CN113758901A - 衍射层析显微成像系统及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了衍射层析显微成像系统，包括：承载片，包括透明载片和反射膜，透明载片包括相对的第一表面和第二表面，第一表面用于承载样品，反射膜设置于第二表面上；光路组件，用于产生参考光以及照射样品的入射光，并对参考光、第一样品光和第二样品光进行合束；显微镜组件，用于使入射光通过而照射到样品背向第一表面的前表面和第一表面上，并且使第一样品光和第二样品光通过；成像组件，用于采集合束后的参考光、第一样品光和第二样品光的干涉图像。本发明还公开了采用了上述成像系统的衍射层析显微成像方法。本发明解决了在衍射层析术中，入射光只能扫描到样品朝向物镜的一侧表面，而无法扫描到样品背向物镜的一侧表面的问题。

Description

衍射层析显微成像系统及方法
技术领域
本发明属于显微成像技术领域，具体地讲，涉及一种采用光源进行层析成像的同时，无需旋转样品的情况下还能实现分辨率近各向同性的衍射层析显微成像系统及方法。
背景技术
层析显微成像技术是一种有效获取微小样品的断层信息并实现样品内部结构三维测量的技术手段。典型的层析显微成像技术包括X射线计算机层析成像技术、激光扫描共聚焦显微成像技术、衍射层析显微成像技术等。这些成像技术已在医学领域、微小光学器件检测等领域中得到了广泛的应用，从而大大推动了医学检测、微纳加工等技术的发展。
衍射层析显微成像技术是指：利用各种干涉技术获取样品各个角度的散射场分布，然后通过傅里叶衍射层析算法重建折射率三维分布。衍射层析显微成像技术能够对样品进行实时、无扰、动态、定量地成像。在衍射层析显微成像技术中，根据样品的类型可以分为透射衍射层析显微成像技术和反射衍射层析显微成像技术。
在衍射层析显微成像技术中，采用光源来进行层析成像，由于承载样品的载玻片是透光的，因此原始光只能照射到样品朝向物镜(即背向载玻片)的表面上，而未照射到样品上的原始光直接穿过载玻片，从而无法照射到样品背向物镜(即与载玻片接触)的表面上。因此，单纯的衍射层析显微成像技术是无法获得各向同性分辨率的折射率分布。为了解决这样的问题，现有技术中通常采用的方法是扫描样品的一侧之后旋转该样品，以此能够扫描样品的另一侧，从而能够记录大视角的散射场分布，以实现三维折射率图中分辨率的近各向同性。但是，这种方法会使得Ewald频域球中出现苹果核形状的频谱缺失，即存在着“苹果核频谱缺失”问题，样品的机械旋转伴随的寄生运动以及旋转过程中样品发生的变形会大大地降低图像重建的精度。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明采用了如下的技术方案：
在本发明的一方面提供了一种衍射层析显微成像系统，该系统包括：
承载片，包括透明载片和反射膜，所述透明载片包括相对的第一表面和第二表面，所述第一表面用于承载样品，所述反射膜设置于所述第二表面上；
光路组件，用于产生参考光以及照射所述样品的入射光，并对所述参考光、第一样品光和第二样品光进行合束；
显微镜组件，用于使所述入射光通过而照射到所述样品背向所述第一表面的前表面和所述第一表面上，并且使第一样品光和所述第二样品光通过；
成像组件，用于采集合束后的所述参考光、所述第一样品光和所述第二样品光的干涉图像；
其中，所述入射光照射到所述样品的前表面时，所述入射光在所述样品的前表面上进行反射和/或穿过所述样品的前表面而生成所述第一样品光；
所述入射光照射到所述第一表面，且在所述反射膜上进行反射而照射到所述样品的背表面时，所述入射光在所述样品的背表面上进行反射和/或穿过所述样品的背表面而形成所述第二样品光；
