CN113727742A - 治疗性水凝胶装置 - Google Patents

Abstract

本发明一般地涉及治疗性水凝胶装置。特别地，本发明公开了平面混合水凝胶宏装置，其包括微孔的阵列和在多个微孔中的每个内的治疗性微组织，并且微孔还包含被布置成引导形成环形微组织的栓。更特别地，本发明公开了用于植入的组合物，且该组合物具有多个生物相容性水凝胶基微胶囊，每个微胶囊内封装有环形微组织，其中的微组织分泌治疗有效物质。

Description

治疗性水凝胶装置

技术领域

本发明一般地涉及治疗性水凝胶装置。更特别地，本发明描述了水凝胶宏装置(macrodevice)的多种实施方式，诸如平面混合水凝胶宏装置，其可以实现微组织的空间控制的分布并支持建立用于增强细胞存活的装置内脉管系统，以及单独封装的微组织，及使用方法。

背景技术

临床胰岛移植是重现天然胰腺β细胞的葡萄糖反应性胰岛素分泌的生理动态以治疗1型糖尿病的潜在策略[Hering,B.J.et al.,Diabetes Care 39(7):1230-1240(2016)；Shapiro,A.M.et al.,Nat Rev Endocrinol 13(5):268-277(2017)]。将胰岛移植物封装在半透性水凝胶膜中已被假定为保护供体细胞免受宿主免疫系统免疫攻击的有前途的方法[Desai,T.et al.,Nat Rev Drug Discov 16(5):338-350(2017)；Lim,F.and Sun,A.M.Science 210(4472):908-910(1980)]。这种封装方法允许有效的营养物和废物交换以及将胰岛素递送到宿主体循环，同时能够扩大非自体细胞来源的使用，以减少对供体器官的需求并消除对免疫抑制剂的需求[Desai,T.et al.,Nat Rev Drug Discov16(5):338-350(2017)]。然而，封装的胰岛的差的生存力和有限的长期功能阻碍了这种治疗策略的临床转化[Tuch,B.E.et al.,Diabetes care 32(10):1887-1889(2009)；de Groot,M.etal.,J Surg Res 121(1):141-150(2004)]。天然胰岛占成人胰腺体积的1-2％[Saisho,Y.Rev Diabet Stud 13(2-3):132(2016)]但接受其～10％的血流[Jansson,L.andHellerstrom,C.Am J Physiol 251(6Pt 1):E644-647(1986)]，是平均直径为50-500μm的球状细胞簇[Kim,A.et al.,Islets 1(2):129-136(2009)；Kilimnik,G.et al.,Islets 4(2):167-172(2012)]。在由丰富的毛细管网络积极支持的胰腺生态位(niche)中，天然胰岛尺寸和几何形状足以支持胰岛的存活和功能[Ionescu-Tirgoviste,C.et al.,Sci Rep 5:14634(2015)]。然而，在移植到接受者后，封装的胰岛失去了它们的支持血管，并且主要依靠被动扩散进行代谢交换[de Groot,M.et al.,J Surg Res 121(1):141-150(2004)]。因此，在移植后，封装的胰岛通常会遭受营养和氧气的差的扩散限制的运输，导致胰岛核心处缺氧和相关组织死亡[de Groot,M.et al.,J Surg Res 121(1):141-150(2004)]。胰岛生存力的这种显著下降导致最终血糖控制失败和长期胰岛素独立性丧失[

M.etal.,Tissue Eng Part B Rev 22(1):34-46(2015)；Elliott,R.B.et al.,Xenotransplantation 14(2):157-161(2007)]。

扩散室或载有细胞的水凝胶片已在胰岛移植的多种临床前研究中进行了评估，结果各不相同[Desai,T.Shea,LD.Nat.Rev.Drug Discov.16(5):338(2017)；Boettler,T.etal.,Cell Transplant.25(3):609-614(2016)；Bruni,A.et al.,Diabetes,metabolicsyndrome and obesity:targets and therapy.7:211(2014)；Lee,BR.et al.,Biomaterials.33(3):837-845(2012)]。然而，获得足够剂量以进行治疗校正所需的高细胞堆积密度增加了细胞或微组织聚集及其不均匀的空间分布的可能性，导致有限的质量转移、随后的缺氧和相关组织坏死以及最终的治疗细胞功能受损[Colton,CK.Advanced drugdelivery reviews.67:93-110(2014)；Avgoustiniatos,ES.Colton,CK.Annals of theNew York Academy of Sciences.831(1Bioartificial Organs:Science,Medicine,andTechnology):145-166(1997)]。

与这些现有装置的有限成功有关的另一个因素是，在移植细胞从供体来源分离后，支持移植细胞的天然脉管系统丧失，导致氧气和营养供应不足和最终组织坏死[Song,S.Roy,S.Biotechnol Bioeng.113(7):1381-1402(2016)]。通常，在装置植入后，作为宿主伤口愈合反应的一部分，新的血管网络将开始侵入装置。然而，这种从现有血管网络形成新血管的过程(也称为血管生成)是缓慢的，并且通常产生比天然胰腺生态位中胰岛周围的血管网络更少的血管[Rouwkema J,Khademhosseini A.Trends Biotechnol.34(9):733-745(2016)]。装置的整体结构和宏观尺寸阻止新宿主脉管系统到达封装的胰岛，尤其是位于中心的那些，从而加剧了这个问题。

已经尝试了多种策略来克服缺氧诱导的细胞死亡[Barkai,U.et al.,CellTransplant 22(8):1463-1476(2013)；Ramachandran,K.et al.,Tissue Eng Part A 19(5-6):604-612(2012)]。例如，血运重建方法涉及胰岛与血管生成基因、生长因子和血管诱导细胞类型的共封装，以促进新脉管系统的形成并随后改善氧气向移植的移植物的运输[Barkai,U.et al.,Cell Transplant 22(8):1463-1476(2013)]。最近，开发了一种3D生物打印技术，涉及可光聚合水凝胶和投影立体光刻技术，以生成脉管系统[Grigoryan,B.etal.,Science 364:458(2019)]。这一设计被用来构造一种血管网络嵌入式装置，用于将肝细胞聚集体递送到慢性肝损伤的啮齿动物模型中，并且证明移植后14天植入物是存活的并具有功能。另一种替代策略是通过皮下植入的进入端口将外源氧气注入包含胰岛的宏封装装置[Ramachandran,K.et al.,Tissue Eng Part A19(5-6):604-612(2012)]。这些方法受到对额外生化试剂和操作附件的要求的限制，这使胰岛递送系统复杂化并使其临床转化更加困难。此外，多项研究已提出重新聚集通过分离的胰岛的胶原酶分散获得的单细胞，以形成具有约50-100μm的较小直径的球状细胞簇[O’Sullivan,E.et al.,Diabetologia 53(5):937-945(2010)；Hilderink,J.et al.,J Cell Mol Med 19(8):1836-1846(2015)；Bosco,D.et al.,Exp Cell Res 184(1):72-80(1989)]。尽管与大胰岛相比，较小的聚集体表现出增强的细胞生存力，但由于较差的细胞间相互作用，它们的葡萄糖反应性降低[Mendelsohn,A.D.et al.,Acta Biomater 8(12):4278-4284(2012)；Wilson J.T.andChaikof,E.L.Adv Drug Del Rev 60(2):124-145(2008)]。此外，对于相同数量的移植细胞，使用小聚集体需要更高数量的微组织，并随后需要增加数量的用于封装的水凝胶微胶囊，从而导致更大的移植体积[Reynolds,T.D.et al.,Drug Dev Ind Pharm 28(4):457-466(2002)]。尽管如此，这些研究仅关注具有球状几何形状的微组织，而其他非球状几何形状对微组织生存力的潜在作用仍有很大部分未经探索。

在所有凸面形状中，理论上已证明对于给定体积来说球状几何形状具有最低的SA/Vol[Komatsu,H.et al.,PloS one 12(8):e0183780(2017)]。此外，Mullen等人已经证明，球状人胰岛在其半径上具有理论最大限制以维持细胞生存力[Enmon Jr,R.M.et al.,Biotechnol Bioeng 72(6):579-591(2001)；Dean,D.M.et al.,FASEB J 21(14):4005-4012(2007)]，使得球状几何形状不太适合扩散驱动的代谢交换。相比之下，据推测，杆状微组织对其长度没有理论限制，只要其半径在支持细胞存活所需的临界扩散限制内即可[Rago,A.P.et al.,Tissue Eng Part A 15(2):387-395(2008)]。另一种吸引人的几何形状是环状，因为其含有内腔的结构减少了氧气和介质扩散到内部细胞中的距离[LivotiC.M.and Morgan,J.R.Tissue Eng Part A 16(6):2051-2061(2010)；Merglen,A.et al.,Endocrinology 145(2):667-678(2004)]。仍然需要开发一种治疗性封装微组织系统，其中相对于现有技术至少具有改进和/或优势。

发明内容

开发了一种专用平台来封装具有受控空间分布的治疗性微组织，并任选地同时支持血管诱导细胞的有组织的装置内网络。该平台包括两个具有互补形貌特征的模块，它们以锁和钥构型配合在一起(图10)。受华夫饼表面上的网格状图案的启发，“锁”组分由相互连接的支持血管的水凝胶网络组成，其用作分隔均匀间隔的微孔(微阱)的隔离侧壁。“钥”组分由封装在免疫隔离水凝胶中的治疗性微组织组成，其被添加到锁组分的微孔中并交联，从而基本上将组分固定或锁定在一起作为一个单元。锁组分的华夫饼启发的微图案旨在引导治疗性微组织的空间均匀的分布，使得每个微组织都可以理想地包埋在一个微孔中，以防止不希望的聚集。此外，该装置的互锁设计将两种组分分离的风险降至最低，并确保锁组分的壁中的任选血管诱导细胞与钥组分中的封装的治疗性微组织接近。

根据本发明的第一方面，存在一种平面生物相容性水凝胶基宏装置，包括微孔的阵列和在多个所述微孔中的每个内的治疗性微组织，其中；

a)所述宏装置包括包含交联水凝胶的互连网络的组分，其用作分隔均匀间隔的微孔的隔离侧壁，其中所述阵列中的每个微孔包括至少一个侧壁并被配置成封装单个治疗性微组织；以及

b)所述宏装置包括包含在免疫隔离水凝胶中的治疗性微组织的组分，当交联时，治疗性微组织被包埋在所述微孔中，并且

其中b)的所述免疫隔离水凝胶组分与a)的互连水凝胶网络组分互锁。

在一些实施方式中，平面生物相容性水凝胶基宏装置还包括免疫隔离水凝胶的封装涂层。

在一些实施方式中，多个所述微孔中的每个的至少一个侧壁还包含血管内皮细胞。

在一些实施方式中，治疗性微组织是环形的。

根据本发明的第二方面，存在一种制造平面生物相容性水凝胶基宏装置的方法，包括以下步骤；

a)将水凝胶预聚物分配到表面上；

i)将具有指定几何形状和尺寸的透明特征或孔阵列的光掩模放置在分配的混合物上，和

ii)将所述混合物暴露于UV光或含有交联剂的溶液以使所述水凝胶预聚物的暴露部分交联，以形成侧壁的微图案网络，和

iii)冲洗交联的水凝胶图案以去除未交联的水凝胶残留物，留下微孔；或

b)使用3D打印将水凝胶预聚物分配到表面上并交联以形成限定微孔的侧壁的微图案网络；

c)向a)或b)的交联水凝胶微图案上添加微组织和可交联的免疫隔离水凝胶的混合物，并使所述免疫隔离水凝胶交联；或

d)将细胞悬浮液添加到微孔中并在合适的条件下培养细胞，直到细胞根据所选的交联水凝胶微图案聚集成期望的微组织形状，和

(i)向交联的水凝胶微图案上添加可交联的免疫隔离水凝胶，和

(ii)使所述免疫隔离水凝胶交联，

其中所述平面生物相容性水凝胶基宏装置包含每微孔单个微组织。

在一些实施方式中，该方法还包括步骤e)i)用可交联的免疫隔离水凝胶的涂层封装平面生物相容性水凝胶基宏装置，和e)ii)使免疫隔离水凝胶交联。

根据本发明的第三方面，存在一种包含用于植入的细胞的组合物，其中所述组合物包含具有封装在其中的单个环形微组织的生物相容性水凝胶基微胶囊，其中所述微组织分泌治疗有效物质，诸如激素或蛋白质。在一些实施方式中，水凝胶是藻酸盐。

