CN113712842A - 一种组合物及其在制备化妆品及医疗器械中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种组合物及其在制备化妆品及医疗器械中的应用。该组合物除包括纤连蛋白外，还包括熊果苷或卵磷脂，其中所述纤连蛋白为0.1‑100份，所述熊果苷为160‑5000份，所述卵磷脂为8‑500份。该组合物具有很好协同增效促进成纤维细胞增殖的作用，并在人体功效测试中显示出抗衰、减少色斑、保湿及修复的作用。该组合物在抗衰、保湿和/或修复护肤品、具有皮肤辅助修复功能的医疗器械或医用敷料、促进成纤维细胞生长的培养基或添加剂及生物衍生细胞支架的开发中均具有较好的应用潜力。

Description

一种组合物及其在制备化妆品及医疗器械中的应用
技术领域
本发明涉及化妆品及医疗器械领域，具体涉及一种组合物及其在制备化妆品及医疗器械中的应用；更具体地，涉及一种含有纤连蛋白和熊果苷或卵磷脂等活性成分的抗衰、保湿和/或修复组合物及其制备和应用。
背景技术
皮肤是由表皮、真皮和皮下脂肪组成。皮肤的表皮具有屏障功能，皮肤的真皮层则具有保持皮肤弹性、提供水分等正常生理功能。皮肤的真皮层由成纤维细胞和细胞外基质构成，其中，成纤维细胞可以分泌如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白等细胞外基质成分。但随着年龄的增大和外界环境的影响，皮肤的表皮层更新减缓，屏障功能和代谢功能降低，真皮层中成纤维细胞活力下降，细胞外基质生成速率减慢，生成速率低于降解速率，皮肤发生衰老。皮肤衰老代表性的表现为皮肤的干燥粗糙、松弛和皱纹、色素沉着、失去弹性等。皮肤中表皮细胞更新缓慢、屏障功能减弱，角质形成细胞活力下降，表皮受伤后修复能力减弱，其中屏障功能的减弱导致皮肤干燥、脱屑、皱纹等。衰老皮肤的真皮层中成纤维细胞数量逐渐减少，合成透明质酸、胶原蛋白的能力下降，皮肤弹性和保水能力下降。
从皮肤衰老机理来看，市场亟需针对表皮的保湿修复及真皮层的抗衰的护肤方案。纤连蛋白，又称纤维连接蛋白、粘连蛋白、纤粘蛋白，是一种多功能糖蛋白细胞外基质，由两个相似的亚基构成，每个亚基有六个功能区和一个RGD序列，能够结合肝素、胶原、纤维、细胞和11种整合素等多种物质，在创伤修复、癌症诊断、细胞培养等方面发挥重要作用。纤连蛋白通过黏附细胞和营养物质，为细胞传输细胞代谢、生长、增殖所需的营养物质(比如胶原蛋白、透明质酸、小分子肽、糖蛋白等)，促进细胞粘连、增殖，还可以修复受损细胞，激活活力不足的细胞，刺激细胞分泌各种功能蛋白并促进细胞增殖的生物学特性，在再生医学中广泛应用。
纤连蛋白不仅可以促进细胞的生长、再生还可以调节细胞外的微环境，维持细胞与细胞间质之间的动态平衡，改善细胞内外微循环，保证内外物质运输。纤连蛋白与淋巴细胞表面接合，刺激淋巴细胞产生免疫抗体，改善机体的免疫系统，阻碍机体衰老。在机体细胞自然凋亡过程中，纤连蛋白利用其能够迁移细胞的生物学效应，调节凋亡细胞与新生细胞的平衡关系。从根本上解决细胞各种问题，恢复细胞年轻状态，在外在表现上能起到淡化色斑、平整皱纹、抵抗衰老等的作用。此外，纤连蛋白在伤口愈合过程中起到至关重要的作用。当伤口出现后，纤连蛋白会出现在伤口血浆中，起到止血、保护损伤组织的作用。在伤口修复过程中，纤连蛋白调动吞噬细胞吞噬异物，促进成纤维细胞分泌蛋白酶，分解蛋白杂质。在损伤组织生长过程中，纤连蛋白提高整合素的表达，从而加快组织修复。纤连蛋白是胚胎发育过程中必不可少的物质，可以指导胚胎发育过程中的细胞黏附和迁移。正常人的唾液中含有纤连蛋白，它们可以清除口腔与咽喉中的致病细菌，防止出现口腔与咽喉病变。
熊果苷又名熊果素，呈白色针状结晶或粉末。萃取自熊果的叶子，能够通过抑制体内酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑，同时还有杀菌、消炎的作用。卵磷脂，又称为蛋黄素，被誉为与蛋白质、维生素并列的“第三营养素”，提供了90％的人体所需的外源性胆碱。卵磷脂具有改善机体神经功能障碍及紊乱、恢复脑功能、增强记忆力、防止心血管系统疾病及抗衰老等功效，在药物辅料中用作增溶剂、乳化剂、油脂类的抗氧化剂及脂质体等。