在所述样品的前表面上进行反射而生成的所述第一样品光和/或穿过所述样品的背表面而生成的所述第二样品光直接朝向所述显微镜组件；穿过所述样品的前表面而生成的所述第一样品光和/或在所述样品的背表面上进行反射而生成的所述第二样品光在所述反射膜上反射后直接朝向所述显微镜组件。
优选地，所述光路组件包括：
光源，用于产生原始光；
分束器，用于对所述原始光进行分束以形成所述参考光和所述入射光；
合束器，用于对所述参考光、所述第一样品光和所述第二样品光进行合束。
优选地，所述光路组件还包括：
第一准直扩束器，用于对所述入射光进行准直扩束；
振镜，用于调整所述入射光的入射角度，以使所述入射光以不同的入射角经由所述合束器而入射到所述显微镜组件；
第二准直扩束器，用于对所述参考光进行准直扩束；
反射镜组件，用于将准直扩束后的所述参考光反射至所述合束器。
优选地，所述反射镜组件包括：第一反射镜和第二反射镜；
所述第一反射镜用于将准直扩束后的所述参考光反射至所述第二反射镜，所述第二反射镜用于将由所述第一反射镜反射至其上的所述参考光反射到所述合束器。
优选地，所述成像组件包括：偏振片和相机；
其中，合束后的所述参考光、所述第一样品光和所述第二样品光经过所述偏振片后到达所述相机。
优选地，所述显微镜组件包括透镜和物镜，所述入射光依序经过所述透镜和所述物镜后照射到所述样品背向所述第一表面的前表面和所述第一表面上；其中，所述第一样品光和所述第二样品光依序经过所述物镜和所述透镜后朝向所述光路组件。
在本发明的另一方面提供了一种衍射层析显微成像方法，所述方法采用了如上所述的衍射层析显微成像系统，所述方法包括：
将样品承载于所述承载片的透明载片的第一表面上，所述透明载片的与所述第一表面相对的第二表面上设置有反射膜；
利用光路组件产生参考光以及照射样品的入射光；
使所述入射光通过显微镜组件和所述反射膜而照射到所述样品背向所述第一表面的前表面和朝向所述第一表面的背表面上，以产生第一样品光和第二样品光；
使所述第一样品光和所述第二样品光通过所述显微镜组件后在所述光路组件中与所述参考光进行合束；
利用成像组件采集合束后的所述参考光、所述第一样品光和所述第二样品光的干涉图像；
其中，所述入射光照射到所述样品的前表面时，所述入射光在所述样品的前表面上进行反射和/或穿过所述样品的前表面而生成所述第一样品光；
所述入射光照射到所述第一表面，且在所述反射膜上进行反射而照射到所述样品的背表面时，所述入射光在所述样品的背表面上进行反射和/或穿过所述样品的背表面而形成所述第二样品光；
在所述样品的前表面上进行反射而生成的所述第一样品光和/或穿过所述样品的背表面而生成的所述第二样品光朝向所述光路组件；穿过所述样品的前表面而生成的所述第一样品光和/或在所述样品的背表面上进行反射而生成的所述第二样品光在所述反射膜上反射后朝向所述光路组件。
本发明提供的衍射层析显微成像系统在用于承载样品的承载片上设置了反射膜，采用该反射膜来改变照射在样品之外的部分入射光的光程，使得该入射光能够照射到样品的背表面(即样品的朝向承载片的承载面的一侧表面)，从而使本发明的衍射层析显微成像系统能够扫描到样品的背表面，生成了具有关于样品的背表面信息的第二样品光，也就是，采用本发明提供的衍射层析显微成像系统不仅能够生成入射光照射在样品的前表面而生成的具有关于样品的前表面信息的第一样品光，而且还能生成具有关于样品的背表面信息的第二样品光，从而实现了不必旋转样品也能够记录大视角的散射场分布，达到了三维折射率图分辨率的近各向同性。
进一步地，本发明提供的衍射层析显微成像系统中，在用于承载样品的承载片上设置了反射膜，还能够将入射光穿过样品的前表面而形成的第一样品光反射至光路组件中，从而实现了本发明提供的衍射层析显微成像系统能够同时兼容反射式样品、透射式样品和混合式样品，以此提高了衍射层析显微成像系统的泛用性。
