CN113740546A - 校准物、复合体、及对IgA凝集体进行测定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明以提供在IgA凝集体的测定中使用的校准物、及使用该校准物的IgA凝集体的测定方法作为目的。本发明由含具有生物素基的IgA及亲和素类的校准物解决所述的课题。
Description
【技术领域】
本发明涉及用于取得试样中的IgA凝集体的浓度的校准物。本发明涉及含具有生物素基的IgA和亲和素类的复合体。本发明涉及使用凝集素对试样中的IgA凝集体进行测定的方法。
【背景技术】
在专利文献1中记载了由使用与IgA凝集体特异性地反应的凝集素的酶联免疫吸附法(ELISA)法检测试样中的IgA凝集体的方法。另外,在专利文献1中记载了当对从IgA肾病患者及健康人的血清纯化的IgA的检测结果进行比较时,患者来源的纯化IgA对于凝集素特别强地反应。
【现有技术文献】
【专利文献】
【专利文献1】专利第6066220号公报
【发明的概要】
【发明要解决的课题】
在由ELISA法等的免疫测定法定量测定受试物质时,使用校准物。校准物一般是指含与受试物质相对应的标准物质的试剂。在免疫测定的领域中,标准物质多是从生物体试样单离的或是合成的受试物质本身。但是,不知晓用于IgA凝集体的测定的适合的校准物。从而,本发明旨在提供:在IgA凝集体的测定中使用的校准物、该校准物中所含的,含具有生物素基的IgA和亲和素类的复合体、及使用该校准物的IgA凝集体的测定方法。
【用于解决课题的手段】
本发明提供含具有生物素基的IgA及亲和素类的用于取得试样中的IgA凝集体的浓度的校准物。本发明提供用于取得试样中的IgA凝集体的浓度的含具有生物素基的IgA和亲和素类的复合体。本发明提供使用凝集素对试样中的IgA凝集体进行测定的方法,其为包括使用含具有生物素基的IgA及亲和素类的校准物取得试样中的IgA凝集体的浓度的方法。
【发明的效果】
根据本发明,提供在IgA凝集体的测定中使用的校准物、含具有生物素基的IgA和亲和素类的复合体、及使用该校准物的IgA凝集体的测定方法。
【附图的简单的说明】
【图1】是具有生物素基的IgA和亲和素类的复合体的模式图。
【图2】是具有生物素基的IgA、亲和素类和具有与凝集素结合的糖链及生物素基的多肽的复合体的模式图。
【图3】是处于一试剂的形态的校准物的模式图。
【图4】是处于含多个试剂的试剂组的形态的校准物的模式图。
【图5】是处于含多个试剂的试剂组的形态的校准物的模式图。
【具体实施方式】
本实施方式的方法是使用凝集素的IgA凝集体的测定方法。IgA凝集体是指在IgA肾病患者的血液中IgA凝集而发生的多聚体IgA。目前,难以从IgA肾病患者的血液等分离及纯化IgA凝集体。因此,无法在校准物中使用IgA凝集体本身。一方面,糖链无异常的IgA单体可容易地入手。但是,这样的IgA单体不与凝集素结合。因此,如上所述,不知晓用于IgA凝集体的测定的适合的校准物。
本实施方式的方法的特征在于,使用含具有生物素基的IgA及亲和素类的校准物取得试样中的IgA凝集体的浓度。“生物素基”是指生物素类的化学结构之中,含咪唑并赖氨酸环的杂环部分。在本说明书中“生物素类”的用语包含生物素及其类似物。作为生物素的类似物,可举出例如脱硫生物素、氧基生物素等。在本说明书中“亲和素类”的用语包含亲和素及其类似物。作为亲和素的类似物,可举出例如链霉亲和素、中性亲和素(商标)、Tamavidin(注册商标)等。亲和素类一般以由4个亚基构成的四聚体的形态存在。以下,如“1分子的链霉亲和素”一样言及1分子的亲和素类,1分子的亲和素类是指四聚体的亲和素类。1分子的亲和素类可与4个生物素基结合。
具有生物素基的IgA(以下,也称为“生物素化IgA”)可通过将IgA单体和生物素类由使用交联剂等的公知的方法结合而得到。也可使用市售的生物素标记试剂。1分子的生物素化IgA所具有的生物素基的数不特别限定,可为1个,也可为多个。IgA单体当是人来源时,也可为天然的IgA及重组型IgA之任一者。IgA的同种型也可为IgA1及IgA2之任一者。优选的同种型是IgA1。
在在本实施方式的方法中使用的校准物中,经生物素基和亲和素类的结合而形成了生物素化IgA和亲和素类的复合体。即,校准物是含生物素化IgA和亲和素类的复合体的试剂。在本实施方式中,此复合体相当于对于IgA凝集体的标准物质。复合体的一例示于图1。图中,“STA”表示链霉亲和素,“B”表示生物素基。在图1中,在1分子的链霉亲和素结合有4分子的生物素化IgA,但本发明不限定于此例。如图1所示,生物素化IgA和亲和素类的复合体是IgA的拟似的凝集体。由于此复合体可与在IgA凝集体的测定中使用的凝集素结合,通过使用含此复合体的校准物,可取得试样中的IgA凝集体的浓度。再者,在图1中,为方便起见、仅显示1个生物素化IgA所具有的生物素基,但如上所述,生物素化IgA也可具有多个生物素基。