根据本发明的第四方面，存在一种治疗方法，包括将本发明任何方面的平面生物相容性水凝胶基宏装置或本发明任何方面的组合物植入到需要此类治疗的受试者中。

根据本发明的第五方面，存在本发明任何方面的平面生物相容性水凝胶基宏装置或本发明任何方面的组合物作为用于治疗受试者的植入物的用途。

根据本发明的第六方面，存在一种试剂盒，包含本发明任何方面的平面生物相容性水凝胶基宏装置和多个微组织和/或藻酸盐。

附图说明

图1A-B是制造微组织的程序的示意图。图1A是使用微模塑非粘性琼脂糖水凝胶制造INS-1E微组织的程序的示意图。通过移液将分散细胞的均匀悬浮液接种到每个微模塑非粘性琼脂糖水凝胶中。在细胞组装至少55小时后，使用微量移液器回收微组织。图1B是使用静电液滴发生器封装胰岛样微组织的程序的示意图。将微组织/藻酸盐溶液的混合物通过20G钝针挤出到Ba²+离子浴中以形成水凝胶微胶囊。

图2A-G示出了初始细胞接种密度对微组织的细胞数量和生存力的影响。图2A-C：从微模塑琼脂糖水凝胶中回收之前(i-iv)和之后(v-viii)具有环状、杆状和球状几何形状的微组织的光学图像。箭头指示微组织核心处死细胞的暗区；图2D-F：使用自动细胞计数器和台盼蓝排除法(trypan blue exclusion)进行的定量测定表明，对于每种几何形状，每微组织的细胞数和死细胞的百分比随着初始细胞接种密度而增加。图2G：与死细胞百分比相似的杆状和球状微组织相比，具有约13％死细胞的环状微组织每微组织的细胞数更高。数据示出为平均值±SEM(n＝3个重复样品)。(***)表示p<0.005。代表300μm的比例尺适用于以相同放大倍率获取的所有图像。

图3A-G示出了微组织几何形状对细胞生存力的影响。图3A：使用自动细胞计数器的定量测定证实，对于所有三种几何形状(n＝6个重复样品)，每微组织的平均细胞数相似；图3B与球状微组织相比，环状和杆状微组织具有较低百分比的死细胞(n＝6个重复样品)；图3C-E具有标准化每微组织细胞数(～12000个细胞)的微组织的光学图像。箭头指示杆状和球状微组织核心处死细胞的暗区；图3F使用WST-1测定(n＝10个重复样品)对完整微组织的代谢活性进行量化表明，环状微组织比杆状和球状微组织具有更高的代谢活性；图3G微组织的体积和SA/Vol比(n＝3批微组织，每批53个微组织)。数据示出为平均值±SEM(***)表示p<0.005。所有比例尺代表300μm。

图4A-L示出了通过活/死染色和共聚焦显微镜对微组织生存力的评估。图4A-C：微组织的明场图像。图4D-F：荧光指示微组织的活细胞；图4G-I：荧光指示微组织的死细胞；图4J-L：微组织的活细胞和死细胞的合并图像。图4B和H中的白色箭头指示杆状微组织内部的死细胞区域，而图4C中的黑色箭头指示染色后具有脱落死细胞的球状微组织；所有比例尺代表300μm。

图5示出了响应于静态葡萄糖刺激的微组织的胰岛素分泌。响应于静态葡萄糖刺激的微组织的胰岛素分泌。将微组织在低葡萄糖(2.8mM)和高葡萄糖(16.8mM)然后低葡萄糖(2.8mM)下连续孵育，每种浓度下1h。对于每种几何形状，响应于较高的葡萄糖水平分泌较高量的胰岛素。数据示出为平均值±SEM(n＝6个重复样品)。(*)和(***)分别表示小于0.05和0.005的p值。

图6A-F示出了封装在藻酸盐水凝胶胶囊中的微组织的光学图像。封装在藻酸盐微胶囊中的多个(图6A-C)和单个(图6D-F)环状、杆状和球状微组织的光学图像。黑色箭头指示光学透明的均匀球状藻酸盐微胶囊的表面。白色箭头指示微组织的外表面。所有比例尺代表500μm。

图7示出了对环状、杆状和球状几何形状的微组织进行微封装期间的破损率的量化。数据示出为来自两个独立实验的平均值±SEM。在每个独立实验中，针对每种几何形状检查了约115至155个微组织。(***)表示p<0.005。

图8示出了说明在培养3天内封装的和裸露的环状微组织的结构变化的光学图像。图8A：在从细胞组装过程回收微组织之后的不同时间点，在涂覆有一层平的琼脂糖的组织培养板上的裸露的环状微组织和封装在藻酸盐微胶囊中的环状微组织的代表性光学图像。裸露的环状微组织的内腔在1天后封闭，而封装的微组织的内腔一直持续到第3天。箭头指示藻酸盐微胶囊的表面。图8B：在不同时间点对裸露的和封装的微组织(n＝10个重复样品)的内径的定量分析。数据示出为平均值±SEM(***)表示p<0.005。代表200μm的比例尺适用于所有图像。

图9示出了使用图2中的初始细胞接种密度和每微组织的细胞数之间的关系，对于标准化的每种几何形状的每微组织细胞数的估计的初始细胞接种密度。对于具有每微组织约13000个细胞的环状、杆状和球状微组织，估计的初始细胞接种密度分别为310、620和920万个细胞/mL。

图10示出了微组织尺寸的测量，用于计算它们的表面积与体积比和体积，如图3G所示。每行中的三个图像取自单个实验，在该实验期间，所有三种几何形状的微组织均由同一批细胞制成(n＝3批微组织，每批53个微组织)。在图像采集后添加微组织上的白线以指示测量尺寸的位置。代表400μm的比例尺适用于以相同放大倍率获取的所有图像。

图11示出了活/死染色后微组织的3D共聚焦可视化的快照。图11A：环状微组织。图11B：杆状微组织。图11C：球状微组织。箭头指示细胞碎片可能已通过其从球状微组织表面排出的孔。

图12示出了制造华夫饼启发的宏装置的示意图，该宏装置包括多个空微孔，用于封装在添加到宏装置之前非原位制造的治疗性微组织。

图13示出了具有不同尺寸的正方形或圆形微孔的对齐阵列的GelMA微图案的明场和荧光图像；200μm、300μm或400μm孔宽。

图14示出了制造华夫饼启发的宏装置的示意图，该宏装置包括多个微孔，每个微孔在其中心具有栓，并且在该装置中原位定向组装单细胞以在每个微孔中形成环形微组织。

图15A-D示出了具有GelMA水凝胶网络的不同微图案设计的宏装置中的微组织分布。图15A：在微组织封装后宏装置的明场图像。图15B：每宏装置(1cmx1cm)的封装微组织总数(n＝18个装置，3批，误差条代表SD)。图15C：每种类型的宏装置的微组织包埋效率和微孔总面积的定量分析(来自N＝3个独立实验的n＝1个装置，误差条代表SD)。微组织包埋效率定义为微孔中包埋的微组织总数与整个宏装置中封装的微组织总数的比率。图15D：S-300、S-400和C-400宏装置中微组织分布率的定量分析。微组织分布率定义为类型Mn的所有微孔中的微组织的组合数(其中n为每微孔的微组织数量并且范围为1到6)与整个宏装置中封装的微组织总数的比率(来自N＝3个独立实验的n＝1个装置，误差条代表SD)。(*)表示使用单向方差分析(one-way ANOVA)确定的统计差异(p<0.05)。比例尺：1mm。

图16A-B示出了具有GelMA微图案的分离的微组织负载装置(图16A)和没有GelMA微图案的对照微组织负载装置(图16B)的明场图像。

图17A-B示出了宏装置中治疗性微组织的生存力和胰岛素分泌功能的表征。图17A：封装在装置中的微组织的明场和荧光活/死图像；图17B：通过对样品连续进行在2.8、16.8和2.8mM葡萄糖溶液中的三个连续孵育而实施的静态葡萄糖刺激的胰岛素分泌测试。(n＝3个装置，误差条代表SD)。(*)表示使用学生t检验确定的统计差异(p<0.05)。

图18A-D示出了包含HUVEC的宏装置的功能特性。图18A：在其GelMA侧壁中具有HUVEC的华夫饼样宏装置的明场和活/死图像；图18B：内皮标志物CD31染色后装置的免疫荧光图像；图18C：共封装有在微孔中的INS-1E微组织和在GelMA侧壁中的HUVEC的宏装置装置的明场和荧光活/死图像；图18D：通过对封装治疗性微组织和HUVEC二者的装置进行在2.8mM、16.8mM和2.8mM葡萄糖溶液中的三个连续孵育而实施的静态葡萄糖刺激的胰岛素分泌测试。(n＝3个装置，误差条代表SD)。(*)表示使用学生t检验确定的统计差异(p<0.05)。

图19A-C示出了通过单分散细胞在华夫饼样GelMA水凝胶微图案上的引导组装而原位形成治疗性微组织。图19A：用于在微图案S-300上原位形成治疗性微组织的单分散细胞的组装的示意性制造；图19B：在来自80万个接种细胞的微图案上形成的微组织的明场和活/死图像；图19C：在来自40万个接种细胞的微图案上形成的微组织的明场图像。

图20示出了通过40万个接种细胞在GelMA水凝胶微图案上的引导组装形成的环状微组织的明场图像，每个微孔的中心有一个栓。本实验中使用的微图案是S-400，其由侧宽尺寸为400μm的正方形微孔阵列组成，且每个微孔中的栓状结构的直径为100μm。

图21是类似于图20所示的华夫饼启发的宏封装装置的示意图，具有正方形微孔(透明区域)和圆形栓(黑色圆圈)。

图22示出了环状装载的华夫饼启发的微封装装置的明场图像，以比较栓直径和微孔侧宽尺寸对环状形态的影响。

图23示出了环状装载的华夫饼启发的宏封装装置的明场图像，以比较初始细胞负载对环状微组织的原位形成的影响。箭头指示由于过多的初始细胞负载而在装置边缘上形成细胞片。

图24示出了说明初始细胞负载对接种后24小时细胞生存力和收率的影响的图。图24A：在所有初始细胞负载下，细胞生存力都保持在高于90％。图24B：在较低的初始细胞负载范围内，活细胞收率最高。

图25示出了响应于静态葡萄糖刺激从华夫饼样宏装置中的环状微组织的胰岛素分泌。将包含微组织的华夫饼样宏装置在低葡萄糖(2.8mM)和高葡萄糖(16.8mM)然后低葡萄糖(2.8mM)下连续孵育，每种浓度下2小时。响应于较高的葡萄糖水平分泌较高平均量的胰岛素。数据示出为平均值±SEM(n＝3个装置，误差条代表SD)。

图26A-B示出了包含环状微组织的华夫饼启发的宏装置的照片。图26A：宏装置具有很强的机械性能以承受镊子的操作。图26B：在放大倍率下观察到华夫饼排列的最小变形。

图27示出了在华夫饼启发的宏装置的三个不同深度处的示意性明场图像和共焦横截面(AA’、BB’、CC’)。GelMA水凝胶网络的“锁”或“互锁”组分通过将GelMA与绿色荧光微珠混合而可视化(箭头标记为“侧壁”)，而藻酸盐-微组织混合物的第二互锁组分通过向藻酸盐中添加红色荧光微珠而可视化(箭头标记为“微孔”)。藻酸盐“钥”组分中的INS-1E微组织用蓝色Hoechst染料染色(箭头标记为“微组织”)。每个共焦平面中所有三个信号的出现说明了两个模块化组分的互锁性质。

图28示出了用于产生化学诱导的糖尿病小鼠模型、制造华夫饼启发的宏装置并将其移植到糖尿病小鼠中的程序的示意图。

图29示出了移植前(图25A)和移植后9天后从糖尿病小鼠中回收后(图25B)的宏装置的照片。宏装置保持其结构和机械稳定性，以在装置回收期间承受镊子的操作。在放大倍率下的明场图像(图25C-D)中，与移植前装置(图25C)相比，在回收的装置(图25D)中观察到华夫饼排列的最小变形。

图30示出了非糖尿病小鼠、对照STZ诱导的糖尿病小鼠、皮下移植含有治疗剂量的环状微组织的华夫饼样宏装置的STZ诱导的糖尿病小鼠的每日非空腹血糖水平随时间变化的图，该治疗剂量为每小鼠100万或200万个β细胞。以每小鼠200万个细胞的治疗剂量接受环状装载的华夫饼样宏装置的糖尿病小鼠仅在移植后1天就降低了糖尿病小鼠的血糖水平。

图31示出了非糖尿病小鼠、糖尿病小鼠和对照STZ诱导的糖尿病小鼠、通过腹腔内移植封装在藻酸盐微胶囊中的环状微组织进行治疗的STZ诱导的糖尿病小鼠的每日非空腹血糖水平随时间变化的图。用微封装的环状微组织治疗的糖尿病小鼠可以在移植后仅1天就将糖尿病小鼠的血糖水平降低至低于300mg/dL。

图32示出了封装原代大鼠胰岛的华夫饼样宏装置的明场图像。图32A：藻酸盐-胰岛混合物分配在载玻片上的GelMA水凝胶网络上，说明了微图案设计通过每微孔包埋一个微组织均匀分布治疗性微组织的能力。图32B：在用钡交联的藻酸盐水凝胶层进一步外部涂覆后，宏装置在其从载玻片上分离后仍保持均匀的胰岛分布。

