CN113754702A - 多金属氧酸盐掺杂氧化石墨烯复合材料及其在抗菌方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多金属氧酸盐，其化学式为：[Cu(L)4][Cu(L)3(H2O)][Cu(L)(H2O)][P2Mo5O23]，L=吡唑；属于单斜晶系，P2(1)/n空间群。本发明将具有良好抑菌效力的多金属氧酸盐与改性的氧化石墨烯纳米片(GO)结合形成以GO为载体的多酸基掺杂氧化石墨烯复合材料，随后对其进行了抗菌应用方面的研究。该复合材料不仅可以在生理pH条件下保护多酸分子不被分解，同时还可以提高其循环利用效率和生物效能；同时又对其实际应用潜力进行了探索，这为未来进一步的应用提供了有价值的参考。

Description

多金属氧酸盐掺杂氧化石墨烯复合材料及其在抗菌方面的 应用
技术领域
本发明属于功能化多酸技术领域，具体涉及一种将具有良好抑菌效力的多酸化合物与改性的氧化石墨烯纳米片(GO)结合形成以GO为载体的多酸基复合材料，随后进行了抗菌应用方面的研究。该类体系不仅可以在生理pH条件下保护多酸分子不被分解，同时还可以提高其循环利用效率和生物效能。同时又对其实际应用潜力进行了探索，这为未来进一步的应用提供了有价值的参考。
背景技术
近年来，非抗生素的抗菌物质越来越受到人们的关注。其中，纳米材料由于其独特的物理化学特性和优良的抗菌性能，是克服细菌耐药性和拓展其潜在应用中最有发展前景的材料。氧化石墨烯(GO)，一种由天然石墨化学剥离制成的新型2D纳米材料，它不仅拥有高的表面积–体积比和平面性，而且含有丰富的含氧基团如羟基、环羟基和羧基。这些含氧官能团能赋予GO纳米片高的亲水性并为与氨基的反应提供了可能性，并且因为氧化石墨烯具有较高的细菌毒性、较低的哺乳动物细胞毒性和其他良好的化学稳定性、较强的力学性能，在纳米复合材料、药物传递系统、组织工程等领域引起了广泛的研究兴趣，可以视为一种极有发展前景的新一代抗菌材料。最近，在GO上接枝聚合物制备功能化石墨烯的改性策略引起了广泛的关注。与纯净的GO相比，GO与聚合物连接表现出更高的稳定性。同时聚合物的功能化也大大提高了其的分散质量，这是因为新的空间位阻阻止了GO的团聚，并且不会破坏它的原始属性。基于相关的文献调研得知在用于改性GO的聚合物分子中，壳聚糖(CS)是在软体动物和甲壳类动物中发现的令人惊叹的原始生物材料之一。它能以非共价的结合方式改性氧化石墨烯，具有对环境友好的优势，是另一种最丰富的天然生物聚合物，常被用作复合材料制备中的粘合剂；同时具有无毒、不致敏性、生物降解性、生物相容性、低廉性、亲水性和抗菌活性等优点，此外还可作为稳定和传递治疗方案中用到的抗炎和水不溶药物的潜在平台。
多金属氧酸盐(简称多酸, POMs)，一种主要是阴离子和纳米尺寸的过渡金属-氧团簇。因具有多样性的结构，广泛且可调谐的物理和化学特征让它们的生物用途变得非常令人感兴趣，这是一个不断出现但很少被探索的领域。由于其的生物和生化效应，包括抗肿瘤、抗病毒和抗菌性能，POMs和POM基体系被认为是未来很有前途的金属药物。特别是，POMs在治疗癌症、阿尔茨海默病、糖尿病以及与病毒和细菌相关的感染方面具有突出的生物学应用潜力。因此为了提高抗菌性能，了解多金属氧酸盐−改性的氧化石墨烯的抗菌机理，本申请采用超声辅助的自组装策略合成多功能纳米复合材料并进一步探究了其抗菌性能。
发明内容
为克服现有技术缺陷，本发明目的在于提供一种多金属氧酸盐掺杂氧化石墨烯复合材料的合成，将具有良好抑菌效力的多酸化合物与改性的氧化石墨烯纳米片(GO)结合形成以GO为载体的多酸基复合材料，随后进行了抗菌应用方面的研究。该类体系不仅可以在生理pH条件下保护多酸分子不被分解，同时还可以提高其循环利用效率和生物效能；此外又对其实际应用潜力进行了探索，这为未来进一步的应用提供了有价值的参考。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种多金属氧酸盐（即多酸化合物1），其化学式为： [Cu(L)4][Cu(L)3(H2O)][Cu(L)(H2O)][P2Mo5O23]，L=吡唑；该多金属氧酸盐属于单斜晶系，P2(1)/n空间群，晶胞参数为：a = 14.7582(12) Å，b = 21.6637(17) Å，c = 16.5156(13) Å，α = 90°，β = 110.2860(10)°，γ= 90°。
