CN113710095A - 用于在高温减少乳糖的方法 - Google Patents

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CN113710095A CN202080030101.7A CN202080030101A CN113710095A CN 113710095 A CN113710095 A CN 113710095A CN 202080030101 A CN202080030101 A CN 202080030101A CN 113710095 A CN113710095 A CN 113710095A
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Abstract

本说明书涉及用于减少含乳糖的乳基底物中乳糖的量的方法，其中所述方法包括使所述底物与具有中性乳糖酶活性的酶在高于约50℃的温度下接触，并且其中所述乳糖酶使所述底物中乳糖的量减少至少约70％。

Description

用于在高温减少乳糖的方法
技术领域
本申请涉及用于通过以下来减少含乳糖的乳基底物中乳糖的量的方法：使底物与具有中性乳糖酶活性的酶接触，更特别地在更高温度接触。本说明书还涉及通过本说明书中所公开的方法获得或可通过所述方法获得的乳基底物和乳制品，如乳糖减少的或不含乳糖的乳基底物和乳制品。本说明书还涉及包含如本说明书中所公开的具有中性乳糖酶活性的酶的酶制剂，编码所述酶的核酸分子，包含所述核酸分子的载体，能够表达所述酶的细胞，以及所述酶用于制备乳基底物和乳制品的用途。本说明书还涉及在50℃-65℃乳糖水解高效的经浓缩和经纯化的乳糖酶，所述乳糖酶可用于制备乳糖减少的或不含乳糖的乳制品。
背景技术
乳糖不耐受人群很难消化具有高乳糖水平的乳制品。据估计，约70％的世界人口的乳糖消化能力有限。因此，对不含乳糖或仅含低水平乳糖的乳制品的需求越来越大。乳糖酶的商业用途是分解乳制品中的乳糖。用于产生具有减少的乳糖的巴氏杀菌乳的典型过程包括向乳中添加乳糖酶，然后在6℃左右的温度长时间孵育(10-48小时，通常是24小时)。已经从多种生物体中分离出了乳糖酶，所述生物体包括像克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)等微生物。克鲁维酵母属(特别是脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis))以及其他真菌(如假丝酵母属(Candida)、圆酵母属(Torula)和球拟酵母属(Torulopsis)的那些)是真菌乳糖酶的常见来源，而凝结芽孢杆菌(B.coagulans)和环状芽孢杆菌(B.circulans)是细菌性乳糖酶的公知来源。衍生自这些生物体的几种商业乳糖酶制剂是可获得的，所述乳糖酶制剂如
Figure BDA0003312475830000021
(可从丹麦诺维信公司(Novozymes,Denmark)获得)、HA-乳糖酶(可从丹麦科汉森公司(Chr.Hansen,Denmark)获得)和
Figure BDA0003312475830000022
(可从荷兰DSM公司(DSM,theNetherlands)获得)，这些全部来自乳酸克鲁维酵母。而且，少数两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)乳糖酶是可商购获得的，如Saphera乳糖酶(Saphera)(可从丹麦诺维信公司获得)和NOLA Fit乳糖酶(NOLA Fit)(可从丹麦科汉森公司获得)。所有这些乳糖酶都是所称的中性乳糖酶，所述中性乳糖酶具有在pH 6和pH 8之间的最佳pH，以及在37℃左右的最佳温度。这些乳糖酶不适合于在高温进行在乳底物中的乳糖水解，这在一些情况下对于保持低的微生物数量，从而确保良好的乳质量而言是有益的。
只有少数的最佳温度在50℃以上的商业乳糖酶制剂可获得，但所述乳糖酶制剂是产生GOS的乳糖酶和/或酸性乳糖酶，如Lactoles(来自大和化成工業株式会社(DaiwaKasei)(日本)的商业芽孢杆菌乳糖酶)、FoodPro GOS(来自杜邦公司(DuPont)的两歧双歧杆菌乳糖酶)和NutribioGOS(来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的酸性乳糖酶)，这使得它们在产生乳糖减少的或不含乳糖的中性乳制品时效率较低。
在涉及冰淇淋的US 4374861和US 4333954中，乳糖是在30℃-50℃的较低温度水解的。在这些低温的水解可能有产生大量微生物的风险。
在涉及炼乳的CZ 201100672中，乳糖是在2℃-50℃的较低温度水解的。在这些低温的水解并不高效。另外，在这些低温的水解可能有产生大量微生物的风险。
本发明提供了在50℃-65℃乳糖水解高效的用于产生乳制品的中性乳糖酶。
发明内容
简言之，本说明书总体上公开了用于减少含乳糖的乳基底物和乳制品中的乳糖量的方法，以及通过所述方法产生的乳基底物和乳制品。
本说明书部分地公开了包含具有中性乳糖酶活性的酶的酶制剂，以及编码所述酶的载体和核酸分子、和能够表达所述酶的细胞。
有利地，本文描述的方法产生如下乳基底物和/或乳制品，所述乳基底物和/或乳制品不含乳糖或乳糖的水平有所下降。有利地，所述方法产生的乳基底物和/或乳制品具有更低水平的异味和/或更少的口感缺陷。
通过阅读本说明书，本说明书的传授内容的其他益处对于本领域技术人员而言将是明显的。
附图说明
图1描绘了质粒pCAS-lipA的核苷酸图谱。
图2描绘了质粒pRS426-lipA的核苷酸图谱。
图3描绘了针对图例中所指示乳糖酶的相对乳糖酶最佳温度(范围为从5℃至70℃)。针对所有样品的相对乳糖酶活性在30℃为100％。
图4描绘了针对实验性杜邦公司乳糖酶SEQ ID NO:1和Nola Fit的高温(A：55℃和58℃)乳基底物中的残留乳糖酶活性。在长达360分钟的孵育中，对残留活性进行定量。
图5(A)描绘了Aria Mini乳样品(0.5％脂肪和4.8％乳糖)中的残留乳糖(以％(w/v)计)，所述样品添加了不同的乳糖酶(见图例)并在60℃孵育。示出了针对10至240分钟的孵育的乳样品中的残留乳糖。(B)描绘了在不同温度下使用SEQ ID NO:1的乳糖酶的乳糖减少量。
图6描绘了在室温下储存1周后的添加不同乳糖酶的重组甜炼乳样品。在55℃将脱脂乳粉和水混合，在60℃与乳糖酶组合，在75℃(仅针对试验6为65℃)、80巴均质化之后在75℃将溶化的黄油与糖和Recodan(样品6)混合在一起，并且然后在90℃进行15秒的巴氏杀菌。空白样品8示出了清晰的乳糖晶体形成，而具有乳糖酶SEQ ID NO:1(2-6)和Recodan(6)的样品未示出乳糖晶体形成。
图7描绘了储存6周的煮熟甜炼乳样品。样品具有乳糖酶SEQ ID NO:1(2-6)、和Recodan(6)、磨碎的乳糖(7)和空白(8)。
图8描绘了UHT乳的感官分析。
序列ID号简述
SEQ ID NO:1是来自德氏乳杆菌保加利亚亚种(LBul)的B-半乳糖苷酶的成熟形式的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是脂肪酶A的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是CB 1387的DNA序列。
SEQ ID NO:4是CB 1284的DNA序列。
SEQ ID NO:5是CB 1283的DNA序列。
SEQ ID NO:6是CB 1288的DNA序列。
SEQ ID NO:7是LipA靶位点引物的DNA序列。
SEQ ID NO:8是DH 18-327F的DNA序列。
SEQ ID NO:9是DH 18-273R的DNA序列。
SEQ ID NO:10是DH 18-272F的DNA序列。
SEQ ID NO:11是DH 18-325R的DNA序列。
SEQ ID NO:12是DH 18-317F的DNA序列。
SEQ ID NO:13是DH 18-320R的DNA序列。
SEQ ID NO:14是DH 18-316F的DNA序列。
SEQ ID NO:15是DH 18-318R的DNA序列。
SEQ ID NO:16是DH 18-343R的DNA序列。
SEQ ID NO:17是DH 18-346R的DNA序列。
SEQ ID NO:18是DH 18-385F的DNA序列。
SEQ ID NO:19是DH 18-386R的DNA序列。
SEQ ID NO:20是脂肪酶A的DNA序列。
具体实施方式
此具体实施方式仅旨在使本领域的其他技术人员熟悉申请人的发明、其原理以及其实际应用，以使得本领域的其他技术人员可以其多种形式来改编和应用申请人的发明，因为它们可能最适合于特定用途的要求。此具体实施方式及其具体实例在指示某些方面的同时仅旨在出于说明的目的。因此，本说明书不限于所描述的方面，并且可进行各种修改。
本说明书公开了用于减少含乳糖的乳基底物中乳糖的量的方法，其中所述方法包括使所述底物与具有中性乳糖酶活性的酶在高于约50℃的温度下接触，并且其中所述乳糖酶使所述底物中乳糖的量减少至少约70％。
本说明书还公开了具有减少的乳糖含量的乳基底物，所述乳基底物通过上文(或本说明书中的其他地方)描述的方法获得或可通过所述方法获得。
本说明书进一步公开了用于产生乳制品的方法，其中所述方法包括使所述乳制品与具有中性乳糖酶活性的酶在高于约50℃的温度接触，并且其中所述乳糖酶使所述乳制品中乳糖的量减少至少约70％。
本说明书还公开了通过上文(或本说明书中的其他地方)描述的方法获得或可通过所述方法获得的乳制品。
本说明书进一步部分地公开了酶制剂，其包含具有中性乳糖酶活性的酶，其中所述酶可以在50℃或更高的温度将底物中乳糖的量减少至少70％。
本说明书还部分地公开了酶制剂，其包含具有中性乳糖酶活性的酶，其中所述酶可以在50℃或更高的温度下将底物中乳糖的量减少至少70％，其中所述酶不是SEQ ID NO:1的酶。
本说明书进一步部分地公开了核酸分子，其编码如本文所描述的具有中性乳糖酶活性的酶或其乳糖酶活性片段。
本说明书还部分地公开了表达载体，其包含如上文(或本说明书中的其他地方)描述的核酸分子、或能够表达如本文所描述的具有中性乳糖酶活性的酶或其乳糖酶活性片段。
本说明书还部分地公开了细胞，其能够编码如本文所描述的具有中性乳糖酶活性的酶或其乳糖酶活性片段。
本说明书进一步部分地公开了表达酶的方法，所述方法包括提供如上文(或本说明书中的其他地方)描述的细胞和从所述细胞中表达所述酶，以及任选地纯化所述酶。
本说明书还部分地公开了具有中性乳糖酶活性的酶(如本文所描述的)，所述酶在55℃在乳中的半衰期为多于4小时、或者在58℃为多于1小时。
本说明书进一步部分地公开了如本文所描述的酶制剂用于制备乳制品的用途。
本说明书进一步部分地公开了细菌性表达宿主，其能够表达如本文所描述的具有中性乳糖酶活性的酶，其中所述宿主细胞包含基因修饰，所述基因修饰减少或消除脂肪酶活性，优选地脂肪酶A活性。
本说明书进一步部分地公开了具有中性乳糖酶活性的酶，所述酶由如本文所描述的细菌性表达宿主产生。
本说明书进一步部分地公开了具有中性乳糖酶活性的酶，所述酶由如本文所描述的细菌性表达宿主产生，其中所述酶是如本文所定义的酶制剂。
本说明书还部分地公开了酶乳制品，其包含如本文所描述的细菌性表达宿主。
本说明书进一步部分地公开了如本文所描述的细菌性表达宿主用于制备乳制品的用途。
本说明书进一步部分地公开了用于产生以下的方法：乳糖减少的或不含乳糖的奶昔、冰淇淋、复原乳产品、甜点、布丁、炼乳、加糖炼乳、亚任卡、牛奶焦糖酱或乳基粉，所述方法包括使乳基底物与乳糖酶在50℃-65℃接触。
本说明书还部分地公开了用于产生具有减少的乳糖含量的乳基粉或乳清粉的方法，其中在蒸发/冷凝过程期间添加具有中性乳糖酶活性的酶以便水解。
本说明书进一步部分地公开了用于用具有中性乳糖酶活性的酶从乳基底物产生不含乳糖的乳制品的方法，其中在72℃巴氏杀菌15秒后，所述乳基底物中仍保留超过20％活性。
本说明书进一步部分地公开了用于产生发酵乳制品的方法，所述方法包括在巴氏杀菌和均质化后，例如在冷却至发酵温度期间，添加乳糖酶。
本说明书进一步部分地公开了用于产生发酵乳制品的方法，所述方法包括在巴氏杀菌和均质化后，例如在仅冷却至约50℃-65℃的同时，添加乳糖酶。然后进一步，可进行冷却，并且当温度为45℃左右时添加起子培养物。
本说明书进一步部分地公开了用于在乳基底物中原位产生GOS的方法，所述乳基底物包含至少4.7％(w/w)乳糖，所述方法包括使所述底物与具有中性乳糖酶活性的乳糖酶接触，其中超过30％的所述乳糖被转换为TGOS。
本说明书进一步部分地公开了用于原位产生GOS的方法，其中所述乳基底物包含6％-40％之间的乳糖(w/w)并且其中超过40％的乳糖被转换为TGOS。
本说明书进一步部分地公开了用于减少乳基底物中糖的量的方法，所述方法包括使所述底物与具有中性乳糖酶活性的酶接触，其中乳糖酶被转换为GOS纤维(DP3+)。
本说明书进一步部分地公开了用于从乳基底物产生不含乳糖的乳制品的方法，所述方法具有如下步骤：提供乳基底物；向所述乳基底物中添加具有中性乳糖酶活性的酶；对所述乳基底物进行巴氏杀菌，其中所述酶在所述巴氏杀菌步骤后保留大量的活性；并且将产生的乳基底物储存足够的时间以产生不含乳糖的乳制品。
具有中性乳糖酶活性的酶
术语“具有中性乳糖酶活性的酶”和“乳糖酶”在本文可互换地使用。
具有中性乳糖酶活性的酶是能够将二糖乳糖水解成构成型半乳糖和葡萄糖单体的任何酶。另外，具有中性乳糖酶活性的酶具有约pH 6.0与约pH 8.0之间的最佳pH。中性乳糖酶制剂通常衍生自微生物的细胞质。它们的产生包括微生物的(大规模)发酵，和随后的乳糖酶的分离。后者需要破坏细胞壁，以便使酶从细胞质中释放出来。几种技术可用于获得细胞溶解，包括通过有机溶剂(如辛醇、超声处理或法压(French Pressing))对细胞壁的透化。除乳糖酶外，与此同时还从细胞质中释放出其他酶，包括蛋白酶。
可以根据FCC(第四版,1996年7月,第801-802页:Lactase(neutral)β-galactosidase activity[乳糖酶(中性)β-半乳糖苷酶活性])中描述的程序使用邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)作底物来将中性乳糖酶活性确定为中性乳糖酶单位(NLU)。可以将一个NLU/g定义为在测定条件下释放1.30μM邻硝基苯酚/min的酶的那个量。
术语“具有中性乳糖酶活性的酶”包括酶的催化活性可能所需的任何辅助化合物，例如像，适当的受体或辅因子，所述辅助化合物可能或可能不天然地存在于反应系统中。
在一方面，具有中性乳糖酶活性的酶具有约pH 6.0与约8.0之间的最佳pH。
在一方面，具有中性乳糖酶活性的酶能够在约50℃与约65℃之间的温度水解乳糖。
在一方面，具有中性乳糖酶活性的酶衍生自乳杆菌属物种。
在一方面，具有中性乳糖酶活性的酶衍生自德氏乳杆菌保加利亚亚种。
在一方面，具有中性乳糖酶活性的酶与SEQ ID NO:1具有至少约60％同一性。在一方面，具有中性乳糖酶活性的酶与SEQ ID NO:1具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一方面，具有中性乳糖酶活性的酶是SEQ ID NO:1的酶或其乳糖酶活性片段、其同源物或其变体。
“同源物”意指与主题氨基酸酸序列具有一定程度的同一性或“同源性”的实体。在一方面，所述主题氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
“同源序列”包括与另一个序列具有一定百分比(例如80％、85％、90％、95％或99％)的序列同一性的多核苷酸或多肽。百分比同一性意指，比对时，当比较两个序列时相同的碱基或氨基酸残基的百分比。与主题序列相比，取代、缺失或添加了氨基酸时氨基酸序列是不同一的。通常是关于主题蛋白质的成熟序列(即，例如去除了信号序列之后)来测量百分比序列同一性。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点残基。同源物可以保留野生型酶或参考酶的酶活性，例如中性乳糖酶活性。
如本文所用，“参考酶”、“参考序列”、“参考多肽”意指任何变体多肽所基于的酶和多肽，例如，SEQ ID NO:1。“参考核酸”意指编码参考多肽的核酸序列。如本文所用，术语“参考序列”和“主题序列”可互换地使用。
如本文所用，“实验性杜邦公司乳糖酶”和“LBul”意指来自德氏乳杆菌保加利亚亚种的、具有SEQ ID NO:1中示出的氨基酸序列的热稳定性β-半乳糖苷酶。
如本文所用，“查询序列”意指与参考序列比对以便看看其是否属于本发明的范围内的外源序列。因此，这样的查询序列可以例如是现有技术序列或第三方序列。
如本文所用，取决于上下文，术语“序列”可以是指多肽序列或核酸序列。
如本文所用，术语“多肽序列”和“氨基酸序列”可互换地使用。
“变体(variant或variants)”是指多肽或核酸。术语“变体”可以与术语“突变体”互换地使用。变体包括分别在氨基酸或核苷酸序列中的一个或多个位置的插入、取代、颠换、截短和/或倒位。短语“变体多肽”、“多肽变体”、“多肽”、“变体”和“变体酶”意指具有如下氨基酸序列的多肽/蛋白质/酶，所述氨基酸序列具有或包含如SEQ ID NO:1等所选氨基酸序列或与所述所选氨基酸序列如SEQ ID NO:1相比是经修饰的。变体可以保留野生型酶或参考酶的酶活性，例如中性乳糖酶活性。
如本文所用，术语“片段”在本文定义为从氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(若干个)氨基酸的多肽，其中所述片段具有活性。
在一方面，术语“片段”在本文定义为从SEQ ID NO:1的多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(若干个)氨基酸的多肽，其中所述片段具有中性乳糖酶活性。
SEQ ID NO:1的乳糖酶活性片段可以是SEQ ID NO:1的具有中性乳糖酶活性的任何片段。例如，SEQ ID NO:1的乳糖酶活性片段可以是SEQ ID NO:1的氨基酸1至618、1至713、或1至1002。
序列同一性程度
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联性由参数“同一性”描述。
在一方面，通过以下方式来确定查询序列与参考序列之间的序列同一性程度：1)通过使用默认评分矩阵和默认空位罚分的任何合适的比对程序来比对两个序列，2)鉴定精确匹配的数目，其中精确匹配是其中比对程序已经在比对的给定位置处鉴定出两个所比对序列中的同一的氨基酸或核苷酸的情况，以及3)用精确匹配的数目除以参考序列的长度。
在一方面，通过以下方式来确定查询序列与参考序列之间的序列同一性程度：1)通过使用默认评分矩阵和默认空位罚分的任何合适的比对程序来比对两个序列，2)鉴定精确匹配的数目，其中精确匹配是其中比对程序已经在比对的给定位置处鉴定出两个所比对序列中的同一的氨基酸或核苷酸的情况，以及3)用精确匹配的数目除以两个序列中最长的长度。
在另一方面，通过以下方式来确定查询序列与参考序列之间的序列同一性程度：1)通过使用默认评分矩阵和默认空位罚分的任何合适的比对程序来比对两个序列，2)鉴定精确匹配的数目，其中精确匹配是其中比对程序已经在比对的给定位置处鉴定出两个所比对序列中的同一的氨基酸或核苷酸的情况，以及3)用精确匹配的数目除以“比对长度”，其中所述比对长度是包括序列的空位和突出部分的整个比对的长度。
序列同一性比较可以通过眼睛，或更通常地借助于容易获得的序列比较程序进行。这些可商购获得的计算机程序使用复杂的比较算法来比对两个或更多个序列，其最好地反映出可能导致两个或更多个序列之间的一个或多个差异的进化事件。因此，这些算法使用评分系统进行操作，评分系统奖励同一或相似氨基酸的比对，并惩罚空位的插入、空位延伸和不相似氨基酸的比对。比较算法的评分系统包括：
每当插入空位时指定罚分(空位罚分)
每当现有的空位用额外的位置扩大时指定罚分(延伸罚分)，
当比对同一的氨基酸时指定高分，以及
当比对非同一的氨基酸时指定可变分数。
大多数比对程序允许待修饰的空位罚分。然而，优选的是当使用此类软件进行序列比较时使用默认值。
对于非同一的氨基酸的比对给出的得分是根据评分矩阵(也称作取代矩阵)指定的。在所述取代矩阵中提供的得分所反映的事实是：进化过程中一个氨基酸被另一个所取代的可能性是变化的并且其取决于将被取代的氨基酸的物理/化学性质。例如，与被疏水性氨基酸取代相比，极性氨基酸被另一极性氨基酸取代的可能性更高。因此，评分矩阵将为同一的氨基酸指定最高分数，为非同一但相似的氨基酸指定较低分数，并且为非同一的不相似氨基酸指定甚至更低分数。最常用的评分矩阵是PAM矩阵(Dayhoff等人(1978),Jones等人(1992))、BLOSUM矩阵(Henikoff和Henikoff(1992))和Gonnet矩阵(Gonnet等人(1992))。