本说明书中提及的参考文献为方便起见以参考文献列表的形式列出并添加在实施例的末尾。这样的参考文献的全部内容通过引用并入本文，但是在说明书中提及它们并不暗示它们形成公知常识的一部分。

具体实施方式

定义

为方便起见，此处收集了说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。

术语“一个”和“一种”在本文中用于指代一个或多于一个(即至少一个)冠词的语法对象。

如本文所用，术语“包含(comprising)”或“包括(including)”应被解释为指示存在如所提到的所述特征、整数、步骤或组分，但不排除一个或多个特征、整数、步骤或组分或它们的组的存在或添加。然而，在本发明的上下文中，术语“包含”或“包括”还包括“由……组成”。词语“包含(comprising)”的变体诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”以及“包括(including)”的变体诸如“包括(include)”和“包括(includes)”具有相应不同的含义。

如本文所用，术语“组分”旨在描述限定微孔阵列的交联水凝胶和包含微组织的交联免疫隔离水凝胶中的每一种。第一组分和第二组分也可用于限定各自的水凝胶。

术语“组合物”被定义为不同材料诸如聚合物和细胞的组合。组合物可包括由透明或半透明聚合物制成的平面基质(也称为“华夫饼启发的”结构)。细胞可以排列成填充排列，诸如由列和行组成的正方形填充排列。细胞可以以规则的间隔隔开。细胞可以形成簇，诸如杆、球体或环形构建单元。

术语“簇”或“细胞簇”被定义为聚集在一起或自组装成微组织的一组细胞。

术语“环形”、“环状”或“环状微组织”在本文中用于描述具有开放腔的环形或甜甜圈形组织。

如本文所用，术语“锁”、“锁定”或“互锁”、“互锁的”旨在描述以下的交错接合：a)交联水凝胶的互连网络，其用作分隔均匀间隔的微孔的隔离侧壁，其中阵列中的每个微孔包括至少一个侧壁并且被配置成封装单个治疗性微组织，和b)免疫隔离水凝胶中的治疗性微组织，当交联时，其被包埋在微孔中，并且其中b)的所述免疫隔离水凝胶组分与a)的互连水凝胶网络组分互锁以形成基本上单一的宏装置。更简单地说，其为免疫隔离水凝胶在宏装置的孔内和孔上方的交联，例如如图12和14中的示意图所示。

术语“聚合物”或“生物聚合物”被定义为具有重复分子单元的物质。聚合物可以是生物相容性聚合物，选自包含多糖(例如琼脂糖)、聚磷腈、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(环氧烷)、聚(乙酸乙烯酯)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及其共聚物和共混物的组。聚合物可以是聚丙烯酰胺或包含聚丙烯酰胺的共混物。聚合物可以是柔性聚合物，其在机械和结构上也是稳定的并且适合于移植或植入(例如皮下移植或植入)。聚合物可以是或不是可生物降解的。

术语“哺乳动物细胞”定义为源自哺乳动物受试者的任何细胞。细胞可以是分泌的(例如胰腺细胞)、结构的(例如间充质或上皮细胞)或代谢的。细胞可以选自包括但不限于以下任何细胞类型的组：朗格汉斯岛、骨髓单核细胞、间充质干细胞、动员的外周血单核细胞、内皮祖细胞、卵泡细胞、睾丸间质细胞、卵巢细胞、神经干细胞、人胚胎干细胞、多能干细胞、骨骼肌成肌细胞、心肌成肌细胞(cardiomyoblast)等。细胞可以是异种的、自体的或同种异体的。细胞可以是直接从哺乳动物受试者获得的原代细胞。细胞还可以是源自从受试者获得的细胞的培养和扩增的细胞。细胞可以是干细胞。永生化细胞(即细胞系)也包括在此定义中。在一些实施方式中，细胞已被遗传工程化以表达重组蛋白和/或核酸。

术语“受试者”在本文中定义为脊椎动物，特别是哺乳动物，更特别是人。出于研究目的，受试者可以特别是至少一种动物模型，例如小鼠、大鼠等。特别地，为了治疗或预防疾病，诸如1型糖尿病，受试者可以是人。

在本发明的上下文中使用的术语“治疗”是指预防性、改善性、治疗性或治愈性治疗。

出于简洁和清楚的目的，本发明的实施方式的描述涉及根据实施例用于治疗性植入的水凝胶封装的微组织和混合水凝胶宏装置。虽然将结合本文提供的实施方式来描述本发明的方面，但是应当理解，其不旨在将本发明限制于这些实施方式。相反，本发明旨在涵盖对本文描述的实施方式的替代、修改和等同物，其包括在由所附权利要求限定的本发明的范围内。此外，在以下详细描述中，阐述了具体细节以提供对本发明的透彻理解。然而，本领域具有普通技术的人员(即技术人员)将认识到，本发明可以在没有具体细节和/或具有由特定实施方式的方面的组合产生的多个细节的情况下实践。在许多情况下，没有详细描述已知的系统、方法、程序和组分，以免不必要地混淆本发明的实施方式的方面。

本发明提供了一种华夫饼启发的混合水凝胶宏装置，其可用于通过促进封装的微组织的分布和互连脉管系统的形成来促进基于细胞的治疗的增强的性能，以在广泛的应用范围中改善微组织性能。

根据本发明的第一方面，存在一种平面生物相容性水凝胶基宏装置，包括微孔的阵列和在多个所述微孔中的每个内的治疗性微组织，其中；

a)所述宏装置包含交联水凝胶的互连网络，其用作分隔均匀间隔的微孔的隔离侧壁，其中所述阵列中的每个微孔包括至少一个侧壁并被配置成封装单个治疗性微组织；以及

b)所述宏装置包含在免疫隔离水凝胶中的治疗性微组织，当交联时，治疗性微组织被包埋在所述微孔中，并且

其中b)的所述免疫隔离水凝胶与a)的互连水凝胶网络互锁。

应理解，存在多种可用于产生宏装置的生物聚合物。聚合物可以是生物相容性聚合物，选自包含多糖(例如琼脂糖)、聚磷腈、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(环氧烷)、聚(乙酸乙烯酯)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、胶原蛋白、弹性蛋白、聚乙二醇、藻酸盐、透明质酸或它们的衍生物以及其共聚物和共混物的组。聚合物可以是聚丙烯酰胺或包含聚丙烯酰胺的共混物。聚合物可以是柔性聚合物，其在机械和结构上也是稳定的并且适合于移植或植入(例如皮下移植或植入)。在一些实施方式中，优选地水凝胶是甲基丙烯酰化明胶(GelMA)。

在一些实施方式中，多个所述微孔中的每个的至少一个侧壁还包含血管内皮细胞。内皮细胞嵌入壁内以促进血管化并支持每个孔内的微组织。

在一些实施方式中，平面生物相容性水凝胶基宏装置还包括封装宏装置的免疫隔离水凝胶诸如藻酸盐水凝胶的涂层。装置上的额外涂层为植入的宏装置提供了额外的结构支持或机械强度。

在一些实施方式中，微孔包括被布置成引导形成环形微组织的栓。非限制性实例示出在图17至19中。在一些实施方式中，栓具有的直径在50μm至200μm的范围内，优选地直径为约100μm。在平面生物相容性水凝胶基宏装置的一些实施方式中，栓具有的直径为100μm并且所述微孔中的每个的宽度尺寸为500μm。

在一些实施方式中，微孔在水平面中为正方形或圆形的，诸如图11所示。

微孔的尺寸在本文中以宽度尺寸表示，其意指，例如，对于正方形孔，宽度尺寸为横截面一边的长度；对于圆形微孔，宽度尺寸是圆形横截面的直径。基本上，其为从孔的一侧到另一侧的距离。

在一些实施方式中，所述微孔中的每个的宽度尺寸在100μm至1000μm的范围内，优选300μm至500μm的范围内，更优选为约500μm。优选地，栓具有的宽度尺寸为100μm并且所述微孔中的每个的宽度尺寸为500μm。

在一些实施方式中，微孔侧壁具有的高度在100μm至1000μm范围内，优选约300μm。孔的高度或深度可根据植入物的性质、植入位置和使用的微组织类型而变化。本发明的3D打印宏装置可以具有更深的孔。

除了由特定应用确定的实际约束之外，生物相容性水凝胶基宏装置的尺寸不旨在受到限制。本文公开的实施例表明，包含144个孔、324个孔、529个孔和1024个孔的宏装置可用于接种微组织(图12)。在一些实施方式中，平面生物相容性水凝胶基宏装置包含至少100个微孔、至少300个微孔、至少500个微孔或至少1000个微孔。

在一些实施方式中，治疗性微组织是杆形、球状或环形的，优选环形的。

在一些实施方式中，微组织包含分泌细胞、结构细胞或代谢细胞。在一些实施方式中，微组织包含选自包含以下的组的细胞：朗格汉斯分泌胰岛素的胰岛细胞[Song,S.andRoy,S.Biotechnol Bioeng.113(7):1381-1402(2016)]、分泌白蛋白的肝细胞[GlicklisR,et al.,Biotechnol Bioeng.86(6):672-680(2004)；Gionet-Gonzales,MA and Leach,JK.Biomedical materials.13(3):034109(2018)]、骨髓单核细胞、间充质干细胞、动员的外周血单核细胞、内皮祖细胞、卵泡细胞、睾丸间质细胞、卵巢细胞、神经干细胞、人胚胎干细胞、多能干细胞细胞、骨骼肌成肌细胞和心肌成肌细胞或用于生长激素缺乏或血友病的基因工程细胞[Gao K,et al.,Stem cell research&therapy.10(1):34(2019)]。在一些实施方式中，微组织分泌治疗有效的物质，诸如激素或蛋白质。

在一些实施方式中，a)中的交联水凝胶优选为GelMA和/或b)中的免疫隔离水凝胶优选为藻酸盐。

在一些实施方式中，所述治疗性微组织中的每个：

a)被添加到所述微孔中，或

b)在所述微孔内由细胞悬浮液产生。

在一些实施方式中，细胞悬浮液包含每cm²宏装置约50至150万个细胞。

根据本发明的第二方面，存在一种制造平面生物相容性水凝胶基宏装置的方法，包括以下步骤；

a)将水凝胶预聚物分配到表面上；

i)将具有指定几何形状和尺寸的透明特征或孔阵列的光掩模放置在分配的混合物上，和

ii)将所述混合物暴露于UV光或含有交联剂的溶液以使所述水凝胶预聚物的暴露部分交联，以形成侧壁的微图案网络，和

iii)冲洗交联的水凝胶图案以去除未交联的水凝胶残留物，留下微孔；或

b)使用3D打印将水凝胶预聚物分配到表面上并交联以形成限定微孔的侧壁的微图案网络；

c)向a)或b)的交联水凝胶微图案上添加微组织和可交联的免疫隔离水凝胶的混合物，并使所述免疫隔离水凝胶交联；或

d)将细胞悬浮液添加到微孔中并在合适的条件下培养细胞，直到细胞根据所选的交联水凝胶微图案聚集成期望的微组织形状，和

(i)向交联的水凝胶微图案上添加可交联的免疫隔离水凝胶，和

(ii)使所述免疫隔离水凝胶交联，

其中所述平面生物相容性水凝胶基宏装置包含每微孔单个微组织。

在一些实施方式中，方法还包括步骤e)将所述宏装置和微组织封装在生物相容性水凝胶层诸如藻酸盐水凝胶层中。当例如用作植入物时，宏装置的这种进一步封装为宏装置提供了额外的支持和保护。

在一些实施方式中，细胞以每cm²宏装置约30至150万个细胞接种到宏装置上。

在一些实施方式中，微组织和/或细胞悬浮液选自包含以下的组：朗格汉斯胰岛细胞、肝细胞、骨髓单核细胞、间充质干细胞、动员的外周血单核细胞、内皮祖细胞、卵泡细胞、睾丸间质细胞、卵巢细胞、神经干细胞、人胚胎干细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、骨骼肌成肌细胞、心肌成肌细胞和用于生长激素缺乏或血友病的基因工程细胞。

在一些实施方式中，在步骤a)或b)中，将水凝胶预聚物和血管内皮细胞的混合物分配到所述表面上，并且其中所述血管内皮细胞嵌入所述微孔侧壁中。

在一些实施方式中，步骤a)或b)中的所述水凝胶预聚物是GelMA和/或步骤c)或d)i)中的所述可交联的免疫隔离水凝胶是藻酸盐。

根据本发明的第三方面，存在一种包含用于植入的细胞的组合物，其中所述组合物包含多个生物相容性水凝胶基微胶囊，每个具有封装在其中的环形微组织，其中所述微组织分泌治疗有效物质，诸如激素或蛋白质。