生物素化IgA和亲和素类的复合体可通过将生物素化IgA和亲和素类混合而得到。混合的条件只要是蛋白质不变性的条件,就不特别限定。例如,也可将生物素化IgA的溶液和亲和素类的溶液混合,于4℃~40℃、优选于15℃~37℃搅拌或静置。
在本实施方式中,复合体优选由1分子的亲和素类和2、3或4分子的生物素化IgA构成。在生物素化IgA具有多个生物素基时,理论上、复合体可成为多个分子的亲和素类和多个分子的生物素化IgA连锁结合的巨大分子。但是,为实质上不发生那样的巨大分子,或即使发生也对本实施方式的方法无影响的程度的量。绝大部分的复合体是1分子的亲和素类和2、3或4分子的生物素化IgA的复合体、特别是1分子的亲和素类和4分子的生物素化IgA的复合体。这被认为是,因为由立体位阻等的原因,不发生生物素化IgA和亲和素类的连锁的结合。
在进一步的的实施方式中,校准物也可还含具有与凝集素结合的糖链及生物素基的多肽(以下,也称为“生物素化载体蛋白质”)。其中,“多肽”的用语是指多个氨基酸由肽键结合的物质,还包含蛋白质及其片段等。在此校准物中,经生物素基和亲和素类的结合而形成了生物素化IgA、亲和素类和生物素化载体蛋白质的复合体。即,此校准物是含生物素化IgA、亲和素类和生物素化载体蛋白质的复合体的试剂。
生物素化载体蛋白质可通过将具有与凝集素结合的糖链的多肽(以下,也称为“载体蛋白质”)和生物素类由使用交联剂等的公知的方法结合而得到。也可使用市售的生物素标记试剂。1分子的生物素化载体蛋白质所具有的生物素基的数不特别限定,可为1个,也可为多个。
载体蛋白质只要是具有在本实施方式的方法中使用的凝集素能结合的糖链,就不特别限定。当是已知的凝集素时,特异性地结合有该凝集素的糖链的序列或结构是公知的。作为载体蛋白质,可举出例如M2BP(Mac-2结合蛋白)、MUC1(Mucin 1,细胞表面相关糖蛋白)、α2M(α-2-巨球蛋白)等。这些载体蛋白质特别适宜于作为凝集素而使用WFA(多花紫藤凝集素)的本实施方式的方法。
在本实施方式中,生物素化IgA、亲和素类和生物素化载体蛋白质的复合体相当于对于IgA凝集体的标准物质。此复合体的一例示于图2。在图2中,在1分子的链霉亲和素结合有2分子的生物素化IgA及2分子的生物素化载体蛋白质,但本发明不限定于此例。如图2所示,生物素化IgA、亲和素类和生物素化载体蛋白质的复合体是具有结合有凝集素的糖链的IgA的拟似的凝集体。由于此复合体可由生物素化载体蛋白质所具有的糖链而与在IgA凝集体的测定中使用的凝集素结合,通过使用含此复合体的校准物,可取得试样中的IgA凝集体的浓度。再者,在图2中,为方便起见、仅显示1个生物素化IgA所具有的生物素基,仅显示1个生物素化载体蛋白质所具有的生物素基,但如上所述,可为生物素化IgA具有多个生物素基,也可为生物素化载体蛋白质具有多个生物素基。
在本实施方式中,复合体优选由1分子的亲和素类和1、2或3分子的生物素化IgA和1、2或3分子的生物素化载体蛋白质构成(但是,生物素化IgA及生物素化载体蛋白质的分子数的合计是2以上4以下)。在生物素化IgA及/或生物素化载体蛋白质具有多个生物素基时,理论上、复合体可成为多个分子的亲和素类、多个分子的生物素化IgA和多个分子的生物素化载体蛋白质连锁结合的巨大分子,如上所述,是实质上不发生那样的巨大分子,即使发生也不影响本实施方式的方法的程度的量。
生物素化IgA、亲和素类和生物素化载体蛋白质的复合体可通过将生物素化IgA、亲和素类和生物素化载体蛋白质混合而得到。混合的条件只要是蛋白质不变性的条件,就不特别限定。例如,也可将生物素化IgA的溶液、亲和素类的溶液和生物素化载体蛋白质的溶液混合,于4℃~40℃、优选于15℃~37℃搅拌或静置。混合的顺序优选将生物素化IgA的溶液、亲和素类的溶液和生物素化载体蛋白质的溶液实质上同时混合。或者,也可先将生物素化IgA的溶液和生物素化载体蛋白质的溶液混合,接下来,将得到的溶液和亲和素类的溶液混合。
校准物中所含的复合体可处于固体(例如粉末、结晶、冷冻干燥品等)的形态,也可处于液体(例如溶液、悬浮液、乳浊液等)的形态。溶剂只要是适宜于蛋白质(特别是抗体)的保存,就不特别限定,可举出例如生理盐水、缓冲液等。缓冲液优选在中性附近的pH(例如6以上8以下的pH)具有缓冲作用的缓冲液。这样的缓冲液可举出例如HEPES、MES、PIPES等的Good缓冲液、Tris缓冲生理盐水(TBS)、磷酸缓冲生理盐水(PBS)等。