用于进行这种比对的合适的计算机程序包括但不限于载体NTI(英杰公司(Invitrogen Corp.))和ClustalV、ClustalW和ClustalW2程序(Higgins DG&Sharp PM(1988),Higgins等人(1992),Thompson等人(1994),Larkin等人(2007))。可从网址为www.expasy.org的ExPASy蛋白质组学服务器(ExPASy Proteomics server)获得不同比对工具的选择。可以执行序列比对的软件的另一个实例是BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))，BLAST可从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的网页获得，所述网页目前可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/找到，并且BLAST首先在Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215；403-410中进行了描述。
在本发明的优选方面，比对程序正在执行全局比对程序，所述全局比对程序优化了对全长序列的比对。在另一个优选方面，全局比对程序是基于尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman,Saul B.；和Wunsch,Christian D.(1970),“Ageneral method applicable to the search for similarities in the amino acidsequence of two proteins[适用于搜索两种蛋白质氨基酸序列相似性的一般方法]”,Journal of Molecular Biology[分子生物学杂志]48(3):443-53)。使用尼德尔曼-翁施算法执行全局比对的当前程序的实例是EMBOSS Needle和EMBOSS Stretcher程序，两者均可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa/上获得。
EMBOSS Needle使用尼德尔曼-翁施比对算法执行最佳全局序列比对，以沿其整个长度找到两个序列的最佳比对(包括空位)。
EMBOSS Stretcher使用尼德尔曼-翁施算法的修改版，所述修改版允许对更大序列进行全局比对。
在一方面，通过全局比对程序对序列进行比对，并且通过鉴定由程序鉴定的精确匹配的数目、除以“比对长度”来计算序列同一性，其中比对长度是包括序列的空位和突出部分的整个比对的长度。
在另一个方面，全局比对程序使用尼德尔曼-翁施算法，并且通过鉴定由程序鉴定的精确匹配的数目、除以“比对长度”来计算序列同一性，其中比对长度是包括序列的空位和突出部分的整个比对的长度。
在又另一个方面，全局比对程序选自由以下组成的组：EMBOSS Needle和EMBOSSstretcher，并且通过鉴定由程序鉴定的精确匹配的数目、除以“比对长度”来计算序列同一性，其中比对长度是包括序列的空位和突出部分的整个比对的长度。
一旦软件生成了比对，就可以计算出相似度％和序列同一性％。典型地，作为序列比较的一部分，软件进行此计算，并且生成数值结果。
在一方面，优选的是使用ClustalW软件来进行序列比对。优选地，使用以下成对比对的参数进行采用ClustalW的比对：
取代矩阵： Gonnet 250
空位开放罚分： 20
空位延伸罚分： 0.2
空位终止罚分： 无
ClustalW2例如可在互联网上在欧洲生物信息学研究所(EuropeanBioinformatics Institute)的EMBL-EBI网页www.ebi.ac.uk的工具-序列分析-ClustalW2下获得。目前，ClustalW2工具的确切地址是www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2。
在另一方面，优选的是使用载体NTI(英杰公司)中的程序比对X(Align X)进行序列比对。在一方面，Exp 10可以与默认设置一起使用：
空位开放罚分：10
空位延伸罚分：0.05
空位分离罚分范围：8
在另一方面，通过使用分数矩阵：blosum62mt2和VectorNTI成对比对设置来确定一个氨基酸序列与，或相对于，另一个氨基酸序列的比对。
Figure BDA0003312475830000141
在一方面，通过使用字号为3并且使用BLOSUM 62作为取代矩阵的Blast来确定一个氨基酸序列与，或相对于，另一个氨基酸序列的同一性的百分比。
经纯化的酶
在一方面，具有中性乳糖酶活性的酶是经纯化的。
在一方面，经纯化的酶是SEQ ID NO:1的酶。
在一方面，如本文所用的术语“经纯化的”是指具有中性乳糖酶活性的酶本质上不含来自产生生物体的不溶性组分。在其他方面，术语“经纯化的”还指具有中性乳糖酶活性的酶，其本质上不含来自从中获得所述酶的原生生物体的不溶性组分。在一方面，具有中性乳糖酶活性的酶也是从衍生所述酶的生物体和培养基的可溶性组分中的一些中分离出的。可以通过如下单元操作中的一个或多个对具有中性乳糖酶活性的酶进行纯化(即分离)：过滤、沉淀或色谱法。
因此，可以对具有中性乳糖酶活性的酶进行纯化，以使得仅少量的其他蛋白质存在。表述“其他蛋白质”特别地涉及其他酶。如本文所用的术语“经纯化的”还指去除了其他组分，特别地其他蛋白质并且最特别地存在于乳糖酶的起源细胞中的其他酶。乳糖酶可以是“基本上纯的”，即不含来自产生所述乳糖酶的生物体(即，例如，针对重组产生的乳糖酶的宿主生物体)的其他组分。在一方面，乳糖酶是在至少40％(w/w)纯的酶制剂中。在一方面，乳糖酶是在至少50％、60％、70％、80％或90％(w/w)纯的酶制剂中。如本文所用，“基本上纯的酶”表示如下酶制剂，所述酶制剂含有按重量计至多10％，优选地至多8％，更优选地至多6％，更优选地至多5％，更优选地至多4％，更优选地至多3％，甚至更优选地至多2％，最优选地至多1％，并且甚至最优选地至多0.5％的与其天然地或重组地缔合的其他多肽材料。
因此，优选的是基本上纯的酶是按制剂中存在的总多肽材料的重量计至少92％纯，优选地至少94％纯，更优选地至少95％纯，更优选地至少96％纯，更优选地至少96％纯，更优选地至少97％纯，更优选地至少98％纯，甚至更优选地至少99％纯，最优选地至少99.5％纯，并且甚至最优选地100％纯的。本发明的酶优选地呈基本上纯的形式(即，制剂本质上不含与其天然地或重组地缔合的其他多肽材料)。这可以例如通过熟知的重组方法或通过经典纯化方法制备多肽来实现。
因此，如本文所用，术语“基本上不含脂肪酶”意指如下制剂，所述制剂含有按重量计至多10％，优选地至多8％，更优选地至多6％，更优选地至多5％，更优选地至多4％，至多3％，甚至更优选地至多2％，最优选地至多1％，并且甚至最优选地至多0.5％的脂肪酶。因此，在本文，术语“基本上不含”可以被看作与术语“分离的酶”和“呈分离形式的酶”同义。术语“分离的”意指多肽至少基本上不含与序列在自然界中天然缔合或者在自然界中发现的至少一种其他组分。在一方面，如本文所用的“分离的多肽”是指如通过SDS-PAGE确定的是至少30％纯、至少40％纯、至少60％纯、至少80％纯、至少90％纯、和至少95％纯的多肽。
因此，如本文所用，术语“基本上不含对硝基苯甲基酯酶”意指如下制剂，所述制剂含有按重量计至多10％，优选地至多8％，更优选地至多6％，更优选地至多5％，更优选地至多4％，至多3％，甚至更优选地至多2％，最优选地至多1％，并且甚至最优选地至多0.5％的对硝基苯甲基酯酶。因此，在本文，术语“基本上不含”可以被看作与术语“分离的酶”和“呈分离形式的酶”同义。
因此，如本文所用，术语“基本上不含纤维素酶”意指如下制剂，所述制剂含有按重量计至多10％，优选地至多8％，更优选地至多6％，更优选地至多5％，更优选地至多4％，至多3％，甚至更优选地至多2％，最优选地至多1％，并且甚至最优选地至多0.5％的纤维素酶。因此，在本文中，术语“基本上不含”可以被看作与术语“分离的多肽”和“呈分离形式的多肽”同义。
如本文所用，术语“基本上不含甘露聚糖酶”在本文意指如下制剂，所述制剂含有按重量计至多10％，优选地至多8％，更优选地至多6％，更优选地至多5％，更优选地至多4％，至多3％，甚至更优选地至多2％，最优选地至多1％，并且甚至最优选地至多0.5％的甘露聚糖酶。因此，在本文中，术语“基本上不含”可以被看作与术语“分离的多肽”和“呈分离形式的多肽”同义。
如本文所用，术语“基本上不含果胶酶”在本文意指如下制剂，所述制剂含有按重量计至多10％，优选地至多8％，更优选地至多6％，更优选地至多5％，更优选地至多4％，至多3％，甚至更优选地至多2％，最优选地至多1％，并且甚至最优选地至多0.5％的果胶酶。因此，在本文中，术语“基本上不含”可以被看作与术语“分离的多肽”和“呈分离形式的多肽”同义。
如本文所用，术语“基本上不含淀粉酶”在本文意指如下制剂，所述制剂含有按重量计至多10％，优选地至多8％，更优选地至多6％，更优选地至多5％，更优选地至多4％，至多3％，甚至更优选地至多2％，最优选地至多1％，并且甚至最优选地至多0.5％的淀粉酶。因此，在本文中，术语“基本上不含”可以被看作与术语“分离的多肽”和“呈分离形式的多肽”同义。
在另一方面，本公开涉及经纯化的具有中性乳糖酶活性的酶，所述酶通过本文描述的方法产生。
在其他方面，本公开涉及如下经纯化的酶，所述经纯化的酶不具有脂肪酶副活性、磷脂酶副活性、纤维素酶副活性、果胶酶副活性、淀粉酶副活性、蛋白酶副活性和/或甘露聚糖酶副活性。在某些其他方面，本公开涉及包含经纯化的酶的乳制品，所述乳制品通过本公开的方法产生。
如本文所定义的，“内源基因”是指位于生物体基因组的其天然位置中的基因。
如本文所定义的，“异源”基因、“非内源”基因、或“外源”基因是指通常不在宿主生物体中被发现，但通过基因转移引入到宿主生物体中的基因(或ORF)。如本文所用，术语一个或多个“异源”基因包含插入到非天然生物体中的天然基因(或ORF)和/或插入到天然或非天然生物体中的嵌合基因。
如本文所用，术语“外源多核苷酸”或“异源多核苷酸”(以及其变体)的定义如下：(A)对于宿主细胞而言不是天然的多核苷酸，(B)对于宿主细胞而言是天然的多核苷酸，但所述多核苷酸已经通过使用以下而被修饰：基因元件(其不与如从宿主细胞中分离出的多核苷酸(例如，异源启动子、5’UTR、3’UTR等)天然地缔合)或(C)天然元件(其已经被操纵以便以在宿主细胞中通常不会发生的方式发挥作用)。
如本文所定义的，“异源”核酸构建体或“异源”核酸序列具有如下序列的一部分，所述序列对于其被表达的细胞不是天然的。
如本文所用，“转化的细胞”包括已经通过使用重组DNA技术转化的细菌性细胞(例如，芽孢杆菌属细胞)。转化通常通过将一个或多个核苷酸序列(例如，多核苷酸)插入到细胞中而发生。所引入的一个或多个核苷酸序列还可以是异源核苷酸序列(即，对于细胞而言不是内源的核酸序列)。
如本文所用，术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子(例如，多核苷酸分子)，所述核酸分子从天然存在的基因中分离或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的。当核酸构建体含有表达编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
如本文所用，将术语“控制序列”定义为包括针对表达编码本发明多肽的多核苷酸是所需的或有利的所有组分。每个控制序列对于编码多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于，前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，控制序列可以提供有多个接头。
如本文所定义的，“异源控制序列”是指如下基因表达控制序列(例如，启动子或增强子)，所述基因表达控制序列本质上不起作用以调控(控制)目的基因的表达。通常，异源核酸序列对于它们存在的细胞或基因组的一部分而言不是内源(天然)的，并且已经通过感染、转染、转化、显微注射、电穿孔等添加到细胞中。“异源”核酸构建体可以含有与在天然宿主细胞中发现的控制序列/DNA编码(ORF)序列组合相同或不同的控制序列/DNA编码序列组合。
如本文所用，术语“启动子”被定义为如下DNA序列，所述DNA序列结合RNA聚合酶并将聚合酶引导至编码多肽的多核苷酸的正确下游转录起始位点。RNA聚合酶有效地催化信使RNA的组装，所述信使RNA与编码区的适当DNA链互补。术语“启动子”还将被理解为包括用于在转录为mRNA后翻译的5’非编码区(在启动子与翻译起始之间)、顺式作用的转录控制元件(如增强子)、和/或能够与转录因子相互作用的其他核苷酸序列。启动子可以是野生型、变体、杂交或共有启动子(consensus promoter)。
如本文所用，术语“启动子区”被定义为包含一个或多个(若干个)启动子序列(例如，双重启动子、三重启动子等)的核苷酸序列。
如本文所用，术语“有效地连接的”表示其中将控制序列(例如，启动子序列)相对于多核苷酸序列的编码序列置于适当位置处使得控制序列引导多肽的编码序列表达的构型。编码序列：当在本文使用时，术语“编码序列”意指直接指明其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由可读框决定，所述可读框通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。
如本文所用，“表达”包括涉及目的多肽(POI)的产生的任何步骤，所述步骤包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
如本文所用，“表达载体”和“表达构建体”可互换地使用并且是指线性或环状DNA分子，所述DNA分子包含编码目的多肽的多核苷酸并且有效地连接到使其得以表达的额外的核苷酸。
在本发明上下文中，“主要成分之一”意指具有如下干物质的成分，所述干物质占乳制品总干物质的20％以上，优选地30％以上或40％以上，而“主要成分”意指具有如下干物质的成分，所述干物质占乳制品总干物质的50％以上、优选地60％以上或70％以上。
酶性质
在一方面，具有中性乳糖酶活性的酶是经浓缩的。在一方面，与浓缩之前的酶相比，酶被浓缩了1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、100、或1000倍。在一方面，可以将乳糖酶浓缩至约10至100mg/ml。
在一方面，所述具有中性乳糖酶活性的酶在60℃的活性是在50℃活性的至少50％。
在一方面，在55℃所述酶在乳中的半衰期为多于4小时、或者在58℃为多于约1小时。
在一方面，所述具有中性乳糖酶活性的酶具有约60℃的最佳温度。
在一方面，所述具有中性乳糖酶活性的酶具有约5.5至约8.0的最佳pH。在一方面，所述具有中性乳糖酶活性的酶具有约5.7至约7.6的最佳pH。
在一方面，当在37℃测量时，所述具有中性乳糖酶活性的酶在pH6.0的乳糖酶活性为其在pH 6.5乳糖酶活性的至少50％。
在一方面，半乳寡聚糖是DP3+半乳寡聚糖。因此，在一方面，具有乳糖酶活性的酶将底物中约35％或更少的乳糖转换为DP3+半乳寡聚糖。优选地，具有乳糖酶活性的酶将底物中约30％或更少的乳糖转换为DP3+半乳寡聚糖，更优选地具有乳糖酶活性的酶将底物中约29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％或更少的乳糖转换为DP3+半乳寡聚糖。
在一方面，所述具有中性乳糖酶活性的酶具有大于1:1的乳糖酶:转半乳糖基酶活性比率。在一方面，在其中酶的乳糖酶活性高于转半乳糖基化活性(例如，高出2、3、4、5、6、7、8、9或10倍)的条件下进行接触。乳糖酶活性与转半乳糖基酶活性之比率可以例如通过HPLC分析来确定。乳糖可以被转换为等量的游离葡萄糖和游离半乳糖。
除其他事项之外，“转半乳糖基酶”意指能够将半乳糖转移至D-半乳糖或D-葡萄糖的羟基基团(由此产生半乳寡聚糖)的酶。在一方面，通过酶在乳糖上的反应来鉴定转半乳糖基酶，其中产生的半乳糖的量小于在任何给定时间产生的葡萄糖的量。
在本发明上下文中，术语“转半乳糖基化活性”意指将半乳糖部分转移至除水以外的分子。活性可以被测量为[葡萄糖]-反应期间的任何给定时间产生的[半乳糖]，或通过直接定量在反应期间的任何给定时间产生的GOS来测量。该测量可以以若干种方式进行，如通过实例中所示的HPLC方法进行。当比较转半乳糖基化活性的测量值时，它们可能已经在给定的初始乳糖浓度(例如像，3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(w/w))下进行。
在一方面，具有乳糖酶活性的酶可以具有低于120％的转半乳糖基化活性比率。
转半乳糖基化活性比率＝(Abs420+纤维二糖/Abs420-纤维二糖)*100％，其中Abs420+纤维二糖是使用以下描述的方法在420nm处读取的吸光度，在反应中包括纤维二糖，并且Abs420-纤维二糖是使用以下描述的方法在420nm处读取的吸光度，而在反应中没有纤维二糖。以上方程仅针对其中吸光度在0.5和1.0之间的稀释有效。
测量β-半乳糖苷酶活性
可以使用可商购获得的底物2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)(西格玛公司(Sigma)N1127)测量酶活性。
ONPG w/o受体
100mM KPO4 pH6.0
12,3mM ONPG
补充有受体的ONPG
100mM KPO4 pH6.0
20mM纤维二糖
12,3mM ONPG
终止溶液
10％Na2CO3
可以将10μl稀释系列的经纯化酶添加到含有90μl ONPG缓冲液的具有或没有受体的微量滴定板的孔中。可以将样品混合并在37℃孵育10min，随后可以向每个孔中添加100μl终止溶液以终止反应。可以在由Softmax软件包控制的分子装置SpectraMax平板读数器上在420nm下记录吸光度测量值。
对于其中吸光度在0.5和1.0之间的稀释液，可以将转半乳糖基化活性的比率计算为如下：转半乳糖基化活性的比率＝(Abs420+纤维二糖/Abs420-纤维二糖)*100。
在一方面，在15min反应、30min反应、60min反应、90min反应、120min反应或180min反应后测量活性。因此，在一方面，作为实例，在添加酶后15分钟，如添加酶后30分钟，如添加酶后60分钟，如添加酶后90分钟，如添加酶后120分钟或如添加酶后180分钟，测量相对转半乳糖基化活性。
在本发明上下文中，术语“转半乳糖基化活性:乳糖酶活性的比率”意指([葡萄糖]-[葡萄糖]/[半乳糖])。
在本发明上下文中，术语[葡萄糖]意指如通过HPLC测量的以重量％计的葡萄糖浓度。
在本发明上下文中，术语[半乳糖]意指如通过HPLC测量的以重量％计的半乳糖浓度。
在本发明上下文中，术语“已经将乳糖转半乳糖基化”意指半乳糖分子已经共价连接至乳糖分子，例如像共价连接至乳糖分子中的游离羟基基团中的任一个，或者如通过例如形成异乳糖的内部转半乳糖基化产生的。
在一方面，具有中性乳糖酶活性的酶当水解乳基底物或乳制品中的乳糖时具有大于1:1(如大于2:1或大于3:1)的乳糖酶活性与转半乳糖基酶活性之比率。在另一方面，酶处理是在其中酶的乳糖酶活性高于转半乳糖基酶活性(如高出至少两倍或高出至少三倍)的条件下进行的。乳基底物中乳糖酶活性与转半乳糖基酶活性之比率可以例如通过HPLC分析来确定。
在一方面，所述具有中性乳糖酶活性的酶具有高于100％的乳糖活性的比率。在一方面，具有中性乳糖酶活性的酶的多肽具有高于120％(如高于150％、175％或200％)的乳糖酶活性的比率。
本文提及的乳糖酶可以是细胞外的乳糖酶。所述乳糖酶可以在其N末端处具有信号序列，在分泌期间所述信号序列被切割。
本文提及的乳糖酶可以衍生自本文提及的来源中的任一种。在该上下文中，术语“衍生的”意指酶可以是已经从其天然存在的生物体中分离出的，即所述酶的氨基酸序列的同一性是与天然酶相同的。术语“衍生的”还意指酶可以是已经在宿主生物体中重组地产生的，重组地产生的酶具有与天然酶相同的同一性，或具有经修饰的氨基酸序列，例如具有缺失、插入和/或取代的一个或多个氨基酸，即它是作为天然氨基酸序列的突变体和/或片段的重组地产生的酶。天然变体包括在天然酶的含义内。此外，术语“衍生的”包括通过例如肽合成而合成地产生的酶。术语“衍生的”还涵盖如下酶，所述酶已经例如通过无论在体内还是在体外的糖基化、磷酸化等进行了修饰。关于重组地产生的酶，术语“衍生自”是指酶的同一性，而非酶在其中重组地产生的宿主生物体的同一性。