在一些实施方式中，水凝胶是可交联的免疫隔离水凝胶。

在一些实施方式中，水凝胶优选是藻酸盐。

在一些实施方式中，微组织包含选自包含以下的组的细胞：朗格汉斯胰岛细胞、肝细胞、骨髓单核细胞、间充质干细胞、动员的外周血单核细胞、内皮祖细胞、卵泡细胞、睾丸间质细胞、卵巢细胞、神经干细胞、人胚胎干细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、骨骼肌成肌细胞、心肌成肌细胞和用于生长激素缺乏或血友病的基因工程细胞。

根据本发明的第四方面，存在一种治疗方法，包括将本发明任何方面的平面生物相容性水凝胶基宏装置或本发明任何方面的组合物植入到需要此类治疗的受试者中。

在一些实施方式中，所述平面生物相容性水凝胶基宏装置或所述组合物包含分泌胰岛素以治疗糖尿病的微组织。

在一些实施方式中，微组织包含胰岛细胞。

根据本发明的第四方面，存在本发明任何方面的平面生物相容性水凝胶基宏装置或本发明任何方面的组合物作为用于治疗受试者的植入物的用途。

根据本发明的第五方面，存在一种试剂盒，其包含本发明任何方面的平面生物相容性水凝胶基宏装置或本发明任何方面的组合物。

在一些实施方式中，试剂盒用于治疗有需要的受试者。例如，受试者可能需要治疗糖尿病并且所述试剂盒包含根据本发明的任何方面的包含分泌胰岛素的微组织的宏装置或组合物。

实施例

实施例1：微组织的制造、表征及其封装在藻酸盐微胶囊中的方法

1.1.微模塑琼脂糖水凝胶的制备

如图1A所示，有机硅(Silicone)模板3D Petri

(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，美国)用于制备微图案化琼脂糖水凝胶，其由具有期望几何形状的多个凹槽组成[Napolitano,A.P.et al.,Biotechniques,43:494,496-500(2007)]。将

琼脂糖(Invitrogen，卡尔斯巴德，美国)粉末高压灭菌并通过在无菌Mili-Q水中加热溶解形成2.3％(w/w)溶液，随后将其添加到每个硅模板中并使其在室温下固化25min。然后，使用抹刀将固化的微模塑琼脂糖水凝胶从有机硅模板上分离，并转移到经过灭菌的6孔组织培养板。每个微模塑琼脂糖水凝胶在细胞接种前用3mL培养基平衡过夜。以每琼脂糖凝胶6×6阵列排列的环形制造凹槽每个深750μm且宽1400μm。其中央栓和周围环形轨道具有的直径分别为600μm和400μm。以每琼脂糖凝胶15×6阵列排列的杆制造凹槽每个长2200μm、宽400μm且深750μm。以每琼脂糖凝胶9×9阵列排列的球体制造凹槽每个深800μm，具有圆底直径为800μm。

1.2.细胞培养

大鼠胰岛素瘤细胞系(INS-1E)是Yusuf Ali博士(新加坡南洋理工大学李光前医学院)的慷慨礼物，并得到Claes B.Wollheim教授(瑞典隆德大学)的许可。根据公开的方案[Napolitano,A.P.et al.,Tissue Eng.,13:2087-2094(2007)]培养96-110代的INS-1E细胞。细胞培养在RPMI完全培养基中，该培养基由补充有10％热灭活胎牛血清(GibcoLaboratories，美国)、2mM L-谷氨酰胺、10mMHEPES、1mM丙酮酸钠、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和50μM 2-巯基乙醇的RPMI-1640培养基(Hyclone，美国)组成。细胞维持在37℃下含有95％空气和5％CO₂的湿润气氛中。在约70％的汇合时，在37℃下用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco Laboratories，美国)处理2min分钟后分离细胞。继代培养以1:4的分流比进行，接种密度为2×10⁵个细胞/cm²。每3天更换培养基。

1.3.胰岛样微组织的制备

如先前所述进行将INS-1E细胞接种到微模塑琼脂糖水凝胶上[Dahl,U.et al.,Development,122:2895-2902(1996)]。通常，将具有期望密度的175μL体积的单细胞悬浮液移入每个微模塑琼脂糖水凝胶中。允许细胞沉入凹槽底部30min，然后将2.5mL培养基添加到微模塑琼脂糖水凝胶。通常，在单分散INS-1E细胞初始接种55h后，使用装有大孔口滤嘴(VWR，美国)的移液器回收微组织，并用RPMI完全培养基冲洗3次，并在进一步表征之前保持在相同培养基中。在回收后立即分析微组织的每微组织的细胞数、死亡细胞百分比、代谢活性和活/死染色。回收的微组织培养在RPMI完全培养基中，并在GSIS试验之前保持在37℃、5％CO₂的培养箱中2.5小时。

1.4.解离的微组织的细胞计数和台盼蓝排除试验

用台盼蓝排除试验(Life Technologies，美国)表征每微组织的细胞数和微组织的生存力。将包含10个微组织的200μL体积的培养基转移到1.5mL Eppendorf管中。在微组织沉降到Eppendorf管底部后，除去185μL培养基，并用200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Hyclone，美国)冲洗微组织两次。随后，每管加入40μL 0.25％胰蛋白酶-EDTA，并且在室温下孵育10min。然后，将95μL培养基加入管中以灭活胰蛋白酶，并然后通过轻轻移液将微组织解离成单细胞悬浮液。将细胞悬浮液以1:1的体积比用台盼蓝染色，并用COUNTESS^TM II自动细胞计数器(赛默飞世尔科技，IL，美国)计数以确定细胞密度和死细胞百分比。死细胞百分比也计算为死细胞数与悬浮液中细胞数的比率。

1.5.微组织的活/死荧光染色

使用LIVE/DEAD^TM细胞生存力试剂盒(赛默飞世尔，美国)表征完整微组织的生存力。将多个微组织转移到24孔板中。去除多余培养基，并且将微组织用2mL PBS冲洗3次。在向每个孔中加入含有1.6μM钙黄绿素-AM和13μM溴乙啡锭二聚体-1的1mL PBS后，将微组织在37℃下孵育45min。在此孵育期间，通过轻轻移液将微组织搅拌一次以实现均匀染色。将微组织用2mL PBS冲洗三次，并使用共聚焦显微镜(ZEISS LSM 800 with Airyscan，卡尔蔡司，德国)可视化，488nm和543nm的激发波长分别用于活细胞和死细胞的成像。对于约200μm的总厚度，以1μm的切片间隔在不同深度处捕获染色微组织的图像。

1.6.评估微组织的代谢活性

使用WST-1增殖试验(艾博抗(Abcam)，美国)表征微组织的代谢活性。将包含8个微组织的200μL体积的培养基转移到96孔未处理的组织培养板中。在除去130μL培养基后，将150μL体积的含有6.5:1体积比的培养基和WST-1试剂的混合物加入每个孔中。将板在37℃下孵育3h。然后，将110μL上清液转移到另一个96孔板中，并使用酶标仪(microplatereader)(

M5，Molecular Devices，美国)测量450nm处的样品吸光度。

1.7.表征微组织的表面积与体积比

从用倒置相差显微镜(CKX，Olympus，日本)获得的光学图像测量微组织的尺寸。环状、杆状和球状微组织分别近似于相应的圆环、圆柱体和球体的理想形状。环状微组织的体积和表面积分别计算为V_T＝0.25π²×(a+b)×(b-a)²和S_T＝π²×(b²-a²)，其中b是圆环的外半径并且a是内半径。杆状微组织的体积和表面积分别计算为V_R＝πr²L和S_R＝2πr×(r+L)，其中r是圆柱体的半径并且L是长度。球状微组织的体积和表面积分别计算为V_S＝(4/3)π×r³和S_S＝4π×r² r，其中r是球体的半径。

1.8.静态葡萄糖刺激的葡萄糖分泌

将包含8个微组织的200μL体积的培养基转移到96孔板中。在去除130μL培养基后，用250μL无葡萄糖RPMI-1640完全培养基冲洗微组织两次以去除残留的胰岛素。将微组织与无葡萄糖培养基在37℃下预孵育1.5h。在将微组织用Krebs Ringer缓冲液HEPES(KRBH)(135mM NaCl,5mM NaHCO₃,0.5mM NaH₂PO₄,3.6mM KCl,1.5mM CaCl₂,0.5mM MgCl₂和10mMHEPES,pH 7.4.BSA(0.1％))洗涤两次之后，通过将微组织在含有2.8mM和然后16.8mM葡萄糖接着是2.8mM葡萄糖的200μL KRBH中在37℃下进行三次连续孵育、每次孵育1h来评估体外胰岛素分泌。通过在两次孵育之间用不含葡萄糖的KRBH缓冲液冲洗样品两次来去除残留的胰岛素。在每次孵育结束时，取出30μL上清液并储存在-20℃下用于后续分析。胰岛素浓度通过超敏胰岛素ELISA(ALPCO Diagnostics，美国)测量并通过DNA含量标准化，其使用

细胞增殖试验(Invitrogen，美国)进行量化。简而言之，将在第三次与葡萄糖溶液孵育后收集的微组织样品在-80℃下冷冻过夜。解冻后，将每个微组织样品用含有1mM EDTA、180mM NaCl和浓度为1.35Kunitz单位/mL的RNAse A(Invitrogen，美国)的120μL细胞裂解缓冲液在室温下处理2小时。随后将

GR染料加入到RNA酶消化的样品中，并使用酶标仪(

M5,Molecular Devices，美国)参照标准DNA校准曲线测量所得荧光信号(激发480nm，发射520nm)以确定DNA浓度。

1.9.将微组织封装在藻酸盐水凝胶中

如图1B所示，根据公开的方案使用静电液滴发生器产生含有微组织的藻酸盐微胶囊[Dang,T.T.et al.,Biomaterials 34(23):5792-5801(2013)；Veiseh,O.et al.,NatMater 14(6):643-651(2015)]。将藻酸钠(PRONOVA UP LVG，FMC Biopolymer，挪威)以1.5％(w/v)溶解在0.9wt％NaCl溶液中。微组织以约340-500个微组织/mL的密度均匀悬浮在500μL藻酸钠溶液中，并装入1mL注射器中。将含有微组织的藻酸盐悬浮液通过液滴发生器的20G钝针(SAI Infusion Technologies，美国)以0.2mL/min的流速和5.0-6.0kV范围内的电压挤出到20mM BaCl₂溶液浴中。使藻酸盐微胶囊交联2min，然后用不含葡萄糖的KRBH缓冲液冲洗三次。所产生的藻酸盐水凝胶微胶囊的直径在800-1000μm的范围内。所有封装的微组织的图像由三名研究人员独立检查，以确定受损微组织的平均数量，用于量化封装后微组织破损的比例。将每种几何形状的十个封装的完整微组织和十个裸露的微组织在96孔板中的单独孔中的RPMI完全培养基中单独培养。含有裸露的微组织的孔预先涂覆有2.3wt％琼脂糖，其在加入微组织之前在孔底部固化形成水凝胶层。在不同时间点获取这些单个微组织的光学图像，以监测和比较其结构外观的任何变化。

1.10.统计分析

所有值均表示为平均值±平均值的标准误差。死细胞百分比、每微组织的代谢活性、微组织的体积和SA/Vol比的统计显著性使用具有Tukey事后检验软件的单向方差分析确定。使用单向重复测量方差分析和Tukey事后检验比较暴露于2.8mM和16.8mM葡萄糖溶液后的分泌的胰岛素水平。小于0.05的P值被认为是显著的。

实施例2

在水凝胶微模具上形成胰岛样环状微组织

如图1A的示意图所示，使用微模塑非粘性琼脂糖水凝胶制造具有受控几何形状的微组织。琼脂糖水凝胶因其细胞相容性、非粘性和在室温下易于物理交联而已被用于生产三维(3D)多细胞聚集体[Napolitano,A.P.et al.,Biotechniques 43(4):494-500(2007)]。在本实施例中，使琼脂糖溶液(2.3％w/w)与包含具有期望几何形状的特征阵列的高压灭菌有机硅模板接触，并在室温下固化以形成微模塑琼脂糖水凝胶。取出后，琼脂糖水凝胶包含其相应的有机硅模板上几何图案的精确负复制。先前的研究报告称，分散的大鼠肝癌、人成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞能够在微模塑非粘性琼脂糖水凝胶上聚集成多细胞微组织[Dean,D.M.et al.,FASEB J21(14):4005-4012(2007)；Napolitano,A.P.et al.,Tissue Eng 13(8):2087-2094(2007)]。在该研究中，大鼠胰岛素瘤INS-1E细胞系由于其能够响应不同的生理葡萄糖浓度而分泌胰岛素[Merglen,A.et al.,Endocrinology 145(2):667-678(2004)]，因此被选择用于模拟构成天然胰岛中主要细胞类型的β细胞。将单分散的INS-1E细胞的悬浮液接种到微模塑琼脂糖水凝胶的凹槽中，其中这些细胞因重力而下沉。琼脂糖水凝胶的非粘性表面防止接种细胞附着在凹槽底部，促进单分散细胞之间的相互作用，这些细胞聚集在琼脂糖模具的凹槽中以形成期望几何形状的3D结构[Berridge,M.Tan,A.Protoplasma,205:74-82(1998)；Saelens,X.et al.,Oncogene,23:2861-2874(2004)]。INS-1E细胞的这种自组装可能受细胞外钙离子和E-钙黏蛋白二者的调节，这两种物质被报道为在调节细胞间相互作用以维持初级胰岛结构中发挥重要作用[Dahl,U.et al.,Development 122(9):2895-2902(1996)；Rouiller,D.G.et al.,Dev Biol 148(1):233-242(1991)]。在细胞聚集过程中，微组织收缩形成致密的结构，通过移液将其轻轻从琼脂糖模具的凹槽中移出，并随后转移到新鲜的培养基中。