校准物也可含公知的添加物。作为添加物,可举出例如,牛血清白蛋白(BSA)等蛋白质稳定化剂、叠氮化钠等的防腐剂、氯化钠等的无机盐类等。
校准物可处于一试剂的形态,也可处于含多个试剂的试剂组的形态。作为一种试剂的校准物,例如,含收容生物素化IgA和亲和素类的复合体的一个容器、或者,收容生物素化IgA、亲和素类和生物素化载体蛋白质的复合体的一个容器。
在校准物是试剂组时,以下,将试剂组中所含的各试剂也称为“校准物试剂”。作为试剂组的校准物包括各自含生物素化IgA和亲和素类的复合体的多个校准物试剂,或者,包括各自含生物素化IgA、亲和素类和生物素化载体蛋白质的复合体的多个校准物试剂。在此试剂组中,在多个校准物试剂中的复合体的浓度互相不同。试剂组,例如,含收容多个校准物试剂的各自的多个容器。在多个容器中,以互相不同的浓度含复合体。
试剂组中所含的校准物试剂的数不特别限定,可选自例如2、3、4、5及6。在各校准物试剂中的复合体的浓度只要是能制成校准曲线,就不特别限定。例如,多个校准物试剂之中,复合体的浓度最低的校准物试剂也可以1μg/mL以上200μg/mL以下的浓度含复合体,复合体的浓度最高的校准物试剂也可以最低的浓度的2倍以上1000倍以下的浓度含复合体。
在本实施方式的方法中,通过使用凝集素对试样中的IgA凝集体进行测定的同时,还测定上述的校准物中所含的复合体,取得试样中的IgA凝集体的浓度。接下来,对于使用凝集素测定试样中的IgA凝集体的方法进行说明。
在本实施方式中,试样只要是含IgA凝集体或有含的疑似,就不特别限定。优选的试样是生物体试样。作为生物体试样,可举出例如血液(全血)、血浆、血清、尿、淋巴液、组织液、脑脊髓液、唾液等细胞外液等。在这些之中,也优选血液、血浆、血清及尿。在试样中含细胞等的不溶性的混杂物时,也可由离心分离、过滤等的公知的手段从试样除去混杂物。试样也可根据需要被适合的水性介质稀释。这样的水性介质只要是不妨碍后述的测定,就不特别限定,可举出例如水、生理盐水、缓冲液等。对于缓冲液而如上述。
凝集素也称为凝集素(agglutinin),是与指定的糖链特异性地结合的蛋白质。在本实施方式中,凝集素只要是与IgA凝集体结合,就不特别限定。这样的凝集素本身是公知的,可举出例如WFA、HHL(Hippeastrum Hybrid凝集素)、GNA(Galanthus nivalis凝集素)、NPA(Narcissus pseudonarcissus凝集素)、SBA(Soybean凝集素)、VVA(Vicia villosa凝集素)、BPL(Bauhinia purpurea凝集素)、TJA(Trichosanthes japonica凝集素)-II、PHA-L(Phaseolus vulgaris白血球凝集素)、AOL(Aspergillus oryzae凝集素)等。在它们之中,也特别优选WFA。
天然存在的WFA以由4个亚基构成的四聚体存在。可由使用还原剂等的公知的方法从四聚体WFA得到单体或二聚体的WFA。在本说明书中,在不特别记载亚基的数的情况中,“WFA”的用语包含单体WFA、二聚体WFA、三聚体WFA及四聚体WFA。在本说明书中,在表示由指定的数的亚基构成的WFA时,如例如“单体WFA”、“二聚体WFA”、“三聚体WFA”“四聚体WFA”一样明示表述亚基的数。
在本实施方式中,WFA可为四聚体WFA,也可为从四聚体WFA得到的单体WFA或二聚体WFA。在它们之中,从与IgA凝集体的反应性的高度来看,也优选二聚体WFA。使用交联剂从四聚体WFA得到二聚体WFA的方法记载在例如美国专利申请公开第2016/0363586号说明书(此文献通过参照整合进本说明书)。
使用凝集素的IgA凝集体的测定方法本身是公知的,记载在例如专利第6066220号公报。作为这样的测定方法,优选例如基于ELISA法的原理的方法。具体而言,可举出代替ELISA法中的捕获抗体或检测抗体而使用与IgA凝集体结合的凝集素的方法。其中,捕获抗体是指与受试物质特异性地结合的抗体而用于通过自身固定于固相而在固相上捕获受试物质的抗体。检测抗体是指与受试物质特异性地结合,并且具有标记物质的抗体而提供能经该标记物质检测的信号的抗体。检测抗体优选不固定于固相。在测定中,也可使用记载在特开平1-254868号公报的免疫复合体转移法。
ELISA法的种类也可为夹心法、竞争结合法、直接法、间接法等之任一者。在优选的实施方式中,由使用凝集素和含标记物质并且与IgA凝集体特异性地结合的捕获体(以下,也称为“标记捕获体”)的夹心ELISA法测定IgA凝集体。此时,凝集素相当于夹心ELISA法中的捕获抗体,标记捕获体相当于夹心ELISA法中的检测抗体。