可以通过使用任何合适的技术从微生物中获得乳糖酶。例如，可以通过以下方式来获得乳糖酶制剂：发酵合适的微生物，并且随后通过本领域中已知的方法从由此产生的发酵液或微生物中分离出乳糖酶制剂。还可以通过使用重组DNA技术获得乳糖酶。这种方法通常包括培养用重组DNA载体转化的宿主细胞，所述重组DNA载体包含编码所讨论的乳糖酶的DNA序列，并且所述DNA序列与适当的表达信号可操作性地连接，以使得所述DNA序列能够在如下条件下在培养基中表达乳糖酶，所述条件允许所述酶的表达以及从培养物中对所述酶的回收。还可以将DNA序列并入到宿主细胞的基因组中。DNA序列可以具有基因组、cDNA或合成来源或这些来源的任何组合，并且可以根据本领域中已知的方法进行分离或合成。
可以通过副活性与乳糖酶活性的比率来确定乳糖酶的质量。已知蛋白酶会导致不良的副作用，如乳凝结或乳中异味形成。在具有长保质期且在室温下储存的产品中，异味形成尤其关键。一种这种产品是UHT乳，并且针对乳糖水解的UHT乳，异味形成是已知的问题。UHT乳对异味形成非常敏感；当乳糖酶制剂在UHT乳中不产生异味时，它通常也不会在其他应用中产生异味。与乳(并且尤其是UHT乳)中异味形成相关的化合物与蛋白水解和美拉德反应(Maillard reaction)有关(Valero等人(2001)Food Chem.[食品化学]72,51-58)。在乳糖酶制剂中作为副活性存在的任何蛋白酶都有可能促进异味形成；尚不清楚需要多少水平的蛋白酶，但随着几个月的储存时间，即使非常低的蛋白水解活性也可能是重要的。UHT乳对异味形成非常敏感；当乳糖酶制剂在UHT乳中不产生异味时，除了所描述的异味(如例如在Valero等人(2001)Food Chem.[食品化学]72,51-58中所描述的)，它通常也不在其他应用中产生异味。因此，UHT应用是评价乳糖酶制剂质量(在其异味潜在性方面)的良好方法。由于蛋白酶被认为至少部分地对异味形成负有责任，已经努力降低乳糖酶产品的蛋白酶水平。
在一方面，所述具有中性乳糖酶活性的酶呈酶制剂的形式。
酶制剂
在一方面，所述具有中性乳糖酶活性的酶呈酶制剂的形式，所述酶制剂具有降低的水平的副活性。“制剂”是包含酶的任何合适组合物。
例如在55℃或更高的温度、或如本文所描述的其他温度，酶制剂可以将底物中乳糖的量减少至少约70％。
在一方面，所述具有中性乳糖酶活性的酶呈酶制剂的形式，所述酶制剂具有降低的水平的以下副活性中的一种或多种：脂肪酶活性、蛋白酶活性、淀粉酶活性、甘露聚糖酶活性、果胶酶活性、纤维素酶活性和/或对硝基苯甲基酯酶活性。
在一方面，所述具有中性乳糖酶活性的酶呈酶制剂的形式，所述酶制剂具有降低的水平的脂肪酶副活性。
在一方面，所述具有中性乳糖酶活性的酶呈酶制剂的形式，所述酶制剂具有降低的水平的蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、果胶酶、纤维素酶和/或对硝基苯甲基酯酶副活性。
在一方面，所述酶制剂具有降低的水平的副活性。在一方面，所述酶制剂具有降低的水平的以下副活性中的一种或多种：脂肪酶活性、蛋白酶活性、淀粉酶活性、甘露聚糖酶活性、果胶酶活性、纤维素酶活性和/或对硝基苯甲基酯酶活性。
在一方面，所述酶制剂具有降低的水平的脂肪酶副活性。
在一方面，所述酶制剂具有降低的水平的蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、果胶酶、纤维素酶和/或对硝基苯甲基酯酶副活性。
与如本文所用的短语“降低的水平的脂肪酶副活性”和“降低的水平的蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、果胶酶、纤维素酶和/或对硝基苯甲基酯酶副活性”相联系的术语“降低的水平”可以指与如下酶制剂相比降低的水平，所述酶制剂含有由不同的宿主细胞产生的具有中性乳糖酶活性的酶。降低的水平可以指与由未经修饰的宿主细胞(即未经历如本文所描述的修饰中的任一种的宿主细胞)产生的酶制剂相比降低的水平。如本发明实例中所展示的，由经过培训的小组进行的感官分析得出结论，用副活性较少的经修饰宿主产生的酶产生的乳是优选的。在一方面，酶制剂在减少的异味形成方面具有改善的性质。还如在实例中所描述的，根据本发明的酶制剂可以促使口感的改善(例如在炼乳中)。
不希望受理论束缚，乳糖酶的副活性(如脂肪酶活性、蛋白酶活性、淀粉酶活性、甘露聚糖酶活性、果胶酶活性、纤维素酶活性和/或对硝基苯甲基酯酶活性)影响乳基底物或乳制品的风味并且导致例如乳制品味道不佳。降低乳糖酶的副活性可进而降低例如乳基底物或乳制品的异味水平。
酶制剂可以有利地用于乳制品中以水解乳糖而不形成异味化合物。乳糖酶可以是细胞内或细胞外产生的乳糖酶。在优选的方面，乳糖酶是细胞内产生的乳糖酶。细胞外乳糖酶也已经描述。它们通常被认为是细胞外酶，因为它们含有被称为前导序列的肽序列。该前导序列被产生酶的细胞以某种方式识别，作为酶应该被输出到细胞外的信号。在分泌期间，前导序列通常被去除。已经针对不同的物种(例如米曲霉)对细胞外乳糖酶进行了描述。细胞外乳糖酶的粗制剂的特征是缺乏细胞内酶且存在典型的细胞外酶(像蛋白酶)。细胞外酶的类型因生物体而异，并且针对该生物体是典型的。由于在发酵或处理期间的细胞溶解，在此类细胞外酶制剂中可以发现低水平的细胞内酶。因此，基于乳糖酶的氨基酸序列与其他已知乳糖酶的那些氨基酸序列的比较，可以将乳糖酶归类为细胞外或细胞内乳糖酶。原则上，细胞内乳糖酶可以提供有前导序列。这可能导致乳糖酶从细胞排泄到培养基中。在典型的细胞外酶存在而典型的细胞内酶缺乏或水平较低的情况下，此类酶的粗制剂的特征是乳糖酶(在其氨基酸序列的基础上将其归类为细胞内乳糖酶)。
酶或酶制剂可以呈适合于所讨论用途的任何形式，例如像，呈干粉或颗粒、非粉尘颗粒、液体、稳定液体或受保护的酶的形式。
在选定的反应条件下，将酶或酶制剂以合适的量添加以达到预期程度的乳糖水解。可以将酶以约0.1至10g/L乳基底物之间，例如0.2至2g/L的乳基底物的浓度添加。在一方面，可以将酶或酶制剂以每升乳基底物约20至300NLU/g乳糖之间，例如约24至240NLU/g乳糖之间的量添加。
如本文所用，术语“乳糖减少的”和“不含乳糖的”是指在将乳基底物或乳制品与乳糖酶接触后所述乳基底物或乳制品中的乳糖量的减少。
在一方面，所述乳糖量减少至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
在一方面，将所述乳糖减少至低于100ppm或低于1000ppm。
在某个方面，在180分钟内在超过50℃的温度将所述乳糖减少至低于100ppm。在某个方面，在120分钟内在超过50℃的温度将所述乳糖减少至低于100ppm。
乳基底物
如本文所用的术语“乳”是指通过对任何哺乳动物(如奶牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼)挤奶获得的乳分泌物。
如本文所用的术语“乳基底物”可以是任何生的和/或经处理的乳材料。在一方面，所述乳基底物选自包含乳糖的任何乳或乳样产品的溶液/悬浮液，如全脂或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复原乳粉、炼乳、乳粉溶液、UHT乳、乳清、乳清渗透物、酸乳清或奶油。
在一方面，基于乳的底物是乳或脱脂乳粉的水溶液。
乳基底物可以比生乳更浓。
在一方面，所述乳基底物为生乳，所述生乳在与所述酶接触之前未经巴氏杀菌。
在一方面，乳基底物包含约3％至约60％乳糖。在一方面，乳基底物包含约3％至约30％乳糖。在一方面，乳基底物包含约3％至约16％乳糖。
在一方面，在与具有中性乳糖酶活性的酶接触前乳基底物包含约3％至约60％乳糖。在一方面，在与具有中性乳糖酶活性的酶接触前乳基底物包含约3％至约30％乳糖。在一方面，在与具有中性乳糖酶活性的酶接触前乳基底物包含约3％至约16％乳糖。
在一方面，乳基底物的蛋白质与乳糖的比率为至少0.2，优选地至少0.3，至少0.4，至少0.5，至少0.6，或最优选地至少0.7。
可以根据本领域已知的方法对乳基底物进行均质化和巴氏杀菌。
如本文所用的术语“均质化”意指强烈混合以获得可溶性悬浮液或乳液。可以进行该均质化以便将乳脂分解成更小的尺寸，这样使得乳脂不再与该乳分离。这可以通过在高压下使该乳通过小孔来实现。
如本文所用的术语“巴氏杀菌”意指减少或消除活生物体如微生物在乳基底物中的存在。在一方面，通过将指定温度维持指定的时间段来实现巴氏杀菌。指定的温度通常通过加热来实现。可以选择温度和持续时间以便杀灭或使某些细菌，如有害细菌失活，和/或使该乳中的酶失活。可以遵循快速冷却步骤。
在一方面提供了如本文所描述的具有减少的乳糖含量的乳基底物。可以通过如本文所描述的方法产生具有减少的乳糖含量的乳基底物。
乳制品
本发明涵盖通过如本文所描述的方法中的任一种获得或可通过所述方法中的任一种获得的乳制品。
如本文所用的术语“乳制品”可以是其中主要成分之一是乳基的任何食品。在一方面，主要成分是乳基的。在一方面，主要成分是已经根据本发明的方法用具有中性乳糖酶活性的酶处理过的乳基底物。如本文所用，术语“主要成分之一”意指具有如下干物质的成分，所述干物质占乳制品总干物质的20％、30％或40％以上。如本文所用，术语“主要成分”意指具有如下干物质的成分，所述干物质占乳制品总干物质的50％、60％或70％以上。
如本文所描述的，本发明可使具有减少的乳糖含量的乳制品得以产生。在一方面，将所述乳糖量减少至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，优选地至少约97％。在一方面，将乳基底物中的乳糖量减少至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，优选地至少约97％。在一方面，与乳基底物相比，将乳制品中的乳糖量减少至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，优选地至少约97％。
在一方面，通过本文所描述的方法产生的乳制品含有低于100ppm乳糖。在一方面，通过本文所描述的方法产生的乳制品含有低于1000ppm乳糖。
在一方面，在约180分钟内，优选地在约170、160、150、140、130、120、110、100或90分钟内在超过50℃的温度下将乳糖减少至低于100ppm。在一方面，可以使用约35至约100mg酶/l奶。在一方面，可以使用约0.75至约2.2mg酶/g乳糖。
如本文所描述的乳制品可以是，例如脱脂乳、低脂乳、全脂乳、奶油、UHT乳、具有延长保质期的乳、发酵的乳产品、奶酪、酸奶、黄油、乳质涂抹料、酪乳、酸化乳饮料、酸性奶油、乳清基饮料、炼乳、牛奶焦糖酱、风味乳饮料、加糖炼乳、乳粉、复原乳制品、冰淇淋、亚任卡、布丁、甜点或奶昔。乳制品可以通过本领域已知的任何方法制造。
在一方面，所述乳制品选自由以下组成的组：脱脂乳、低脂乳、全脂乳、奶油、UHT乳、具有延长保质期的乳、发酵的乳产品、奶酪、酸奶、黄油、乳质涂抹料、酪乳、酸化乳饮料、酸性奶油、乳清基饮料、炼乳、牛奶焦糖酱、风味乳饮料、加糖炼乳、乳粉、复原乳制品、冰淇淋、亚任卡、布丁、甜点和奶昔。在一方面，所述乳制品是炼乳、冰淇淋或奶昔。在一方面，所述乳制品是乳粉或乳清粉。
“发酵乳制品”应被理解为任何乳制品，其中任何类型的发酵形成产生过程的一部分。发酵乳制品的实例是产品像酸奶、酪乳、鲜奶油、奶渣和清爽干酪。发酵乳制品的另一个实例是奶酪。发酵乳制品可以通过本领域已知的任何方法来产生。
术语“发酵”意指通过微生物如起子培养物的作用将碳水化合物转换为醇或酸。在一方面，发酵包括将乳糖转换为乳酸。
在本发明上下文中，“微生物”可以包括能够发酵乳底物的任何细菌或真菌。
乳制品可以额外地包括非乳组分，例如，植物组分例如像植物油、植物蛋白和/或植物碳水化合物。乳制品还可以包括另外的添加剂，例如像酶、调味剂、微生物培养物如益生菌培养物、盐、甜味剂、糖、酸、水果、果汁或本领域已知的可作为乳制品的组分或添加剂的任何其他组分。
减少乳糖的方法
在一方面，所述方法包括使乳基底物与具有中性乳糖酶活性的酶在约50℃至约90℃，优选地约50℃至约65℃，更优选地约55℃至约60℃的温度接触。
在一方面，所述方法包括使乳基底物与如本文所描述的具有中性乳糖酶活性的酶在选自以下的温度接触：约51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃和90℃。
在一方面，所述方法包括使乳基底物与具有中性乳糖酶活性的酶在约55℃或58℃的温度接触。
在一方面，温度是约55℃。例如，当乳制品是炼乳时，温度可以是约55℃。在一方面，例如针对约30分钟的时间，温度可以是约63℃。
在一方面，所述接触的进行持续数分钟的时间段或数小时的时间段，例如持续约1至60分钟或约1至5小时。在一方面，所述接触的进行持续约10分钟与约4小时之间。在一方面，所述接触进行约10分钟与约3小时之间。在一方面，所述接触进行约10分钟与约2小时之间。在一方面，所述接触进行约10分钟与约1小时之间。
在一方面，将所述具有中性乳糖酶活性的酶以如下浓度添加至乳基底物中，所述浓度为约20至约300NLU/g乳糖，例如约24至约240NLU/g乳糖，更优选地约60至约70NLU/g乳糖。
本发明涵盖用于产生以下的方法：乳糖减少的或不含乳糖的奶昔、冰淇淋、复原乳产品、甜点、布丁、炼乳、加糖炼乳、亚任卡、牛奶焦糖酱或乳基粉，所述方法包括使乳基底物与乳糖酶在约50℃至约65℃的温度接触。
在一方面，所述方法包括巴氏杀菌步骤。如本文所用的“巴氏杀菌”意指减少或消除活生物体如微生物在乳基底物中的存在。优选地，通过将指定温度维持指定的时间段来实现巴氏杀菌。指定的温度通常通过加热来实现。可以选择温度和持续时间以便杀灭或使某些细菌，如有害细菌失活，和/或使该乳中的酶失活。可以遵循快速冷却步骤。
在一方面，所述方法包括在乳基底物的巴氏杀菌和/或均质化后添加所述具有中性乳糖酶活性的酶。接触可以是在冷却至发酵温度期间。在一方面，所述方法包括在巴氏杀菌和/或均质化之前或期间添加所述具有中性乳糖酶活性的酶。在一方面，巴氏杀菌可以在约72℃发生。在一方面，巴氏杀菌的发生可以持续15与30秒之间的时间段，例如在10与20秒之间，优选地约15秒。在一方面，巴氏杀菌的发生可以持续约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30秒的时间段。
在一方面，在巴氏杀菌之后，约10％、15％、20％、25％、30％或35％，优选地约20％至30％，更优选地约20％乳糖酶活性可以保留在乳基底物中。
在一方面，乳基底物不经历巴氏杀菌。在一方面，底物是在与如本文所描述的酶接触之前未经巴氏杀菌的生乳。
如本文所用的“均质化”意指强烈混合以获得可溶性悬浮液或乳液。可以进行该均质化以便将乳脂分解成更小的尺寸，这样使得乳脂不再与该乳分离。这可以通过在高压下使该乳通过小孔来实现。
在一方面，接触可以是在蒸发过程期间。在一方面，接触可以是在冷凝过程期间。在一方面，接触在巴氏杀菌期间发生。
宿主细胞
术语“宿主”、“宿主细胞”和“细胞”在本文中可以互换使用。
在一方面，宿主是细菌性表达宿主。
在一方面，细菌性表达宿主能够表达如本文所描述的具有中性乳糖酶活性的酶。
在一方面，宿主包含减少或消除脂肪酶活性的基因修饰。在一方面，能够表达具有中性乳糖酶活性的酶的细菌性表达宿主包含减少或消除脂肪酶A活性的基因修饰。
在一方面，所述基因修饰包含编码脂肪酶的基因的缺失、破坏或下调。在一方面，所述基因修饰包含编码如SEQ ID NO:2所示的脂肪酶A多肽的基因的缺失、破坏或下调。
在一方面，所述宿主包含基因修饰，所述基因修饰减少或消除选自以下的一个或多个酶活性：蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、果胶酶、纤维素酶和对硝基苯甲基酯酶活性。
在一方面，所述宿主包含基因修饰，所述基因修饰减少或消除脂肪酶(优选地脂肪酶A)、蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、果胶酶、纤维素酶和对硝基苯甲基酯酶活性。
在一方面，所述宿主包含减少或消除纤维素酶活性的基因修饰。
在一方面，细菌性表达宿主是芽孢杆菌属物种细胞。
在一方面，细菌性表达宿主选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(B.sonorensis)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、饲料芽孢杆菌(B.pabuli)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、粘琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)、秋叶氏芽孢杆菌(B akibai)、克氏芽孢杆菌(B.clarkii)、假坚强芽孢杆菌(B.pseudofirmus)、列城芽孢杆菌(B.lehensis)、巨大芽胞杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)、和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。在一方面，细菌性表达宿主是枯草芽孢杆菌。
在一方面，细菌性表达宿主包含如本文所描述的核酸分子。
在一方面，所述宿主表达如本文所描述的具有中性乳糖酶活性的酶。
对具有中性乳糖酶活性的酶进行编码的核酸分子的修饰、下调或失活可以通过RNA干扰(RNAi)技术(FEMS Microb.Lett.[FEMS微生物学快报]237:317-324,2004)来获得。更具体地，丝状真菌细胞基因表达可以通过如下来减少或消除：克隆其表达待受影响的核苷酸序列的同一的正义和反义部分(其后各自具有位于其间的核苷酸间区序列)，插入表达载体，并且将表达载体引入细胞中，在所述细胞中双链RNA(dsRNA)可以被转录，并且然后加工成能够杂交至靶mRNA的较短的siRNA。dsRNA转录后，小(21-23)核苷酸siRNA片段的形成将导致待受影响的mRNA的靶向降解。特异性mRNA的消除可以是各种程度的。可以将WO2005/05672和WO 2005/026356中所描述的RNA干扰技术用于编码具有中性乳糖酶活性的酶的核酸分子的修饰、下调、或失活。
一个方面涉及经基因修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，所述芽孢杆菌属宿主细胞能够表达/产生本公开的一种或多种乳糖酶。例如，国际PCT公开号WO 2016/071504公开了如下重组枯草芽孢杆菌宿主细胞，所述重组枯草芽孢杆菌宿主细胞用编码不同β-半乳糖苷酶的多核苷酸构建体(例如，表达构建体)转化。因此，芽孢杆菌属宿主细胞是本领域中众所周知的表达宿主并且是用于表达/产生本公开的乳糖酶的特别合适的宿主细胞。
在某些方面，因此，本公开涉及用于基因上修饰芽孢杆菌属细胞的方法，其中所述修饰包含(a)引入、取代、或去除基因(或其ORF)中的一个或多个核苷酸，或者引入、取代、或去除基因或其ORF的转录或翻译所需要的调控元件中的一个或多个核苷酸，(b)基因破坏，(c)基因转换，(d)基因缺失，(e)基因下调，(f)位点特异性诱变，和/或(g)随机诱变。
因此，本公开的经修饰芽孢杆菌属细胞是通过减少或消除编码本文所描述的副活性中的任一种的基因的表达而构建的，使用的方法在本领域中众所周知，例如插入、破坏、替换、缺失、截短、取代、移码突变等。待修饰或失活的基因的部分可以是，例如，编码区或编码区表达所需的调控/控制元件。
此种调控或控制序列的实例可以是启动子序列或其功能部分(即，足以影响核酸序列表达的部分)。用于修饰的其他控制序列包括但不限于前导序列、前肽序列、信号序列、转录终止子、转录激活子等。
在某些其他方面，通过基因缺失构建经修饰的芽孢杆菌属细胞以消除或减少基因的表达。基因缺失技术能够部分或完全去除一个或多个基因，从而消除它们的表达、或表达非功能性(或活性降低的)蛋白产物。在此类方法中，基因的缺失可以通过使用质粒进行同源重组来完成，所述质粒已构建成连续含有基因侧翼的5'和3'区。可以将连续的5'和3'区引入芽孢杆菌属细胞中，例如，在温度敏感的质粒(如pE194)上，在允许温度下与第二可选择标志物结合以允许质粒在细胞中建立。然后将细胞移至非允许温度，以选择在同源侧翼区之一处具有整合到染色体中的质粒的细胞。通过选择第二可选择标志物来实现质粒整合的选择。整合后，通过将细胞移至允许温度持续几代而不进行选择来刺激第二同源侧翼区处的重组事件。将细胞铺板以获得单菌落，并检查菌落是否损失两种可选择标志物(参见例如，Perego,1993)。因此，本领域技术人员(例如，通过参考>-硝基苯甲基酯酶基因的(核酸)序列和其所编码的蛋白质序列)可以容易地在适合于完全或部分缺失的基因的编码序列和/或基因的非编码序列中鉴定核苷酸区。