目前，市场对于兼具抗衰和保湿修复的化妆品和医疗器械产品的需求更迫切。由于纤连蛋白的分子量较大，皮肤难以吸收，且活性和稳定性容易受到其他原料的影响，因此为纤连蛋白寻找合适的复配原料并且协同发挥功效难度较大；熊果苷具有很好的亲水性，但很难穿透皮肤。因此，尚无在纤连蛋白、熊果苷和/或卵磷脂(例如脂质体)活性物组合基础上开发的稳定的抗衰产品，且在制备过程中如何保存其活性并将之用于开发抗衰修复产品仍是尚未解决的技术问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术无法提供兼具抗衰和保湿修复的产品的问题，提供一种组合物及其在制备化妆品及医疗器械的应用。所述组合物除包括纤连蛋白外，还包括熊果苷或卵磷脂。本发明解决了纤连蛋白、卵磷脂(例如脂质体)和熊果苷复配困难，化妆品组合物产品形式局限的问题，该组合物具有很好的锁水保湿和抗衰作用。
为解决上述问题，本发明采取的技术方案之一为：一种组合物，所述组合物除包括纤连蛋白外，还包括卵磷脂或熊果苷，其中所述纤连蛋白为0.1-100份，所述卵磷脂为8-500份，所述熊果苷为160-5000份。
较佳地，所述纤连蛋白为0.1-80份，所述卵磷脂为10-200份，所述熊果苷为500-4000份。
较佳地，所述组合物包括纤连蛋白、卵磷脂和熊果苷，其中所述纤连蛋白为0.1-1份，所述卵磷脂为20-200份，所述熊果苷为800-4000份。优选地，所述纤连蛋白为1份，所述卵磷脂为100-200份，所述熊果苷为800份。
较佳地，所述纤连蛋白的来源包括动物及微生物发酵来源，由血浆或组织提取、生物酶切或基因工程表达获得的片段及或全长蛋白；所述熊果苷包括天然提取和化学合成来源；所述卵磷脂包括大豆、蛋黄等天然来源的卵磷脂及合成的氢化饱和或非饱和卵磷脂，和/或，所述卵磷脂的制备工艺选自薄膜蒸发法、逆向蒸发法、高压微射流/挤压法和醇质体。
较佳地，所述组合物包括多元醇。优选地，所述多元醇为乙醇、甘油、丙二醇、丁二醇、戊二醇中的一种或多种。更优选地，所述多元醇为50-2500份。进一步更优选地，所述多元醇为丙二醇。
较佳地，所述组合物还包括保湿剂。优选地，所述保湿剂为聚谷氨酸钠、透明质酸钠、水解透明质酸钠或水解透明质酸中的一种或多种。更优选地，所述保湿剂为100-1000份聚谷氨酸钠和/或100-5000份透明质酸钠。进一步更优选地，所述保湿剂为500份聚谷氨酸钠和/或2000份透明质酸钠。
较佳地，所述组合物包括中药或植物提取物。优选地，所述中药或植物提取物优选为马齿苋提取物、甘草提取物、苦参根提取物、胀果甘草根提取物和/或黄芩根提取物。优选地，所述中药或植物提取物为20-80份马齿苋提取物、150-600份苦参根提取物、150-600份胀果甘草根提取物和200-800份黄芩根提取物。
较佳地，所述组合物包括成膜剂。优选地，所述组合物还包括成膜剂。优选地，所述成膜剂为聚季铵盐类、聚氨酯类、聚丙烯酸酯类。更优选地，所述成膜剂为50-1000份聚季铵盐-51。
较佳地，所述组合物还包括皮肤调理剂。优选地，所述皮肤调理剂为维生素A、B、D、E、K及其衍生物、泛醇、尿囊素、水解胶原、积雪草苷或积雪草提取物、虾青素、辅酶Q10、糖鞘脂、神经酰胺及其衍生物的一种或多种。更优选地，所述泛醇为100-10000份、所述尿囊素为100-5000份、所述水解胶原为100-50000份。
较佳地，所述组合物还包括增稠剂。和/或，美白剂。优选地，所述增稠剂为黄原胶、卡拉胶、小核菌胶及水解小核菌胶、果胶、卡波姆、聚丙烯酸及其盐、聚丙烯酰胺及其盐类中的一种或多种，所述美白剂包括黄酮类、维生素C及其衍生物、烟酰胺、传明酸或曲酸中的一种或多种。更优选地，所述增稠剂为1-1000份水解小核菌胶、所述美白剂为1000-20000份传明酸。
如上所述的组合物，其特征在于，所述组合物的制备包括以下步骤：
(1)将所述份数优选100份的卵磷脂与所述份数优选1000份的多元醇优选丙二醇混匀，得组分A；
(2.1)将所述份数优选1份的纤连蛋白制成溶液，并与组分A混匀，得组合物I；所述混匀优选1000～3000rpm/min搅拌，更优选2000rpm/min搅拌；
较佳地，还包括以下步骤：
(3)将所述份数优选800份熊果苷制成水溶液得组分B，并将组分B与所述组合物I混匀，得混合溶液II；
更佳地，还包括以下步骤：
(4)将所述份数透明质酸钠、聚谷氨酸钠与甘油优选2000份透明质酸钠、500份聚谷氨酸钠与50000份甘油加热混匀后，加水至透明质酸钠溶胀分散均匀得组分C；所述混匀优选1000～3000rpm/min搅拌，更优选2000rpm/min搅拌；
(5)组分C降温至室温后与所述组合物I或所述混合溶液II混匀，得混合溶液III；
进一步更佳地，还包括以下步骤：