上述多金属氧酸盐的制备方法，其将含Cu(ClO4)2·6H2O和吡唑的水溶液与Na2MoO4·2H2O水溶液混合，在连续搅拌条件下调节pH值保持在3.0-4.0，再搅拌反应30-40min，过滤，滤液放置在室温下，7-10天后析出深蓝色透明条状晶体，即得多酸化合物1。
进一步的，Cu(ClO4)2·6H2O、吡唑与Na2MoO4·2H2O的摩尔比为1:2-3:4。
进一步的，通过滴加浓H3PO4调节pH值保持在3.0-4.0。
一种含上述多金属氧酸盐掺杂氧化石墨烯复合材料，其经下述步骤制备获得：
1）制备多金属氧酸盐：
2）制备GO纳米片粉末：
3）制备壳聚糖修饰的氧化石墨烯GO@CS：将80-100 mg 壳聚糖溶于1%乙酸溶液获得CS溶液；将80-100 mg GO粉末均匀分散于50 mL水中，形成GO分散液；随后在搅拌下将GO分散液加入到CS溶液中并室温搅拌8-10 h，经离心、洗涤、真空干燥得到壳聚糖修饰的氧化石墨烯GO@CS；
4）制备多酸负载的复合材料：在分散良好的GO@CS的乙醇溶液中，加入80-100 mg多酸化合物，随后在温度20-25 °C下连续超声处理2-3 h，然后继续搅拌1-2 h；经离心、洗涤、真空干燥即得。
具体的，所述GO纳米片粉末经下述步骤制备获得：
a）将石墨粉预氧化：把2.5 g P2O5、2.5 g K2S2O8和3.0 g石墨粉加入到浓H2SO4中，并在75-85°C油浴下加热搅拌4-5h，加热结束，冷却至室温，随后加入水并继续搅拌30-40min，过滤、干燥，获得预氧化物；
b）将预氧化物在冰水浴下加入到120-130 mL浓H2SO4中，然后加入14-15 g的KMnO4并继续搅拌2-3 h，随后在保持温度不超过35 oC条件下加入水，再将所得悬浮液倒入大量水中，并加入30% H2O2直至颜色由深褐色变为黄色，静置，弃去上清液，然后加入400-500 mL1% 的盐酸，继续搅拌2 h，静置，弃去上清液，沉淀经洗涤、真空干燥即得。
本发明还提供了上述多金属氧酸盐掺杂氧化石墨烯复合材料在抗菌方面的应用。
本发明所述复合材料制备过程中，第一个步骤包括将GO的超声分散液在搅拌作用下滴加到壳聚糖的水溶液中，溶液中带高负电荷的GO纳米片能够与带正电荷的壳聚糖进行静电结合，促使改性的GO即GO@CS的形成。第二个步骤是在超声的协助下，将杂化的多酸化合物加入到上述得到的GO@CS溶液中，通过超声自组装，氢键及静电作用合成了三元的多酸基复合材料，其中杂化的多酸化合物被认为均匀地分布到GO的表面上。由于改性的氧化石墨烯具有锋利的边缘，与细菌悬浮液的直接接触能对其细胞膜造成物理损伤，从而使细菌细胞膜的完整性被破坏，造成细胞质内组分的渗漏。其次，本发明所制备的复合材料由于大量生物聚合物壳聚糖的存在而带正表面，可与带负电荷的细胞壁/膜相互作用，促使细胞在初始阶段的粘附。
本发明所述的复合材料，负电荷的多酸片段能够静电结合以及与改性的氧化石墨烯纳米片中的官能团之间形成氢键的作用力被负载在GO的表面上，形成以GO为纳米载体的多酸基复合材料。复合材料具有纳米材料的自身特性，能够与细菌细胞直接接触，由于氧化石墨烯纳米片具有锋利的边缘对其的细胞膜造成一定程度的物理损伤。其次在表面正电荷的作用下能与带负电荷的细菌细胞壁/膜作用，对细菌进行捕获，促使其粘附，实现此多酸基复合材料的合成、抗菌效力和实际应用潜能。