标记捕获体可通过使与IgA凝集体特异性地结合的捕获体直接或间接结合标记物质而得到。例如,也可使用交联剂、市售的标记试剂盒等,将与IgA凝集体特异性地结合的捕获体和标记物质结合。或者,也可使用针对与IgA凝集体特异性地结合的捕获体的标记第二抗体。标记第二抗体是指与和IgA凝集体特异性地结合的捕获体特异性地结合的抗体而结合有标记物质的抗体。
与IgA凝集体特异性地结合的捕获体只要是在IgA凝集体中能与和凝集素结合的部位不同的部位结合的物质,就不特别限定。作为这样的捕获体,可举出例如,与IgA特异性地结合的抗体(抗IgA抗体)或适体、被IgA凝集体中的IgA识别的抗原等。
标记物质可为信号发生物质,也可为催化其他物质的反应而发生能检测的信号的物质。作为信号发生物质,可举出例如荧光物质、放射性同位素等。作为催化其他物质的反应而发生能检测的信号的物质,可举出例如酶。作为酶,可举出碱性磷酸酶(ALP)、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、酪氨酸酶、酸性磷酸酶、荧光素酶等。作为荧光物质,可举出异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明、Alexa Fluor(注册商标)、花青苷系染料等的荧光染料、GFP等的荧光蛋白质等。作为放射性同位素,可举出125I、14C、32P等。在它们之中,也优选酶,特别优选ALP。
接下来作为一例说明由夹心ELISA法测定试样及校准物的情况。在此例中,对试样中的IgA凝集体进行测定之后,对校准物中的复合体进行测定,但本发明不限定于此例。对校准物中的复合体进行测定之后,也可对试样中的IgA凝集体进行测定。或者,也可对试样中的IgA凝集体及校准物中的复合体实质上同时进行测定。
首先,使用试样、凝集素和标记捕获体取得IgA凝集体的测定值。具体而言,如以下。在固相上形成含试样中的IgA凝集体、凝集素和标记捕获体的免疫复合体。该免疫复合体可通过将试样、凝集素和标记捕获体混合而形成。进而,通过使上述的免疫复合体和可固定凝集素的固相接触,可在固相上形成上述的免疫复合体。在本实施方式中,优选使用预先固定了凝集素的固相。即,通过将固定凝集素的固相、试样和标记捕获体混合,可在固相上形成上述的免疫复合体。
凝集素向固相的固定的实施方式不特别限定。例如,可使凝集素和固相直接键合,也可使凝集素和固相经别的物质间接结合。作为直接的结合,可举出例如物理的吸附等。作为间接的结合,可举出例如,经生物素类和亲和素类的组合的结合。此时,通过将凝集素预先用生物素类修饰,使固相预先结合亲和素类,可经生物素类和亲和素类的结合而将凝集素和固相间接结合。
固相的原料不特别限定,可选自例如有机高分子化合物、无机化合物、生物体高分子等。作为有机高分子化合物,可举出例如乳胶、聚苯乙烯、聚丙烯等。作为无机化合物,可举出例如磁性体(氧化铁、氧化铬及铁素体等)、氧化硅、氧化铝、玻璃等。作为生物体高分子,可举出例如不溶性琼脂糖、不溶性葡聚糖、明胶、纤维素等。也可将这些中的2种以上组合使用。固相的形状不特别限定,可举出例如粒子、微平板、微管、膜、试管等。在它们之中,也优选微平板及粒子(特别是磁性粒子)。
进而,通过将在固相上形成的免疫复合体用现有技术中公知的方法检测,可取得IgA凝集体的测定值。例如,在作为标记捕获体而使用结合有标记物质的抗IgA抗体时,通过检测由该标记物质发生的信号,可取得试样中的IgA凝集体的测定值。在使用标记第二抗体时,也可同样地取得试样中的IgA凝集体的测定值。
在本说明书中,“检测信号”含定性检测信号的有无,对信号强度进行定量,及半定量检测信号的强度。半定量的检测是指将信号的强度如“不发生信号”、“弱”、“中”、“强”等一样阶段性地表示。在本实施方式中,优选定量检测信号的强度。
酶的底物可对应于该酶的种类从公知的底物适宜选择。例如,在作为酶而使用碱性磷酸酶时,作为底物,可举出CDP-Star(注册商标)(4-氯-3-(甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)、CSPD(注册商标)(3-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)等的化学发光底物、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)、5-溴-6-氯-吲哚基磷酸2钠、p-硝基苯基磷酸等的显色底物。另外,在作为酶而使用过氧化物酶时,作为底物,可举出LUMINOR及其衍生物等的化学发光底物、2,2'-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸铵)(ABTS)、1,2-亚苯基二胺(OPD)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)等的显色底物。
