在i.p.感染SL1344lux的动物内没有观察到这样的位置分布(图3B)。但是在经口接种野生型SL1344lux的小鼠的晚期，在解剖后没有看到其它的发光焦点。在感染低毒LB5000lux后7天的易感性小鼠体内，在去除皮肤和腹膜壁之后，在任何组织或器官中都没有检测到发光，即使是聚焦在一处的光。

在被感染动物的脾或血流中都没有检测到生物光；只有在疾病的晚期才看到肝脏发出的生物光；来自胃肠道的生物光仅在疾病的早期限于盲肠。以上方式可能是因为沙门氏菌在不同组织内的数量不同，或者是因为缺乏可以得到的氧。将经口感染的小鼠的器官均质后计数其中的Amp^rCFU，由此评价标记的沙门氏菌SL1344lux的分布。在第7天，从所有被分析的感染SL1344lux的BLAB/c小鼠组织获得了90％以上的Amp^r细菌集落，这表明体内肝脏、脾脏和肺部的总CFU在1.9×10³至1.0×10⁵以上，但没有可活体测得的光子(表2)。相反，可以测得来自盲肠的光子发射，该组织内的总CFU超过1.0×10⁸。在感染LB5000lux的小鼠的任何组织内都未能测得CFU。以上结果表明，组织中存在1×10⁶的微生物大约是利用目前的实验系统在目前的发射波长的测定极限。

氧是萤光素酶反应的必需底物，所以只有处于有氧微环境中的沙门氏菌才会生物发光。所以，在胃肠道内的无氧环境下没有来自沙门氏菌的生物光是可以预见的，而令肠腔接触空气将揭示存在着原先由于缺氧而无法测得的细菌。可支持这一观点的是，只在盲肠测得生物光的动物排泄的粪便在接触空气后立即可发出生物光。在肠腔中存在着不发光的表达萤光素酶的细菌，以及该组织内有氧区和无氧区的清晰划分，这些说明，在肠腔内注入空气将揭示还存在着更多的细菌。给生物发光方式类似的另一动物的回肠和结肠内注入空气，结果在注入位置附近测得了光子(图8)。最后，杀死另一个盲肠生物发光的小鼠时，生物光很快消失。因为没有明显的有氧环境与无氧环境的区域，所以在其它组织位置注入空气。

表2感染了生物发光的沙门氏菌的小鼠组织经均质后其中的集落形成单位

菌株组织动物编号组织重量(mg) 总CFUSL1344lux 肝脏 1 441 1.9×10³

2 778 2.5×10⁴

脾脏 1 218 1.2×10⁴

2 248 4.9×10⁵

肠系淋巴结 1 76 ＞1.0×10⁶

2 46 ＞1.0×10⁶

肺 1 17 1.5×10³

2 69 2.7×10³

盲肠 1 351 ＞1.0×10^8*

2 422 ＞1.0×10^8* ^*由这些组织位置处的细菌发射的光子是从外部测得的。

实施例10

I.P.接种沙门氏菌后的剖腹后造影

Balb/c小鼠如实施例7所述经腹膜内接种1×10⁷沙门氏菌(SL1344lux)。图9A、9B和9C显示了以上动物的一例照片。

在接种后(p.i.)24小时，动物被麻醉并对其进行5分钟的造影(图9A)。将腹腔打开后再次进行5分钟的造影(图9B)。将盲肠拉至左侧，再造影5分钟(图9A)。

实验结果显示，用非侵害性造影法确定的感染位置很好的对应于打开腹腔后发现的位置。

实施例11

环丙沙星治疗对SL1344lux沙门氏菌生物发光的作用

为了说明活体造影的用途，用抗生素环丙沙星治疗一被感染的动物，已知该抗生素能够抗全身性沙门氏菌感染。Magalianes等，1993，《抗微生物剂化学治疗》(Antinuionbial agento cheme) 37：2293。

给实验组和对照组的Balb/c小鼠经口接种SL1344lux。在接种后第8天，给实验组的小鼠i.p.注射100mg盐酸环丙沙星(3mg/kg体重；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。在给实验组动物进行治疗后，在治疗后的5.5小时，多次给两组的动物造影(如前文)。

图10B至E显示了代表性的照片。图10B和10D分别显示对照组和治疗组代表性动物在临对实验组进行治疗前的组合像。图10C和10E显示以上动物在治疗5.5小时后的合成像。在这段时间内，接受环丙沙星治疗的小鼠的腹部的生物光被降低到无法测得的水平，而对照组的生物发光则通常提高7.5倍。我们测定了腹部区域测得的光子的总数，并将该指标准化成t＝0时的值，将其对治疗后时间绘图在图10A中。