在本申请中，我们报道了一例改性的氧化石墨烯用于负载和控制生物活性POM分子的复合材料自组装，以提高生理稳定性，降低毒性效应，从而提高POM组分的生物利用度。考虑到POM的优良生物学效应以及氧化石墨烯的载体特性，我们合理地假设所得的复合材料具有双重优势，即能够保持高效的治疗性能有望产生协同作用，同时相比于纯POM又能提高其生理稳定性。具体来说，将POM分子负载到改性的GO表面上中形成以GO为载体的多酸基复合材料，然后再将所得的复合材料进行抗菌应用的探究。
本发明通过将酸化的壳聚糖溶液与GO的分散液进行混合搅拌，产生了壳聚糖改性的GO；随后采用超声自组装策略，将杂化的多酸化合物负载到改性的GO表面上制备获得了多酸基的复合材料。分别对革兰氏阴性大肠杆菌、革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和两种耐抗生素的大肠的抑菌效力进行了评价，同时对作用机制进行了探究。此外，还对其实际应用潜力进行了评估。和现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1）本发明首次开发了一种引入CS作为稳定剂和粘合剂，并在GO纳米片的表面负载上杂化的Strandberg型多酸化合物来构筑一类新颖和绿色的多酸基复合材料作为杀菌剂和吸附材料的合成策略；
2）本发明选择的GO载体具有较大的比表面积，易表面改性等特性，这为多酸组分的充分扩散、负载提供了足够的空间和可行性；
3）本发明制备的复合材料具有较高杀菌效率和良好的生物相容性，能够在一定时间内保持高效的治疗效果；
4）本发明制备的多酸基复合材料对耐药性的细菌也具有一定的抗菌效力。此外，还对该材料的可能作用机制进行了系统的阐明。我们坚信所得到的杂化多酸基复合材料在生物医学领域有着很大的应用前景。
附图说明
图1为本发明所述复合材料合成路线的简要描述；
图2中，(a)、(b)、(c)分别为GO、GO@CS、GO@CS/1的SEM图像；(d)、(e)、(f)分别为GO、GO@CS、GO@CS/1的TEM图像；g分别代表复合材料的组成元素的mapping图；
图3中，(a) 为多酸化合物1的晶胞结构，(b) 为三维晶体结构堆积图；
图4分别为自制的GO、GO@CS、GO@CS/1的(a)红外谱图，(b) PXRD谱图，(c)紫外-可见吸收光谱图；
图5为(a) XPS 的总谱图，(b) N1s, (c) Mo3d和(d) Cu2p的高分辨XPS谱图；
图6为用GO、GO@CS和GO@CS/1处理大肠杆菌(左)和金黄色葡萄球菌(右)后的抗菌效果；
图7为耐硫酸卡娜霉素(a)和耐氨苄青霉素(b)的大肠杆菌在琼脂平板上的抗菌效果示意图
图8为GO@CS/1复合材料对耐药性菌的抗菌（左为抗硫酸卡那霉素，右为抗氨苄青霉素）活性与时间相关的光学图像；
图9大肠杆菌的SEM图像(a)对照组和(b)用GO@CS/1处理组的细菌形貌；
图10为不同样品在不同浓度下对HUVECs的细胞毒性评估；
图11为不同水样中的微生物抑制试验。
具体实施方法
以下通过具体实施方法对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于此。
下述实施例中，所用壳聚糖购买自北京百灵威科技有限公司。
实施例1：
一种多金属氧酸盐，其化学式为： [Cu(L)4][Cu(L)3(H2O)][Cu(L)(H2O)][P2Mo5O23]，L = 吡唑；该多金属氧酸盐属于单斜晶系，P2(1)/n空间群，晶胞参数为：a =14.7582(12) Å，b = 21.6637(17) Å，c = 16.5156(13) Å，α = 90°，β = 110.2860(10)°，γ= 90°。
上述多金属氧酸盐掺杂氧化石墨烯复合材料的具体制备方法(合成路线见图1)如下：
1）制备多金属氧酸盐，即多酸化合物1：