实施例3

初始细胞接种密度对微组织尺寸和生存力的影响

发明人评估了制造具有不同几何形状的INS-1E胰岛样微组织的可行性以及通过改变初始细胞接种密度来调整微组织尺寸的能力。图2A(i-iv)、B(i-iv)和C(i-iv)中的光学图像示出了微模塑琼脂糖水凝胶中具有环状、杆状和球状几何形状的微组织的形成，如通过凹槽的形状指示的。图2A(v-viii)、B(v-viii)、C(v-viii)是这些微组织通过移液从琼脂糖水凝胶中回收后的明场图像。回收之前和之后微组织的相似形态证实了大多数微组织的结构完整性并未因此过程而降低。

之前有报道称，细胞生存力随着人胰岛尺寸的增加而降低[Komatsu,H.et al.,PloS one 12(8):e0183780(2017)]。为了定量探索初始接种密度与微组织尺寸之间的关系，将细胞以3至10×10⁶个细胞/ml的多种接种密度接种到琼脂糖水凝胶中。在从微模塑琼脂糖水凝胶中回收后，立即通过与胰蛋白酶孵育将微组织酶促分散成单细胞悬浮液，然后轻轻移液并用台盼蓝染色。微组织被酶促分散成单细胞，并通过台盼蓝排除试验进行表征，以量化死细胞的百分比。随后使用自动化细胞来确定每个微组织中的细胞数量。死细胞的百分比也计算为死细胞数与悬浮液中细胞总数的比率。对于每种几何形状，每微组织的细胞数随着初始细胞接种密度而增加(图2D、E、F)，证明我们能够仅通过改变初始接种密度来控制微组织尺寸。此外，微组织中死细胞的百分比随着每微组织的细胞数而增加(图2D、E、F)。该定量结果与光学图像一致，后者在视觉上表明对于每种几何形状，微组织中心处包含死细胞的暗区也随着初始细胞接种密度而增加(图2A、B、C)。这一发现与已公开的研究一致，这些研究报告了细胞生存力随着人胰岛[Livoti,C.M.Morgan,J.R.Tissue Eng PartA,16:2051-2061(2010)]和肝细胞球体[Henquin,J.C.Diabetes,49:1751-1760(2000)]的尺寸的增加而降低。计算刺激模型[Komatsu,H.et al.,PloS one 12(8):e0183780(2017)]和最近的体外研究[Sigmundsson,K.et al.,Matrix Biol 70:5-19(2018)]二者都表明，在人和小鼠胰岛中产生的缺氧是由于低氧张力导致在这些胰岛核心处形成死细胞所涉及的主要因素。此外，在我们的实验中，对于约13％的类似细胞死亡百分比，环状、杆状和球状微组织的每微组织的细胞数量分别为约14000、7500和5500(图2G)。该结果表明，为了实现类似的细胞生存力，环状几何形状比杆状和球状几何形状更有效地支持细胞填充成单个微组织。

实施例4

微组织几何形状对细胞生存力的影响

通过表征具有环状、杆状和球状形状的微组织的代谢活性，进一步评估了微组织几何形状对细胞生存力的影响。首先将每微组织的细胞数标准化，同时改变微组织几何形状。对于每种几何形状(图2和图8)，初始细胞接种密度和每微组织的细胞数之间的关系被用来估计用于该体积标准化的初始细胞接种密度。我们分别使用350、580和930万个细胞/ml的初始细胞接种密度制造了具有相似的每微组织细胞数的环状、杆状和球状微组织。微组织在胰蛋白酶消化之后分散成单细胞悬浮液，用台盼蓝染色并通过自动细胞计数器计数。图3A中的结果证实，所有3种几何形状的平均每微组织的细胞数为约12000。环状微组织的平均死细胞百分比最低(11％)，并且球状微组织的最高(29％)(图3B)。这与光学图像(图3C-E)一致，其显示环状微组织核心处的暗区最小，并且球状几何形状的最大。除了表征活细胞和死细胞的相对百分比外，监测活细胞的代谢健康对于了解微组织几何形状的影响也很重要。在平行实验中，WST-1试剂用于表征完整微组织的活细胞的代谢活性。四唑盐WST-1可主要在活细胞的外表面裂解以形成水溶性甲臜，其浓度可通过比色法测定[BerridgeM.and Tan,A.Protoplasma 205(1-4):74-82(1998)]。图3F表明环状微组织具有比杆状和球状微组织高得多的代谢活性。图3F表明环状微组织具有比杆状和球状微组织的代谢活性高得多的代谢活性。有趣的是，虽然球状微组织的死细胞百分比高于杆状微组织的死细胞百分比(图3B)，但杆状微组织的代谢活性与球状微组织的代谢活性相同(图3F)。总体而言，这些结果(图3B-F)表明，环状形状对于保持胰岛样微组织的生存力和代谢活性来说是更好的几何形状。

为了探索微组织几何形状与SA/Vol之间的关系，将环状、杆状和球状微组织分别近似为是圆环、圆柱和球体的理想几何形状。使用这些理想形状的数学公式和从光学图像测量的微组织尺寸估计微组织的体积(图9)。图3G表明，对于相同的标准化体积，与球状微组织相比，环状和杆状微组织具有显著更高的SA/Vol。这与环状和杆状微组织的死细胞百分比均低于球状微组织的死细胞百分比的结果一致(图3B)。

为了使微组织的生存力进一步可视化，发明人进行了荧光染色试验，然后进行了共聚焦显微镜检查，以使微组织中活细胞和死细胞的3D分布可视化。在该试验中，活细胞被非荧光细胞可渗透性钙黄绿素-AM染色，其被细胞内酯酶切割以产生绿色荧光。同时，死细胞被溴乙啡锭二聚体-1染色，其渗透受损的细胞膜以与DNA结合并产生红色荧光。图4A-C是染色微组织的明场图像，而图4D-L示出了在同一微组织的不同深度处捕获的多个图像的组合投影。绿色通道图像(图4D、E、F)证实了所有三种类型的微组织表面上的大多数细胞都是活的。然而，红色通道图像(图4G、H、I)揭示了三种几何形状的微组织内部中死细胞分布的有趣差异。环状微组织只有零星地散布在整个微组织中的很少死细胞。相反，在与白色箭头所指的相同微组织的明场图像(图4B)中的暗核相同的位置处，在杆状微组织内部检测到更多死细胞(图4H)。此外，明场图像(图4A、B)还显示，在活/死试验过程中经过几次染色和冲洗步骤后，环状和杆状微组织保留了其原始外观和结构完整性。相比之下，在多个染色的球状微组织中的每个的中心处观察到如图4C中的白色箭头所指的浅灰色圆形区域，而不是未染色球体的由死细胞构成的暗中央核心(图3E)。这一特征表明，这些球状微组织核心处的死细胞在染色和冲洗过程中已经脱落，从而允许更多的光穿透微组织的核心。来自核心的细胞碎片可能通过存在于球状微组织的表面上的小孔排出(图9)。一小部分死细胞仍然与外部活细胞区域相邻，形成围绕中央浅灰色区域的圆形黑色边缘(图4C)。一些球状微组织的核心的这种死细胞损失也使得这些微组织中心处的红色荧光信号降低(图4I)，导致与杆状微组织的红色荧光信号相当的红色荧光信号，后者在染色和冲洗步骤期间没有死细胞损失。对于在通过胰蛋白酶消化和细胞计数定量死细胞百分比之前未进行任何荧光染料或冲洗过程的未染色的球状微组织(图3E)，未发生死细胞从核心的损失(图3B).因此，与杆状微组织相比，球状微组织的核心处的死细胞仍然导致更高的死细胞百分比，如图3B所报告的。总体而言，与环状和杆状结构相比，球状微组织的机械性能较弱，这与这些球体中死细胞的百分比较高有关。

实施例5

微组织几何形状对胰岛素分泌的影响

来自治疗性细胞移植的生理上适当的胰岛素分泌对于维持葡萄糖稳态很重要，因为过度分泌导致低血糖，而分泌不足导致高血糖[Henquin,J.C.Diabetes 49(11):1751-1760(2000)]。发明人进行了葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)试验以研究微组织几何形状对来自INS-1E微组织的胰岛素分泌的影响。微组织在2.8mM、16.8mM和2.8mM的葡萄糖水平下进行三次连续孵育，以分别模拟糖尿病患者交替暴露于生理基础条件、高血糖条件和恢复到基础条件。结果表明，对于每种几何形状，与第一次暴露于较低葡萄糖水平期间的胰岛素分泌相比，在第二次孵育期间响应于较高葡萄糖水平而分泌更大量的胰岛素(图5)。在较低葡萄糖水平下的第三次孵育显示在先前较高葡萄糖水平下刺激之后恢复到了基础胰岛素水平，证实在高葡萄糖水平下的第二次孵育期间胰岛素分泌增加不是由于来自受损β细胞的胰岛素倾泻。从低葡萄糖浓度变为高葡萄糖浓度导致胰岛素分泌增加3.1至7.7倍，与之前的研究结果相当，该研究报告了INS-1E球体簇的葡萄糖刺激指数为6.6倍[Merglen,A.et al.,Endocrinology 145(2):667-678(2004)]。

实施例6

封装在藻酸盐微胶囊中的环状微组织的增强的结构完整性

发明人还研究了形成封装胰岛样微组织的无缺陷藻酸盐微胶囊的可行性，并评估了这些微组织的结构完整性是否会因该封装过程而受到损害。在该实验中，将藻酸盐和微组织的混合物通过静电液滴发生器的20G针挤出到Ba²⁺离子的溶液中，其中含有微组织的藻酸盐液滴交联形成水凝胶微胶囊。图6A-F表明所有三种几何形状的微组织都可以封装在均匀的球状藻酸盐微胶囊中，这些微胶囊是光学透明的并且没有明显的表面变形或可见的不规则性，如蓝色箭头所指示的。此外，尽管其非球状几何形状，但环状(图6A和D)和杆状(图6B和E)微组织不会导致藻酸盐微胶囊具有不希望的不规则性，诸如尾部或变形的水凝胶表面，否则可能会导致体内移植后增加的免疫细胞募集和随后的纤维化宿主反应[de Groot,M.et al.,J Surg Res 121(1):141-150(2004)]。对于所有三种几何形状，封装的微组织被藻酸盐水凝胶膜覆盖而没有任何可见的不规则组织突起(图6A-F)，为封装的微组织提供了足够的免疫保护[Ma,M.et al.,Adv Healthc Mater 2(5):667-672(2013)；Chang,T.M.NatRev Drug Discov 4(3):221-235(2005)]。有趣的是，一小部分封装的杆状和球状微组织被破坏，微组织破损率分别为～5.5％和～20.6％(图7)。相比之下，藻酸盐微胶囊中的所有环状微组织仍保留其封装前的结构外观，破损率为～0％(图7)。

发明人还监测了相比于在从微模塑琼脂糖水凝胶回收微组织并封装在藻酸盐微胶囊中后培养3天的封装的环状微组织，未封装的、裸露的环状微组织的外观。将回收的裸露微组织在涂覆于组织培养板底部上的一层平的固化琼脂糖上面培养，以防止其粘附在板的经处理的聚苯乙烯表面上。图8A示出了代表性裸露的环状微组织和封装的环状微组织在不同时间点的光学图像，而图8B总结了这些环状微组织的内径的相应变化的定量分析。一天后，裸露的环状微组织的中央腔(图8A(i))迅速闭合(图8A(ii)和图8B)；并且这些微组织的初始环状几何形状变为球体形状，其从第2天开始形成死细胞的中央核心(图8A(iii-iv))。相比之下，封装在藻酸盐水凝胶中的环状微组织保留其中央腔直至第3天(图8A(v-viii))，尽管腔直径略有减小(图8B)。图8中的数据表明，封装在交联的藻酸盐水凝胶中有助于保持微组织的环状几何形状。

总体而言，这项研究表明，由胰岛素瘤INS-1E细胞系制成的环状微组织表现出增强的生存力，这将导致每个接受者的血糖校正所需的微组织数量减少。这导致移植的胰岛组织的利用效率提高，以潜在地补偿胰岛分散过程中细胞质量的损失。此外，移植较少的微组织也减少了封装的水凝胶微胶囊的数量，并从而减少了移植体积。此外，环状微组织中较低百分比的死细胞也最大限度地减少了细胞碎片的形成，否则会在移植后引发宿主免疫反应。因此，将胰岛解离成单细胞并将它们重组装成更可行的微组织的优势可能超过分散过程中胰岛质量损失的劣势。已采用类似的原理来支持将整个胰腺解离为单个胰岛以实现血糖校正的临床前成功，虽然存在一些胰岛质量损失[Ballinger W.F.and Lacy,P.E.Surgery 72(2)(1972)175-186].。