附图说明
图1为本发明实施例的衍射层析显微成像系统的光路图；
图2为本发明实施例中扫描反射式样品时的光路图；
图3为本发明实施例中扫描透射式样品时的光路图；
图4为本发明实施例中扫描混合式样品时的光路图；
图5为本发明实施例的衍射层析显微成像方法的流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
实施例1
本实施例提供了一种衍射层析显微成像系统，如图1所示，该系统包括：承载片1、光路组件2、显微镜组件3和成像组件4。
如图2所示，所述承载片1，包括透明载片11和反射膜12，所述透明载片11包括相对的第一表面11a和第二表面11b，所述第一表面11a用于承载样品B，所述反射膜12设置于所述第二表面11b上。其中，所述反射膜12的构成材料可以是铝或者是银，所述透明载片11优选为以透明的聚合物材料构成。
所述光路组件2，用于产生参考光A2以及照射所述样品B的入射光A1。具体地，所述光路组件2包括：光源21、分束器22、第一准直扩束器24、振镜27、第二准直扩束器25、反射镜组件和合束器23。
如图1所示，所述原始光A经过所述分束器22后生成所述入射光A1和所述参考光A2。所生成的所述入射光A1经过所述第一准直扩束器24进行准直扩束后在所述振镜27的调节下朝向所述合束器23，并经过所述合束器23入射到所述显微镜组件3。其中，所述振镜27用于调整所述入射光A1的入射角度，以使所述入射光A1以不同的入射角经由所述合束器23而入射到所述显微镜组件3，从而实现了以不同的角度照射到所述样品B，以此得到了所述样品B的不同区域的信息。
所生成的所述参考光A2经过所述第二准直扩束器25进行准直扩束后在所述反射镜组件的作用下反射至所述合束器23中，并经过所述合束器23入射到所述显微镜组件3。其中，所述反射镜组件包括：第一反射镜261和第二反射镜262，所述第一反射镜261用于将准直扩束后的所述参考光A2反射至所述第二反射镜262，所述第二反射镜262用于将由所述第一反射镜261反射至其上的所述参考光A2反射到所述合束器23。
显微镜组件3，用于使所述入射光A1通过而照射到所述样品B背向所述第一表面11a的前表面和所述第一表面11a上，从而使所述入射光A1生成第一样品光B1和第二样品光B2。其中，所述显微镜组件3包括透镜31和物镜32，所述入射光A1依序经过所述透镜31和所述物镜32后照射到所述样品B背向所述第一表面11a的前表面和所述第一表面11a上。
以下说明所述第一样品光B1和所述第二样品光B2的具体生成过程。
如图2所示，图中所述样品B为反射式样品。在一方面，部分入射光A1照射到所述样品B的前表面(图2中样品B背向第一表面11a的一侧)时，所述入射光A1在所述样品B的前表面上进行反射而生成所述第一样品光B1，所生成的所述第一样品光B1直接朝向所述显微镜组件3；
在另一方面，部分入射光A1照射到所述第一表面11a上(即没有照射到样品本身)，并在所述反射膜12的反射作用下照射到所述样品B的背表面(图2中样品B的朝向第一表面11a的一侧)，此时所述入射光A1在所述样品B的背表面上进行反射而形成所述第二样品光B2，所生成的所述第二样品光B2在所述反射膜12上反射后直接朝向所述显微镜组件3(该过程中第二样品光B2可以在样品与反射膜之间进行多次反射)。
如图3所示，图中所述样品B为透射式样品。在一方面，部分入射光A1穿过所述样品B的前表面而生成所述第一样品光B1，所生成的所述第一样品光B1在所述反射膜12上反射后直接朝向所述显微镜组件3；
在另一方面，部分入射光A1照射到所述第一表面11a上，并在所述反射膜12的反射作用下照射到所述样品B的背表面，此时所述入射光A1穿过所述样品B的背表面而形成所述第二样品光B2，所生成的所述第二样品光B2直接朝向所述显微镜组件3。