含Cu(ClO4)2·6H2O (0.056 g，0.15 mmol) 和吡唑(0.02 g，0.3 mmol)的水溶液30 mL，在60℃下搅拌30 min。冷却至室温后，加入到10 mL Na2MoO4·2H2O (0.145 g，0.6mmol)水溶液中，在连续搅拌条件下滴加浓H3PO4，使pH值保持在3.0。再搅拌反应30 min，然后过滤。滤液放置在室温下缓慢蒸发，7天后，得到适合X-射线研究的深蓝色透明条状晶体，即为多酸化合物1；
2）制备GO纳米片粉末：
首先将石墨粉预氧化，即把2.5 g P2O5、2.5 g K2S2O8和3.0 g石墨粉加入到浓H2SO4 (12 mL)中，并在80 °C油浴下加热搅拌5 h。加热结束，将混合物冷却至室温。随后加入大量的H2O (500 mL)并继续搅拌40 min，过滤、干燥，获得预氧化物。其次将预氧化物在冰水浴下加入到浓H2SO4 (120 mL)中，之后加入14 g的KMnO4并继续搅拌2 h。随后在保持温度不超过35 oC下缓慢加入250 mL的H2O。再将所得悬浮液倒入大量H2O中(700 mL)，并加入30% H2O2直至颜色由深褐色变为黄色。静置一晚（12h），倒掉上清液，得到沉淀。然后把1%的盐酸(500 mL)加入到沉淀中，继续搅拌2 h并静置一夜（12h），弃去上清液。最后把制得的产物用水洗涤三次，在60 °C下真空干燥5-6 h，即得GO粉末；
3）制备壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米片(GO@CS)：
利用壳聚糖作为稳定和粘合剂对GO进行功能化。简单地说，100 mg CS于100 mL1%乙酸溶液中搅拌溶解30 min，获得CS溶液。此后将100 mg GO粉末加入50 mL水中，超声处理30 min，形成GO分散液。随后在搅拌下将GO分散液加入到CS溶液中并室温搅拌8 h，离心分离GO@CS的反应溶液，分别用水、乙醇进行洗涤，并在60°C的真空干燥箱中干燥5-6 h，得到壳聚糖改性的氧化石墨烯纳米片(GO@CS)以供下一步使用；
4）制备多酸负载的复合材料：
采用超声协助的自组装方法合成了多酸负载的复合材料。首先在分散良好的GO@CS的乙醇溶液中，加入多酸化合物 (100 mg)，随后在温度20-25 °C下连续超声处理3 h，之后继续搅拌1 h。所得产物经离心纯化，并用乙醇反复冲洗，最后在60 °C的真空烘箱下干燥，得到的干燥产物即为多酸负载的复合材料（GO@CS/1），并用于后续实验。
图2中，(a)、(b)、(c)分别为GO、GO@CS、GO@CS/1的SEM图像；(d)、(e)、(f)分别为GO、GO@CS、GO@CS/1的TEM图像；g分别代表复合材料的组成元素的mapping图。由图2可以看出，裸露的GO由团聚堆积的纳米片组成，边缘有小皱纹。同时用CS改性的GO纳米片中没有看出GO纳米片和CS聚合物之间的空隙或不连续性，表明这两个物质之间具有良好的相容性。从GO@CS/1的电镜图中看出GO@CS/1是一个单分散的薄层，具有不规则的上下皱褶并且其表面上负载着一些球状或长条状颗粒。图2g展示出了相应元素的mapping图，表明了该复合材料中各元素组分的分布情况，以上的结果证实了GO@CS/1的成功制备。
X-射线单晶衍射的分析结果表明，多酸化合物1的晶体结构类型属单斜晶系。图3中，(a) 为多酸化合物1的晶胞结构，(b) 为三维晶体结构堆积图。多酸化合物1 (图3a) 结构单元中存在三个独立的铜离子(Cu(1)、Cu(2)和Cu(3))，这三个铜离子处在不同的配位环境中。Cu(1) 与三个配体的吡唑氮原子，一个[P2Mo5O23]6-的P末端氧原子，以及一个配位水分子的氧原子相连。Cu(2) 则与四个配体的吡唑氮原子和[P2Mo5O23]6-的一个Mo末端氧原子相连。Cu(3) 由一个[P2Mo5O23]6-聚阴离子的两个Mo氧原子和配体吡唑环中的一个氮原子配位形成“t型”构型。图3b展现了沿a轴的三维堆积图，Cu(3) 原子与[P2Mo5O23]6-团簇在层平面两侧交替配位，形成无限延伸的一维链状结构。同时可以观察到相邻两个单元之间的相互作用，连接成一维的单链结构，并进一步拓展形成三维堆积图。这些结果与X-射线衍射结构分析的结果一致。