在标记物质是放射性同位素时可使用闪烁计数器等的公知的装置测定作为信号的放射线。在标记物质是荧光物质时可使用荧光酶标仪等的公知的装置测定作为信号的荧光。激发波长及荧光波长可对应于使用的荧光物质的种类适宜确定。
信号的检测结果可作为IgA凝集体的测定值使用。例如,在定量检测信号强度时,可以信号强度的测定值本身或从该测定值取得的值作为IgA凝集体的测定值使用。作为从信号强度的测定值取得的值,可举出例如,从该测定值减去阴性对照试样的测定值或背景的值的值等。阴性对照试样可适宜选择,可举出例如,从健康者得到的试样等。
接下来,使用校准物、凝集素和标记捕获体取得该校准物中的复合体的测定值。“校准物中的复合体”是指生物素化IgA和亲和素类的复合体、或者,生物素化IgA、亲和素类和生物素化载体蛋白质的复合体。具体而言,如以下。在固相上形成含校准物中的复合体、凝集素和标记捕获体的免疫复合体。该免疫复合体可通过将校准物、凝集素和标记捕获体混合而形成。进而,通过使上述的免疫复合体和可固定凝集素的固相接触,可在固相上形成上述的免疫复合体。在本实施方式中,优选使用预先固定了凝集素的固相。即,通过将固定凝集素的固相、校准物和标记捕获体混合,可在固相上形成上述的免疫复合体。固相的详细如上述。
进而,通过将在固相上形成的免疫复合体用现有技术中公知的方法检测,可取得校准物中的复合体的测定值。例如,在作为标记捕获体而使用结合有标记物质的抗IgA抗体时,通过检测由该标记物质发生的信号,可取得校准物中的复合体的测定值。在使用标记第二抗体时,也可同样地取得校准物中的复合体的测定值。信号的检测的详细如上述。
在本实施方式中,优选对复合体的浓度互相不同的多个校准物进行测定。通过从多个校准物得到测定值,可制成后述的校准曲线。
在本实施方式中,优选由使用固定于固相的凝集素和被标记物质标记的抗IgA抗体的夹心ELISA法测定试样中的IgA凝集体及校准物。在固相是磁性粒子时,测定也可使用HISCL系列(Sysmex株式会社)等的市售的装置进行。
在本实施方式中,也可在免疫复合体的形成及检测之间,进行除去未形成免疫复合体的未反应的游离成分的B/F(Bound/Free)分离。未反应的游离成分是指不构成免疫复合体的成分。例如,可举出不与IgA凝集体结合的凝集素及标记捕获体等。B/F分离的手段不特别限定,当固相是粒子时,可通过由离心分离仅回收捕获免疫复合体的固相来进行B/F分离。当固相是微平板或微管等的容器时,可通过除去含未反应的游离成分的液进行B/F分离。另外,在固相是磁性粒子时,可通过在用磁铁磁约束磁性粒子的状态下由管嘴吸除含未反应的游离成分的液来进行B/F分离,在自动化的观点优选。除去未反应的游离成分之后,也可将捕获免疫复合体的固相用PBS等的适合的水性介质清洗。
在本实施方式中,从试样中的IgA凝集体的测定值和校准物中的复合体的测定值取得试样中的IgA凝集体的浓度。试样中的IgA凝集体的浓度不仅是一般使用的浓度的概念(例如质量比、体积比、摩尔分数、每单位体积的质量、每单位体积的摩尔数等),还包含成为浓度的指标的值。作为成为浓度的指标的值,可举出例如,半定量示试样中的IgA凝集体的浓度的数字(等级)等。
由于校准物中的复合体的浓度已知的,可基于该复合体的测定值而从IgA凝集体的测定值算出试样中的IgA凝集体的浓度。在优选的实施方式中,从复合体的测定值制成校准曲线,基于校准曲线及IgA凝集体的测定值而取得试样中的IgA凝集体的浓度。校准曲线,例如,可通过在X轴取校准物中的复合体的浓度,Y轴取测定值(例如信号强度)的XY平面,对从多个校准物取得的复合体的测定值进行标绘,由最小二乘法等的公知的方法得到直线或曲线来制成。通过将IgA凝集体的测定值适用于校准曲线,可取得试样中的IgA凝集体的浓度。
现在、IgA肾病仅由肾活体检查诊断。一方面,如上所述,知晓IgA肾病患者的血液及尿中IgA凝集体增加。从而,也可在受试者是IgA肾病与否的判定中利用由本实施方式的方法取得的IgA凝集体的浓度。例如,本发明提供辅助IgA肾病的判定的方法。此方法包括使用凝集素测定从受试者得到的试样中的IgA凝集体的工序,及使用含具有生物素基的IgA及亲和素类的校准物取得上述试样中的IgA凝集体的浓度的工序,上述IgA凝集体的浓度在指定的阈值以上提示上述受试者是IgA肾病的风险高。