在这里需要说明的是，所述样品B可以为混合式样品。如图4所示，当所述所述样品B为混合式样品时，上述说明的两种情形会同时发生，也就是，所述入射光A1照射到所述样品B的前表面或者背表面时，会同时发生光线在样品的表面上进行反射和直接穿过样品的现象。
进一步地，生成后的所述第一样品光B1和所述第二样品光B2依序经过所述物镜32和所述透镜31后朝向所述合束器23。所述第一样品光B1和所述第二样品光B2在所述合束器23中与所述参考光A2进行合束后，被所述成像组件4捕获。
具体地，所述成像组件4包括偏振片41和相机42。合束后的所述参考光A2、所述第一样品光B1和所述第二样品光B2经过所述偏振片41后到达所述相机42。所述相机42捕获合束后的所述参考光A2、所述第一样品光B1和所述第二样品光B2后生成干涉图像。
本实施例的衍射层析显微成像系统采用了具有反射膜12的承载片，从而在采用光源21来进行层析成像时，光线不仅能够扫描到反射式的样品B朝向物镜32的一侧表面，而且通过承载片的反射膜还能够扫描到反射式的样品B背向物镜32的一侧表面，以此不必旋转反射式的样品B也能够记录大视角的散射场分布，可以达到三维折射率图分辨率的近各向同性。不仅如此，本实施例的衍射层析显微成像系统还能够兼容反射式样品、透射式样品和混合式样品的检测，以此提高了衍射层析显微成像系统的泛用性。
实施例2
本实施例提供了一种衍射层析显微成像方法，该方法采用了实施例1的衍射层析显微成像系统的各个硬件。
如图5所示，该方法的具体步骤包括：
S1、将样品B承载于所述承载片1的透明载片11的第一表面11a上，所述透明载片11的与所述第一表面11a相对的第二表面11b上设置有反射膜12；
S2、利用光路组件2产生参考光A2以及照射样品B的入射光A1；
S3、使所述入射光A1通过显微镜组件3和所述反射膜12而照射到所述样品B背向所述第一表面11a的前表面和朝向所述第一表面11a的背表面上，以产生第一样品光B1和第二样品光B2；
S4、使所述第一样品光B1和所述第二样品光B2通过所述显微镜组件3后在所述光路组件2中与所述参考光A2进行合束；
S5、利用成像组件4采集合束后的所述参考光A2、所述第一样品光B1和所述第二样品光B2的干涉图像；
其中，所述入射光A1照射到所述样品B的前表面时，所述入射光A1在所述样品B的前表面上进行反射和/或穿过所述样品B的前表面而生成所述第一样品光B1；
所述入射光A1照射到所述第一表面11a，且在所述反射膜12上进行反射而照射到所述样品B的背表面时，所述入射光A1在所述样品B的背表面上进行反射和/或穿过所述样品B的背表面而形成所述第二样品光B2；
在所述样品B的前表面上进行反射而生成的所述第一样品光B1和/或穿过所述样品B的背表面而生成的所述第二样品光B2朝向所述光路组件2；穿过所述样品B的前表面而生成的所述第一样品光B1和/或在所述样品B的背表面上进行反射而生成的所述第二样品光B2在所述反射膜12上反射后朝向所述光路组件2。
需要说明的是，所述样品B为反射式样品、透射式样品和混合式样品中的一种。
在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种衍射层析显微成像系统，其特征在于，包括：
承载片，包括透明载片和反射膜，所述透明载片包括相对的第一表面和第二表面，所述第一表面用于承载样品，所述反射膜设置于所述第二表面上；
光路组件，用于产生参考光以及照射所述样品的入射光，并对所述参考光、第一样品光和第二样品光进行合束；
显微镜组件，用于使所述入射光通过而照射到所述样品背向所述第一表面的前表面和所述第一表面上，并且使第一样品光和所述第二样品光通过；