图4分别为GO、GO@CS、GO@CS/1和多酸化合物1的(a)红外谱图，(b)PXRD谱图，(c)紫外-可见吸收光谱图。图4a给出了上述所制材料的红外图谱。GO图谱中3397 cm-1处的强峰归属于O–H伸缩振动。在1054、1220、1395和1726 cm–1处观察到的C–O峰归属于环氧基团(C-O-C)伸缩振动、苯酚C-O伸缩、伯醇的C-OH伸缩以及碳基和羧基中典型的C=O伸缩振动。1623cm–1处的峰归属于sp2碳骨架网络的C=C伸缩振动或分子内氢键，这些结果证实了GO的成功制备。从GO@CS的图谱中可以看出CS接枝后，在∼2926和2863 cm–1处出现的峰，分别为CS聚合物的对称和不对称的伸缩振动模式，证明了一些CS大分子已成功接枝到GO表面。同时在GO@CS和GO@CS/1的红外图中，1630 cm-1处的峰归属于O=C–NH基团或CS分子中的交联以及-NH伸缩振动所致的羰基的伸缩振动，也说明了CS的成功键合。多酸化合物1的红外图谱中，在1072、902、768和673 cm–1处的峰值分别归属于P2Mo5的ν(P–O)，ν(Mo–Od)，ν(Mo–Ob–Mo)和ν(Mo–Oc–Mo)，在1632–1330 cm–1处的峰归属于吡唑配体的特征峰，这证实了化合物1的成功制备。从GO@CS/1的红外图中可以看出多酸化合物1负载到改性的GO表面上后，其特征吸收分别转变为1083、899、808和667 cm–1，这是由GO@CS与多酸化合物1之间的物理静电相互作用和氢键相互作用引起的。
图4b给出了上述所制材料的X-射线粉末衍射图谱。从GO的PXRD图谱中看到只有一个2θ = 11.47°的尖锐单峰对应于(001)衍射峰，表明了所制的GO中不含未反应的石墨，具有较好的相纯度。在CS修饰后，在GO@CS中得到了一个2θ = 20.04°新的宽峰，这可以用CS的非晶态特性来解释，这个变化表明了CS在GO表面上的成功接枝。GO@CS/1的PXRD图像也证实了多酸化合物1的存在，其中在大约2θ = 8.32°、11.01°、22.61°和24.56°处观察到的四个衍射峰归属于多酸化合物1的结晶衍射特征峰。GO@CS/1中没有观察到归属于GO (001)晶面的特征峰，这是由多酸化合物1的修饰防止了GO层的堆积所致的。
图4c给出了上述所制材料的紫外-可见吸收光谱图。对于GO的光谱图，在∼238nm(尖峰)和∼300nm (宽峰)处观察到的两个特征峰，分别对应于芳香C-C键的电子π-π*跃迁和C-O键的n-π*跃迁。与GO的光谱相比，在GO@CS的光谱图中可以清楚地观察到GO的峰值向更短波长的移动(蓝移，从238到234 nm)，这是由CS在GO上的接枝所致的。多酸化合物1在220nm处有一个特征吸收峰归属于Ot–Mo和Obridge–Mo 键的pπ→dπ电荷转移转移和配体吡唑的电子π-π*跃迁。在GO@CS/1的光谱图中，多酸化合物1的峰发生蓝移(从220到210 nm)，但不能观察到GO的特征峰。这些特征峰的变化意味着GO和多酸化合物1之间相互作用的建立，证明了GO@CS/1的成功制备。
图5为(a) XPS 的总谱图，(b) N1s, (c) Mo3d和(d) Cu2p的高分辨XPS谱图。图5a给出GO，GO@CS和GO@CS/1的X-射线光电子能谱图。从GO的XPS谱图中，清楚地看到了C和O元素的强信号。对于GO@CS，从其谱图中观察到的398.2 eV的新结合能归属于N1s，对应于CS氨基中的氮原子，表明CS的存在及其在GO上的成功修饰。从GO@CS/1的光谱图中清楚地看到，其样品中存在的主要元素是Cu、Mo、P、O、N和C。图5b给出了GO@CS和GO@CS/1中N元素的高分辨XPS谱图，表明了在各自的谱图中的N元素都以什么形式存在。图5c中给出了Mo3d相关的精细XPS谱，分别将232.2 eV和235.3 eV的结合能归属于Mo3d5/2和Mo3d3/2，表明Mo元素主要以MoVI的形式存在于GO@CS/1纳米复合材料中。结合Mo3d (图5c)和Cu2p (图5d)的精细XPS谱证实了GO@CS/1复合材料中多酸化合物1的存在。