(6)在所述组合物I、所述混合溶液II或混合溶液III中加入所述份数优选100份尿囊素制成的水溶液，和/或，加入终浓度为0.08％的马齿苋提取物、0.1％的聚季铵盐-51和0.05％的辛酰羟肟酸；
较佳地，所述步骤(2.1)后还包括以下步骤：
(2.2)所述组合物I还包括加入甘露醇溶液，混合溶液中甘露醇的最终浓度优选为3～5％(m/V)，所述混合溶液优选在0.5～0.75MPa真空度下进行搅拌，优选1000～3000rpm/min，更优选2000rpm/min；
(2.3)将上一步骤混匀的料体灌装后，冷冻干燥得所述组合物I的冻干粉；所述冷冻干燥优选包括以下步骤：
a)预冷冻：常压下，降温至-50℃，预冷冻样品3～5h；
b)冷冻干燥：开启真空泵使真空度值为0.001mbar，在-45～-50℃下冷冻2～4h；
c)维持真空度不变，升温至-35℃，在此条件下继续冷冻干燥2～6h；
d)维持真空度不变，升温至-30℃，在此条件下继续冷冻干燥12～36h；
e)升温至-10℃，在此条件下继续冷冻干燥1～2h；
f)解析干燥：维持真空度不变，升温至25℃，在此条件下继续干燥3～6h。
本领域人员皆知，所述灌装可以将组合物灌装至西林瓶，例如3mL的西林瓶，并加塞例如加半塞。冷冻干燥之前，所述冷冻干燥设备先降温至低温例如4℃，所述降温或所述升温的速度例如为1℃/min。冷冻干燥完成后，真空状态下压塞密封，可用轧盖机将冻干粉轧盖。冻干粉可室温保存，也可冷冻保存。
上述步骤(3)中将组分B与所述组合物I混匀，但本领域人员皆知，组分B可先与所述组合物I混匀，也可与步骤(4)的组分C和/或步骤(6)的尿囊素水溶液、马齿苋提取物、聚季铵盐-51和辛酰羟肟酸混匀后制成精华液，再与组合物I混匀。
为解决上述问题，本发明采取的技术方案之二为：提供一种所述组合物在制备抗衰、保湿和/或修复的产品中的应用；优选地，所述产品为与成纤维细胞及其分泌的胶原蛋白功能相关的护肤品、具有皮肤修复功能的医疗器械或医用敷料、促进成纤维细胞生长的培养基或生物衍生细胞支架；更优选地，所述护肤品为精华液、凝胶、化妆水、乳液、面霜、眼霜、身体乳、面膜或沐浴露。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明提供的活性物组合方案，是针对皮肤衰老的外源性损伤及内源性损伤，根据皮肤各种问题和护理需求，提出了具有抗衰、保湿修复的活性物复配成分组合方案。同时运用了脂质体的包裹技术和低温冻干技术，分别提高多重活性物的功效性，和保证了活性物的稳定性，并提高了皮肤对活性物的吸收，大大提高了产品的保质期，解决了通常活性物的不稳定和吸收性不好的问题。产品可以增强皮肤的屏障功能，从而进一步减少外界污染物对皮肤的刺激，从内而外更加健康年轻。
附图说明
图1为纤连蛋白对成纤维细胞的增殖作用；
图2为熊果苷与不同浓度纤连蛋白脂质体复配物对成纤维细胞的增殖作用；
图3为不同浓度熊果苷与纤连蛋白复配物对成纤维细胞的增殖作用；
图4为不同含量熊果苷与纤连蛋白脂质体(在本发明中，卵磷脂为例如脂质体)的复配物对成纤维细胞的增殖作用；
图5为熊果苷与不同纤连蛋白复配物对成纤维细胞的增殖作用；
图6为Primos总皱纹平均深度，其中A为总皱纹平均深度，B为相比使用前总皱纹平均深度的变化率；
图7为Primos最大皱纹平均深度，其中A为最大皱纹平均深度，B为相比使用前最大皱纹平均深度的变化率，*表示与使用前相比，有显著性差异(p<0.05)；
图8为Primos最大皱纹最大深度，其中A为最大皱纹最大深度，B为相比使用前最大皱纹最大深度的变化率，*表示与使用前相比，有显著性差异(p<0.05)；
图9为Primos皱纹总体积，其中A为皱纹总体积，B为相比使用前皱纹总体积的变化率，*表示与使用前相比，有显著性差异(p<0.05)；
图10为Primos皱纹总面积，其中A为皱纹总面积，B为相比使用前皱纹总面积的变化率，*表示与使用前相比，有显著性差异(p<0.05)；
图11为Primos皮肤纹理，其中A为皮肤纹理，B为相比使用前皮肤纹理的变化率，*表示与使用前相比，有显著性差异(p<0.05)；
图12为Visia皱纹特征计数，其中A为皱纹特征计数，B为相比使用前皱纹特征计数的变化率；
图13为Visia皱纹分值，其中A为皱纹分值，B为相比使用前皱纹分值的变化率；
图14为Visia色斑特征计数，其中A为色斑特征计数，B为相比使用前色斑特征计数的变化率，*表示与使用前相比，有显著性差异(p<0.05)；