在进一步的的实施方式中,辅助IgA肾病的判定的方法也可为包括:使用从受试者得到的试样、凝集素和含标记物质并且与IgA凝集体特异性地结合的捕获体取得上述试样中的IgA凝集体的测定值的工序,使用校准物、上述凝集素和上述捕获体取得上述校准物中的复合体的测定值的工序,从上述IgA凝集体的测定值及上述复合体的测定值取得上述试样中的IgA凝集体的浓度的工序,上述IgA凝集体的浓度在指定的阈值以上提示上述受试者是IgA肾病的风险高的方法。
指定的阈值不特别限定,可适宜设定。例如,从健康者组及IgA肾病患者组的各自采集生物体试样,由本实施方式的方法取得该试样中的IgA凝集体的浓度。对于取得的IgA凝集体的浓度的数据而求出能最高精度地区别健康者组和患者组的值,将该值设定为阈值。在阈值的设定中,也可考虑灵敏度、特异性、阳性的中率、阴性的中率等。
本发明的进一步的的实施方式是含生物素化IgA及亲和素类的用于取得试样中的IgA凝集体的浓度的校准物。本实施方式的校准物也可还含生物素化载体蛋白质。本实施方式的校准物适宜地在上述的本实施方式的方法中使用。校准物的详细与对于本实施方式的方法而所述的同样。
在一实施方式中,校准物是含生物素化IgA和亲和素类的复合体的试剂。在进一步的的实施方式中,校准物是含生物素化IgA、亲和素类和生物素化载体蛋白质的复合体的试剂。这些复合体的详细与对于本实施方式的方法而所述的同样。试剂也可处于收容上述的复合体的容器的形态。也可将此容器捆包到箱中而提供于使用者。也可在箱中同装附带文书。在附带文书中,也可对于本实施方式的校准物的组成、使用方法、保存方法等而记载。
校准物的一例示于图3。在图3中,10表示本实施方式的校准物,11表示收容生物素化IgA和亲和素类的复合体、或者生物素化IgA、亲和素类和生物素化载体蛋白质的复合体的第1容器,12表示捆包箱,13表示附带文书。图3显示处于一试剂的形态的校准物,本发明不限于此。校准物也可处于含多个校准物试剂的试剂组的形态。作为试剂组的校准物的详细与对于本实施方式的方法而所述的同样。
在进一步的的实施方式中,校准物是包括含生物素化IgA的试剂和含亲和素类的试剂的试剂组。通过将含生物素化IgA的试剂和含亲和素类的试剂混合,可得到生物素化IgA和亲和素类的复合体。混合的条件的详细与对于本实施方式的方法而所述的同样。此校准物的一例示于图4。在图4中,20表示本实施方式的校准物,21表示收容生物素化IgA的第1容器,22表示收容亲和素类的第2容器,23表示捆包箱,24表示附带文书。
在进一步的的实施方式中,校准物是包括含生物素化IgA的试剂、含亲和素类的试剂和含生物素化载体蛋白质的试剂的试剂组。通过将含生物素化IgA的试剂、含亲和素类的试剂和含生物素化载体蛋白质的试剂混合,可得到生物素化IgA、亲和素类和生物素化载体蛋白质的复合体。混合的条件的详细与对于本实施方式的方法而所述的同样。此校准物的一例示于图5。在图5中,30表示本实施方式的校准物,31表示收容生物素化IgA的第1容器,32表示收容亲和素类的第2容器,33表示收容生物素化载体蛋白质的第3容器,34表示捆包箱,35表示附带文书。
本发明的进一步的的实施方式是用于取得试样中的IgA凝集体的浓度的含生物素化IgA和亲和素类的复合体。本实施方式的复合体可为生物素化IgA和亲和素类的复合体,也可为生物素化IgA、亲和素类和生物素化载体蛋白质的复合体。本实施方式的复合体适宜地在上述的本实施方式的方法中使用。本实施方式的复合体的详细与对于本实施方式的方法而所述的同样。
本发明的进一步的的实施方式是具有生物素基的IgA及亲和素类用于制造用于取得试样中的IgA凝集体的浓度的校准物的用途。在本实施方式中,通过将具有生物素基的IgA和亲和素类混合,可得到含具有生物素基的IgA和亲和素类的复合体的校准物。
本发明的进一步的的实施方式是具有生物素基的IgA、亲和素类、及与凝集素结合的糖链及具有生物素基的多肽用于制造用于取得试样中的IgA凝集体的浓度的校准物的用途。在本实施方式中,通过将生物素化IgA、亲和素类和生物素化载体蛋白质混合,可得到含生物素化IgA、亲和素类和生物素化载体蛋白质的复合体的校准物。
接下来,将本发明由实施例详细地说明,但本发明不限于这些实施例。
【实施例】
【实施例1】
【1.测定用试剂的调制】
(1.1)试样稀释用缓冲液(第1试剂)
作为试样稀释用缓冲液,调制含有1%BSA的10mM HEPES(pH7.5)。
(1.2)固定WFA的磁性粒子(第2试剂)