可以通过使用自动机器人液体处理系统进行细胞传代和接种来实现扩大制造过程以大规模生产用于临床应用的环状微组织。最近的研究已表明，通过两个中央机器人臂互相连接的培养箱、液体处理系统、离心机和显微镜可用于处理诱导多能干细胞[Paull,D.et al.,Nat Methods 12(9):885-892(2015)；Conway,M.K.et al.,J Vis Exp(99):e52755(2015)]。细胞接种和微组织回收可以通过类似的机器人平台自动化，以使人工干预最小化以实现环状微组织的高通量制造。

实施例7

制造具有含有微组织的华夫饼样结构的宏装置

本发明的平面水凝胶基宏装置具有华夫饼样结构(图12)，其由用于包埋治疗性微组织的微孔阵列和包含血管内皮细胞的侧壁的互连网络组成。利用光刻微细加工技术设计侧壁网络，其引导有组织的血管网络的形成。通常，使用图12中所示的程序来制造该装置。首先，将甲基丙烯酰化明胶(GelMA)图案化以形成散布着限定尺寸的正方形或圆形微孔的华夫饼启发的水凝胶网络。简而言之，将含有I2959光引发剂(0.5％w/v)的45μL体积的GelMA预聚物溶液移液到培养皿盖表面上的两个垫片之间，每个垫片由两个堆叠的盖玻片组成。为了将血管诱导细胞引入宏装置的GelMA网络中，可以将人脐带血管内皮细胞(HUVEC)与GelMA预聚物混合，然后将该混合物分配到培养皿上。然后，将载玻片(22mm x50mm)轻轻放置在垫片之间的GelMA溶液上。300μm厚的垫片控制着受限制的GelMA预聚物膜的高度。随后，将具有指定尺寸和几何形状的透明特征或孔阵列的光掩模放置在载玻片的顶部。在暴露于紫外线(360-480nm；7.9mW cm^-2)19秒后，GelMA膜的UV暴露的部分交联以形成侧壁的微图案网络。然后，将具有UV交联的GelMA图案的载玻片用缓冲溶液冲洗以去除未暴露于UV光的未交联GelMA残留物，留下微孔。通过改变光掩模的设计，可以制造具有正方形或圆形微孔的对齐阵列的多种微图案，如图13所示。

为了将治疗性微组织封装到该装置中，将微组织和藻酸盐的混合物分配到UV交联的GelMA微图案上。例如，使用微模塑非粘性琼脂糖水凝胶非原位制造由INS-1E细胞组成的微组织(如实施例2所述)。在微组织接种后，将20mM BaCl₂溶液添加到藻酸盐-微组织层的顶部，使藻酸盐交联10分钟。藻酸盐凝胶化后，用手术刀片将整个宏装置(1cm×1cm)从载玻片上轻轻分离。

替代地，为了诱导单分散细胞原位聚集成微组织(图14)，将80μL具有期望密度的单分散INS-1E细胞悬浮液分配到UV交联的GelMA微图案上。将均匀分布在GelMA微图案的微孔中的接种细胞在37℃和5％CO₂气氛中孵育4小时。接下来，添加过量培养基并将样品再孵育20小时，直到细胞根据所选的GelMA微图案聚集成球状或环状微组织。例如，通过在每个微孔中设计栓样结构(图14)，可以在最终装置的每个微孔中组装环状微组织。随后，去除培养基并将藻酸盐溶液添加到含有微组织的GelMA微图案上，并与氯化钡溶液交联以形成免疫隔离水凝胶层。

实施例8

通过华夫饼样宏装置实现微组织的有效且均匀的空间分布

评估了具有不同GelMA网络设计的六个宏装置在有效包埋和均匀分布微组织方面的性能(图15A)。在接种和封装微组织后，所有宏装置都保持其结构完整性(图15A)。封装到每个装置中的微组织数量从封装后获得的光学图像中人工计数，并确定一致为每装置约730个(图15B)。量化并比较两个参数以选择具有最佳性能的装置设计。首先，微组织驻留率，定义为微孔中包埋的微组织与整个装置中封装的微组织总数的比率。较高的驻留率表明微组织更有效地包埋在微孔内，因为较少微组织留在GelMA侧壁上。从图15C可见，与其他装置设计相比，S-400、S-300和C-400宏装置具有分别为91％、89％和76％的显著更高的微组织驻留率。

其次，微组织分布率，定义为类型Mn的所有微孔中微组织的组合数与整个装置中封装的微组织总数的比率，其中n是每微孔的微组织数量。每微孔仅包埋一个微组织是最佳的，以避免多个微组织聚集，并允许通过周围血管化网络灌注单个微组织。因此，M1微孔的更高分布比表明了更均匀的微组织分布。在具有最高驻留率的三种装置设计中，如图15D所示，S-300宏装置对于M1微孔具有显著更高的微组织分布比，表明S-300设计实现了最均匀的微组织分布。

最佳装置S-300很容易从载玻片上分离，而没有结构上的损坏，如图16A所示。与没有任何微图案设计的对照装置中微组织的随机聚集相比，这种S-300装置实现了更均匀的微组织空间分布，结块更少(图16B)。

实施例9

华夫饼样宏装置中封装的治疗性微组织的生存力和功能性能

通过荧光活/死染色评估华夫饼样宏装置中封装的微组织的生存力。图17A表明大多数微组织被染成绿色(右下图中的浅灰色细胞)，表明它们在我们的S-300装置中封装后具有生存力。共焦图像堆栈的水平和垂直投影二者验证了微组织在规则阵列中的均匀排列，相邻微组织之间具有相等间距。随后，通过将含有微组织的宏装置在含有2.8mM并然后16.8mM葡萄糖随后是2.8mM葡萄糖的KRBH中于37℃下连续孵育三次、每次孵育2小时来进行静态葡萄糖刺激的胰岛素分泌测试，并且通过胰岛素ELISA试验对分泌的胰岛素量进行量化以评估其葡萄糖反应性。S-300装置中封装的微组织表现出在第二次孵育中用高葡萄糖浓度刺激后胰岛素分泌增加5倍，并且能够在低葡萄糖浓度下的第三次孵育期间恢复基础胰岛素分泌(图17B)。该胰岛素分泌数据证实，我们的华夫饼启发的宏装置设计可以支持封装微组织的关键治疗功能。

实施例10

华夫饼样宏装置中具有空间控制的图案的装置内脉管系统的形成

我们的S-300装置能够支持形成空间控制的血管网络。引入微图案化GelMA网络的人血管内皮细胞(HUVEC)在培养7天后表现出良好的生存力(图18A)，证实使用光引发剂和短的UV暴露时间不会显著影响细胞生存力。还通过CD31的免疫荧光染色检查了HUVEC，CD31是构成内皮细胞细胞间连接的血小板内皮细胞粘附分子1(PECAM-1)，并且通常位于面向腔的表面血管[Albelda,SM.et al.,The Journal of cell biology.；114(5):1059-1068(1991)；DeLisser,HM.et al.,Am J Pathol.151(3):671-677(1997)]。CD31的阳性染色(图18B)证明了我们的S-300装置中引入的HUVEC的血管诱导潜力。

实施例11

华夫饼样宏装置中共装载的治疗性微组织和血管诱导细胞的生存力和功能

当血管诱导性HUVEC和治疗性胰岛素分泌微组织二者引入S-300装置中时，两种细胞类型保持了期望的生存力，如在将装载微组织的装置置于培养物中过夜后通过活/死荧光试验(图18C)证实的。图18D中GSIS试验的结果表明，与2.8mM葡萄糖溶液中的分泌水平相比，当装载微组织的装置暴露于16.8mM葡萄糖溶液时，胰岛素分泌增加了6倍。在葡萄糖刺激后的第三次孵育期间，封装微组织的胰岛素分泌也能够恢复到基础水平。观察到的葡萄糖刺激指数是未封装的INS-1E球体所特有的，并且与实施例9中没有HUVEC的装置的指数相似，证实封装的微组织当在华夫饼样宏装置中与血管诱导细胞同时存在时能够维持其治疗功能。

实施例12

在华夫饼样宏装置中诱导单分散细胞的组装以原位形成空间分布的微组织

虽然S-300宏装置能够实现约89％的高微组织驻留率，但在制造过程中分配到装置上的所有微组织中有约11％的一部分最终位于GelMA侧壁上。为了使驻留率最大化并确保每个微孔包含一个微组织，本发明人采用了一种替代方法来在单个微孔中诱导单分散细胞的组装以原位形成微组织。将单分散细胞的悬浮液(而不是微组织)分配到微图案GelMA网络上，并且单个细胞很容易掉入微孔的凹陷中或迁移到微孔中。在自组装约24小时之后，在每个微孔中形成多细胞簇，没有簇落在微孔外落到GelMA侧壁上(图19)。通过这种方法，M1微孔的最终微组织驻留率和微组织分布率均达到了几乎100％的理论极限。当微图案被重新设计以在每个微孔的中央包含栓时，单分散细胞在栓周围自组装以在每个孔中形成环状微组织，如图20所示。这些结果证明了华夫饼启发的宏装置设计促进单分散细胞原位组装以形成具有期望几何形状的微组织的多功能性。

与现有方法相比，我们的发明的一个优点是能够改善封装的微组织的空间分布，同时提供内皮细胞以促进灌注个体微组织的互连网络中的血管化。封装在我们装置中的微组织的均匀分布防止了它们结块，从而可能促进营养物质和氧气运输并提高细胞存活率[Bochenek,MA.et al.,Nature Biomedical Engineering.2(11):810(2018)；O'sullivan,ES.et al.,Endocrine reviews.32(6):827-844(2011)]。将治疗性微组织封装在藻酸盐水凝胶中还降低了过度突出的风险，否则可能会引发严重的炎症反应然后是植入装置的纤维化和随后的组织死亡[De Vos,P.et al.,Transplantation.62(7):893-899(1996)；Bhujbal,SV.et al.,Scientific reports.4:6856(2014)]。

实施例13

促进环状微组织的原位形成的华夫饼样宏装置的优化设计参数

为了促进包含多个正方形微孔且每个正方形微孔的中央具有圆柱形栓的华夫饼启发的宏装置中的微组织形成，关键设计参数包括微孔宽度尺寸和栓直径(图21)。研究了50μm至150μm之间的栓直径和400μm至600μm之间的微孔侧宽尺寸的多种组合。

发明人观察到在具有孔宽度尺寸或直径为600μm并且栓宽度或直径为150μm的宏装置中可以形成具有最均匀、完整的环状几何形状和良好的生存力的微组织(图22)。相比之下，50μm的小栓直径导致接种细胞沉降在栓的上表面上，并导致形成没有中央腔的盘形微组织，而不是期望的环形。

实施例14

保持华夫饼样宏装置中环状微组织的生存力的最佳初始细胞负载

将不同数量的细胞接种到相同的微图案GelMA水凝胶网络(1cm x 1cm)中，该网络包含多个微孔，每个微孔的侧宽尺寸为500μm，并且栓直径为150μm。研究了在30至130万个细胞每cm²范围内的接种到每个微图案GelMA水凝胶中的初始细胞负载或初始活细胞数量(图23)。细胞接种后24小时，在去除培养基后，用手术刀片将含有微组织的GelMA水凝胶从载玻片上轻轻分离。分离的GelMA水凝胶和相关的微组织被胰蛋白酶消化以释放单分散的细胞，用于通过台盼蓝染色对回收的细胞数量进行定量和生存力评估。

发明人发现，对于所有初始细胞负载数量，细胞生存力都可保持在超过90％(图24A)。细胞使用收率或效率，计算为回收的活细胞与初始细胞接种数的比率，其在30至70万的初始接种密度下是最佳的(图24B)，因为在装置边缘形成细胞片最少。当初始接种每cm²90至130万个细胞时，由于在宏装置边缘形成细胞片，过多的细胞负载导致细胞从装置中损失(图24A)。