图15为Visia色斑分值，其中A为色斑分值，B为相比使用前色斑分值的变化率；
图16为皮肤角质层(眼角)含水量，其中A为皮肤角质层(眼角)含水量，*表示与使用前相比，有显著性差异(p<0.05)；B为相比使用前皮肤角质层(眼角)含水量的变化率，*表示与对照相比，样品部位变化值有显著性差异(p<0.05)；
图17为皮肤角质层(脸颊)含水量，其中A为皮肤角质层(脸颊)含水量，*表示与使用前相比，有显著性差异(p<0.05)；B为相比使用前皮肤角质层(脸颊)含水量的变化率，*表示与对照相比，样品部位变化值有显著性差异(p<0.05)；
图18为皮肤(眼角)经表皮失水率，其中A为皮肤(眼角)经表皮失水率，B为相比使用前皮肤(眼角)经表皮失水率的变化率，*表示与使用前相比，有显著性差异(p<0.05)；
图19为皮肤(脸颊)经表皮失水率，其中A为皮肤(脸颊)经表皮失水率，B为相比使用前皮肤(脸颊)经表皮失水率的变化率，*表示与使用前相比，有显著性差异(p<0.05)；
图20为皮肤(眼角)弹性，其中A为皮肤(眼角)弹性，B为相比使用前皮肤(眼角)弹性的变化率，*表示与使用前相比，有显著性差异(p<0.05)；
图21为皮肤(脸颊)弹性，其中A为皮肤(脸颊)弹性，*表示与使用前相比，有显著性差异(p<0.05)；B为相比使用前皮肤(脸颊)弹性的变化率，*表示与对照相比，样品部位变化值有显著性差异(p<0.05)。
具体实施方式
以下为本发明常用的细胞、培养基、耗材及设备仪器
细胞株为BJ细胞(人成纤维细胞)、DMEM培养基(Gibco)、胎牛血清、FBS(Gibco)、PBS(Phosphate Buffered Saline)(1×，pH 7.4，Hyclone)、Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒，Bimake)、Spark酶标仪(TECAN)、CO2细胞培养箱(Thermo)、25mL细胞培养瓶、96孔细胞培养板等(品牌：Corning)
实施例1样本的制备
原料：卵磷脂(大豆磷脂，食品级)、丙二醇(国药)、纤连蛋白
实施例1：
(1)用超纯水将质量浓度为1mg/mL的纤连蛋白溶液稀释不同倍数，配制成不同质量浓度的纤连蛋白溶液(图1)；
(2)称取1g卵磷脂加入10mL的丙二醇中，温度加热至50-70℃，磁力搅拌下溶解分散均匀，得组分A；
(3)称取10g熊果苷溶解于500mL超纯水中，室温下搅拌溶解均匀，得组分B；
(4)室温下，用移液器分别吸取4mL、2mL、400μL和160μL的组分A于四个烧杯中；
(5)在2000rpm/min的快速搅拌下，分别向上述四个烧杯中分别加入2mL、1mL、200μL和80μL的质量分数为1mg/mL的纤连蛋白溶液，以及80mL的组分B，保持快速搅拌15～20min；
(6)向四个烧杯中继续分别加入14mL、17mL、19.4mL和19.76mL的超纯水，继续搅拌15～20min，得不同浓度的纤连蛋白-熊果苷-脂质体溶液(浓度及其对成纤维细胞的增殖作用结果见图2及下文实施例)；
(7)分别称取不同质量的熊果苷于不同的三个烧杯中，加入超纯水分别配制成质量浓度为8％、1.6％和0.32％的熊果苷溶液，再加入一定质量浓度的纤连蛋白溶液，得到含有不同浓度熊果苷-纤连蛋白溶液(浓度及其对成纤维细胞的增殖作用结果见图3及下文实施例)；
(8)同上述操作，移取1mL的组分A于烧杯中，在2000rpm/min的快速搅拌下，分别加入体积为0mL、2mL的质量浓度为1mg/mL的纤连蛋白溶液，再加入不同浓度的熊果苷溶液和超纯水，保持搅拌30～40min，得到含有不同浓度的熊果苷-纤连蛋白-脂质体溶液(浓度及其对成纤维细胞的增殖作用结果见图4及下文实施例)；
(9)分别吸取加入2mL、1mL、200μL、80μL和0μL的质量分数为1mg/mL的纤连蛋白溶液，再分别加入熊果苷溶液和超纯水，搅拌均匀，配制得到不同质量浓度配比的熊果苷-纤连蛋白溶液(浓度及其对成纤维细胞的增殖作用结果见图5及下文实施例)。
实施例2样本对人皮肤成纤维细胞生长影响试验
1、人皮肤成纤维细胞株，使用10％FBS+DMEM培养，生长状况良好，细胞密度达80％-90％，弃去培养基，PBS清洗一遍后，使用0.25％(w/v)胰蛋白酶-0.53mM EDTA消化2min后，加入10％FBS+DMEM终止消化，800rpm/min转速下离心5min；