在其他方面，通过引入、取代、或去除基因或其基因转录或翻译所需的调控元件中的一个或多个核苷酸来构建本公开的经修饰的芽孢杆菌属细胞。例如，可以插入或去除核苷酸，以便导致引入终止密码子、去除起始密码子、或移码可读框。此种修饰可以根据本领域中已知的方法，通过定点诱变或PCR产生的诱变来完成(例如，参见Botstein和Shortle,1985；Lo等人,1985；Higuchi等人,1988；Shimada,1996；Ho等人,1989；Horton等人,1989以及Sarkar和Sommer,1990)。因此，在某些方面，通过完全或部分缺失来使本公开的>-硝基苯甲基酯酶基因失活。
在另一方面，通过基因转换的过程构建经修饰的芽孢杆菌属细胞(例如，参见Iglesias和Trautner,1983)。例如，在基因转换方法中，与基因相对应的核酸序列在体外诱变以产生缺陷核酸序列，然后将所述缺陷核酸序列转化到亲本芽孢杆菌属细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，缺陷核酸序列将内源基因替换。可能期望的是，缺陷基因或基因片段也编码可用于选择含有缺陷基因的转化体的标志物。例如，可以将缺陷基因与可选择标志物结合引入非复制或温度敏感的质粒上。通过在不允许质粒复制的条件下选择标志物来实现质粒整合的选择。通过检查菌落损失可选择标志物和获得突变型基因来实现导致基因替换的第二重组事件的选择(Perego,1993)。替代性地，缺陷核酸序列可以含有基因的一个或多个核苷酸的插入、取代、或缺失，如下所述。
在其他方面，通过建立的反义技术使用与基因的核酸序列互补的核苷酸序列来构建经修饰的芽孢杆菌属细胞(Parish和Stoker,1997)。更具体地，可以通过引入与基因的核酸序列互补的核苷酸序列来减少(下调)或消除芽孢杆菌属细胞的基因的表达，所述核苷酸序列可以在细胞中转录并且能够与细胞中产生的mRNA杂交。在允许互补的反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，由此减少或消除了从基因翻译而来的蛋白质的量。此类反义方法包括但不限于RNA干扰(RNAi)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、反义寡核苷酸等，所有这些都是本领域技术人员熟知的。
在其他方面，经由CRISPR-Cas9编辑产生/构建经修饰的芽孢杆菌属细胞。例如，编码本文提及的副活性中的任一种的基因可以被核酸指导的内切核酸酶的方式破坏(或缺失或下调)，所述方式通过将指导RNA(例如，Cas9)和Cpf 1或指导DNA(例如，NgAgo)结合发现其靶DNA，这将内切核酸酶募集到DNA上的靶序列上，其中所述内切核酸酶可以在DNA中产生单链或双链断裂。该靶向DNA断裂成为DNA修复的底物，并且可以与提供的编辑模板重组以破坏或缺失所述基因。例如，编码核酸指导的内切核酸酶(出于此目的，来自化脓链球菌(S.pyogenes)的Cas9)的基因或编码Cas9核酸酶的密码子优化的基因有效地连接到在芽孢杆菌属细胞中有活性的启动子和在芽孢杆菌属细胞中有活性的终止子，从而产生芽孢杆菌Cas9表达盒。同样地，本领域技术人员可容易地鉴定所述基因特有的一个或多个靶位点。例如，为了构造编码gRNA的针对目的基因内的靶位点的DNA构建体，可变的靶向(VT)结构域将包含为(PAM)前间区序列邻近基序(TGG)5'的靶位点的核苷酸，所述核苷酸与编码化脓链球菌Cas9的Cas9内切核酸酶识别结构域(CER)的DNA融合。将编码VT结构域的DNA和编码CER结构域的DNA组合，从而产生编码gRNA的DNA。因此，通过将编码gRNA的DNA有效地连接到在芽孢杆菌属细胞中有活性的启动子和在芽孢杆菌属细胞中有活性的终止子来产生gRNA的芽孢杆菌属表达盒。
在又其他方面，使用本领域已知的方法(包括但不限于化学诱变(参见例如，Hopwood,1970)和转座(参见例如，Youngman等人,1983)，通过随机或特异性诱变来构建经修饰的芽孢杆菌属细胞。可以通过对亲本细胞进行诱变并筛选其中基因表达已经减少或消除的突变细胞来进行基因的修饰。诱变可以是特异性的或随机的，可以通过例如使用适合的物理或化学诱变剂进行、通过使用合适的寡核苷酸进行、或通过使所述DNA序列经受PCR产生的诱变来进行。此外，诱变可通过使用这些诱变方法的任意组合来进行。
适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、N-甲基-N'-亚硝基胍(NTG)、邻甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲磺酸(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸、和核苷酸类似物。当使用这些药剂时，通常通过如下方法来进行诱变：在合适的条件下在选择的诱变剂的存在下孵育待诱变的亲本细胞，并选择表现出基因表达降低或无基因表达的突变的细胞。
在其他方面，经修饰的芽孢杆菌属细胞包含内源基因的破坏，其中多核苷酸破坏盒包含标志物基因。
PCT公开号WO 2003/083125公开了用于修饰芽孢杆菌属细胞的方法，如使用PCR融合来产生芽孢杆菌属缺失菌株和DNA构建体以绕过大肠杆菌。
PCT公开号WO 2002/14490公开了用于修饰芽孢杆菌属细胞的方法，所述方法包括(1)构建和转化整合的质粒(pComK)，(2)随机诱变编码序列、信号序列和前肽序列，(3)同源重组，(4)通过向转化DNA添加非同源侧翼增加转化效率，(5)优化双交叉整合，(6)定向诱变和(7)无标志物缺失。
本领域技术人员充分意识到用于将多核苷酸序列引入细菌性细胞(例如，大肠杆菌和芽孢杆菌属物种)中的合适方法(例如，Ferrari等人,1989；Saunders等人,1984；Hoch等人,1967；Mann等人,1986；Holubova,1985；Chang等人,1979；Vorobjeva等人,1980；Smith等人,1986；Fisher等人,1981和McDonald,1984)。实际上，包括原生质体转化和中板集合、转导、和原生质体融合在内的此类方法如转化是已知的并且适合用于本公开。转化方法特别优选地用于将本公开的DNA构建体引入宿主细胞中。
除了常用方法之外，在一些方面，直接转化宿主细胞(即，在引入到宿主细胞中之前，中间细胞不用于扩增DNA构建体或以其他方式处理DNA构建体)。将DNA构建体引入宿主细胞中包括本领域已知的将DNA引入宿主细胞而不插入质粒或载体中的那些物理和化学方法。此类方法包括但不限于氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA、脂质体等。在另外的方面，DNA构建体与质粒一起共转化而不插入到所述质粒中。在另外的方面，通过本领域已知的方法，将选择性标志物从经修饰的芽孢杆菌属菌株中缺失或基本上切除(例如，Stahl等人，1984和Palmeros等人,2000)。在一些方面，载体从宿主染色体上分解下来，将侧翼区域留在染色体上，而将固有的染色体区去除。
在一方面，提供了用于表达如本文所描述的酶的方法，所述方法包括：提供如本文所描述的宿主细胞；以及从所述细胞表达酶；以及任选地对酶进行纯化和/或浓缩。在一方面，提供了通过此种方法产生的酶。还提供了如下乳制品，所述乳制品包含如本文所描述的表达宿主、或在所述表达宿主中产生的本文所描述的酶。
核酸和载体
在一方面，本发明涉及如上所述的具有中性乳糖酶活性的分离的酶(多肽)，所述酶由如下多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严格条件，优选地低严格条件，更优选地中严格条件，更优选地中-高严格条件，甚至更优选地高严格条件，以及最优选地非常高严格条件下与i)编码SEQ ID NO:1的成熟多肽的核酸序列；ii)i)的cDNA序列；或iii)i)或ii)的互补链杂交(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning[分子克隆]，A Laboratory Manual[实验室手册],第2版,Cold Spring Harbor,New York[纽约冷泉港])。核酸序列的子序列含有至少100个连续核苷酸或优选地至少200个连续核苷酸。此外，子序列可以编码具有中性乳糖酶活性的多肽片段。
如本文所描述的核苷酸序列或其子序列，以及SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其片段可以用来设计核酸探针，以便根据本领域熟知的方法从不同属或物种的菌株鉴定并克隆编码具有中性乳糖酶活性的多肽的DNA。特别地，此类探针可以用于按照标准DNA印迹程序与目的属或物种的基因组或cDNA杂交，以便鉴定并分离其中的相应基因。此类探针可以比完整序列短得多，但是长度应当是至少14个、优选地至少25个、更优选地至少35个、且最优选地至少70个核苷酸。然而，优选的是核酸探针的长度是至少100个核苷酸。例如，核酸探针的长度可以是至少200个核苷酸、优选地至少300个核苷酸、更优选地至少400个核苷酸、或最优选地至少500个核苷酸。可使用甚至更长的探针，例如长度为至少600个核苷酸，至少优选地至少700个核苷酸，更优选地至少800个核苷酸，或最优选地至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地对探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。这类探针涵盖于本发明中。
因此，可以针对与以上所描述的探针杂交并且编码具有乳糖酶活性的多肽的DNA对由此类其他生物体制备的基因组DNA文库进行筛选。可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术来分离来自此类其他生物体的基因组或其他DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移并且固定在硝酸纤维素或其他合适的载体材料上。为鉴定与如本文所描述的核酸序列或其子序列同源的克隆或DNA，在DNA印迹法中使用载体材料。
出于本发明的目的，杂交表明核苷酸序列在非常低至非常高严格条件下与被标记的核酸探针杂交，所述探针对应于本文所描述的核苷酸序列、其互补链、或其子序列。可以使用X射线胶片检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
在另一优选方面，所述核酸探针是核酸序列的成熟多肽编码区。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针，非常低至非常高严格条件被定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200g/ml剪切和变性的鲑鱼精子DNA中，以及对于非常低和低严格在25％甲酰胺中，对于中和中-高严格性在35％甲酰胺中，或对于高和非常高严格性在50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言，载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，优选地至少在45℃下(非常低严格性)，优选地至少在50℃下(低严格性)，优选地至少在55℃下(中严格性)，更优选地至少在60℃下(中-高严格性)，甚至更优选地至少在65℃下(高严格性)，并且最优选地至少在70℃下(非常高严格性)洗涤三次，每次15分钟。
在具体方面，洗涤使用0.2X SSC、0.2％SDS，优选地至少在45℃下(非常低严格性)，更优选地至少在50℃下(低严格性)，更优选地至少在55℃下(中严格性)，更优选地至少在60℃下(中-高严格性)，甚至更优选地至少在65℃下(高严格性)，并且最优选地至少在70℃下(非常高严格性)进行。在另一具体方面，洗涤使用0.1X SSC、0.2％SDS，优选地至少在45℃下(非常低严格性)，更优选地至少在50℃下(低严格性)，更优选地至少在55℃下(中严格性)，更优选地至少在60℃下(中-高严格性)，甚至更优选地至少在65℃下(高严格性)，并且最优选地至少在70℃下(非常高严格性)进行。
对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针而言，严格条件被定义为按照标准DNA印迹程序，在比使用根据Bolton和McCarthy(1962,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences[美国国家科学院院刊]USA 48:1390)的计算计算的Tm低约5℃至约10℃下，在0.9MNaCl、0.09M Tris-HCl(pH 7.6)、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X登哈特氏溶液(Denhardt's solution)、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP、以及0.2mg的酵母RNA/ml中预杂交、杂交及杂交后洗涤。
对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针而言，将载体材料在比计算的Tm低5℃至10℃下，在6X SCC加0.1％SDS中洗涤一次，持续15分钟，并且使用6X SSC洗涤两次，每次15分钟。
在含盐杂交条件下，有效的Tm是控制成功杂交的探针和过滤器结合DNA之间所需的同一性程度的Tm。可以使用以下公式确定有效Tm，以确定两种DNA在各种严格条件下杂交所需的同一性程度。
有效Tm＝81.5+16.6(log M[Na+])+0.41(％G+C)-0.72(甲酰胺％
对于中严格性，甲酰胺为35％，并且5X SSPE的Na+浓度为0.75M。
另一个相关关系是两个DNA的1％错配将Tm降低1.4℃。为了确定两个DNA在42℃的中严格条件下杂交所需的同一性程度，使用以下公式：
同源性％＝100-[(有效Tm-杂交温度)/1.4]
(参见www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm)
变体核酸包括与编码SEQ ID NO:1的核酸具有一定百分比，例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％序列同一性的多核苷酸。在一方面，提供了能够编码如本文所描述的酶(多肽)的核酸。在另一方面，核酸具有与能够编码如本文所描述的酶(多肽)的核酸具有至少60％，如至少65％，如至少70％，如至少75％，如至少80％，如至少85％，如至少90％，如至少95％，如至少99％同一性的核酸序列。
在一方面，提供了包含如本文所描述的核酸的质粒。
在一方面，提供了包含如本文所描述的核酸或能够表达如本文所描述的多肽的表达载体。
提供了与编码如本文所定义的任意多肽变体的核酸互补的核酸。额外地，提供了能够与互补序列杂交的核酸。在另一方面，用于本文所描述的方法和组合物中的序列是合成的序列。它包括但不限于：用最佳密码子使用制备的用于在宿主生物体如酵母中表达的序列。
根据本领域众所周知的程序，如本文提供的多肽变体可以经合成或通过在宿主细胞中重组表达来产生。在一方面，本文公开的一种或多种多肽是一种或多种重组多肽。任选地将如本文所定义的所表达的多肽变体在使用前分离。
在另一方面，如本文所定义的多肽变体是在表达后经纯化的。多肽变体的基因修饰和重组产生的方法描述于例如美国专利号7,371,552、7,166,453、6,890,572、和6,667,065，以及美国公开申请号2007/0141693、2007/0072270、2007/0020731、2007/0020727、2006/0073583、2006/0019347、2006/0018997、2006/0008890、2006/0008888、和2005/0137111中。这些公开的相关教导通过引用并入本文，所述相关教导包括编码多肽的多核苷酸序列、引物、载体、选择方法、宿主细胞、所表达的多肽变体的纯化和重构以及如本文所定义的多肽变体的表征，包括有用的缓冲液、pH范围、Ca2+浓度、底物浓度和用于酶法测定的酶浓度。
提供编码SEQ ID NO:1的蛋白质的核酸序列或与编码SEQ ID NO:1的酶的核酸具有至少约66％、68％、70％、72％、74％、78％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在一方面，核酸序列与编码SEQ ID NO:1的酶的核酸具有至少约60％、66％、68％、70％、72％、74％、78％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在一方面，本发明涉及包含多核苷酸的载体。在一方面，细菌性细胞包含载体。在一些方面，将包含编码变体的核酸的DNA构建体在包含与编码序列有效地连接的调控序列的表达载体中转移到宿主细胞。载体可以是可以整合到真菌宿主细胞基因组中并且当被引入宿主细胞时进行复制的任何载体。密苏里大学FGSC菌株目录列出合适的载体。合适的表达和/或整合载体的额外实例提供于：Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual[分子克隆：实验室手册],第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,New York[纽约冷泉港，冷泉港实验室出版社](2001)；Bennett等人,MoreGene Manipulations in Fungi[更多在真菌中的基因操作],Academic Press,San Diego[圣地亚哥学术出版社](1991)，第396-428页；以及美国专利号5,874,276中。示例性载体包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D、pDONTM201、pDONRTM221、pENTRTM、
Figure BDA0003312475830000421
3Z以及
Figure BDA0003312475830000422
4Z。用于在细菌性细胞中使用的示例包括允许在大肠杆菌中复制的pBR322和pUC19，以及例如允许在芽孢杆菌属中复制的pE194。
在一些方面，编码变体的核酸有效地连接到合适的启动子，其允许在宿主细胞中转录。启动子可以衍生自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。启动子的合适的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1、和egl2启动子。在一方面，启动子是对宿主细胞天然的启动子。例如，当宿主为嗜糖假单胞菌时，启动子为天然的嗜糖假单胞菌启动子。“诱导型启动子”是指在环境调节或发育调节下具有活性的启动子。在另一方面，启动子是对宿主细胞异源的启动子。
在一些方面，将编码序列有效地连接到编码信号序列的DNA序列上。在另一方面，代表性信号肽可以是枯草芽孢杆菌aprE前体的天然信号序列。在其他方面，将编码信号序列的DNA用编码来自其他细胞外枯草芽孢杆菌前体的信号序列的核苷酸序列替换。在一方面，编码信号序列的多核苷酸紧邻编码多肽的多核苷酸的上游并在框内。信号序列可以选自与宿主细胞相同的物种。
在额外方面，包扩待引入真菌宿主细胞的DNA构建体或载体的信号序列和启动子序列衍生自相同的来源。在一些方面，表达载体还包括终止序列。在一方面，终止序列和启动子序列来自相同的来源。在另一方面，终止序列与宿主细胞是同源的。
在一些方面，表达载体包括选可选择的标志物。合适的可选择的标志物的实例包括赋予抗微生物剂抗性的那些，例如潮霉素或腐草霉素。营养选择性标志物也是合适的，并且包括amdS、argB和pyr4。在一方面，选择性标志物是编码乙酰胺酶的amdS基因；其允许经转化的细胞在作为氮源的乙酰胺上生长。构巢曲菌(A.nidulans)amdS基因作为选择性标志物的用途在Kelley等人,EMBOJ.[欧洲分子生物学组织杂志]4:475-479(1985)和Penttila等人,Gene[基因]61:155-164(1987)中进行了描述。
包含具有编码变体的多核苷酸的DNA构建体的合适的表达载体可以是能够在给定宿主生物体中自主复制的或整合到宿主DNA中的任何载体。在一些方面，表达载体是质粒。在一些方面，考虑了两种类型的表达载体，用于获得基因表达。第一表达载体包括DNA序列，其中启动子、编码区和终止子全部来源于待表达基因。在一些方面，在其自身的转录和翻译调控序列的控制下，通过删除不想要的DNA序列以留下待表达的结构域而获得基因截短。预先组装第二种类型表达载体，并且包含高水平转录所需的序列和可选择的标志物。在一些方面，将基因或其部分的编码区插入到该通用表达载体中，这样使得它处于表达构建体启动子和终止子序列的转录控制下。在一些方面，将基因或其部分插入强cbh1启动子的下游。