实施例2：
抗菌实验步骤：以典型的革兰氏菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和两种耐抗生素的大肠杆菌(抗硫酸卡那霉素、氨苄青霉素)的细菌菌株作为模型微生物，对本发明复合材料GO@CS/1的抗菌活性进行了评价。采用计数的菌落形成单元(CFU)来计算杀菌率。分别用浓度和用量均为(100 μg, 1 mL)的GO、GO@CS和GO@CS/1处理等量的细菌悬浮液(细胞浓度∼105 CFU/mL)并在37 °C的恒温摇床中作用1 h。此后，100 μL的细菌悬浮液均匀地涂布到LB琼脂平板上，并在37 °C下孵育12 h，实验同时进行一式三份。培养后对可见菌落进行计数和记录，计算菌落的减少量。结果见图6。
从图6中可以看出，纯的GO和GO@CS对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出中等的抗菌活性(杀菌率分别为53.11%，64.28%, 74.75%和82.13%)，这是由于GO的锋利边缘从而破坏了细菌膜的磷脂双层，继而导致细菌的死亡。令人惊讶的是，在用GO@CS/1进行相同处理后，琼脂板上几乎没有形成大肠杆菌菌落和金黄色葡萄球菌菌落，其杀菌率能达到近100%，明显高于GO和GO@CS的抗菌效果，这结果表明在改性的氧化石墨烯表面上引入多酸化合物1可以明显增强其的抗菌性能。
抗生素耐药性的日益发展对公共卫生构成了巨大的威胁，因此进一步应用两种耐抗生素的大肠杆菌(抗硫酸卡那霉素、氨苄青霉素)来评估所制的GO@CS/1复合材料对耐药性菌的灭菌能力。结果见图7。从图7中可以看出，在相应的材料作用1 h后，GO@CS、多酸化合物1和GO@CS/1的灭菌率可达到49.08%、44.80%、88.58%(耐卡那霉素的大肠杆菌，图7中a)以及55.38%、58.52%和76.84%(耐氨苄青霉素的大肠杆菌，图7中b))。从这可以得知：与所构成复合材料的单体组分相比，其复合材料具有更强的杀菌能力。该实验结果表明：形成新型的复合材料能实现比单一组分更加优异的物理化学或生物性能，同时对解决耐药性的细菌菌株也具有较好的指导。
实施例3：
时间动态杀菌实验步骤：用100 μg/mL的GO@CS/1 (1 mL)分别与等量的耐药性的大肠杆菌(抗氨苄青霉素、硫酸卡那霉素，105 CFU/mL)直接混合并放置在37 °C的恒温摇床中培养。在0、1、3和6 h的不同培养时间后，从EP管中取出100 μL的细菌悬浮液均匀地涂布在对应的LB琼脂板上并在37 °C的恒温培养箱里培养24 h，根据存活的细菌菌落数计算杀菌率。所有测试一式三份。结果见图8。
从图8中可以看出，在与GO@CS/1作用1 h后，观察到活菌的数量急剧减少，而所选用的两种耐药性细菌在6 h内能分别达到99.93%和97.94%的杀菌率（左为抗硫酸卡那霉素，右为抗氨苄青霉素），表明GO@CS/1在一定的作用时间内能达到理想的抗菌效果。
实施例4：
扫描电镜观察样品-细菌相互作用：用扫描电镜对样品处理前后大肠杆菌细胞的形态变化进行了探究。首先用与光密度值为0.5的菌液相同用量的GO@CS/1复合材料(100 μg/mL)直接接触作用1 h，然后用pH值为7.2的磷酸缓冲溶液洗涤三次，接着进行离心获得已处理的细菌，并用2.5%戊二醛溶液(3 mL)固定2 h，之后依次用梯度浓度(0、30、50、70、90、100%)的乙醇溶液进行组织脱水。最后，将脱水的细菌细胞(20 μL)滴在硅片上，室温下自然风干并从SEM中获得形态变化的图片。结果见图9。