2、弃去培养基，使用10％FBS+DMEM重悬细胞，计数密度为5～8×104/mL，取96孔板，以每孔100μL加入96孔板，放入5％CO237℃的培养箱培养过夜；
3、24h后换液，弃去上清，加入100μL 0.4％FBS+DMEM维持培养基，放入5％CO237℃培养箱培养过夜。
4、用0.4％FBS+DMEM维持培养基稀释实施例1中各样本至测试浓度，弃去细胞上清，按100μL/孔将各稀释样本加入96孔板。
5、培养48h后，将CCK-8与基础培养基1:9混合均匀，吸去细胞上清，并按每孔100μL加入CCK-8试剂，放入5％CO237℃培养箱孵育2h。
6、酶标仪读数测试，在450nm波长下测OD值，620nm作为参比波长。
7、P值计算均采用双样本(因素)方差分析。
测试结果：
图1的结果说明了纤连蛋白浓度的增加对成纤维细胞的增殖有明显的促进作用。
图2的结果说明了熊果苷、熊果苷-脂质体、熊果苷-纤连蛋白-脂质体均可促进成纤维细胞的增殖，其中熊果苷-纤连蛋白-脂质体的组合促进效果最佳，熊果苷-脂质体组合物的促进效果次之。
图3的结果说明了熊果苷对成纤维细胞增殖的促进作用并不是随着浓度增加而提高，但在160和800ppm是对成纤维细胞增殖具有明显的促进作用，而加入纤连蛋白后，0～4000ppm的熊果苷均对成纤维细胞的增值具有促进作用。
图4的结果说明了纤连蛋白、纤连蛋白-脂质体、纤连蛋白-脂质体对熊果苷促进成纤维细胞增殖的提升作用。
图5的结果说明了纤连蛋白对熊果苷促进成纤维细胞增殖具有提升作用。
实施例3效果评分和满意度
Figure BDA0002507768640000111
志愿者自我评估
采用问卷调查的方式，在使用产品后4周，了解受试者对产品使用后改善情况的评价。评判指标主要分为：眼角细纹的改善效果、皮肤弹性、保湿度、皮肤光泽度等改善效果。受试者对其功效进行自我评价，1分为不满意，2分为稍微不满意，3分为一般，4分为满意，5分为非常满意。
以下为产品使用方法、打分标准、打分人群(消费者)以及参与打分的人数(>30人)的数据。
Figure BDA0002507768640000121
配方基质为：水、甘油、透明质酸钠、聚谷氨酸钠、尿囊素、马齿苋提取物、聚季铵盐-51、辛酰羟肟酸等原料(具体见后面精华液制备)。
结论：纤连蛋白、熊果苷的组合物具有较好的减少皱纹，提高皮肤弹性，修复皮肤屏障和保湿的作用。通过脂质体包裹技术后，更大程度的提高了活性物的抗衰保湿修复作用，其中组合物6和7的效果最好，组合物1-5次之；说明仅含熊果苷和脂质体，或仅含熊果苷和纤连蛋白的组合物效果不如含熊果苷、脂质体和纤连蛋白的组合物。但这些组合物的效果均优于仅含熊果苷的产品的效果。
实施例4消费者测试用的化妆品制备
1、按以下配方制备本发明的组合物7(冻干粉+精华液)
冻干粉的制备
(1)称取1g卵磷脂于烧杯中，再加入10mL的丙二醇，溶解分散均匀，得组分A；
(2)取质量浓度为1mg/mL的纤连蛋白溶液100mL，在2000rpm/min的快速搅拌下，加入含组分A的烧杯中，保持快速搅拌15～20min；
(3)在0.5～0.75MPa真空度下，2000rpm/min转速下，向上述混合溶液中加入甘露醇并配制成最终浓度为4％(m/V)甘露醇的混合溶液1000mL，保持搅拌20min；
(4)将步骤(3)制得的料体按每瓶1mL的量灌装至3mL西林瓶中，加半塞后放至冻干机托盘上；
(5)打开冻干机舱门，将步骤4的冻干瓶放置冻干架上，关闭舱门；
(6)开启冷冻干燥机，并以最快速度1℃/min，降温至4℃；
(7)设置并运行冷冻干燥程序：
a)预冷冻：常压下，1℃/min降温至-50℃，预冷冻样品3～5h；
b)冷冻干燥：开启真空泵使真空度值为0.001mbar，在-45～-50℃下冷冻2～4h；
c)维持真空度不变，升温至-35℃，在此条件下继续冷冻干燥2～6h；
d)维持真空度不变，升温至-30℃，在此条件下继续冷冻干燥12～36h；
e)升温至-10℃，在此条件下继续冷冻干燥1～2h；
f)解析干燥：维持真空度不变，升温至25℃，在此条件下继续干燥3～6h。
(8)冷冻干燥完成后，真空状态下压塞密封，出舱；
(9)用轧盖机将步骤8所得的冻干粉进行轧盖、室温保存，即得冻干粉。
精华液的制备
(1)称取8g熊果苷溶解于200mL超纯水中，室温下搅拌溶解均匀，得组分B；
(2)称取2g透明质酸钠、0.5g聚谷氨酸钠于烧杯中，加入50mL的甘油，搅拌分散3min后，加入500mL超纯水，搅拌加热至75～80℃，1000rpm/min下搅拌30min，待透明质酸钠溶胀分散均匀，得组分C；