在另外的方面，表达如本文所描述的多肽的方法包括获得如本文所描述的宿主细胞或细胞，并且从该细胞或宿主细胞表达该多肽，以及任选地纯化该多肽。
当变体在特定宿主细胞中产生时，表达特征意指变体的改变的表达水平。表达通常涉及使用本领域已知的标准技术在给定时间内从发酵液中回收的活性变体的量。表达还可以涉及宿主细胞内产生的或由宿主细胞分泌的变体的量或速率。表达还可以涉及编码变体多肽的mRNA的翻译速率。
将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括以下技术，例如转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染，例如脂质转染介导的和DEAE-右旋糖酐介导的转染；与磷酸钙DNA沉淀一起孵育；用DNA包被的微粒高速轰击；以及原生质体融合。通用转化技术是本领域已知的。参见，例如，Ausubel等人(1987),同上,第9章；Sambrook等人(2001),同上；和Campbell等人,Curr.Genet.[当代遗传学]16:53-56(1989)。异源蛋白质在木霉属中的表达描述于例如美国专利号6,022,725；美国专利号6,268,328；Harkki等人,Enzyme Microb.Technol.[酶与微生物技术]13:227-233(1991)；Harkki等人,BioTechnol.[生物技术]7:596-603(1989)；EP 244,234；以及EP 215,594。在一方面，用载体系统构建了遗传上稳定的转化体，由此编码变体的核酸被稳定地整合到宿主细胞染色体中。然后通过已知技术纯化转化体。
在一个非限制性实例中，包括amdS标志物的稳定转化体通过其更快的生长速率和在包含乙酰胺的固体培养基上形成具有光滑而不是粗糙轮廓的圆形菌落而区别于不稳定的转化体。额外地，在一些情况下，通过如下进行稳定性的进一步测试：使转化体在固体非选择性培养基(例如，缺乏乙酰胺的培养基)上生长，从这种培养基中收获孢子并且确定随后在包含乙酰胺的选择性介质上发芽并生长的这些孢子的百分比。本领域已知的其他方法可用于选择转化体。
为了评估变体在宿主细胞中的表达，测定可以测量所表达的蛋白质、相应的mRNA或中性乳糖酶活性。例如，合适的测定包括使用适当标记的杂交探针的RNA印迹法和DNA印迹法、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链式反应)和原位杂交。合适的测定还包括测量样品中的活性。该变体的活性的合适的测定包括但不限于基于ONPG的测定或确定例如像本文的方法和实例中所描述的反应混合物中的葡萄糖。
通常，细胞培养物中产生的变体被分泌到介质中，并且可以例如通过从细胞培养基中除去不需要的组分来纯化或分离。在一些情况下，可以从细胞裂解物中回收变体。在此种情况中，使用本领域技术人员常规采用的技术从产生酶的细胞中纯化所述酶。实例包括但不限于，例如：亲和色谱法、离子交换色谱法(包括高分辨率离子交换)、疏水相互作用色谱、两相分配、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅或阳离子交换树脂上进行色谱法(如DEAE)、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和使用Sephadex G-75的凝胶过滤。根据预期用途，本文公开的一种或多种多肽可以是例如冷冻干燥的或制备于溶液中的。在一方面，本文公开的一种或多种多肽是冷冻干燥形式的。在另一方面，本文公开的一种或多种多肽是处于溶液中的。可以根据本领域已知的方法来制备多肽组合物，并且所述多肽组合物可以处于液体或干燥组合物的形式。例如，该多肽组合物可以呈颗粒或微粒的形式。包括在组合物中的多肽可以根据本领域已知的方法稳定化。
以下给出了本发明的酶或酶制剂的优选用途的实例。
在一方面，通过添加能够将乳糖转换为TGOS(即，具有转半乳糖基化活性)的乳糖酶，可以将乳基底物(例如，典型地具有约4.7％至约5.0％乳糖的新鲜乳、低脂乳或脱脂乳，或具有从约6.0％至约65％乳糖的炼乳或经浓缩的乳)中乳糖的量减少。在本文，将“乳糖”定义为衍生自乳糖水解的乳糖(DP2)和单糖(DP1)，包括葡萄糖和半乳糖以及其他DP2分子(像异乳糖和DP2 GOS)DP3+纤维不是糖。因此，用具有转半乳糖基酶活性的乳糖酶处理具有给定量的乳糖的乳基底物可以使糖减少，其中乳糖被转换为GOS纤维(DP3+)。
根据本发明的该方面，乳基底物优选地含有6％-9％乳糖、9％-20％乳糖、20％-40％乳糖或40％-65％乳糖。乳基底物中的乳糖优选地减少了多于20％、多于25％、多于30％以及多于40％。
在一方面，本文公开了通过用如本文所描述的酶处理包含乳糖的底物来产生食品的方法。
在一方面，本文公开了通过用如本文所描述的酶处理包含乳糖的乳基底物来产生乳制品的方法。
酶制剂(如处于根据本发明制备的食物成分的形式)可以是溶液形式或作为固体-这取决于用途和/或应用模式和/或给予模式。固体形式可以是呈干燥酶粉末或呈造粒酶。
干酶配制品的实例包括喷雾干燥的产物、混合器造粒产物、层状产物如流化床颗粒、挤出或颗粒状颗粒造粒产物、冻干产物。
酶制剂(如处于根据本发明制备的食物成分的形式)可以是溶液形式或作为固体-这取决于用途和/或应用模式和/或给予模式。固体形式可以是呈干燥酶粉末或呈造粒酶。
在一方面，提供了组合物，优选地是食物组合物，更优选地是包含如本文所描述的宿主细胞或酶的乳制品。
此外，基于在组合物中与SEQ ID NO:1具有至少70％，例如像72％、74％、74％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％序列同一性的酶的总量，本文公开了包括至少5％，例如像，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％w/w的一种或多种酶的组合物或制剂。这可以通过使用本领域技术人员已知的以下技术来评估。使待评估的样品进行SDS-PAGE，并使用适合于蛋白质定量的染料例如像伯乐标准(Bio-Rad Criterion)系统进行可视化。然后使用适当的光密度扫描仪(例如像伯乐标准系统)扫描凝胶，并确保所得图像处于动态范围内。对与任何变体/片段相对应的条带进行定量，并且将多肽的百分比计算为：所讨论的多肽的百分比＝所讨论的多肽/(表现出转半乳糖基化活性的所有多肽的总和)*100。组合物中的多肽变体/片段的总数可以通过本领域技术人员已知的方法使用多克隆抗体通过蛋白质印迹检测的片段来确定。
在一方面，本发明提供了包含根据本发明的酶、酶载体和任选地稳定剂和/或防腐剂的酶制剂。
在本发明的又另一方面，酶载体选自由甘油或水组成的组。
在另一方面，制剂/组合物包括稳定剂。在一方面，该稳定剂选自下组，该组由以下各项组成：无机盐、多元醇、糖及其组合。在一方面，该稳定剂是无机盐如氯化钾。在另一方面，该多元醇是甘油、丙二醇或山梨糖醇。在又另一方面，糖是小分子碳水化合物，特别是若干种甜味碳水化合物如葡萄糖、半乳糖、果糖和蔗糖中的任何一种。
在又另一方面，制剂包括防腐剂。在一方面，该防腐剂是对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸酯、山梨酸酯或其他食品认可的防腐剂或其混合物。
本发明的方法可以用固定化酶实施，例如，固定化的乳糖酶或其他产生半乳寡糖的酶。可以将酶固定在任何有机或无机支持物上。示例性无机支持物包括氧化铝、硅藻土、Dowex-1氯化物、玻璃珠和硅胶。示例性有机支持物包括DEAE-纤维素、藻酸盐水凝胶或藻酸盐珠或等效物。在本发明的各个方面，可以通过物理吸附到无机支持物上来优化乳糖酶的固定化。可以将用于实施本发明的酶固定在不同的介质中，包括水、Tris-HCl缓冲液和磷酸盐缓冲溶液。可以将酶固定在任何类型的底物上，例如滤器、纤维、柱、珠、胶体、凝胶、水凝胶、网眼等。
在一方面，提供了通过如本文所描述用酶处理包含乳糖的乳基底物来产生乳制品的方法。在一方面，提供了方法，其中用如本文所描述的酶的处理在针对酶的活性的最佳温度下发生，或者例如在本文所描述的更高温度下发生。
在另外的方面，将多肽以0.01-1000ppm的浓度添加到乳基底物中。在又另外的方面，将多肽以0.1-100ppm的浓度添加到乳基底物中。在另外的方面，将多肽以1至60ppm，例如1至55、1至50、1至45、1至40、1至35、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10或1至5ppm、优选地1至10ppm的浓度添加至乳基底物。
在一方面，提供了一种进一步包括用微生物发酵底物如乳制品的方法。在另一方面，该乳制品是酸奶。在另外的方面，基本上同时进行使用酶和微生物的处理。在一方面，基本上同时将多肽和微生物添加至乳基底物。
在一方面，提供了包含如本文所描述的细胞或酶的乳制品。在一方面，将如本文所定义的酶以0.01-1000ppm的浓度添加。在一方面，提供了包含如本文所定义的失活酶的乳制品。在一方面，提供了包含浓度为0.01-1000ppm的如本文所定义的失活酶的乳制品。在一方面，提供了包括如本文所定义的细胞的乳制品。
如本文所描述的乳制品可以是，脱脂乳、低脂乳、全脂乳、奶油、UHT乳、具有延长保质期的乳、发酵的乳产品、奶酪、酸奶、黄油、乳质涂抹料、酪乳、酸化乳饮料、酸性奶油、乳清基饮料、炼乳、牛奶焦糖酱、风味乳饮料、加糖炼乳、乳粉、复原乳制品、冰淇淋、亚任卡、布丁、甜点和奶昔。乳制品可以通过本领域已知的任何方法制造。
乳制品可以额外地包括非乳组分，例如，植物组分例如像植物油、植物蛋白和/或植物碳水化合物。乳制品还可以包括另外的添加剂，例如像酶、调味剂、微生物培养物如益生菌培养物、盐、甜味剂、糖、酸、水果、果汁或本领域已知的可作为乳制品的组分或添加剂的任何其他组分。
在本发明的一方面，一种或多种乳组分和/或乳级分占乳制品的至少50％(重量/重量)，如至少70％，例如至少80％，优选地至少90％。
在本发明的一方面，已经用如本文所定义的酶处理的一种或多种乳基底物占乳制品的至少50％(重量/重量)，如至少70％，例如至少80％，优选地至少90％。
在本发明的一方面，将酶处理的乳基底物在用作乳制品中的成分之前未进行干燥。
在本发明的一方面，乳制品是冰淇淋。在本发明上下文中，冰淇淋可以是任何种类的冰淇淋，如全脂冰淇淋、低脂冰淇淋或基于酸奶或其他发酵的乳产品的冰淇淋。冰淇淋可以通过本领域已知的任何方法制造。
在本发明的一方面，乳制品是乳或炼乳。
在本发明的一方面，乳制品是UHT乳。在本发明的上下文中的UHT乳是已经进行灭菌程序的乳，其旨在杀死包括细菌孢子在内的所有微生物。UHT(超高温)处理可以是例如在130℃下热处理30秒，或者在145℃下热处理一秒。
在本发明的一方面，乳制品是ESL乳。在上下文中，ESL乳是由于微量过滤和/或热处理而具有延长的保质期，并且能够在2℃-5℃的商店架上保持新鲜至少15天，优选至少20天的乳。
在本发明的另一优选方面，乳制品是发酵的乳制品，例如酸奶。
用于大多数发酵的乳产品的微生物选自由通常称为乳酸菌的细菌组成的组。如本文所用，术语“乳酸菌”是指革兰氏阳性、微量需氧或厌氧细菌，该细菌发酵糖，并且产生酸，这些酸包括作为主要产生的酸的乳酸、乙酸和丙酸。工业上最有用的乳酸菌可在“乳杆菌(Lactobacillales)”目中找到，其中包括乳球菌属物种、链球菌属物种、乳杆菌属物种、明串珠菌属物种、假明串珠菌属物种、片球菌属物种、短杆菌属物种、肠球菌属物种和丙酸菌属物种。额外地，乳酸菌组中通常包括属于厌氧细菌的组的产乳酸细菌，双歧杆菌，即双歧杆菌属物种，这些产乳酸细菌常单独或与乳酸菌组合用作食品培养物。乳酸菌通常作为冷冻或冻干培养物供应给奶业，用于进行大量起子增殖(bulk starter propagation)或者所谓的“直投式”(DVS)培养物，旨在直接接种入发酵容器或桶中用于产生发酵乳制品。这种培养物通常称作“起子培养物”或“起子”。
常用的乳酸菌的起子培养物菌株通常分成嗜常温生物体(其最佳生长温度约30℃)，和嗜热生物体(其最佳生长温度在约40℃至约45℃的范围内)。属于嗜常温组的典型生物体包括乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、肠膜状明串珠菌乳脂亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、肠膜状假明串珠菌乳脂亚种(Pseudoleuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰生物突变株(Lactococcuslactis subsp.lactis biovar.diacety lactis)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactococcuslactis subsp.lactis biovar.diacety lactis)和副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)。嗜热乳酸细菌性物种包括例如嗜热链球菌、屎肠球菌、德氏乳杆菌乳酸亚种、瑞士乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜酸乳杆菌。
此外，属于双歧杆菌属的厌氧细菌，包括两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)常用作乳品起子培养物，并且通常包括在乳酸菌组中。额外地，丙酸杆菌属物种用作乳品起子培养物，特别是在奶酪的制造中。额外地，属于双歧杆菌属的生物体通常用作食物起子培养物。
另一组微生物起子培养物是真菌培养物，包括丝状真菌的酵母培养物和培养物，其具体用于制造某些类型的奶酪和饮料。真菌的实例包括娄地青霉、白青霉(Penicilliumcandidum)、白地霉、开菲尔圆酵母、开菲尔酵母和酿酒酵母。
在本发明的一方面，用于乳基底物发酵的微生物是干酪乳杆菌、或嗜热链球菌和德氏乳酸杆菌保加利亚亚种的混合物。
本发明的方法中使用的发酵方法是众所周知的，并且本领域的技术人员知道如何选择合适的工艺条件，如温度、氧、微生物的量和特征、添加剂如碳水化合物、调味剂、矿物质、酶、和处理时间。显然，选择发酵条件以便支持本发明的实现。作为发酵的结果，将降低乳基底物的pH。本发明的发酵乳制品的pH可以是，例如，在3.5-6的范围内，如在3.5-5的范围内，优选在3.8-4.8的范围内。
在一方面，提供了本文公开的细胞用于产生选自下组的产品的用途，该组由以下各项组成：酸奶、奶酪、发酵的乳产品、膳食补充剂和益生菌食物产品。
在一方面，本文所描述的酶可以用于制备奶酪产品并且可以在用于制作奶酪产品的方法中使用。例如，奶酪产品可以选自由以下组成的组：奶油奶酪、松软奶酪、和精制奶酪。
用将乳糖转化为单糖的酶处理乳产品具有若干个优点。首先，产品可以被患有乳糖不耐症的人消耗，其在其他情况下会出现症状如胃肠气胀和腹泻。其次，与乳糖相比，用乳糖酶处理的乳制品将比类似的未处理产品具有更高的甜度，这是因为葡萄糖和半乳糖的更高的感知甜度。这种效果对于应用如酸奶和冰淇淋尤为有益，其中最终产品的高甜度是所希望的，并且这允许所消耗的产品中的碳水化合物的净减少。第三，在冰淇淋产生中，经常看到称为沙质的现象，其中乳糖分子由于乳糖的相对低的溶解度而结晶。当乳糖转化为单糖时，冰淇淋的口感比未处理产品大大改进。可以消除由于乳糖结晶引起的沙感的存在，并且可以通过用乳清粉替代脱脂乳粉来降低原料成本。酶处理的主要作用是增加甜味。
在一方面，如本文公开的酶可以与其他酶一起使用，所述酶例如是：蛋白酶(例如凝乳酶(chymosin)或肾素(rennin))、脂酶(例如磷脂酶)、淀粉酶、转移酶和乳糖酶。在一方面，如本文公开的酶可与转半乳糖基酶一起使用。当用一种或多种转半乳糖基化多肽处理后，特别是在低乳糖水平下希望减少残留的乳糖时，这可以是特别有用的。具有乳糖酶活性的酶是能够将二糖乳糖水解成构成型半乳糖和葡萄糖单体的任何糖苷水解酶。乳糖酶的组包括但不限于分配在EC 3.2.1.108亚类的酶。分配到其他亚类的酶，例如像EC 3.2.1.23，也可以是乳糖酶。乳糖酶可以具有除乳糖水解活性之外的其他活性，例如像转半乳糖基化活性。在本发明的上下文中，乳糖酶的乳糖水解活性可以被称为其乳糖酶活性或其β-半乳糖苷酶活性。具有乳糖酶活性的酶可以是动物、植物或微生物来源的酶。酶可以从微生物来源获得，特别是从丝状真菌或酵母或从细菌获得。酶可以例如衍生自如下各项的菌株：伞菌属，例如双孢蘑菇；Ascovaginospora；曲霉属，例如黑曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、米曲霉；假丝酵母属；毛壳菌属；Chaetotomastia；网柄菌属，例如盘基网柄菌；克鲁维酵母菌属，例如脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母；毛霉属，例如爪哇毛霉、高大毛霉、细小毛霉；脉孢菌属，例如粗糙脉孢菌；根毛霉属，例如微小根毛霉；根霉属，例如少根根霉、日本根霉、匍枝根霉；核盘霉属，例如白腐核盘霉；圆酵母属；球拟酵母属；毛癣菌属，例如红色毛癣菌；维氏核盘菌属，例如大豆维氏核盘菌；芽孢杆菌属，例如凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、诺瓦利斯芽孢杆菌(B.novalis)、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌；双歧杆菌属，例如长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌；金黄杆菌属；柠檬酸杆菌属，例如弗氏柠檬酸杆菌；梭菌属，例如产气荚膜梭菌；色二孢属，例如棉色二孢；肠杆菌属，例如产气肠杆菌，阴沟肠杆菌；爱德华菌属，迟钝爱德华菌；欧文氏菌属，例如草生欧文氏菌；埃希氏菌属，例如大肠杆菌；克雷伯氏菌属，例如肺炎克雷伯氏菌；多球菌属(Miriococcum)；漆斑菌属(Myrothesium)；毛霉属；脉孢菌属，例如粗糙脉孢菌；变形杆菌属，例如普通变形杆菌；普罗维登斯菌属，例如斯氏普罗威登斯菌；密孔菌属，例如朱红密孔菌、血红密孔菌；瘤胃球菌属，例如扭链瘤胃球菌；沙门氏菌属，例如鼠伤寒沙门菌；沙雷氏菌属，例如液化沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌；志贺菌属，例如弗氏志贺菌；链霉菌属，例如抗生链霉菌、栗色球孢链霉菌、紫红链霉菌；栓菌属(Trametes)；木霉属，例如里氏木霉、绿色木霉；耶尔森氏菌属(Yersinia)，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌。在一方面，乳糖酶是像克鲁维酵母属和芽孢杆菌属等微生物的细胞内组分。克鲁维酵母属(尤其是脆壁克鲁维酵母和乳酸克鲁维酵母)以及其他真菌例如假丝酵母属、圆酵母属和球拟酵母属的那些是真菌乳糖酶的常见来源，而凝结芽孢杆菌和环状芽孢杆菌是细菌性乳糖酶的公知来源。衍生自这些生物体的几种商业乳糖酶制剂是可获得的，如Lactozym.RTM.(可从丹麦诺维信公司获得)、HA-乳糖酶(可从丹麦科汉森公司获得)和Maxilact.RTM.(可从荷兰DSM公司获得)，所有均来自乳酸克鲁维酵母。所有这些乳糖酶都是所谓的中性乳糖酶，所述中性乳糖酶具有在pH6和pH 8之间的最佳pH。
在本发明的一方面，提出了用于从乳基底物产生不含乳糖的乳制品的方法，所述方法具有如下步骤：a.)提供乳基底物；b.)向所述乳基底物中添加具有中性乳糖酶活性的酶；c.)对所述乳基底物进行巴氏杀菌，其中在所述巴氏杀菌步骤后所述具有中性乳糖酶活性的乳糖酶保留大量的活性；以及d.)将所述乳基底物储存足够的时间以提供不含乳糖的乳制品。
优选地，所述乳基底物具有至少4.7％(w/w)乳糖。优选地，所述巴氏杀菌步骤是在65℃至75℃下进行的。更优选地，所述巴氏杀菌步骤是在70℃至73℃下进行的。最优选地，所述巴氏杀菌步骤是在72.8℃下进行的。
优选地，储存步骤持续3至10天。更优选地，储存步骤为6至9天。最优选地，储存步骤为8天。
优选地，具有中性乳糖酶活性的酶衍生自乳杆菌属。更优选地，具有中性乳糖酶活性的酶衍生自德氏乳杆菌保加利亚亚种。仍更优选地，所述酶与SEQ ID NO:1具有至少约60％同一性。又更优选地，所述酶与SEQ ID NO:1具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在仍更优选的实施例中，所述酶为SEQ ID NO:1的酶，或其乳糖酶活性片段。在其他优选的实施例中，具有中性乳糖酶活性的酶是经纯化的。仍更优选地，具有中性乳糖酶活性的酶是经浓缩的。又更优选地，所述具有中性乳糖酶活性的酶呈酶制剂的形式，所述酶制剂具有降低的水平的脂肪酶副活性。在最优选的实施例中，所述具有中性乳糖酶活性的酶呈酶制剂的形式，所述酶制剂具有降低的水平的蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、果胶酶、纤维素酶和/或对硝基苯甲基酯酶副活性。