图9给出了复合材料处理前后的细菌形态变化。对照组中大肠杆菌(图9a)的形态正常，细胞膜光滑，结构完整。相反，在用GO@CS/1处理后，大肠杆菌的细胞(图9b)被“片状”GO@CS/1紧密包裹，其细胞膜受到严重损伤，出现空穴、坍塌结果。该结果表明：GO@CS/1纳米复合材料对细菌结构造成不可逆的损伤，导致膜完整性的丧失，这是GO@CS/1对抗病原体的主要机制之一。
实施例5：
体外细胞毒性评价方法：采用MTT(3-[4，4，5-二甲基硫氮醇-2-基]-2，5-二苯基四碘化)法评估了所制样品对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)活性的影响。细胞浓度为1×104的HUVECs (100 µL)接种在96孔板中，在37℃、5% CO2下培养24 h。然后将每个样品溶于DMSO中制成1 mg/mL的浓度，用含有10% (V:V)胎牛血清(FBS)和1%(V:V)青霉素(100U/mL)-链霉素(100 µg/mL)的达尔伯克(氏)必需基本培养基(DMME)溶液稀释至不同浓度(100、50、10和1 μg·mL-1)。在此之后，去除上清液，并与不同浓度的样品GO@CS/1 (100 μg mL–1、50 μgmL–1、10 μg·mL–1和 1 μg·mL–1)分别培养24 h。在细胞毒性分析中，加入20 µL的MTT (5mg·mL–1)继续培养4 h。此后，取出所有溶液，用DMME培养液洗干净每个井，最后，每个井中加入150 µL的二甲基亚砜(DMSO)，在570 nm处测定吸光度。通过下面的公式计算相对的细胞活力：细胞活性 (%) = (A 570 sample - A 570 blank) / (A 570 control - A 570 blank) ×100%。结果见图10。
从图10中可以看出，随着GO@CS/1浓度的增加，人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的细胞活力略有所下降，但依然保持80%以上的细胞活力。体外细胞毒性的实验数据表明，GO@CS/1纳米复合材料具有良好的体外细胞相容性，是医学应用的潜在候选材料。而且其在一定的浓度范围内具有较好的安全性。
实施例6
实际水样的抗菌处理步骤：水污染是我们日常生活和工业过程中排放废水增加引起的主要污染问题之一，不仅造成了宝贵资源的损失，而且对人类健康和环境造成了威胁。为了研究本发明复合材料GO@CS/1在水处理中的应用，讨论其抗菌性能的潜在能力。以所在学校内夏季的湖水、实验室内的污水和下雨天地面上取的雨水作为真实的测试水样，检测所制得的复合材料GO@CS/1对微生物的去除和杀灭能力。简单地说，将本发明的GO@CS/1复合材料加入到等用量的待测水样(1 mL)中，在37 °C下培养1 h，然后将处理后的水样(100微升)分散到固体LB板中，并用菌落计数法评估其的抗菌效果。结果见图11。
从图11中可以看出，没有经过GO@CS/1处理的雨水、湖水和污水能够在相应的平板表面产生大量细菌，而加入GO@CS/1则达到较好的灭菌率。该结果表明，GO@CS/1的加入能明显赋予雨水、湖水和污水优良的抗菌性能，表明GO@CS/1在水处理等相关领域具有潜在的抗菌应用前景。
综上，本发明围绕严重的细菌感染问题，开发高效、低毒性的抗菌材料。本发明公开了一类具有优良抑菌效力的多酸基复合材料。将有机小分子功能化的Strandberg型的多酸加入到生物聚合物壳聚糖修饰的氧化石墨烯溶液中，通过改性的氧化石墨烯和杂化多酸在超声的协助下进行自组装合成了新颖的多酸基复合材料，所得的复合材料不仅可以在生理pH条件下保护生物活性多酸分子不被分解，同时兼具复合材料的高抗菌性能及低细胞毒性。此外，还对所得材料的实际应用潜力进行探索，这为其未来进一步的应用提供有价值的参考。本发明多酸基复合材料的合成路线如下：壳聚糖改性的氧化石墨烯溶液 + 杂化的多酸 →多酸基复合材料，其中，杂化的多酸为Strandberg型多酸阴离子。