将WFA凝集素(VECTOR Laboratories公司)添加到20mM PBS(pH7.5)中,得到含有WFA的溶液(WFA浓度2.5mg/mL)。向此含有WFA的溶液以WFA/交联剂(摩尔比)成为1/100的方式添加作为具有生物素基的交联剂的5-(N-琥珀酰亚胺基氧基羰基)戊基D-生物素酰胺(Biotin-AC5-Osu、株式会社同仁化学研究所)。将得到的溶液于25℃温育90分钟而使WFA和交联剂反应。将得到的反应产物由HPLC纯化而得到生物素化二聚体WFA。在HPLC中,作为分离柱,使用凝胶过滤柱(TSKgelG3000SWXL、东Thor株式会社),作为溶出溶剂,使用PBS(pH6.5)。作为含链霉亲和素结合磁性粒子的悬浮液,使用HISCL R2试剂(Sysmex株式会社)。将生物素化二聚体WFA和HISCL R2试剂以生物素化二聚体WFA的浓度成为20μg/mL的方式混合而使反应。将得到的反应产物用100mM MES缓冲液(pH6.5)清洗3次,得到固定二聚体WFA的磁性粒子(以下,也称为“WFA固定化粒子”)。
(1.3)含ALP标记抗IgA抗体的溶液(第3试剂)
作为抗IgA抗体,使用抗人IgA抗体(SouthernBiotech)。将此抗IgA抗体和牛小肠来源ALP(ORIENTAL酵母株式会社)使用马来酰亚胺交联剂结合,由亲和性层析纯化得到含ALP标记抗IgA抗体的溶液。
(1.4)测定用缓冲液(第4试剂)及基质溶液(第5试剂)
作为测定用缓冲液,使用HISCL R4试剂(Sysmex株式会社)。作为基质溶液,使用含作为ALP的化学发光底物的CDP-Star(商标)(Applied Biosystems公司)的HISCL R5试剂(Sysmex株式会社)。
【2.校准物的调制】
(2.1)具有生物素基的IgA的调制
作为IgA单体,使用人IgA(Native Human IgA protein、Abcam公司)。将人IgA添加到20mM PBS(pH7.5)中而得到IgA溶液。向此IgA溶液以IgA/交联剂(摩尔比)成为1/100的方式添加交联剂Biotin-AC5-Osu(株式会社同仁化学研究所)。将得到的溶液于25℃温育90分钟而得到生物素化IgA。
(2.2)具有与凝集素结合的糖链及生物素基的多肽的调制
作为载体蛋白质,使用M2BP(Sysmex公司调制品)、MUC1(Sysmex公司调制品)及α2M(Sigma-Aldrich)。将各载体蛋白质添加到20mM PBS(pH7.5)中而得到载体蛋白质的溶液。向此溶液以载体蛋白质/交联剂(摩尔比)成为1/100的方式添加交联剂Biotin-AC5-Osu(株式会社同仁化学研究所)。将得到的溶液于25℃温育90分钟而得到生物素化载体蛋白质。
(2.3)生物素化IgA和链霉亲和素的复合体的调制
将含生物素化IgA的溶液和含链霉亲和素(Streptavidin SQ、Roche Diagnostics株式会社)的溶液混合,于室温静置1小时而得到生物素化IgA和链霉亲和素的复合体(以下,也称为“IgA-Bio-STA-Bio-IgA”)。
(2.4)生物素化IgA、链霉亲和素和生物素化载体蛋白质的复合体的调制
将各生物素化载体蛋白质的溶液和含生物素化IgA的溶液混合。将得到的混合液和含链霉亲和素(Streptavidin SQ、Roche Diagnostics株式会社)的溶液混合,于室温静置1小时而得到生物素化IgA、生物素化载体蛋白质和链霉亲和素的复合体(0.2mg/mL)。以下,将含M2BP的复合体也称为“M2BP-Bio-STA-Bio-IgA”,将含MUC1的复合体也称为“MUC1-Bio-STA-Bio-IgA”,将含α2M的复合体也称为“A2M-Bio-STA-Bio-IgA”。
【3.校准物的测定(1)】
使用上述的第1试剂~第5试剂,由全自动免疫测定装置HISCL(商标)5000(Sysmex株式会社),作为校准物,测定M2BP-Bio-STA-Bio-IgA、MUC1-Bio-STA-Bio-IgA及A2M-Bio-STA-Bio-IgA的各自。由HISCL-5000的测定程序如以下。将校准物(30μL)和第1试剂(100μL)混合之后,添加第2试剂(30μL)。对得到的混合液中的磁性粒子进行集磁而除上清,加HISCL清洗液(300μL)而清洗磁性粒子。除上清,向磁性粒子添加第3试剂(100μL)而混合。对得到的混合液中的磁性粒子进行集磁而除上清,加HISCL清洗液(300μL)而清洗磁性粒子。除上清,向磁性粒子添加第4试剂(50μL)及第5试剂(100μL)而对化学发光强度进行测定。作为对照,同样地测定链霉亲和素(STA)及各生物素化载体蛋白质(M2BP-Bio、MUC1-Bio及A2M-Bio)。测定值(信号计数)示于表1。
【表1】
校准物 | 计数 |
STA | 531 |
M2BP-Bio | 532 |
MUC1-Bio | 542 |
A2M-Bio | 1,279 |
M2BP-Bio-STA-Bio-IgA | 144,375 |