实例
以下实例仅是说明性的，并且不以任何方式限制本说明书。
实例1：酶
实验性杜邦公司乳糖酶：来自德氏乳杆菌保加利亚亚种的、具有SEQ ID NO:1中示出的氨基酸序列的热稳定性β-半乳糖苷酶。作为来自乳酸克鲁维酵母GODO-YNL2(可从丹麦杜邦公司获得)的水解性乳糖酶的实例被使用。来自两岐双岐杆菌的水解性乳糖酶的另一个实例是可商购获得的，作为Saphera(可从丹麦诺维信公司获得)或作为NOLA Fit(可从丹麦科汉森公司获得)。作为转半乳糖基化乳糖酶FoodPro GOS的实例，对两歧双歧杆菌乳糖酶(可从丹麦杜邦公司获得)和Nutribio GOS L(来自米曲霉(可从丹麦杜邦公司获得)的酸性乳糖酶)进行了利用。
实例2：HPLC乳糖确定
以下方法描述了针对乳样品和其他基质中乳糖(以及潜在地异乳糖)定量的程序。对样品进行衍生化，并通过用UV和FLD检测的HPLC进行分析。
化学品：二甲亚砜，DMSO(CAS：67-68-5西格玛公司(Sigma)A8418)；磷酸，H3PO4(CAS：7664-38-2，西格玛公司P5811)；乙酸，≥99％(CAS：64-19-7，西格玛公司A6283)；磷酸钠，NaH2PO4≥99.0％(CAS：7558-79-4，西格玛公司S7907)；4-氨基-苯甲酸，≥99％(CAS：150-13-0，西格玛公司A9878)；2-甲基吡啶硼烷复合物溶液，95％(CAS：3999-38-0，西格玛公司654213)；四丁基硫酸氢铵，≥99.0％，(CAS：32503-27-8，西格玛公司86868)；乳糖(CAS：10039-26-6，西格玛公司)
衍生化溶剂是DMSO/乙酸(70/30％v/v)并且溶剂中的衍生化试剂4-氨基苯甲酸和2-甲基吡啶硼烷复合物是新鲜制备的。样品溶剂为10mM Na2HPO4(用H3PO4(85％)调节至pH2.5)。
利用安捷伦1100模块化HPLC系统，所述系统配备有在线真空脱气器、泵、自动进样器、柱温控制、二极管阵列检测器和荧光检测器。将安捷伦科技公司(AgilentTechnologies)OpenLAB CDS软件用于定量。柱：Knauer Prontosil RP-C18 SH(150×4.6mm，3μm)，来自Mikrolab公司(KN 15EF180PSG/15VH185PSJ)。将四丁基硫酸氢铵用作洗脱液系统中的离子对试剂。注射体积为20μL，柱温为20℃，等度：MP A流速：0.8mL/min，A：含有20mM四丁基硫酸氢铵(pH 2.0)的10mM磷酸钠缓冲液，B：针对洗涤程序的乙腈％，在每个注射柱之间用50/50v/v％乙腈/水进行洗涤，压力：250巴，运行时间：100min，荧光Ex：313nm和Em：358nm，二极管阵列检测器吸光度303nm。用于校准标准品的乳糖在ddH2O中制备为范围为5-500mg/L。
样品制备：将在pH 2.5在10mM NaH2PO4中制备的L-阿拉伯糖(75mg/L)用作针对所有样品的内标。对于不含乳糖的乳和奶油以及标准品：将200μL样品/标准品转移至1.5mLEppendorf管，添加400μL样品溶剂并混合。将该混合物在最大速度下离心10min(莱伯特离心机(Labnet centrifuge))并将200μL上清液转移至2mL Eppendorf管。对于不含乳糖的酸奶、脱脂酸牛奶(Skyr)和脱脂凝乳(Quarg)，利用以下制备：称取大约1g的发酵样品至1.5mLEppendorf管。将样品在最大速度下离心10min(莱伯特离心机)。将300μL样品转移至1.5mLEppendorf管，并添加600μL样品溶剂并混合。将该溶液在最大速度下离心10min并将200μL上清液转移至1.5mL Eppendorf管。如下对样品进行衍生化：向含有200μL样品200μL的2mLeppendorf管中添加衍生化试剂。将管放置在60℃的恒温混匀仪(Thermomixer)中，以750rpm反应30min。30min后，将含反应混合物的管从恒温混匀仪中取出，并将25μL反应混合物与225μL mL流动相在微量滴定板中混合。将该溶液经离心通过带有过滤器的微量滴定板过滤。最后封板后进行HPLC分析。根据校准标准品和内部对照计算乳制品样品(包括乳)中的乳糖浓度。
实例3：中性乳糖酶活性确定
以下方法将被用于确定乳糖酶活性的活性(以NLU/g计)。适用于确定衍生自乳酸克鲁维酵母和酵母属物种的酶制剂中2000-5000个中性乳糖酶单位(NLU)/g的乳糖酶活性。该测定方法的原理是：乳糖酶在30℃且在pH 6.5水解邻硝基苯酚(ONP)和半乳糖中的邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)。通过添加碳酸钠将反应终止，并在分光光度计或色度计在420nm处测量释放的ONP。将一个NLU/g定义为在测定条件下释放1.30μM邻硝基苯酚/min的酶的那个量。
制备以下试剂：0.1M镁溶液，通过将24.65g MgSO4.7H2O(西格玛奥德里奇公司(Sigma-aldrich))定量转移到1L容量瓶中。5mM EDTA溶液，通过将1.86g Na2EDTA(C10H14N2Na2O8.2xH2O)定量转移到1L容量瓶中，溶解于较小体积的蒸馏水中，并且之后稀释至体积。0.1M PEM缓冲液：磷酸盐缓冲溶液。-pH 6.5。将8.8g KH2PO4和8g K2HPO4.3H2O定量转移到1L容量瓶中并溶解于约900mL H2O中。添加10mL Mg溶液和10mL EDTA溶液。用蒸馏水稀释并混合。如果必要，在使用前用水性KOH溶液56g/L或10％H3PO4溶液调节pH。Na2CO3终止溶液-将50g的Na2CO3和37.2g Na2EDTA溶解于1000ml的蒸馏水中。ONPG底物-将250mg的ONPG(Mw：301.55g/mol，西格玛奥德里奇公司N1127号)溶解于容量瓶中，用缓冲液补足100ml。ONP标准品溶液-0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12和0.14μM ONP/mL，制备如下：将139mgONP(2-邻硝基苯酚，西格玛奥德里奇公司33444-25G号>99％纯度，LC等级)转移到1L容量瓶中，并溶解于10mL 95％乙醇中。用H2O稀释至体积并混合。从该溶液中，用移液管移2、4、6、8、10、12和14mL等分试样到单独的100mL容量瓶中。向每个瓶中添加25mL Na2CO3溶液并用缓冲液稀释至体积。
测定程序：一式两份地称取最低1g乳糖酶；溶解于缓冲液中，以便在最终稀释中1mL含有0.027-0.095NLU。记录总稀释体积。使ONPG底物在30℃平衡(至少)10min。从每个最终稀释(样品和样品空白)中用移液管移两份1mL等分试样到单独的15×150mm测试格拉斯管(glas tube)。将测试管和缓冲液空白(非样品空白)放置在30℃的水浴中并且恰好平衡5min，从零点时间开始，并且以1min(或15秒)间隔添加5mL经平衡的ONPG底物(并通过摇动混合，当添加底物时启动秒表)。10min孵育后，通过添加2mL Na2CO3溶液(或者如果体积缩小，则为1mL)，按1min(或15秒)间隔以相同顺序终止反应。样品空白：向样品空白中添加2mLNa2CO3溶液(或者如果体积缩小，则为1mL)。通过摇动混合并添加5mL ONPG底物。30min内以蒸馏水为空白，例如在比色皿中确定样品、样品空白、缓冲液空白和ONP标准品的OD420。针对每个标准品溶液，针对μM的ONP绘制OD420。必须获得通过原点的直线。将每个标准品溶液的吸光度除以μM的ONP，以获得针对每个浓度的吸收性a和计算值的平均值。应获得4.65+/-0.05的值。如果未获得该值，则用新鲜制备的试剂重复分析。
在如下测试样品中计算中性乳糖酶活性：
Figure BDA0003312475830000561
A＝测试的吸光度，针对测试空白校正；
8＝终止后孵育混合物的体积，mL；
D＝测试样品的总稀释因子；
a＝吸收性；
10＝孵育时间，min；
W＝测试部分的重量，g
1.30＝NLU定义中使用的因子。
将活性计算为双份分析的平均值。
实例4：蛋白质测定方法
通过无染料成像仪标准(Stain FreeImagerCriterion)进行蛋白质确定
使用Gel DocTMEZ成像系统通过SDS-PAGE凝胶和光密度法对蛋白质进行定量。测定中使用的试剂：经浓缩的(2x)Laemmli样品缓冲液(伯乐公司(Bio-Rad)，目录号161-0737)；26孔XT 4-12％Bis-Tris凝胶(伯乐公司，目录号345-0125)；蛋白质标志物“精密度+蛋白质标准品(Precision Plus Protein Standards)”(伯乐公司，目录号161-0363)；蛋白质标准BSA(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)，目录号23208)和SimplyBlue Safestain(英杰公司，目录号LC 6060)。如下进行测定：在96孔PCR板中，将50μL经稀释的酶样品与含有2.7mg DTT的50μL样品缓冲液混合。将板用来自伯乐公司的Microseal‘B’膜密封并放入PCR机器中加热至70℃，持续10分钟。之后，通过运行缓冲液填充腔室，设置凝胶盒。然后将10μL的每个样品和标准品(0.125-1.00mg/mL BSA)加载在凝胶上，并加5μL的标志物。之后，将电泳在200V下运行45min。电泳后，将凝胶在水中漂洗3次5min，然后在Safestain中染色过夜，并最后在水中脱色。然后，将凝胶转移到成像仪中。使用Image Lab软件来计算每个条带的强度。使用BSA(赛默飞世尔科技公司，目录号23208)制作校准曲线。通过条带强度和校准曲线来确定靶蛋白的量。采用蛋白质定量方法来制备用于随后实例的酶样品。
实例5：经基因修饰以缺乏所分泌的脂肪酶(lipA)的表达乳糖酶的芽孢杆菌属宿主细胞的产生
使用CRISPR技术，使没有对硝基苯甲基酯酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶和甘露聚糖酶活性的芽孢杆菌属宿主细胞中缺失对所分泌的脂肪酶进行编码的枯草芽孢杆菌lipA基因[如WO 2018/187524中所描述的]。如WO/US 18/026170中所描述的对含有Cas9Y155H变体表达盒的质粒pRF827进行构建。
pCAS-lipA质粒的构建(图1)：将质粒pRF827扩增，以将pRF827中serA靶位点替换为lipA靶位点。使用引物CB1287(SEQ ID NO:3)和CB1284(SEQ ID NO:4)来扩增新的lipA靶位点。
CB 1287(SEQ ID NO:3)5’-TTA TGG TTC ACG GTA TTG GAG TTT TAG AGC TAGAAA TAG CAA GTT-3’
CB 1284(SEQ ID NO:4)5’-GAT AGC AGA AGA AAA TGG AGG AAT TGT CAG ACCAAG TTT ACT CA-3’
同样使用pRF827构建第二DNA片段，并将aprE启动子扩增到新的lipA靶位点。
CB 1283(SEQ ID NO:5)5’-TGA GTA AAC TTG GTC TGA CAA TTC CTC CAT TTTCTT CTG CTA TC-3’
CB 1288(SEQ ID NO:6)5’-TCC AAT ACC GTG AAC CAT AAT CCA CAC ATT ATGCCA CAC-3’
将这两段体外组装，随后转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中。质粒含有lipA靶位点(SEQ ID NO:7，5’-TTATGGTTCACGGTATTGGA-3’)，然后使用所述靶位点使lipA缺失。
pRS426-lipA缺失质粒的构建(图2)：使用酵母组装，对具有枯草芽孢杆菌的基因组中的同源区的lipA缺失构建体进行组装。通过PCR扩增四个片段并组装。第一片段包括pRS426载体主链的一半(Genetics.[遗传学]1989年5月；122(1):19-27)。使用引物DH 18-327F和DH 18-273R扩增该段。
DH 18-327F(SEQ ID NO:8)
5’-CTTTTGCAGGACGTGCATTTCAGACTTGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAA
TGAGTGAGGTAACTC-3’
DH 18-273R(SEQ ID NO:9)5’-GTAGTAAGAACTATTCATAGAGTGAATCGAAAACAATACG-3’
第二DNA片段包括pRS426载体主链的一半(Genetics.[遗传学]1989年5月；122(1):19-27)。使用引物DH 18-272F和DH 18-325R扩增该段。
DH 18-272F(SEQ ID NO:10)
5’-CGTATTGTTTTCGATTCACTCTATGAATAGTTCTTACTAC-3’
DH 18-325R(SEQ ID NO:11)
5’-CTATGGTTCTTCTCAAATGTCACGACTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTT
TCTCGCC ACGTTCG-3’
使用枯草芽孢杆菌基因组DNA扩增第三片段，并且所述第三片段在lipA的上游含有基因区，所述基因区包括imrB、imrA、ansZ基因，以便整合在基因组中，其中在lipA的下游区具有突出，以允许组装。
DH 18-317F(SEQ ID NO:12)
5’-CGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGTCGTGACATTT
GAGAAGAACC AT AG-3’
DH 18-320R(SEQ ID NO:13)5’-CTTCAAGGTTTTGTTTTTCATTAATTCTAAGATTCAGA
GGTCATTATTGGTCCT-3’
从枯草芽孢杆菌基因组DNA扩增第四片段，并且所述第四片段在lipA的下游区中含有yczC、yccF、natK基因，其中具有到上游区中的突出以允许组装。
DH 18-316F(SEQ ID NO:14)
5’-AGGACCAATAATGACCTCTGAATCTTAGAATTAATGAAAAA
CAAAACCTTGAAGAAT-3’
DH 18-318R(SEQ ID NO:15)
5’-TCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACAAGTCTGAAATGCACG
TCCTGCAAAAG-3’
将这四个段组装并使用Zymo研究冷冻-EZ酵母转化Ⅱ试剂盒(Zymo ResearchFrozen-EZ Yeast TransformationⅡKit)转化到研究酵母菌株ATCC#76625＝酿酒酵母yph499中。使用寡核苷酸DH 18-343F和DH18-346R从组装好的酵母质粒中扩增出由上游lipA同源区和下游lipA同源区组成的线性缺失构建体。将该片段用作使lipA缺失的修复模板。
DH 18-343F(SEQ ID NO:16)5’-CGTGAC ATTTGAGAAGAACC ATAGTACAACGGTG-3’
DH 18-346R(SEQ ID NO:17)5’-GTCTGAAATGCACGTCCTGCAAAAGAAG-3’
lipA缺失的菌株的转化和分离
将线性缺失构建体和pCAS-lipA CRISPR质粒共转化到枯草芽孢杆菌细胞中。将转化反应在具有1.6％脱脂乳的5ppm(百万分率)的卡那霉素上铺板。然后将转化体在5ppm卡那霉素板上划线，并且进行菌落PCR以检查lipA缺失(使用的引物见下文)。
DH 18-385F(SEQ ID NO:18)5’-GTCGGTTCGATGAGACCTTCCAC-3’
DH 18-386R(SEQ ID NO:19)5’-CTGCC ATGATTCTACGATCTCAC-3’
β-半乳糖苷酶表达盒的转化
将用于表达来自德氏乳杆菌保加利亚亚种的β-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:1)的盒在lipA缺失的菌株中转化并在半乳糖苷(X-gal)板上铺板。将转化体在半乳糖苷板上重新分离，以更好地观察表达乳糖酶的克隆。
lipA(SEQ ID NO:20)[枯草芽孢杆菌168]的核苷酸序列
ATGAAATTTG TAAAAAGAAG GATCATTGCA CTTGTAACAA TTTTGATGCT GTCTGTTACA
TCGCTGTTTG CGTTGCAGCC GTCAGCAAAA GCCGCTGAAC ACAATCCAGT CGTTATGGTT
CACGGTATTG GAGGGGCATC ATTCAATTTT GCGGGAATTA AGAGCTATCT CGTATCTCAG
GGCTGGTCGC GGGACAAGCT GTATGCAGTT GATTTTTGGG ACAAGACAGG CACAAATTAT
AACAATGGAC CGGTATTATC ACGATTTGTG CAAAAGGTTT TAGATGAAAC GGGTGCGAAA
AAAGTGGATA TTGTCGCTC A CAGCATGGGG GGCGCGAACA CACTTTACTA CATAAAAAAT
CTGGACGGCG GAAATAAAGT TGCAAACGTC GTGACGCTTG GCGGCGCGAA CCGTTTGACG
ACAGGCAAGG CGCTTCCGGG AACAGATCCA AATCAAAAGA TTTTATACAC ATCCATTTAC
AGCAGTGCCG ATATGATTGT CATGAATTAC TTATCAAGAT TAGATGGTGC TAGAAACGTT
CAAATCCATG GCGTTGGACA CATCGGCCTT CTGTACAGCA GCCAAGTCAA CAGCCTGATT
AAAGAAGGGC TGAACGGCGG GGGCCAGAAT ACGAATTAA
Lip A(SEQ ID NO:2)[枯草芽孢杆菌168]的氨基酸序列
MKFVKRRIIA LVTILMLSVT SLFALQPSAK AAEHNPVVMV HGIGGASFNFAGIKSYLVSQGWSRDKLYAV DFWDKTGTNY NNGPVLSRFV QKVLDETGAK KVDIVAHSMGGANTLYYIKNLDGGNKV ANV VTLGGANRLT TGKALPGTDP NQKILYTSIY SSADMIVMNYLSRLDGARNVQIHGVGHIGL LYSSQVNSLI KEGLNGGGQN TN
实例6：来自德氏乳杆菌保加利亚亚种的β-半乳糖苷酶的表达和纯化
来自德氏乳杆菌保加利亚亚种的B-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的表达是在好氧发酵条件下实现的。典型地，发酵是在工业标准的生物反应器中在pH 6-8且在37C在由碳和氮源以及无机盐组成的培养基中进行的。然后使用常规程序(包括但不限于离心、微滤或絮凝组合旋转真空转鼓或压滤器过滤)从发酵培养基中回收β-半乳糖苷酶。收集上清液或滤液，并跨10kDa PES膜(科氏公司(Koch))超滤至期望的富集浓度，以便纯化。可以采用纯化以达到期望的纯度水平，如但不限于色谱法(即EP 2280065)、蛋白质结晶(即WO8908703)或沉淀。用于最佳溶出的沉淀剂或结晶剂包括但不限于金属卤化物，如氯化钠、氯化镁、氯化钾、硫酸钠及其范围为0.1％(w/w)至5％(w/w)的组合。可以将目的色谱级分进一步汇集并浓缩，以使最终配制品在pH 6-8由40％-60％甘油组成。额外地，沉淀或结晶的β-半乳糖苷酶在7000-10,000rpm下形成团粒，其中团粒可以用水重新悬浮并重新形成团粒，以获得最佳纯度。可以用上述配制品将团粒重新悬浮，并跨旋转转鼓过滤或压滤器进行过滤，以去除在该过程中在上游形成的任何不溶性微粒。
实例7：乳糖酶最佳温度
根据如实例3中给出的经修饰的FCC IV方法，针对乳糖酶GODO-YNL、实验性杜邦公司乳糖酶SEQ ID NO:1和Saphera，从5℃至70℃对乳糖酶最佳温度进行了评估。结果示出于图3中并且全部以在30℃所定量的酶活性的相对乳糖酶活性％来呈现。对温度曲线进行比较，可清楚地看到，实验性杜邦公司乳糖酶SEQ ID NO:1具有接近于60℃(300％)的显著的最佳温度，而GODO YNL2和Saphera具有接近于45℃(100％-150％)的最佳值。与现有的水解性乳糖酶相比，预期实验性杜邦公司乳糖酶SEQ ID NO:1将使得能够在更高的温度用于乳基应用。