即利用酸性条件下的壳聚糖溶液与分散良好的氧化石墨烯溶液在室温搅拌下形成壳聚糖改性的氧化石墨烯，该改性的氧化石墨烯材料与功能化的多酸在超声协助的条件下生成性能优良的多酸基复合材料。由于改性的氧化石墨烯的优越特性以及多酸的固有抗菌性能，多酸基复合材料被赋予更强的抗菌效果，其产生显著抑菌效力的原因如下：(1)改性的氧化石墨烯具有锋利的边缘，与细菌悬浮液的直接接触能对其的细胞膜造成物理损伤，从而使细菌细胞膜的完整性被破坏，造成细胞质内组分的渗漏；(2)所制备的复合材料由于生物聚合物壳聚糖的存在而带正表面，可与带负电荷的细胞壁/膜相互作用，促使细胞在初始阶段的粘附；(3)多酸的广谱生物活性(使细胞壁/膜破裂、胞内物质泄漏、酶活性降低、抗氧化机制的摧垮以及生物靶点干扰等)赋予复合材料更强的杀菌作用；(4)总之，细菌与样品表面电荷的协同作用、生物活性成分的存在以及氧化石墨烯的自身特性都是我们制备复合材料所具备的重要优势，这正是抗菌生物材料所必备的特性。

Claims (7)

1.多金属氧酸盐，其特征在于，化学式为： [Cu(L)4][Cu(L)3(H2O)][Cu(L)(H2O)][P2Mo5O23]，L=吡唑；该多金属氧酸盐属于单斜晶系，P2(1)/n空间群，晶胞参数为：a =14.7582(12) Å，b = 21.6637(17) Å，c = 16.5156(13) Å，α = 90°，β = 110.2860(10)°，γ= 90°。
2.权利要求1所述多金属氧酸盐的制备方法，其特征在于，将含Cu(ClO4)2·6H2O和吡唑的水溶液与Na2MoO4·2H2O水溶液混合，在连续搅拌条件下调节pH值保持在3.0-4.0，再搅拌反应30-40 min，过滤，滤液放置在室温下，7-10天后析出深蓝色透明条状晶体，即得。
3.如权利要求2所述多金属氧酸盐的制备方法，其特征在于，Cu(ClO4)2·6H2O、吡唑与Na2MoO4·2H2O的摩尔比为1:2-3:4。
4.如权利要求2所述多金属氧酸盐的制备方法，其特征在于，通过滴加浓H3PO4调节pH值保持在3.0-4.0。
5.一种权利要求1所述多金属氧酸盐掺杂氧化石墨烯复合材料，其特征在于，经下述步骤制备获得：
1）制备多金属氧酸盐：
2）制备GO纳米片粉末：
3）制备壳聚糖修饰的氧化石墨烯GO@CS：将80-100 mg 壳聚糖溶于1%乙酸溶液获得CS溶液；将80-100 mg GO粉末均匀分散于50 mL水中，形成GO分散液；随后在搅拌下将GO分散液加入到CS溶液中并室温搅拌8-10 h，经离心、洗涤、真空干燥得到壳聚糖修饰的氧化石墨烯GO@CS；
4）制备多酸负载的复合材料：在分散良好的GO@CS的乙醇溶液中，加入80-100 mg多酸化合物，随后在温度20-25 °C下连续超声处理2-3 h，然后继续搅拌1-2 h；经离心、洗涤、真空干燥即得。
6.如权利要求5所述的多金属氧酸盐掺杂氧化石墨烯复合材料，其特征在于，所述GO纳米片粉末经下述步骤制备获得：
a）将石墨粉预氧化：把2.5 g P2O5、2.5 g K2S2O8和3.0 g石墨粉加入到浓H2SO4中，并在75-85°C油浴下加热搅拌4-5h，加热结束，冷却至室温，随后加入水并继续搅拌30-40 min，过滤、干燥，获得预氧化物；
b）将预氧化物在冰水浴下加入到120-130 mL浓H2SO4中，然后加入14-15 g的KMnO4并继续搅拌2-3 h，随后在保持温度不超过35 oC条件下加入水，再将所得悬浮液倒入大量水中，并加入30% H2O2直至颜色由深褐色变为黄色，静置，弃去上清液，然后加入400-500 mL 1%的盐酸，继续搅拌2 h，静置，弃去上清液，沉淀经洗涤、真空干燥即得。
7.权利要求5所述多金属氧酸盐掺杂氧化石墨烯复合材料在抗菌方面的应用。
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