(3)待组分C降温至30-35℃后，将组分B与组分C混合，搅拌均匀；
(4)将1g尿囊素加入250mL超纯水中，搅拌溶解均匀后加入步骤(3)的溶液中；
(5)加入2％的马齿苋提取物、2％的聚季铵盐-51、1％的辛酰羟肟酸，搅拌混合均匀，得到含有效量为0.08％马齿苋提取物、0.1％聚季铵盐-51、0.05％辛酰羟肟酸的精华液。
将冻干粉溶解在精华液中，混合溶解均匀后，即可使用。
2、按以下配方制备本发明的组合物7(精华液)
(1)称取1g卵磷脂于烧杯中，再加入10mL的丙二醇溶解分散均匀，得组分A；
(2)取质量浓度为1mg/mL的纤连蛋白溶液100mL，在2000rpm/min的快速搅拌下，加入含组分A的烧杯中；
(3)称取8g熊果苷溶解于200mL超纯水中，室温下搅拌溶解均匀，得组分B，快速搅拌下加入上述烧杯中，保持快速搅拌15～20min；
(4)称取2g的透明质酸钠、500mg聚谷氨酸钠于烧杯中，加入50mL的甘油，搅拌分散3min后，加入500mL超纯水，搅拌加热至75～80℃，1000rpm/min下搅拌30min，待透明质酸钠溶胀分散均匀，得组分C；
(5)组分C降温至室温后，加入步骤3的烧杯中，继续搅拌15～20min；
(6)将1g尿囊素加入250mL超纯水中，搅拌溶解均匀后加入上述步骤所得的溶液中；
(7)加入2％的马齿苋提取物、2％的聚季铵盐-51、1％的辛酰羟肟酸，搅拌混合均匀，搅拌混合均匀，得到含有效量为0.08％马齿苋提取物、0.1％聚季铵盐-51、0.05％辛酰羟肟酸的组合物7。
实施例5样品的临床消费者测试
测试样品：组合物7(即实施例4第1部分的“冻干粉+精华液”)、对照组不含组合物
使用频率：每天使用一次
测试节点：使用前，使用7天后、使用14天后，使用28天后、使用56天后
测试设备：
1.皮肤水分测定仪Corneometer CM 825用于检测皮肤角质层水分含量
参照《化妆品皮肤保湿功能评价方法的研究》，在22-24℃，湿度为50-60％的实验室内进行。基于表皮所含完全不同的电解质的客观情况进行测定，其结果通过设定的湿度测量值(MMV,Moisture Measurement Value)来表示，MMV为0-150的数值。
2.皮肤水分流失测定仪Tewameter TM300用于检测皮肤经表皮失水率
基于菲克扩散定律，在规定的温湿度条件下，通过测量单位时间、单位横截面积，经表皮上不同点的水蒸气分压梯度，得到经表皮水分流失TEWL(Transepidermal WaterLoss)值。按开放室经表皮水分流失测试仪使用说明进行测试，测量TEWL值时，仪器探头须置于斑贴区域中心位置，测量时，取TEWL值曲线的10个连续点的平均值。受试者左、右前臂曲侧随机分为样品涂抹侧和对照侧，每侧包含3个斑贴区域，确保样品涂抹侧和对照侧在统计学上达到平衡。
方案设计：
使用前：受试者清洁面部(使用氨基酸洗面奶清洗面部，参照《化妆品改善眼角纹功效临床评价方法》，清洗的目的包括保持测试部位洁净，避免测试误差；以及保持每个时点测试部位的条件一致，每个测试时点的清洁方式应保持一致，33人参与)，在温度21±1℃，相对湿度50±5％的实验室中休息30min，测试外眼角及脸颊皮肤角质层水分含量、皮肤经表皮失水率，发放产品及使用说明。
使用7天后：受试者清洁面部，在温度21±1℃，相对湿度50±5％的实验室中休息30min，测试外眼角及脸颊皮肤角质层水分含量、皮肤经表皮失水率。
使用14天后：受试者清洁面部，在温度21±1℃，相对湿度50±5％的实验室中休息30min，测试外眼角及脸颊皮肤角质层水分含量、皮肤经表皮失水率。
使用28天后：受试者清洁面部，在温度21±1℃，相对湿度50±5％的实验室中休息30min，测试外眼角及脸颊皮肤角质层水分含量、皮肤经表皮失水率。
使用56天后：受试者清洁面部，在温度21±1℃，相对湿度50±5％的实验室中休息30min，测试外眼角及脸颊皮肤角质层水分含量、皮肤经表皮失水率。
测试参数：
1.Visia仪器用于进行面部图像采集及照片分析
2.Primos仪器用于进行外眼角图像采集及照片分析
3.皮肤水分测定仪Corneometer CM 825用于检测皮肤角质层水分含量
4.皮肤水分流失测定仪Tewameter TM300用于检测皮肤经表皮失水率
5.皮肤弹性测定仪Cutometer MPA580用于检测皮肤弹性及皮肤紧致
6.受试者自我评估