实例8：乳中的乳糖酶稳定性
将水解性乳糖酶样品(实验性杜邦公司乳糖酶SEQ ID NO:1和Nola Fit)在AriaMini乳样品(丹麦爱氏晨曦公司(Aria Foods,Denmark)，0.5％脂肪和4.8％乳糖)中稀释并等分成1mL样品，然后在55℃和58℃孵育长达6小时。将一份样品储存在5℃以供参考。当从孵育中取出时，将样品在冰上迅速冷却，并且然后冷冻储存，直到对残留活性进行定量。
通过以下程序对残留乳糖酶活性进行定量：将20μL的每个乳样品在480μL 0,1MMES缓冲液(pH 6.4)(Mw：195.2g/mol，西格玛奥德里奇公司M8250-250G号)中稀释。将样品预热2min至37℃，然后添加750μL 3.7mg/ml ONPG底物(ONPG，Mw：301.55g/mol，西格玛奥德里奇公司N1127号)。在10分钟的酶解后，用750μL 10％碳酸钠(西格玛奥德里奇公司)终止溶液将反应终止。将样品在850μL终止缓冲液中进一步稀释150μL，然后在分光光度计上读取Abs420。将残留活性％计算为Abs420(在≥50温度孵育的样品)/Abs420(在5℃储存的参考样品)。结果在图4A和4B上示出。可清楚地观察到，与Nola Fit相比，在55℃和58℃，实验性杜邦公司乳糖酶SEQ ID NO:1均保留了显著地更高的特异性活性，这可以实现在乳基产品中充足的乳糖水解。
实例9：热稳定性乳糖酶用于在高温产生乳糖减少的或不含乳糖的乳产品的用途
在60℃下，将50mL Aria Mini乳样品(丹麦爱氏晨曦公司，0.5％脂肪和4.8％乳糖)在水浴中回火。在乳样品中添加不同乳糖酶，以使乳糖能够在高温(60℃)减少。在乳糖酶样品中所确定的蛋白质浓度是实例4中的相应方法，并且应用了表1中给出的剂量。
表1：
蛋白质，mg/ml： 剂量ml/L乳
GODO YNL2 30.7 1.212
NOLA Fit 5500 25.2 1.476
NutriBio GOS液体 21.3 1.746
FoodPro GOS 81.3 0.458
实验性杜邦公司乳糖酶SEQ ID NO:1，J15005 63.0 0.590
在时间零点，将不同乳糖酶添加到乳中并混合。在从10至240分钟的不同时间点提取1mL样品以便以下酶失活。立即在98℃在恒温混匀仪中进行失活，持续10分钟。将失活的样品储存在-20℃直至定量。根据实例2中的HPLC方法在所有样品中对乳糖进行定量，并且结果示出于图5A中。
清楚的是，实验性杜邦公司乳糖酶SEQ ID NO:1的高热稳定性使得能够在60℃水解以高效地产生不含乳糖(100ppm，0.01％w/vol)或乳糖减少的(1000ppm，0.1％w/vol)乳样品。其余组的所测试乳糖酶显示在乳中的乳糖水解不足，可能是由于高温导致的快速失活。
SEQ ID NO:1的乳糖酶也是使用相同条件测试的，但是在不同的温度下测试。结果示出于图5B中。清楚的是，乳糖酶可以在一系列不同的温度下显著地减少乳糖的量。
实例10：热稳定性乳糖酶用于炼乳中的乳糖水解的用途
通过将低脂乳(丹麦爱氏晨曦公司，脂肪0.1％)(83,5％)与脱脂乳粉(丹麦爱氏晨曦公司，脂肪1.25％，批次3150035537)(16,5％)混合制备了具有12％(w/v)乳糖的重组乳样品。将乳样品在55℃回火，然后添加以下表2中所指示剂量的实验性杜邦公司乳糖酶SEQID NO:1。在恰好1小时后，持续10min将乳迅速加热至97℃，以使乳糖酶失活。根据实例2中的HPLC方法对残留乳糖进行定量，并且结果示出于表2中。实验清楚地展示出实验性杜邦公司乳糖酶SEQ ID NO:1能够在高温在乳基溶液中减少乳糖。
表2
Figure BDA0003312475830000641
Figure BDA0003312475830000651
实例11：热稳定性乳糖酶用于产生重组甜炼乳的用途
程序：根据表3成分(以％w/w计)产生了样品2至8号。将脱脂乳粉(丹麦爱氏晨曦公司，脂肪1.25％，批次3150035537)(22.9％w/w)和脱矿质水(24.4％w/w)在55℃良好搅动下混合并水化大约15分钟以便完全溶解。将与乳糖酶SEQ ID NO:1(具有16976SDLU/g的乳糖酶活性)相对应的实验性杜邦公司乳糖酶：J15005批：4863191499以不同浓度添加至样品2至6(0.005％、0.01％、0.34％、0.50％和0.34％w/w)，并将混合物在55℃进一步孵育60min。将黄油AMF(黄油(Butter oil)，科尔曼(Corman)，比利时A00015111号(Belgiumno.A00015111))溶化并且然后在75℃(仅针对试验6为65℃)与蔗糖(砂糖(Granulatedsugar)，550，北欧糖(Nordic Sugar)，丹麦)和Recodan(
Figure BDA0003312475830000652
RS VEG，丹麦杜邦营养生物科学公司(Dupont Nutrition Bioscience,Denmark))一起添加至混合物。然后将所有样品在75℃(仅针对样品6为65℃)、80巴下均质化，并且然后在90℃进行进一步巴氏杀菌，持续15秒。然后将甜炼乳填充入铝罐并密封。将乳糖粉(
Figure BDA0003312475830000653
992BG100，丹麦爱氏晨曦公司)研磨得尽可能的细，以确保仅较小的晶体形成并且在巴氏杀菌后仅添加样品7，并且在32℃孵育60-90min，然后填充。根据实例2中的HPLC方法对样品2-6进行乳糖定量，并且结果示出于表4中。乳糖浓度根据所添加的热稳定性乳糖酶的量而明显有所下降。图6中示出了重组甜炼乳的图片。该图片清楚地示出，在样品8中形成乳糖晶体，其中既未使用实验性杜邦公司乳糖酶SEQ ID NO:1，也未使用细研磨的乳糖(微晶的)(所述这些可用于避免较大的晶体形成)。样品2和7具有轻微的沙质口感，但含实验性杜邦公司乳糖酶SEQ IDNO:1的样品3-6的口感全顺滑，并且没有任何晶体形成。数据清楚地证明，针对重组甜炼乳的产生，高温下热稳定性实验性杜邦公司乳糖酶SEQ ID NO:1的使用可以出乎意料地防止乳糖晶体形成并减少沙质口感。
表3
Figure BDA0003312475830000661
表4
Figure BDA0003312475830000662
煮熟甜炼乳程序：在120℃将含上述制备的样品的铝罐在高压釜中热处理10min以诱导美拉德反应。(煮熟以获得美拉德反应)。之后将样品在室温下储存6周。图7中示出了煮熟甜炼乳的图片。
图片清楚地示出，与没有微晶乳糖或添加乳糖酶的对照相比，以仅0.05％(w/w)实验性杜邦公司乳糖酶SEQ ID NO:1(防止晶体形成)的剂量可以出乎意料地实现相同水平的所需褐变。针对0.05％以上的实验性杜邦公司乳糖酶(样品3-6)的所有剂量，可以观察到增加的褐变(作为对增加的美拉德反应的响应)。
实例12：热稳定性乳糖酶用于产生含低乳糖的奶昔的用途
在以下实例中对热稳定性乳糖酶用于产生低乳糖奶昔的用途进行了测试。将根据表5的所有液体成分在55℃混合：奶油(丹麦爱氏晨曦公司，38％脂肪)、脱脂乳(丹麦爱氏晨曦公司，0.1％脂肪，4.8％乳糖)和乳糖酶(实验性杜邦公司乳糖酶SEQ ID NO:1、Nola Fit或无酶)。将干成分混合在其中：脱脂乳粉(丹麦爱氏晨曦公司，脂肪1.25％，批次3150035537)、蔗糖(砂糖，550，北欧糖，丹麦)、
Figure BDA0003312475830000672
Two(丹麦杜邦公司)、CremodanMSA(丹麦杜邦公司)，并添加以下香草调味和着色物(胭脂树种子提取物(Annatto SeedExtract)，丹尼斯克公司(Danisco)，丹麦，P.no.1211663)。将所有成分彻底混合，并在56℃保持70分钟。将温度增加至70℃并根据脂肪百分比将三个样品(1、2、和3)在70℃/压力下均质化，并且然后在84℃下巴氏杀菌30秒。之后将样品冷却至5℃并填充至2X 180ml TPS+2x155ml锅，并将其余的填充在金属容器中以供进一步热处理。将金属容器加热至95℃，持续10min，以确保恰当的酶失活。根据实例2对乳糖进行定量，并且样品1、2、和3分别含有：4.50％(w/v)、0.17％(w/v)和0.30％(w/v)乳糖。这清楚地证明了在高温下实验性杜邦公司乳糖酶SEQ ID NO:1针对低乳糖奶昔的高效用途。
表5
Figure BDA0003312475830000671
Figure BDA0003312475830000681
实例13：热稳定性乳糖酶用于产生低乳糖冰淇淋的用途
在以下实例中对热稳定性乳糖酶用于产生低乳糖冰淇淋的用途进行了测试。将根据表6的所有液体成分在55℃混合：奶油(丹麦爱氏晨曦公司，38％脂肪)、脱脂乳(丹麦爱氏晨曦公司，0.1％脂肪，4.8％乳糖)、葡萄糖糖浆(32DE 95％TS)和乳糖酶(实验性杜邦公司乳糖酶SEQ ID NO:1、Nola Fit或无酶)。将干成分混合在其中：脱脂乳粉(丹麦爱氏晨曦公司，脂肪1.25％，批次3150035537)、蔗糖(砂糖，550，北欧糖，丹麦)、
Figure BDA0003312475830000683
Two(丹麦杜邦公司)、Cremodan MSA(丹麦杜邦公司)、
Figure BDA0003312475830000684
SE 30(丹麦杜邦公司)，并添加以下调味(香草调味)和着色物(胭脂树种子提取物，丹尼斯克公司，丹麦，P.no.1211663)。将所有成分彻底混合，并在56℃保持70分钟。将温度增加至70℃并根据脂肪百分比将三个样品(1、2、和3)在70℃/压力下均质化，并且然后在84℃下巴氏杀菌30秒。之后将样品冷却至5℃并填充至2X 180ml TPS+2x 155ml锅，并将其余的填充在金属容器中以供进一步热处理。将金属容器加热至95℃，持续10min，以确保恰当的酶失活，并且然后冷冻。根据实例2对乳糖进行定量，并且样品1、2、和3分别含有：4.90％(w/v)、0.20％(w/v)和0.74％(w/v)乳糖。这清楚地证明了在高温下实验性杜邦公司乳糖酶SEQ ID NO:1针对低乳糖冰淇淋的高效用途。
表6
Figure BDA0003312475830000682
Figure BDA0003312475830000691
实例14：感官评价
用于感官评价的UHT乳的产生
向乳中添加不同的酶，并留在5摄氏度的循环冰水浴中24小时。
UHT-PHE直接注射：
-H1：70℃
-H2：90℃
-注射：142℃(3秒)
-真空：87℃
-下游均质化(150/30)
-C2：45℃
-C3：20℃
-填充在1L无菌瓶中
-.-在室温下储存10周
感官方法
为了描述感官可感知的产品属性，选择描述性感官分析。描述性分析的基础是ISO13299“Sensory analysis-Methodology-General guidance for establishing asensory profile[感官分析-方法学-用于确立感官曲线的通用指南]”。
在感官描述性分析中，在具有表示低强度和高强度的两个锚点的直线标度上分别评价每个描述符的强度。在训练/校准会议中，将低和高的锚点教导给小组。一式三份评价所有样品。
感官小组由8个人组成，在参与这一分析的描述性分析之前，在小组接受他们之前，这些人都已经通过基础感官筛选测试。在产品属性的识别和强度标度化方面，对小组成员进行了训练。图8示出了具有显著差异的风味属性。它清楚地描绘了含有LipA的乳糖酶是如何在乳中导致bam样(bam like)、酸味、陈味和苦味的，而不含LipA的样品无论是参考乳还是添加了不含LipA的乳糖酶的乳都不存在这种情况。随着乳糖酶的添加，UHT乳的风味属性(像甜味、煮熟味和焦糖味)等通常可见。
脂肪酶/FFA测试
试剂制备
R1：通过将一瓶颜色A(Color A)和溶剂A混合来制备R1。
制备R1之后，储存在2℃-10℃且在1个月内使用。
R2：通过将一瓶颜色B(Color B)和溶剂B混合来制备R2。
制备R2之后，储存在2℃-10℃且在1个月内使用。
程序
将200μL酶样品添加至含3,5％脂肪的800μL参考乳中。然后将样品储存在5℃持续20小时。向10μL的参考乳和经酶解的乳样品中添加297μL R1，并在37℃在恒温混匀仪中孵育。10min后，将150μL R2添加至每个管中，并在37℃孵育，持续8分钟。然后将样品离心，使雾状乳(milk haze)留在顶部级分中。从底部级分中小心地等分200μL，然后在微量滴定板中读取OD 546。
结果显示，含有LipA的乳糖酶的OD546为0.5673，参考乳的OD546为0.2213，并且不含LipA的乳糖酶的OD546为0.3048。
实例15：巴氏杀菌和均质化后乳糖酶的添加
通过添加来自BBA拉克塔利斯公司(Lactalis)(法国马耶讷省拉瓦勒(Laval,Mayenne,France))的脱脂乳粉(33％蛋白质、1.2％脂肪、54％碳水化合物)、和来自丹麦爱氏晨曦公司的奶油(38％脂肪)，将储存在4℃-6℃的预巴氏杀菌(72℃持续15s)的散装共混脱脂乳(0.1％脂肪)(丹麦爱氏晨曦公司)标准化至期望的蛋白质(4％w/w)和脂肪(1％w/w)含量。然后将标准化的奶在标准板式热交换巴氏杀菌器中进行巴氏杀菌和均质化。在65℃以200巴进行均质化，并在95℃进行巴氏杀菌6分钟。然后将乳冷却至其发酵温度(45℃)。在达到发酵温度之后，为乳接种嗜热起子培养物(例如YO-MIX 224/485)，接种率为20DCU/100L。直接向乳糖酶添加培养物。替代性地，乳糖酶可以在≤60℃温度下在巴氏杀菌和均质化之后(即在冷却至发酵温度期间)添加。在酶添加之后和在发酵期间，在不同时间点内取经加热的样品(95℃，20min)和未经加热的样品(各自2mL)。将未经加热的样品用于确定剩余的乳糖酶活性。通过以下程序对残留乳糖酶活性进行定量：将20μL的每个乳样品在480μL0,1M MES缓冲液(pH 6.4)(Mw：195.2g/mol，西格玛奥德里奇公司M8250-250G号)中稀释。将样品预热2min至37℃，然后添加750μL 3.7mg/ml ONPG底物(ONPG，Mw：301.55g/mol，西格玛奥德里奇公司N1127号)。在10分钟的酶解后，用750μL 10％碳酸钠(西格玛奥德里奇公司)终止溶液将反应终止。将样品在850μL终止缓冲液中进一步稀释150μL，然后在分光光度计上读取Abs420。将残留活性％计算为Abs420(在≥50℃温度孵育的样品)/Abs420(在5℃储存的参考样品)。将经加热的样品用于随后根据实例2确定剩余的乳糖。使用CINAC多通道pH系统(Ysebaert公司(Ysebaert)，弗雷皮永(Frépillon)，法国)进行发酵，所述系统每5min监测一次pH变化。进行发酵直至pH为4.60，并将产物在酸奶板式热交换器(斯必克流体技术公司(SPX Flow Technology)，英国萨塞克斯郡(Sussex,UK))和YTRON-ZP剪切泵系统(YTRON工艺技术公司(YTRON Process Technology)，德国拜德恩多夫(Bad Endorf,Germany))上冷却至24℃。将所得搅拌型酸奶储存在4℃-6℃。
词语“包含(comprise、comprises、以及comprising)”将被解释为包含的而非排他的。这种解释旨在与在本文提交时根据美国专利法给出的这些词语的解释相同。
除非上下文另外指示，否则单数形式“一个/种(a)”和“一个/种(an)”旨在包括复数指示物。因此，例如，除非上下文另外指示，否则提及存在“一种赋形剂”并不排除存在多种赋形剂。
实例16：用于对GOS纤维进行定量的HPLC方法
已经描述了德氏乳杆菌保加利亚亚种乳糖酶能够在含5.2％初始乳糖(文献1、2)的脱脂乳中形成GOS(DP3+)，将15％的乳糖转换为聚合度为3或以上的GOS(DP3+)。Tien-Thanh Nguyen等人(文献3)也描述了测试德氏乳杆菌保加利亚亚种乳糖酶在较高底物浓度下，在含20.5％初始乳糖的缓冲条件下，将多达50％的乳糖转换为总GOS(TGOS，包括DP2GOS(像异乳糖))。然而，尚无预期在乳底物中可以实现相似的转换产率。Todor Vasiljevic和Paul Jelen 2003(文献4)显示，与使用溶解于缓冲液中作为底物的5％乳糖相比，使用德氏乳杆菌保加利亚亚种乳糖酶的产率在含5％乳糖的乳底物中要低约40％。当以10％-15％乳糖浓度测试时，观察到了相同的趋势(与经缓冲的条件相比，在乳底物中乳糖转换为TGOS的转换率更低)。
本文显示，当酶解乳底物时，针对原位GOS产生，德氏乳杆菌保加利亚亚种乳糖酶具有商业价值。出乎意料的是，发现在含9％-30％(w/w)乳糖的乳基底物中获得超过25％的糖减少是可能的。当使用普通乳糖酶(像GODO YNL2)时将不可能达到25％的糖减少。
在双蒸馏水(ddH2O)中制备标准乳糖(HPLC分析等级，西格玛奥德里奇公司)并将所述乳糖通过0.2μm注射器式过滤器进行过滤。创建从500至10000ppm的乳糖标准品的稀释系列。
应用相似的乳基溶液样品制剂，然而，将乳样品稀释至大约5％的乳碳水化合物，然后将200mg样品(注明重量的)在800μL H2O中彻底混合。将50μL Carrez试剂A(Carrez澄清试剂盒(Carrez Clarification Kit)，1.10537.001，默克公司(Merck))和50μL CarrezB添加至1000μL经稀释的样品中，在各自之后混合，以诱导蛋白质和脂质沉淀。将样品混合物在室温下孵育15分钟，并将50μL 10mM NaOH、1mM EDTA添加至样品。将样品以10.000rpm离心4分钟，并将300μL澄清的上清液转移至MTP过滤板，通过0.20μm 96孔板过滤器(以3000rpm离心15分钟)，然后分析(Coming过滤板(Coming filter plate)，PVDF亲水膜，美国纽约)。在用胶带密封的96孔MTP板中一式两份地分析所有样品。
仪器：
通过HPLC进行半乳寡聚糖(GOS)、乳糖、葡萄糖和半乳糖的定量。样品分析在配备有DGP-3600SD双梯度分析泵、WPS-3000TSL恒温自动进样器，TCC-3000SD恒温柱温箱和RI-101折光率检测器(昭和公司(Shodex)，JM科学公司(JM Science))的Dionex Ultimate3000HPLC系统(赛默飞世尔科技公司)上进行。使用Chromeleon数据系统软件(6.80版，DU10A Build 2826，171948)进行数据采集和分析。
色谱条件：
使用配备有在70℃下操作的分析保护柱(Carbo-Ag+中性，AJ0-4491，菲罗门公司(Phenomenex)，荷兰)的RSO寡糖柱(Ag+4％交联的(菲罗门公司，荷兰))，通过HPLC分析样品。以0.3ml/min的流速用双蒸水(通过0.45μm再生纤维素膜过滤并用氦气吹扫)洗脱柱。
在整个分析中保持0.3ml/min的等度流速，总运行时间为45分钟，并且注射体积设定为10μL。在恒温自动进样器室中将样品保持在30℃，以确保所有组分的溶解。通过折光率检测器(RI-101，昭和公司，JM科学公司)监测洗脱液，并通过相对于如上文所描述的乳糖标准品的峰面积的峰面积进行定量。将DP3及以上(DP3+)的峰定量为半乳糖寡糖(DP3、DP4、DP5等)。用质量平衡证实了所有DP3+半乳寡聚糖组分都提供相同的响应这一假设。以类似方式将包括其他DP2组分的乳糖定量为DP2、葡萄糖和半乳糖。
实例17：总GOS
总GOS(TGOS)是转半乳糖基化分子的总和。该值的计算依据是TGOS分子中结合的半乳糖量乘以因子1.4，其中因子1.4表示半乳糖与葡萄糖的比率。TGOS分子中结合的半乳糖是通过从总半乳糖(即游离半乳糖、TGOS中结合的半乳糖和乳糖中结合的半乳糖之和)中减去游离半乳糖和乳糖中结合的半乳糖来计算的。该计算方法符合AOAC2001.02方法。
基于从实例2和实例16中获得的值，如下计算了TGOS：
TGOS＝(总碳水化合物(％w/w)/1.9-半乳糖(％w/w)-乳糖(％w/w)/1.9×1.4
总碳水化合物(％w/w)是DP3+(％w/w)、DP2(％w/w)、葡萄糖(％w/w)和半乳糖(％w/w)之和
总碳水化合物(％w/w)/1.9表示样品中的总半乳糖
半乳糖(％w/w)是样品中的游离半乳糖。
乳糖(％w/w)/1.9是乳糖分子中结合的半乳糖。
实例18：乳糖缓冲的底物中乳糖转换为GOS
在100ml 0.1M MES缓冲液(pH 6.4)(Mw：195.2g/mol，西格玛奥德里奇公司M8250-250G号)中由无水乳糖(西格玛奥德里奇公司，17814号)制备12％、20％、和30％的乳糖溶液。将溶液温度提升至40℃，以便添加GODO YNL2，或提升至55℃以便添加LBul。当达到正确的温度时，根据表7，在时间0时添加酶。在20、40、60和80分钟后，收集5ml样品以便失活。失活在95℃下进行，持续10分钟。DP3+、DP2、葡萄糖、半乳糖的定量根据实例16进行，并且根据实例2对乳糖进行定量。
表7.