成像组件，用于采集合束后的所述参考光、所述第一样品光和所述第二样品光的干涉图像；
其中，所述入射光照射到所述样品的前表面时，所述入射光在所述样品的前表面上进行反射和/或穿过所述样品的前表面而生成所述第一样品光；
所述入射光照射到所述第一表面，且在所述反射膜上进行反射而照射到所述样品的背表面时，所述入射光在所述样品的背表面上进行反射和/或穿过所述样品的背表面而形成所述第二样品光；
在所述样品的前表面上进行反射而生成的所述第一样品光和/或穿过所述样品的背表面而生成的所述第二样品光直接朝向所述显微镜组件；穿过所述样品的前表面而生成的所述第一样品光和/或在所述样品的背表面上进行反射而生成的所述第二样品光在所述反射膜上反射后直接朝向所述显微镜组件。
2.根据权利要求1所述的衍射层析显微成像系统，其特征在于，所述光路组件包括：
光源，用于产生原始光；
分束器，用于对所述原始光进行分束以形成所述参考光和所述入射光；
合束器，用于对所述参考光、所述第一样品光和所述第二样品光进行合束。
3.根据权利要求2所述的衍射层析显微成像系统，其特征在于，所述光路组件还包括：
第一准直扩束器，用于对所述入射光进行准直扩束；
振镜，用于调整所述入射光的入射角度，以使所述入射光以不同的入射角经由所述合束器而入射到所述显微镜组件；
第二准直扩束器，用于对参考光进行准直扩束；
反射镜组件，用于将准直扩束后的所述参考光反射至所述合束器。
4.根据权利要求3所述的衍射层析显微成像系统，其特征在于，所述反射镜组件包括：第一反射镜和第二反射镜；
所述第一反射镜用于将准直扩束后的所述参考光反射至所述第二反射镜，所述第二反射镜用于将由所述第一反射镜反射至其上的所述参考光反射到所述合束器。
5.根据权利要求1所述的衍射层析显微成像系统，其特征在于，所述成像组件包括：偏振片和相机；
其中，合束后的所述参考光、所述第一样品光和所述第二样品光经过所述偏振片后到达所述相机。
6.根据权利要求1所述的衍射层析显微成像系统，其特征在于，所述显微镜组件包括透镜和物镜，所述入射光依序经过所述透镜和所述物镜后照射到所述样品背向所述第一表面的前表面和所述第一表面上；其中，所述第一样品光和所述第二样品光依序经过所述物镜和所述透镜后朝向所述光路组件。
7.一种衍射层析显微成像方法，其特征在于，所述方法采用了如权利要求1至6任一所述的衍射层析显微成像系统，所述方法包括：
将样品承载于所述承载片的透明载片的第一表面上，所述透明载片的与所述第一表面相对的第二表面上设置有反射膜；
利用光路组件产生参考光以及照射样品的入射光；
使所述入射光通过显微镜组件和所述反射膜而照射到所述样品背向所述第一表面的前表面和朝向所述第一表面的背表面上，以产生第一样品光和第二样品光；
使所述第一样品光和所述第二样品光通过所述显微镜组件后在所述光路组件中与所述参考光进行合束；
利用成像组件采集合束后的所述参考光、所述第一样品光和所述第二样品光的干涉图像；
其中，所述入射光照射到所述样品的前表面时，所述入射光在所述样品的前表面上进行反射和/或穿过所述样品的前表面而生成所述第一样品光；
所述入射光照射到所述第一表面，且在所述反射膜上进行反射而照射到所述样品的背表面时，所述入射光在所述样品的背表面上进行反射和/或穿过所述样品的背表面而形成所述第二样品光；
在所述样品的前表面上进行反射而生成的所述第一样品光和/或穿过所述样品的背表面而生成的所述第二样品光朝向所述光路组件；穿过所述样品的前表面而生成的所述第一样品光和/或在所述样品的背表面上进行反射而生成的所述第二样品光在所述反射膜上反射后朝向所述光路组件。
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