数据统计：数据使用SPSS进行统计，对测试数据进行统计分析，统计方法显著性水平p<0.05。
测试结果：
图6、7、8、9、10的结果说明，消费者分别使用组合物和对照组样品7天、14天、28天及56天后，Primos仪器测得组合物组的总皱纹平均深度、最大皱纹平均深度、最大皱纹最大深度、皱纹总体积、皱纹总面积、皮肤纹理、皱纹总面积与使用前相比，整体趋势均有降低；且使用56天后，最大皱纹平均深度、最大皱纹最大深度、皱纹总体积与使用前相比，有显著性差异(p<0.05)；皮肤皱纹总面积和皮肤纹理在使用28天和56天与使用前相比，有显著性降低(p<0.05)。
图12、13、14、15的结果说明，消费者分别使用组合物和对照组样品7天、14天、28天及56天后，Visia仪器测得组合物组的皱纹特征计数、皱纹分值、色斑特征计数、色斑分值与使用前相比，整体趋势均有降低；且使用28天后，色斑特征计数与使用前相比，有显著性降低(p<0.05)。
图16、17的结果说明，消费者分别使用组合物和对照组样品7天、14天、28天及56天后，仪器测得组合物组的皮肤(眼角、脸颊)角质层含水量与使用前相比，整体趋势均有提高；且使用7天、14天、28天和56天后与使用前相比，角质层含水量有显著性提高(p<0.05)；眼角部位在使用7天、14天和56天后与对照组相比，角质层含水量有显著性提高(p<0.05)；脸颊部位在使用14天和56天后与对照组相比，角质层含水量有显著性提高(p<0.05)。
图18、19的结果说明，消费者分别使用组合物和对照组样品7天、14天、28天及56天后，仪器测得组合物组的皮肤(眼角、脸颊)经表皮失水率与使用前相比，整体趋势均有降低；且眼角部位在使用7天、28天和56天后与使用前相比，经表皮失水率有显著性降低(p<0.05)；脸颊部位在使用7天、14天、28天和56天后与使用前相比，经表皮失水率有显著性降低(p<0.05)。
图20、21的结果说明，消费者分别使用组合物和对照组样品7天、14天、28天及56天后，仪器测得组合物组的皮肤(眼角、脸颊)弹性与使用前相比，整体趋势均有提高；且眼角部位在使用7天、14天、28天后与使用前相比，皮肤弹性有显著性提高(p<0.05)；脸颊部位在使用7天、14天、28天后与使用前相比，皮肤弹性有显著性提高(p<0.05)，且在使用7天、14天和28天后，脸颊皮肤弹性与对照组相比，有显著性提高(p<0.05)。
Primos总皱纹平均深度、最大皱纹平均深度、最大皱纹最大深度、皱纹总体积、皱纹总面积、皮肤纹理、皱纹总面积、Visia皱纹特征计数、皱纹分值、色斑特征计数、色斑分值、皮肤角质层水分含量和皮肤经表皮失水率、皮肤弹性的检测结果说明，本发明的产品具有抗皱、减少色斑、保湿及修复皮肤屏障的作用。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，所述组合物除包括纤连蛋白外，还包括卵磷脂或熊果苷，其中所述纤连蛋白为0.1-100份，所述卵磷脂为8-500份，所述熊果苷为160-5000份。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述纤连蛋白为0.1-80份，所述卵磷脂为10-200份，所述熊果苷为500-4000份；优选地，所述组合物包括纤连蛋白、卵磷脂和熊果苷，其中所述纤连蛋白为0.1-1份，所述卵磷脂为20-200份，所述熊果苷为800-4000份；更优选地，所述纤连蛋白为1份，所述卵磷脂为100-200份，所述熊果苷为800份。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述纤连蛋白的来源包括动物及微生物发酵来源，由血浆或组织提取、生物酶切或基因工程表达获得的片段及或全长蛋白；所述熊果苷包括天然提取和化学合成来源；所述卵磷脂包括大豆、蛋黄等天然来源的卵磷脂及合成的氢化饱和或非饱和卵磷脂，和/或，所述卵磷脂的制备工艺选自薄膜蒸发法、逆向蒸发法、高压微射流/挤压法和醇质体。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括多元醇；优选地，所述多元醇为乙醇、甘油、丙二醇、丁二醇、戊二醇中的一种或多种；更优选地，所述多元醇为50-2500份；进一步更优选地，所述多元醇为丙二醇。