实施例15

来自封装环状微组织的华夫饼样宏装置的静态葡萄糖刺激的胰岛素分泌试验

进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)试验以评价原位组装并封装在华夫饼样宏装置中的环状微组织的功能(如实施例7中所述)。在去除所有培养基之后，将含有环状微组织的华夫饼样宏装置用不含葡萄糖的培养基冲洗两次以去除残留的胰岛素。将该装置与含有2.8mM葡萄糖的Krebs Ringer缓冲液HEPES(KRBH)(135mM NaCl,5mM NaHCO₃,0.5mMNaH₂PO₄,3.6mM KCl,1.5mM CaCl₂,0.5mM MgCl₂和10mM HEPES,pH 7.4.BSA(0.1％))在37℃下预孵育2小时。然后，通过将含有微组织的宏装置在含有2.8mM、16.8mM和2.8mM葡萄糖中在37℃下连续孵育2小时来评估体外胰岛素分泌，以分别模拟糖尿病患者中交替暴露于生理基础条件、高血糖条件和恢复到基础条件。在每次孵育后，通过在连续孵育之间用不含葡萄糖的KRBH缓冲液冲洗样品两次来去除残留的胰岛素。在每次孵育结束时，取出100μL上清液并储存在-20℃下用于后续分析。胰岛素浓度通过超敏胰岛素ELISA(ALPCODiagnostics，美国)测量。

结果表明，与在较低葡萄糖浓度下的第一次和第三次孵育期间的胰岛素分泌相比，在高葡萄糖浓度下的第二次孵育期间分泌的胰岛素平均量更高(图25)。该结果表明，在宏装置中组装和封装的环状微组织保留了对体外葡萄糖浓度作出反应的能力，显示在葡萄糖刺激后胰岛素分泌增加了4.3倍。

实施例16

通过华夫饼样宏装置的互锁模块化组分实现机械和结构稳定性

宏装置可以制成具有很强的机械性能，以承受镊子的操作。观察到华夫饼布置的最小变形(图26A-B)。如(图27)所示，“锁”组分由互连的微图案GelMA水凝胶网络组成，其用作分隔均匀间隔微孔的隔离侧壁。“钥”组分由封装在免疫隔离藻酸盐水凝胶中的治疗性微组织组成，其配合在锁组分的微孔中。我们的华夫饼启发的装置的互锁设计最大限度地降低了两种组分分离的风险(图31B)，以确保锁组分中的血管诱导细胞与钥组分中的封装的治疗性微组织接近。

实施例17

在皮下移植到糖尿病小鼠中之后环状负载宏装置的机械和结构稳定性

根据已知方法[Dang,T.T et al.,Biomaterials 34(23):5792-5801(2013)]，由健康小鼠通过每天多次低剂量注射链脲佐菌素(STZ)以诱导对其胰腺β细胞的损伤而产生糖尿病C57BL/6J小鼠(图28)。将含有从胰岛素瘤(INS1E)细胞原位组装的微组织的华夫饼样宏装置皮下移植到这些糖尿病小鼠体内，以评估嵌入宏装置中的细胞是否可以分泌胰岛素来纠正血糖水平。观察到宏装置可以移植到小鼠体内并在9天后回收而不会降低其机械性能或微组织的融合(图29)。

实施例18

华夫饼样宏装置中组装和封装的环状微组织对糖尿病小鼠血糖水平的影响

使用实施例17中的方法，发明人建立了化学诱导的糖尿病小鼠模型，以评估华夫饼样宏装置中组装和封装的INS-1E环状微组织的治疗功能。将这些如实施例7中所述制造的含有微组织的华夫饼样宏装置皮下移植到糖尿病C57/B6小鼠的背侧以建立边缘/最小细胞团模型，这对应于在50％的小鼠中纠正血糖水平所需的最小细胞量。

结果表明，每华夫饼样宏装置100至200万个INS-1E细胞的初始细胞接种数就足以在1天后降低糖尿病小鼠的血糖水平(图30)。与Coronel,MM.et al.,Biomaterials 210:1-11(2019)的方法相比这是优越的，前者需要每小鼠250万个MIN6细胞以在使用盘形宏装置移植后17天将血糖降低至低于300mg/dL。

实施例19

藻酸盐微胶囊中封装的环状微组织对糖尿病小鼠血糖水平的影响

将如实施例1中所述制造并封装在藻酸盐微胶囊中的200个环状微组织的边缘细胞团(约240万个INS-1E细胞)移植到如实施例17所述建立的每只糖尿病小鼠的腹腔内空间。结果显示仅在移植后1天，环状微组织即可将糖尿病小鼠的血糖水平降低至低于300mg/dL(图31)。

实施例20

制作封装原代大鼠胰岛微组织的华夫饼样宏装置

根据已知方法，通过胶原酶消化和用Ficoll梯度纯化从Sprague-Dawley大鼠中分离原代大鼠胰岛[O’Sullivan,E.et al.,Diabetologia 53(5):937-945](2010)]。将这些原代大鼠胰岛与藻酸盐混合，并且将藻酸盐-胰岛混合物分配在微图案GelMA水凝胶网络上。GelMA水凝胶网络的微孔阵列通过对于大多数胰岛来说每微孔包埋每个胰岛从而促进了治疗性微组织的均匀分布(图32A)。含有胰岛的华夫饼样宏装置进一步用外部藻酸盐水凝胶层涂覆，然后在氯化钡溶液中交联。在通过手术刀片将其从载玻片分离后，宏装置保持了胰岛的均匀分布(图32B)。

总结

我们证明了微组织的几何形状在微组织生存力中起着重要作用。与杆状和球状微组织相比，环状微组织表现出增强的细胞生存力和代谢活性。此外，这种微组织几何形状不会影响INS-1E细胞系的胰岛素分泌。另外，环状微组织在封装在免疫隔离水凝胶中后保留了其完整的结构，并在腹腔内植入STZ诱导的糖尿病小鼠时降低了血糖水平。

此外，所公开的华夫饼形混合水凝胶宏装置具有许多优点，包括(1)改善微组织的空间分布，(2)支持封装在华夫饼启发的互连网络中的人源性内皮细胞的血管化，(3)由互锁组分组成，使血管诱导网络和具有治疗性微组织的免疫隔离水凝胶组分能够稳定和接近，以及(4)诱导单分散细胞原位聚集成具有期望几何形状的均匀分布的微组织。我们表明，包含微孔阵列(每个微孔含有单个胰岛环状)以及含有血管内皮细胞的侧壁的互连网络的平面生物相容性水凝胶基宏装置当腹腔内植入STZ诱导的糖尿病小鼠时降低了血糖水平。

参考文献

本说明书中表面在先公开的文件的任何列表或讨论不应被视为承认此类文件是现有技术的一部分或是公知常识。

Albelda SM,Muller WA,Buck CA,Newman PJ.Molecular and cellularproperties of PECAM-1(endoCAM/CD31):a novel vascular cell-cell adhesionmolecule.The Journal of cell biology.Sep 1991；114(5):1059-1068.

Avgoustiniatos ES,Colton CK.Effect of External Oxygen Mass TransferResistances on Viability of Immunoisolated Tissue a.Annals of the New YorkAcademy of Sciences.1997；831(1Bioartificial Organs:Science,Medicine,andTechnology):145-166.

Ballinger,WF.Lacy,PE.Transplantation of intact pancreatic islets inrats.Surgery 72(2):(1972)175-186.

Baranski JD,Chaturvedi RR,Stevens KR,et al.Geometric control ofvascular networks to enhance engineered tissue integration andfunction.Proceedings of the National Academy of Sciences.2013；110(19):7586-7591.

Barkai,U.Weir,GC.et al.,Enhanced oxygen supply improves isletviability in a new bioartificial pancreas.Cell Transplant 22(8):(2013)1463-1476.

Berridge,M.Tan,A.Trans-plasma membrane electron transport:a cellularassay for NADH-and NADPH-oxidase based on extracellular,superoxide-mediatedreduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1.Protoplasma 205(1-4):(1998)74-82.

Bertuzzi,F.Marzorati,S.et al.,Tissue factor and CCL2/monocytechemoattractant protein-1 released by human islets affect islet engraftmentin type 1 diabetic recipients.J Clin Endocrinol Metab 89(11):(2004)5724-5728.

Bhujbal SV,De Haan B,et al.,A novel multilayer immunoisolatingencapsulation system overcoming protrusion of cells.Scientific reports.2014；4:6856.

Bochenek MA,Veiseh O,et al.Alginate encapsulation as long-term immuneprotection of allogeneic pancreatic islet cells transplanted into the omentalbursa of macaques.Nature Biomedical Engineering.2018；2(11):810.

Boettler T,Schneider D,Cheng Y,et al.Pancreatic Tissue Transplantedin TheraCyte Encapsulation Devices Is Protected and Prevents Hyperglycemia ina Mouse Model of Immune-Mediated Diabetes.Cell Transplant.2016；25(3):609-614.

Bosco,D.Orci,L.Meda,P.Homologous but not heterologous contactincreases the insulin secretion of individual pancreatic B-cells.Exp Cell Res184(1):(1989)72-80.

Bruni A,Gala-Lopez B,et al.,Islet cell transplantation for thetreatment of type 1 diabetes:recent advances and future challenges.Diabetes,metabolic syndrome and obesity:targets and therapy.2014；7:211.

Chang,TM.Therapeutic applications of polymeric artificial cells.NatRev Drug Discov 4(3):(2005)221-235.

Chen X,Aledia AS,Ghajar CM,et al.Prevascularization of a fibrin-basedtissue construct accelerates the formation of functional anastomosis withhost vasculature.Tissue Engineering Part A.2008；15(6):1363-1371.

Colton CK.Oxygen supply to encapsulated therapeutic cells.Advanceddrug delivery reviews.2014；67:93-110.

Conway,MK.Gerger,MJ.Balay,EE.et al.,Scalable 96-well plate based iPSCculture and production using a robotic liquid handling system.J Vis Exp(99):e52755(2015).

Coronel,MM.et al.,Oxygen generating biomaterial improves the functionand efficacy of beta cells within a macroencapsulation device Biomaterials210:(2019)1-11.

Dahl,U.Sjodin,A.Semb,H.Cadherins regulate aggregation of pancreaticbeta-cells in vivo.Development 122(9):(1996)2895-2902.

Dang,TT.Thai,AV.Cohen,J.et al.,Enhanced function of immuno-isolatedislets in diabetes therapy by co-encapsulation with an anti-inflammatorydrug.Biomaterials 34(23):(2013)5792-5801.

Dean,D.M.Napolitano,A.P.et al.,Rods,tori,and honeycombs:the directedself-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.FASEB J21(14):(2007)4005-4012.

DeLisser HM,Christofidou-Solomidou M,Strieter RM,et al.Involvement ofendothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis.Am J Pathol.Sep 1997；151(3):671-677.

Glicklis,R.Merchuk,JC.Cohen,S.Modeling mass transfer in hepatocytespheroids via cell viability,spheroid size,and hepatocellularfunctions.Biotechnol Bioeng 86(6):(2004)672-680.

de Groot,M.Schuurs,TA.van Schilfgaarde,R.Causes of limited survivalof microencapsulated pancreatic islet grafts,J Surg Res 121(1)(2004)141-150.

Desai,T.Shea,L.D.Advances in islet encapsulation technologies.Nat RevDrug Discov 16(5):(2017)338-350.

De Vos,P.De Haan,et al.,Association between capsule diameter,adequacyof encapsulation,and survival of microencapsulated rat islet allografts1.Transplantation.1996；62(7):893-899.

Elliott,R.B.Escobar,L.et al.,Live encapsulated porcine islets from atype 1 diabetic patient 9.5 yr after xenotransplantation,Xenotransplantation14(2):(2007)157-161.

Enmon Jr,RM.O'Connor,KC.Et al.,Dynamics of spheroid self-assembly inliquid-overlay culture of DU 145 human prostate cancer cells.BiotechnolBioeng 72(6):(2001)579-591.

Gao,K.Kumar,P.Cortez-Toledo,E.et al.Potential long-term treatment ofhemophilia A by neonatal co-transplantation of cord blood-derived endothelialcolony-forming cells and placental mesenchymal stromal cells.Stem cellresearch&therapy.Jan 222019；10(1):34.

Gionet-Gonzales,MA.Leach,JK.Engineering principles for guidingspheroid function in the regeneration of bone,cartilage,and skin.Biomedicalmaterials.Mar 21 2018；13(3):034109.

Glicklis,R.Merchuk,JC.Cohen,S.Modeling mass transfer in hepatocytespheroids via cell viability,spheroid size,and hepatocellularfunctions.Biotechnol Bioeng.Jun 20 2004；86(6):672-680.

Grigoryan,B.et al.,Multivascular networks and functionalintravascular topologies within biocompatible hydrogels.Science2019,364:458.

Henquin,J.C.Triggering and amplifying pathways of regulation ofinsulin secretion by glucose.Diabetes 49(11):(2000)1751-1760.

Hering,BJ.Clarke,WR.et al.,Clinical Islet Transplantation,Phase 3Trial of Transplantation of Human Islets in Type 1 Diabetes Complicated bySevere Hypoglycemia.Diabetes Care 39(7):(2016)1230-1240.

Hilderink,J.Spijker,S.et al.,Controlled aggregation of primary humanpancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable tonative islets.J Cell Mol Med 19(8):(2015)1836-1846.

Ionescu-Tirgoviste,C.Gagniuc,PA.et al.,A 3D map of the islet routesthroughout the healthy human pancreas,Sci Rep 5:(2015)14634.