实验数据显示，本发明的方法和组合物可以被用来活体评价药物对于感染扩散的作用。

虽然以上结合具体的方法和实施方式对本发明进行了说明，但是应该认识到，在本发明范围内还可进行多种修改和改变。

Claims

1.一种非医学目的的检测具有不透明组织的非人类哺乳动物活体受试者内转基因整合情况的非侵害性方法，它包括：

给予所述受试者载体结构物，该载体结构物能够整合到所述哺乳动物的细胞内，所述载体结构物含有转基因，编码生物发光蛋白或荧光蛋白的异源基因和可激活启动子，编码所述发光蛋白的所述异源基因的表达受所述启动子的调控，

激活所述的启动子，

保持受试者位于光检测装置的检测场内，

用光检测器检测所述受试者体内由所表达发光蛋白发出并透过不透明组织的光子发射水平，

根据光子发射水平明显高于背景水平来确认发生了转基因的整合。

2.一种非医学目的的检测具有不透明组织的非人类哺乳动物活体受试者内由启动子诱导的活动的非侵害性方法，它包括：

激发转基因哺乳动物受试者体内的所述由启动子诱导的活动，其中，(i)该转基因哺乳动物含有编码生物发光蛋白或荧光蛋白并处于可诱导启动子调控之下的异源基因，(ii)所述活动由所述可诱导启动子引起，

保持受试者位于光检测装置的检测场内，

用光检测器检测所述受试者体内由所表达发光蛋白发出并透过不透明组织的光子发射水平。

3.一种非医学目的的检测非人类哺乳动物活体受试者内异源基因表达的非侵害性方法，它包括：

提供细胞内含有转基因的哺乳动物受试者，其中，(i)所述转基因包含编码生物发光蛋白或荧光蛋白的异源基因，(ii)所述受试者具有不透明组织；

用光检测装置检测透过不透明组织的光子发射来检测所述异源基因的表达，其中，所述受试者被维持于允许所述细胞表达所述异源基因的条件下。

4.根据权利要求1，2或3所述的方法，所述的光子发射是生物发光蛋白介导的化学反应的结果。

5.根据权利要求4所述的方法，所述生物发光蛋白由luc基因编码。

6.根据权利要求4或5所述的方法，包括为生物发光蛋白提供荧光素底物。

7.根据权利要求1，2或3所述的方法，所述的光子发射缘于荧光蛋白介导的荧光。

8.根据权利要求7所述的方法，所述荧光蛋白是绿荧光蛋白，2，4-二氧四氢喋啶和黄荧光蛋白。

9.根据权利要求7或8所述的方法，用激光器输入用于激发荧光蛋白的光。

10.根据权利要求3所述的方法，所述异源基因的表达是组成性-活性启动子介导的。

11.根据权利要求3所述的方法，所述异源基因的表达是有可诱导启动子介导的。

12.根据权利要求1，2或3-11中任一项所述的方法，所述用光检测装置检测透过不透明组织的光子发射持续进行，直至可构成光子发射图像。

13.根据权利要求12所述的方法，还包括：

获得所述受试者的反射光图像；和

将所述光子发射图像重叠在所述反射光图像上构成组合像。

14.根据权利要求1，2或3-13中任一项所述的方法，还包括：

按照一定的间隔重复检测；

所述的重复检测可随时间跟踪异源基因在所述受试者体内的表达。

15.根据权利要求1，2或3-14中任一项所述的方法，还包括：

给予所述受试者某种化合物；

检测给予该化合物后受试者的光子发射。

16.根据权利要求15所述的方法，还包括：

在给予所述化合物后，按照一定的间隔重复检测；

所述的重复检测可随时间跟踪所述化合物在所述受试者体内对于异源基因表达水平的影响。

17.根据权利要求1，2或3-16中任一项所述的方法，所述检测用增强电荷耦合光检测器进行。

18.根据权利要求1，2或3-16中任一项所述的方法，所述检测用经冷却的电荷耦合光检测器进行。

19.根据权利要求1，2或3-18中任一项所述的方法，所述的光子检测在将所述哺乳动物固定的情况下进行。

20.根据权利要求1，2或3-19中任一项所述的方法，其中，在检测光子发射之前所述受试者已被置于光检测装置的检测场中。

21.根据权利要求1，2或3-20中任一项所述的方法，所述构成光子发射的光子是可见光光子。

22.根据权利要求1，2或3-21中任一项所述的方法，所述用光检测装置检测来自受试者体内透过不透明组织的光子发射用位于受试者体外的光检测装置进行。