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括保湿剂；优选地，所述保湿剂为聚谷氨酸钠、透明质酸钠、水解透明质酸钠或水解透明质酸中的一种或多种；更优选地，所述保湿剂为100-1000份聚谷氨酸钠和/或100-5000份透明质酸钠；进一步更优选地，所述保湿剂为500份聚谷氨酸钠和/或2000份透明质酸钠。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括中药或植物提取物，所述中药或植物提取物优选为马齿苋提取物、甘草提取物、苦参根提取物、胀果甘草根提取物和/或黄芩根提取物；优选地，所述中药或植物提取物为20-80份马齿苋提取物、150-600份苦参根提取物、150-600份胀果甘草根提取物和200-800份黄芩根提取物。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括成膜剂；优选地，所述成膜剂为聚季铵盐类、聚氨酯类、聚丙烯酸酯类；更优选地，所述成膜剂为50-1000份聚季铵盐-51。
8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括皮肤调理剂、增稠剂，和/或，美白剂；优选地，所述皮肤调理剂为维生素A、B、D、E、K及其衍生物、泛醇、尿囊素、水解胶原、积雪草苷或积雪草提取物、虾青素、辅酶Q10、糖鞘脂、神经酰胺及其衍生物的一种或多种，所述增稠剂为黄原胶、卡拉胶、小核菌胶及水解小核菌胶、果胶、卡波姆、聚丙烯酸及其盐、聚丙烯酰胺及其盐类中的一种或多种，所述美白剂包括黄酮类、维生素C及其衍生物、烟酰胺、传明酸或曲酸中的一种或多种；更优选地，所述泛醇为100-10000份，所述尿囊素为100-5000份，所述水解胶原为100-50000份，所述增稠剂为1-1000份水解小核菌胶，所述美白剂为1000-20000份传明酸。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的制备包括以下步骤：
(1)将所述份数优选100份的卵磷脂与所述份数优选1000份的多元醇优选丙二醇混匀，得组分A；
(2.1)将所述份数优选1份的纤连蛋白制成溶液，并与组分A混匀，得组合物I；所述混匀优选1000～3000rpm/min搅拌，更优选2000rpm/min搅拌；
较佳地，还包括以下步骤：
(3)将所述份数优选800份熊果苷制成水溶液得组分B，并将组分B与所述组合物I混匀，得混合溶液II；
更佳地，还包括以下步骤：
(4)将所述份数透明质酸钠、聚谷氨酸钠与甘油优选2000份透明质酸钠、500份聚谷氨酸钠与50000份甘油加热混匀后，加水至透明质酸钠溶胀分散均匀得组分C；所述混匀优选1000～3000rpm/min搅拌，更优选2000rpm/min搅拌；
(5)组分C降温至室温后与所述组合物I或所述混合溶液II混匀，得混合溶液III；
进一步更佳地，还包括以下步骤：
(6)在所述组合物I、所述混合溶液II或混合溶液III中加入所述份数优选100份尿囊素制成的水溶液，和/或，加入终浓度为0.08％的马齿苋提取物、0.1％的聚季铵盐-51和0.05％的辛酰羟肟酸；
最佳地，所述步骤(2.1)后还包括以下步骤：
(2.2)所述组合物I还包括加入甘露醇溶液，混合溶液中甘露醇的最终浓度优选为3～5％(m/V)，所述溶液优选在0.5～0.75MPa真空度下进行搅拌，优选1000～3000rpm/min，更优选2000rpm/min；
(2.3)将上一步骤混匀的料体灌装后，冷冻干燥得所述组合物I的冻干粉；所述冷冻干燥优选包括以下步骤：
a)预冷冻：常压下，降温至-50℃，预冷冻样品3～5h；
b)冷冻干燥：开启真空泵使真空度值为0.001mbar，在-45～-50℃下冷冻2～4h；
c)维持真空度不变，升温至-35℃，在此条件下继续冷冻干燥2～6h；
d)维持真空度不变，升温至-30℃，在此条件下继续冷冻干燥12～36h；
e)升温至-10℃，在此条件下继续冷冻干燥1～2h；
f)解析干燥：维持真空度不变，升温至25℃，在此条件下继续干燥3～6h。
10.一种如权利要求1-9中任一项所述的组合物在制备抗衰、保湿和/或修复的产品中的应用；优选地，所述产品为与成纤维细胞及其分泌的胶原蛋白功能相关的护肤品、具有皮肤修复功能的医疗器械或医用敷料、促进成纤维细胞生长的培养基或生物衍生细胞支架；更优选地，所述护肤品为精华液、凝胶、化妆水、乳液、面霜、眼霜、身体乳、面膜或沐浴露。
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