Jansson,L.Hellerstrom,C.Glucose-induced changes in pancreatic isletblood flow mediated by central nervous system.Am J Physiol 251(6 Pt 1):(1986)E644-647.

Kilimnik,G.Jo,J.et al.,Quantification of islet size andarchitecture.Islets 4(2):(2012)167-172.

Kim,A.Miller,K.et al.,Islet architecture:A comparative study.Islets 1(2):(2009)129-136.

M.Appel,AA.et al.,Long-term function of alginate-encapsulated islets.Tissue Eng Part B Rev 22(1):(2015)34-46.

Komatsu,H.Cook,C.et al.,Oxygen environment and islet size are theprimary limiting factors of isolated pancreatic islet survival.PloS one 12(8):(2017)e0183780.

Lee BR,Hwang JW,Choi YY,et al.,In situ formation and collagen-alginate composite encapsulation of pancreatic isletspheroids.Biomaterials.2012；33(3):837-845.

Levenberg S,Rouwkema J,Macdonald M,et al.,Engineering vascularizedskeletal muscle tissue.Nature biotechnology.2005；23(7):879.

Lim,F.Sun,A.M.Microencapsulated Islets as Bioartificial EndocrinePancreas.Science 210(4472):(1980)908-910.

Livoti,CM.Morgan,JR.Self-assembly and tissue fusion of toroid-shapedminimal building units.Tissue Eng Part A 16(6):(2010)2051-2061.

Ma,M.Chiu,A.et al.,Core–shell hydrogel microcapsules for improvedislets encapsulation.Adv Healthc Mater 2(5):(2013)667-672.

Mendelsohn,A.D.Nyitray,C.Sena,M.Desai,T.A.Size-controlled insulin-secreting cell clusters.Acta Biomater 8(12):(2012)4278-4284.

Merglen,A.Theander,S.et al.,Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1Einsulinoma cells.Endocrinology 145(2)(2004)667-678.

Napolitano,AP.Dean,DM.et al.,Scaffold-free three-dimensional cellculture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels.Biotechniques 43(4):(2007)494-500.

Napolitano,AP.Chai,P.Dean,DM.Morgan,JR.Dynamics of the self-assemblyof complex cellular aggregates on micromolded nonadhesive hydrogels.TissueEng 13(8):(2007)2087-2094.

O’Sullivan,E.Johnson,A.et al.,Rat islet cell aggregates are superiorto islets for transplantation in microcapsules.Diabetologia53(5):(2010)937-945.

O'sullivan ES,Vegas A,Anderson DG,Weir GC.Islets transplanted inimmunoisolation devices:a review of the progress and the challenges thatremain.Endocrine reviews.2011；32(6):827-844.

Paull,D.Sevilla,A.et al.,Automated,high-throughput derivation,characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells.NatMethods 12(9):(2015)885-892.

Pellegrini,S.Cantarelli,E.et al.,The state of the art of islettransplantation and cell therapy in type 1 diabetes.Acta Diabetol 53(5):(2016)683-691.

Rago,AP.Chai,PR.Morgan,JR.Encapsulated arrays of self-assembledmicrotissues:an alternative to spherical microcapsules.Tissue Eng Part A 15(2):(2008)387-395.

Ramachandran,K.Williams,SJ.et al.,Engineering islets for improvedperformance by optimized reaggregation in a micromold.Tissue Eng Part A 19(5-6):(2012)604-612.

Reynolds,TD.Mitchell,SA.Balwinski,KM.Investigation of the effect oftablet surface area/volume on drug release from hydroxypropylmethylcellulosecontrolled-release matrix tablets.Drug Dev Ind Pharm 28(4):(2002)457-466.

Rouiller,DG.Cirulli,V.Halban,PA.Uvomorulin mediates calcium-dependentaggregation of islet cells,whereas calcium-independent cell adhesionmolecules distinguish between islet cell types.Dev Biol 148(1):(1991)233-242.

Rouwkema J,Khademhosseini A.Vascularization and Angiogenesis inTissue Engineering:Beyond Creating Static Networks.Trends Biotechnol.Sep2016；34(9):733-745.

Saelens,X.Festjens,N.et al.,Toxic proteins released from mitochondriain cell death.Oncogene 23(16):(2004)2861-2874.

Saisho,Y.Pancreas volume and fat deposition in diabetes and normalphysiology:consideration of the interplay between endocrine and exocrinepancreas.Rev Diabet Stud 13(2-3):(2016)132.

Schell,JY.Wilks,BT.et al.,Harnessing cellular-derived forces in self-assembled microtissues to control the synthesis and alignment ofECM.Biomaterials 77:(2016)120-129.

Shapiro,AM.Pokrywczynska,M.Ricordi,C.Clinical pancreatic islettransplantation.Nat Rev Endocrinol 13(5):(2017)268-277.

Sigmundsson,K.Ojala,JRM.et al.,Culturing functional pancreatic isletson alpha5-laminins and curative transplantation to diabetic mice.Matrix Biol70:(2018)5-19.

Song,S.Roy,S.Progress and challenges in macroencapsulation approachesfor type 1 diabetes(T1D)treatment:Cells,biomaterials,and devices.BiotechnolBioeng.Jul 2016；113(7):1381-1402.

Tuch,BE.Keogh,GW.et al.,Safety and viability of microencapsulatedhuman islets transplanted into diabetic humans.Diabetes care 32(10):(2009)1887-1889.

Ungphaiboon,S.Attia,D.et al.,Materials for microencapsulation:whattoroidal particles(“doughnuts”)can do better than spherical beads.Soft Matter6(17):(2010)4070-4083.

Veiseh,O.Doloff,JC.et al.,Size-and shape-dependent foreign bodyimmune response to materials implanted in rodents and non-human primates.NatMater 14(6):(2015)643-651.

Wilson,JT.Chaikof,EL.Challenges and emerging technologies in theimmunoisolation of cells and tissues.Adv Drug Del Rev 60(2):(2008)124-145。

Claims (31)

1.一种平面生物相容性水凝胶基宏装置，包括微孔的阵列和在多个所述微孔中的每个内的治疗性微组织，其中；

a)所述宏装置包括包含交联水凝胶的互连网络的组分，其用作分隔均匀间隔的微孔的隔离侧壁，其中所述阵列中的每个微孔包括至少一个侧壁并被配置成封装单个治疗性微组织；以及

b)所述宏装置包括包含在免疫隔离水凝胶中的治疗性微组织的组分，当交联时，治疗性微组织被包埋在所述微孔中，并且

其中b)的所述免疫隔离水凝胶组分与a)的互连水凝胶网络组分互锁。

2.根据权利要求1所述的平面生物相容性水凝胶基宏装置，其中，多个所述微孔中的每个的至少一个侧壁还包含血管内皮细胞。

3.根据权利要求1或2所述的平面生物相容性水凝胶基宏装置，还包括封装所述宏装置的免疫隔离水凝胶诸如藻酸盐水凝胶的涂层。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的平面生物相容性水凝胶基宏装置，其中，所述微孔中的每个还包含被布置成引导形成环形微组织的栓。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的平面生物相容性水凝胶基宏装置，其中，所述治疗性微组织是环形的。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的平面生物相容性水凝胶基宏装置，其中，所述微组织包含分泌细胞、结构细胞或代谢细胞。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的平面生物相容性水凝胶基宏装置，其中，所述微组织包含选自包含以下的组的细胞：朗格汉斯胰岛细胞、肝细胞、骨髓单核细胞、间充质干细胞、动员的外周血单核细胞、内皮祖细胞、卵泡细胞、睾丸间质细胞、卵巢细胞、神经干细胞、人胚胎干细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、骨骼肌成肌细胞、心肌成肌细胞和用于生长激素缺乏或血友病的基因工程细胞。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的平面生物相容性水凝胶基宏装置，其中，a)中的所述交联水凝胶是GelMA和/或b)中的所述免疫隔离水凝胶是藻酸盐。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的平面生物相容性水凝胶基宏装置，其中，至少一个微孔的横截面是正方形或圆形。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的平面生物相容性水凝胶基宏装置，其中，所述微孔中的每个具有在100μm至1000μm范围内，优选500μm的宽度尺寸。

11.根据权利要求4至10中任一项所述的平面生物相容性水凝胶基宏装置，其中，所述栓具有在50μm至150μm范围内的宽度尺寸，优选地所述栓具有100μm的宽度尺寸。

12.根据权利要求11所述的平面生物相容性水凝胶基宏装置，其中，所述栓具有100μm的宽度尺寸并且所述微孔中的每个的宽度尺寸为500μm。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的平面生物相容性水凝胶基宏装置，包括在所述阵列中的至少100个微孔。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的平面生物相容性水凝胶基宏装置，其中，所述治疗性微组织中的每个：

a)被添加到所述微孔中，或

b)在所述微孔内由细胞悬浮液产生。

15.根据权利要求14(b)所述的平面生物相容性水凝胶基宏装置，其中，所述细胞悬浮液包含每cm²宏装置约50至150万个细胞。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的平面生物相容性水凝胶基宏装置，还包括封装所述宏装置和微组织的生物相容性水凝胶层，诸如藻酸盐水凝胶层。

17.一种制造根据权利要求1至16中任一项所述的平面生物相容性水凝胶基宏装置的方法，包括以下步骤；

a)将水凝胶预聚物分配到表面上；

i)将具有指定几何形状和尺寸的透明特征或孔阵列的光掩模放置在分配的混合物上，和

ii)将所述混合物暴露于UV光或含有交联剂的溶液以使所述水凝胶预聚物的暴露部分交联，以形成侧壁的微图案网络，和

iii)冲洗交联的水凝胶图案以去除未交联的水凝胶残留物，留下微孔；或

b)使用3D打印将水凝胶预聚物分配到表面上并交联以形成限定微孔的侧壁的微图案网络；

c)向a)或b)的交联水凝胶微图案上添加微组织和可交联的免疫隔离水凝胶的混合物，并使所述免疫隔离水凝胶交联；或

d)将细胞悬浮液添加到微孔中并在合适的条件下培养细胞，直到细胞根据所选的交联水凝胶微图案聚集成期望的微组织形状，和

(i)向交联的水凝胶微图案上添加可交联的免疫隔离水凝胶，和

(ii)使所述免疫隔离水凝胶交联，

其中所述平面生物相容性水凝胶基宏装置包含每微孔单个微组织。

18.根据权利要求17所述的方法，还包括步骤e)将所述宏装置和微组织封装在生物相容性水凝胶层诸如藻酸盐水凝胶层中。

19.根据权利要求17(d)或18所述的方法，其中，所述细胞以每cm²宏装置约30至150万个细胞接种到所述宏装置上。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中，所述微组织和/或细胞悬浮液选自包含以下的组：朗格汉斯胰岛细胞、肝细胞、骨髓单核细胞、间充质干细胞、动员的外周血单核细胞、内皮祖细胞、卵泡细胞、睾丸间质细胞、卵巢细胞、神经干细胞、人胚胎干细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、骨骼肌成肌细胞、心肌成肌细胞和用于生长激素缺乏或血友病的基因工程细胞。

21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中，在步骤a)或b)中，将水凝胶预聚物和血管内皮细胞的混合物分配到所述表面上，并且其中所述血管内皮细胞嵌入所述微孔侧壁中。

22.根据权利要求17至21任一项所述的方法，其中，步骤a)或b)中的所述水凝胶预聚物是GelMA和/或步骤c)或d)i)中的所述可交联的免疫隔离水凝胶是藻酸盐。

23.一种包含用于植入的细胞的组合物，其中所述组合物包含多个生物相容性水凝胶基微胶囊，每个具有封装在其中的环形微组织，其中所述微组织分泌治疗有效物质，诸如激素或蛋白质。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中，所述水凝胶是可交联的免疫隔离水凝胶。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中，所述水凝胶是藻酸盐。

26.根据权利要求23至25中任一项所述的组合物，其中，所述微组织包含选自包含以下的组的细胞：朗格汉斯胰岛细胞、肝细胞、骨髓单核细胞、间充质干细胞、动员的外周血单核细胞、内皮祖细胞、卵泡细胞、睾丸间质细胞、卵巢细胞、神经干细胞、人胚胎干细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、骨骼肌成肌细胞、心肌成肌细胞和用于生长激素缺乏或血友病的基因工程细胞。

27.一种治疗方法，包括将根据权利要求1至16中任一项所述的平面生物相容性水凝胶基宏装置或根据权利要求23至26中任一项所述的组合物植入需要此类治疗的受试者中。

28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述平面生物相容性水凝胶基宏装置或所述组合物包含分泌胰岛素以治疗糖尿病的微组织。

29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述微组织包含胰岛细胞。

30.根据权利要求1至16中任一项所述的平面生物相容性水凝胶基宏装置或根据权利要求23至26中任一项所述的组合物作为用于治疗受试者的植入物的用途。

31.一种试剂盒，包含根据权利要求1至16中任一项所述的平面生物相容性水凝胶基宏装置或根据权利要求23至26中任一项所述的组合物。

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