MUC1-Bio-STA-Bio-IgA | 201,568 |
A2M-Bio-STA-Bio-IgA | 659,882 |
如表1所示,在测定M2BP-Bio-STA-Bio-IgA、MUC1-Bio-STA-Bio-IgA及A2M-Bio-STA-Bio-IgA之时得到了显著地高的信号计数。从而表明,M2BP-Bio-STA-Bio-IgA、MUC1-Bio-STA-Bio-IgA及A2M-Bio-STA-Bio-IgA可作为使用凝集素及抗IgA抗体的免疫测定法的校准物使用。
【4.校准物的测定(2)】
作为校准物,使用M2BP-Bio-STA-Bio-IgA、MUC1-Bio-STA-Bio-IgA、A2M-Bio-STA-Bio-IgA及IgA-Bio-STA-Bio-IgA。除了将各校准物用20mM PBS(pH7.5)稀释5倍、25倍及125倍之外,与上述同样地进行测定。测定值(信号计数)示于表2。
【表2】
如表2所示,无论在使用何种校准物时,均是对应于稀释倍率而测定值变动。从而表明,在使用凝集素及抗IgA抗体的免疫测定法中,M2BP-Bio-STA-Bio-IgA、MUC1-Bio-STA-Bio-IgA及A2M-Bio-STA-Bio-IgA可作为用于对IgA凝集体的浓度进行定量的校准物使用。
【符号的说明】
10、20、30:校准物
11、21、31:第1容器
12、23、34:捆包箱
13、24、35:附带文书
22、32:第2容器
33:第3容器
Claims (20)
1.校准物,其含具有生物素基的IgA及亲和素类,且用于取得试样中的IgA凝集体的浓度。
2.权利要求1所述的校准物,其为含所述具有生物素基的IgA和所述亲和素类的复合体的试剂。
3.权利要求1所述的校准物,其为包括下列试剂的试剂组:
含所述具有生物素基的IgA的试剂、和
含所述亲和素类的试剂。
4.权利要求1所述的校准物,其还含具有与凝集素结合的糖链及生物素基的多肽。
5.权利要求4所述的校准物,其为含所述具有生物素基的IgA、所述亲和素类和所述多肽的复合体的试剂。
6.权利要求4所述的校准物,其为包括下列试剂的试剂组:
含所述具有生物素基的IgA的试剂、
含所述亲和素类的试剂、和
含所述多肽的试剂。
7.含具有生物素基的IgA和亲和素类的复合体,其用于取得试样中的IgA凝集体的浓度。
8.使用凝集素对试样中的IgA凝集体进行测定的方法,其包括使用含具有生物素基的IgA及亲和素类的校准物,取得所述试样中的IgA凝集体的浓度。
9.权利要求8所述的方法,其中所述校准物是含所述具有生物素基的IgA和所述亲和素类的复合体的试剂。
10.权利要求8所述的方法,其中所述校准物是包括下列多个试剂的试剂组:
含所述具有生物素基的IgA的试剂、和
含所述亲和素类的复合体的试剂,
其中所述多个试剂中的所述复合体的浓度互相不同。
11.权利要求8所述的方法,其中所述校准物还含所述具有与凝集素结合的糖链及生物素基的多肽。
12.权利要求11所述的方法,其中所述多肽含选自M2BP、MUC1及α2M的至少1种糖蛋白质的全部或一部分。
13.权利要求11或12所述的方法,其中所述校准物是含所述具有生物素基的IgA、所述亲和素类和所述多肽的复合体的试剂。
14.权利要求11或12所述的方法,其中所述校准物是包括下列多个试剂的试剂组:
含所述具有生物素基的IgA的试剂、
含所述亲和素类的试剂、和
含所述多肽的复合体的试剂,
其中所述多个试剂中的所述复合体的浓度互相不同。
15.权利要求9、10、13及14之任一项所述的方法,其包括:
使用所述试样、所述凝集素和含标记物质并且与所述IgA凝集体特异性地结合的捕获体,取得所述IgA凝集体的测定值的工序,
使用所述校准物、所述凝集素和所述捕获体,取得所述复合体的测定值的工序,及
从所述IgA凝集体的测定值及所述复合体的测定值取得所述试样中的IgA凝集体的浓度的工序。
16.权利要求15所述的方法,其中在所述IgA凝集体的浓度的取得工序中,由所述复合体的测定值制成校准曲线,基于所述校准曲线及所述IgA凝集体的测定值而取得所述试样中的IgA凝集体的浓度。
17.权利要求8~16之任一项所述的方法,其中所述凝集素固定于固相。
18.权利要求8~17之任一项所述的方法,其中所述IgA是IgA1。
19.权利要求8~18之任一项所述的方法,其中所述凝集素是选自WFA、HHL、GNA、NPA、SBA、VVA、BPL、TJA-II、PHA-L及AOL的至少1种凝集素。
20.权利要求8~19之任一项所述的方法,其中所述凝集素是WFA。
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