乳糖％ 酶 剂量g/L 温度(℃)
12 LBul 0.77 55
20 LBul 1.29 55
30 LBul 1.43 55
12 GODO YNL2 0.79 40
20 GODO YNL2 8.00 40
30 GODO YNL2 11.9 40
所有数据与总碳水化合物(carb.)、糖减少％、TGOS(根据实例17)和转换为TGOS的乳糖％的计算值一起呈现于表8(针对LBul)和表9(针对GODO YNL2)中。
表8.在乳糖缓冲的底物中LBul乳糖转换为GOS
Figure BDA0003312475830000751
Figure BDA0003312475830000761
*总碳水化合物(％w/w)是DP3+(％w/w)、DP2(％w/w)、葡萄糖(％w/w)和半乳糖(％w/w)之和
**将转换为TGOS的乳糖％计算为相对于总碳水化合物的TGOS％。
***糖减少％是相对于总碳水化合物的DP3+％。
表9.在乳糖缓冲的底物中GODO YNL2乳糖转换为GOS
Figure BDA0003312475830000762
Figure BDA0003312475830000771
*总碳水化合物(％w/w)是DP3+(％w/w)、DP2(％w/w)、葡萄糖(％w/w)和半乳糖(％w/w)之和
**将转换为TGOS的乳糖％计算为相对于总碳水化合物的TGOS％。
***糖减少％是相对于总碳水化合物的DP3+％。
结论：
清楚的是，不同于用于产生不含乳糖的产品的GODO YNL2乳糖酶，LBul能够产生显著水平的GOS纤维(DP3+)，从而在12％-30％的乳糖缓冲的底物中提供30％以上的糖减少。
实例19：乳基底物中乳糖转换为GOS
将根据表10的底物Aria Mini乳(丹麦爱氏晨曦公司，0.5％脂肪，4.8％乳糖)或脱脂乳粉(丹麦爱氏晨曦公司，脂肪1.25％，批次3150035537)在水(100ml)中制备，并且针对Mini乳将温度维持在50℃，针对12％-40％乳粉将温度维持在55℃，并且针对60％乳粉将温度维持在58℃。根据表10在时间0给予LBul，并且在不同时间点收集样品以供热失活。失活在95℃进行，持续10分钟。DP3+、DP2、葡萄糖、半乳糖的定量根据实例16进行，并且根据实例2对乳糖进行定量。
表10.
Figure BDA0003312475830000772
所有数据与总碳水化合物(carb.)、糖减少％、TGOS(根据实例17)和转换为TGOS的乳糖％的计算值一起呈现于表11中。
表11.乳底物中LBul乳糖转换为GOS
Figure BDA0003312475830000781
Figure BDA0003312475830000791
*总碳水化合物(％w/w)是DP3+(％w/w)、DP2(％w/w)、葡萄糖(％w/w)和半乳糖(％w/w)之和
**将转换为TGOS的乳糖％计算为相对于总碳水化合物的TGOS％。
***糖减少％是相对于总碳水化合物的DP3+％。
结论：
发现与目前的文献相比，LBul将不只是将15％的乳糖(始于5.2％)转换为GOS纤维(DP3+)，而是在含4.7％乳糖的普通乳中能转换多于18％。这将与普通Aria Mini乳中多于18％的糖减少相对应。类似地，发现在含6％乳糖的经浓缩乳底物中多于20％的乳糖转换为DP3+(多于20％的糖减少)，在含9％-12％乳糖的经浓缩乳底物中多于25％的乳糖转换为DP3+(多于25％的糖减少)，在含20％-40％乳糖的经浓缩乳底物中多于30％的乳糖转换为DP3+(多于30％的糖减少)。同样地，与目前的文献相比，发现LBul将不只是将20％的乳糖(始于5.2％)转换为TGOS，而是在含4.7％乳糖的普通乳中能转换多于30％。类似地，发现含6％乳糖的经浓缩乳底物中多于35％的乳糖转换为TGOS，在含9％乳糖的经浓缩乳底物中多于40％的乳糖转换为TGOS，在含12％乳糖浓缩的奶的经浓缩乳底物中多于45％的乳糖转换为TGOS，在含20％-40％乳糖的底物中多于50％的乳糖转换为TGOS。
实例20：在55％乳糖缓冲的底物中乳糖转换为GOS
制备体积为200ml的56.2％(w/w)乳糖于0.1M MES(pH 6.0)(针对LBul)或50mM乙酸钠(pH 4.8)(针对NutriBio GOS)中的两种溶液。将溶液在加热块中伴随混合(400rpm)加热至>90℃。然后将溶液在桌上冷却约30分钟至59℃。之后，将80U/ml的NutriBio GOS添加至pH 4.8的乳糖溶液，并将0.488ml的LBul添加至pH 6的乳糖溶液(在将溶液放置在另一个58℃的加热块中之后)。在58℃和400rpm下将反应运行长达3小时。在0.5、1、1.5、2和3小时后从每种溶液中收集1ml的样品并通过加热至98℃持续10分钟进行失活。DP3+、DP2、葡萄糖、半乳糖的定量根据实例16进行，并且根据实例2对乳糖进行。
所有数据与总碳水化合物(carb.)、糖减少％、TGOS(根据实例17)和转换为TGOS的乳糖％的计算值一起呈现于表12中。
表12.在55％乳糖缓冲的底物中LBul和NutriBio GOS乳糖转换为GOS
Figure BDA0003312475830000801
*总碳水化合物(％w/w)是DP3+(％w/w)、DP2(％w/w)、葡萄糖(％w/w)和半乳糖(％w/w)之和
**将转换为TGOS的乳糖％计算为相对于总碳水化合物的TGOS％。
***糖减少％是相对于总碳水化合物的DP3+％。
结论
发现LBul可以产生比如今用于GOS产生的NutriBio GOS更高产率的GOS纤维(从而实现更大的糖减少)和显著地更高的TGOS产率。
实例21：将用于产生乳糖减少的或不含乳糖的高温短时(HTST)乳的保持时间减少或消除
将Belfonte脱脂乳用实验性杜邦公司乳糖酶处理，每升的乳在4℃下处理6小时然后进行巴氏杀菌步骤，或在4℃下处理5分钟然后进行巴氏杀菌步骤。然后使乳经历HTST巴氏杀菌步骤，其中60℃预热，72.8℃或73.3℃巴氏杀菌30秒，并且1300psi均质化。将乳在巴氏杀菌后立即冷却并在4℃下储存3周。在3周时完成感官评价。目前的HTST乳糖减少的或不含乳糖的条件典型地需要18-24小时的乳糖水解，然后进行巴氏杀菌，因为一旦经过巴氏杀菌器，酶就会失活。
在贯穿研究的多个时间点取1mL乳样品并转移至单独的1.5mL Eppendorf管以便进行根据实例2的乳糖定量：酶解前的初始乳样品，在巴氏杀菌后30分钟或2小时，在巴氏杀菌后24-26小时，在巴氏杀菌后42-43小时，以及在巴氏杀菌后8-9天。取乳样品后，立即将其放置在加热块中，在95℃下持续10分钟以使乳糖酶失活。然后将乳样品冷却至室温，并且制备如下：将200μL的经热处理的乳样品转移至新的1.5mL Eppendorf管，并且添加800μL的去离子水并进行涡旋。向每个管中添加50μL的Carrez药剂I和50μL Carrez药剂II并且进行涡旋。将溶液在室温下保持30分钟，并且然后以3000rpm离心5分钟。在单独的1.5mLEppendorf管中，将10μL的上清液添加至990μL的去离子水，进行涡旋，并通过0.45微米过滤器过滤到小瓶中，用于通过离子色谱法分析乳糖。根据校准标准品和内部对照计算乳糖浓度。
表13示出了针对所进行实验的酶用量、巴氏杀菌前的孵育时间和巴氏杀菌温度，以及针对每个样品的乳样品时间点和乳糖结果。针对所测试的所有条件，在巴氏杀菌后乳糖水平均下降，并且示出了通过巴氏杀菌步骤和巴氏杀菌后酶在保质期内的存活能力。在处理后8-9天内，乳糖水平达到<0.1％w/v。在3周的保质期内在样品中的任一个中未检测到异味。该实例说明了实验性杜邦公司乳糖酶在高温短时(HTST)乳中制作不含乳糖或乳糖减少的乳的用途。贯穿巴氏杀菌步骤的酶的存活能力允许显著减少或可能消除巴氏杀菌前的保持时间。
表13
Figure BDA0003312475830000821
Figure BDA0003312475830000831
参考文献：
1:EP303201
2:Fischer,C.and Kleinschmidt,T.(2018),Synthesis ofGalactooligosaccharides in Milk and Whey:A Review.Comprehensive Reviews inFood Science and Food Safety,17:678-697.
3:Tien-Thanh Nguyen,Hoang Anh Nguyen,Sheryl Lozel Arreola,GeorgMlynek,Kristina Djinovic-Carugo,Geir Mathiesen,Thu-Ha Nguyen,and DietmarHaltrich.Homodimericβ-Galactosidase from Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus DSM 20081:Expression in Lactobacillus plantarum andBiochemical Characterization.Journal of Agricultural and Food Chemistry 201260(7),1713-1721.DOI:10.1021/jf203909e
4:Todor Vasiljevic and Paul Jelen(2003).Oligosaccharide productionand proteolysis during lactose hydrolysis using crude cellular extracts fromlactic acid bacteria.Lait,83 6(2003)453-467.
本说明书中引用的所有参考文献都通过引用结合到本说明书中。

Claims (98)

1.一种用于减少含乳糖的乳基底物中乳糖的量的方法，其中所述方法包括使所述底物与具有中性乳糖酶活性的酶在高于约50℃的温度下接触，并且其中所述乳糖酶使所述底物中乳糖的量减少至少约70％。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述具有中性乳糖酶活性的酶衍生自乳杆菌属(Lactobacillus)。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述具有中性乳糖酶活性的酶衍生自德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiibulgaricus)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述酶与SEQ ID NO:1具有至少约60％同一性。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述酶与SEQ ID NO:1具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述酶为SEQ ID NO:1的酶，或其乳糖酶活性片段。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述具有中性乳糖酶活性的酶是经纯化的。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述具有中性乳糖酶活性的酶是经浓缩的。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述具有中性乳糖酶活性的酶呈酶制剂的形式，所述酶制剂具有降低的水平的脂肪酶副活性。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述具有中性乳糖酶活性的酶呈酶制剂的形式，所述酶制剂具有降低的水平的蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、果胶酶、纤维素酶和/或对硝基苯甲基酯酶副活性。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中所述制剂基本上不具有脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、果胶酶、纤维素酶和/或对硝基苯甲基酯酶副活性。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述温度为约50℃至约65℃，优选地约55℃至约60℃。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述温度选自约51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃和90℃。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述温度为约55℃或58℃。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述酶在60℃的活性是在50℃活性的至少50％。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述酶具有约60℃的最佳温度。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述酶具有约5.5至约8.0的最佳pH。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中当在37℃下测量时，在pH 6.0的所述酶的乳糖酶活性为在pH 6.5其乳糖酶活性的至少50％。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述接触进行约10分钟与约4小时之间。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述乳基底物选自包含乳糖的任何乳或乳样产品的溶液/悬浮液，如全脂或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复原乳粉、炼乳、乳粉溶液、UHT乳、乳清、乳清渗透物、酸乳清或奶油。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述乳基底物为生乳，所述生乳在与所述酶接触之前未经巴氏杀菌。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述底物包含约3％至30％乳糖，优选地约3％至16％乳糖，更优选地约4％至5％乳糖。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中将所述乳糖量减少至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，优选地至少约97％。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中将所述乳糖减少至低于100ppm或低于1000ppm。
25.根据权利要求24所述的方法，其中在180分钟内，优选地120分钟内在超过50℃的温度下将所述乳糖减少至低于100ppm。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中将所述酶以约24NLU至约240NLU/g乳糖的浓度添加至所述乳基底物。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述酶具有乳糖酶:转半乳糖基酶活性大于1:1的比率，或者其中所述酶具有低于120％的转半乳糖基化活性的比率。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述酶具有高于100％的乳糖酶活性的比率。
29.一种具有减少的乳糖含量的乳基底物，所述乳基底物通过根据权利要求1至28中任一项所述的方法获得或可通过所述方法获得。
30.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，所述方法用于产生乳制品。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述乳制品选自脱脂乳、低脂乳、全脂乳、奶油、UHT乳、具有延长保质期的乳、发酵的乳产品、奶酪、酸奶、黄油、乳质涂抹料、酪乳、酸化乳饮料、酸性奶油、乳清基饮料、炼乳、牛奶焦糖酱、风味乳饮料、加糖炼乳、乳粉、复原乳制品、冰淇淋、亚任卡、布丁、甜点和奶昔。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述乳制品是炼乳、冰淇淋或奶昔。
33.根据权利要求1至28和30至32中任一项所述的方法，其中所述方法包括巴氏杀菌步骤。
34.一种乳制品，其通过根据权利要求30至33中任一项所述的方法获得或可通过所述方法获得。
35.根据权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述乳制品为炼乳并且所述温度为约55℃。
36.一种酶制剂，其包含具有中性乳糖酶活性的酶，其中所述酶可以在50℃或更高的温度将底物中乳糖的量减少至少70％。
37.根据权利要求36所述的酶制剂，其中所述酶不是SEQ ID NO:1的酶。
38.根据权利要求36或37所述的酶制剂，其中所述具有中性乳糖酶活性的酶是经纯化的，其中优选地所述酶是SEQ ID NO:1的酶或其乳糖酶活性片段。
39.根据权利要求36至38中任一项所述的酶制剂，其中所述具有中性乳糖酶活性的酶是经浓缩的。
40.根据权利要求36至39中任一项所述的酶制剂，其中所述具有中性乳糖酶活性的酶与SEQ ID NO:1具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
41.根据权利要求36至40中任一项所述的酶制剂，其中所述酶制剂具有降低的水平的脂肪酶副活性。
42.根据权利要求36至41中任一项所述的酶制剂，其中所述酶制剂具有降低的水平的蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、果胶酶、纤维素酶和/或对硝基苯甲基酯酶副活性。
43.根据权利要求41或42所述的酶制剂，其中所述酶制剂基本上不具有脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、果胶酶、纤维素酶和/或对硝基苯甲基酯酶副活性。
44.根据权利要求36至43中任一项所述的酶制剂，其中所述具有中性乳糖酶活性的酶在60℃的活性是在50℃活性的至少50％。
45.根据权利要求36至44中任一项所述的酶制剂，其中所述具有中性乳糖酶活性的酶具有约60℃的最佳温度。
46.根据权利要求36至45中任一项所述的酶制剂，其中所述具有中性乳糖酶活性的酶具有约5.5至约8.0的最佳pH。
47.根据权利要求36至46中任一项所述的酶制剂，其中当在37℃下测量时，所述具有中性乳糖酶活性的酶在pH 6.0为其在pH 6.5乳糖酶活性的至少50％。
48.一种核酸分子，其编码如权利要求36至47中任一项所定义的具有中性乳糖酶活性的酶或其乳糖酶活性片段。
49.一种表达载体，其包含根据权利要求48所述的核酸分子或能够表达如权利要求36至47中任一项所定义的具有中性乳糖酶活性的酶或其乳糖酶活性片段。
50.一种细胞，其能够表达如权利要求36至47中任一项所定义的具有中性乳糖酶活性的酶或其乳糖酶活性片段。
51.一种表达酶的方法，所述方法包括提供根据权利要求50所述的细胞和从所述细胞中表达所述酶，以及任选地纯化所述酶。
52.一种如权利要求36至47中任一项所定义的具有中性乳糖酶活性的酶，所述酶在55℃在乳中的半衰期为多于4小时、或者在58℃为多于1小时。
53.根据权利要求36至47中任一项所述的酶制剂用于制备乳制品的用途。
54.根据权利要求53所述的用途，其中所述乳制品选自脱脂乳、低脂乳、全脂乳、奶油、UHT乳、具有延长保质期的乳、发酵的乳产品、奶酪、酸奶、黄油、乳质涂抹料、酪乳、酸化乳饮料、酸性奶油、乳清基饮料、炼乳、牛奶焦糖酱、风味乳饮料、加糖炼乳、乳粉、复原乳制品、冰淇淋、冰淇淋、亚任卡、布丁、甜点和奶昔。
55.一种细菌性表达宿主，其能够表达如权利要求36至47中任一项所定义的具有中性乳糖酶活性的酶或其乳糖酶活性片段，其中所述宿主细胞包含基因修饰，所述基因修饰减少或消除脂肪酶活性，优选地脂肪酶A活性。
56.根据权利要求55所述的细菌性表达宿主，其中所述基因修饰包含编码如SEQ IDNO:2所示的脂肪酶A多肽的基因的缺失、破坏或下调。
57.一种细菌性表达宿主，其能够表达如权利要求36至47中任一项所定义的具有中性乳糖酶活性的酶，其中所述宿主细胞包含基因修饰，所述基因修饰减少或消除选自以下的一种或多种酶活性：蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、果胶酶、纤维素酶和对硝基苯甲基酯酶活性。
58.根据权利要求56或权利要求57所述的细菌性表达宿主，其中所述宿主细胞包含基因修饰，所述基因修饰减少或消除脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、果胶酶、纤维素酶和对硝基苯甲基酯酶活性。
59.根据权利要求55至58中任一项所述的细菌性表达宿主，其中所述细菌是芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)。
60.根据权利要求59所述的细菌性表达宿主，其选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(B.sonorensis)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、饲料芽孢杆菌(B.pabuli)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、粘琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)、秋叶氏芽孢杆菌(B akibai)、克氏芽孢杆菌(B.clarkii)、假坚强芽孢杆菌(B.pseudofirmus)、列城芽孢杆菌(B.lehensis)、巨大芽胞杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)、和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。
61.根据权利要求60所述的细菌性表达宿主，其中所述细菌是枯草芽孢杆菌。
62.根据权利要求55至61中任一项所述的细菌性表达宿主，其中所述细菌包含根据权利要求48所述的核酸分子或根据权利要求49所述的表达载体。
63.根据权利要求55至62中任一项所述的细菌性表达宿主，其中所述宿主表达具有中性乳糖酶活性的酶。
64.一种具有中性乳糖酶活性的酶，其由根据权利要求63所述的细菌性表达宿主产生。
65.一种根据权利要求64的酶，其中所述酶是如权利要求37至47中的任一项中所定义的。
66.一种乳制品，其包含根据权利要求55至65中任一项所述的细菌性表达宿主。
67.根据权利要求55至65中任一项所述的细菌性表达宿主用于制备乳制品的用途。
68.一种用于产生以下的方法：乳糖减少的或不含乳糖的奶昔、冰淇淋、复原乳产品、甜点、布丁、炼乳、加糖炼乳、亚任卡、牛奶焦糖酱或乳基粉，所述方法包括使乳基底物与具有中性乳糖酶活性乳糖酶的酶在50℃-65℃接触。
69.一种用于产生具有减少的乳糖含量的乳基粉或乳清粉的方法，其中在蒸发或冷凝过程期间添加具有中性乳糖酶活性的酶以便水解。
70.一种用于用具有中性乳糖酶活性的酶从乳基底物产生不含乳糖的乳制品的方法，其中在72℃巴氏杀菌15秒后，所述乳基底物中仍保留超过20％活性。
71.一种用于产生发酵乳制品的方法，所述方法包括在50℃-65℃巴氏杀菌和均质化后添加具有中性乳糖酶活性的酶。
72.如权利要求71所述的方法，其进一步包括冷却至约45℃和添加起子培养物。
73.一种用于在乳基底物中原位产生GOS的方法，所述乳基底物包含至少4.7％(w/w)乳糖，所述方法包括使所述底物与具有中性乳糖酶活性的酶接触，其中超过30％的所述乳糖被转换为TGOS。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述乳基底物包含6％-40％之间的乳糖(w/w)并且其中超过40％的乳糖被转换为TGOS。
75.一种用于减少乳基底物中糖量的方法，所述乳基底物包含至少4.7％(w/w)乳糖，所述方法包括使所述底物与具有中性乳糖酶活性的酶接触，其中超过18％的所述乳糖被转换为GOS纤维(DP3+)。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述乳基底物包含至少6％-9％乳糖并且其中超过20％的乳糖被转换为GOS纤维(DP3+)。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述乳基底物包含至少9％-20％乳糖并且其中超过25％的乳糖被转换为GOS纤维(DP3+)。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述乳基底物包含至少20％-40％乳糖并且其中超过30％的乳糖被转换为GOS纤维(DP3+)。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述乳基底物包含至少40％-65％乳糖并且其中超过30％的乳糖被转换为GOS纤维(DP3+)。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述乳基底物包含至少40％-65％乳糖并且其中超过40％的乳糖被转换为GOS纤维(DP3+)。
81.一种用于从乳基底物产生不含乳糖的乳制品的方法，所述方法包括：
a.)提供乳基底物；
b.)向所述乳基底物中添加具有中性乳糖酶活性的酶；
c.)对所述乳基底物进行巴氏杀菌，其中在所述巴氏杀菌步骤后所述具有中性乳糖酶活性的乳糖酶保留大量的活性；以及
d.)将所述乳基底物储存足够的时间以提供不含乳糖的乳制品。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述乳基底物包含至少4.7％(w/w)乳糖。
83.如权利要求81或82中任一项所述的方法，其中所述巴氏杀菌步骤是在65℃至75℃进行的。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述巴氏杀菌步骤是在70℃至73℃进行的。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述巴氏杀菌步骤是在72.8℃进行的。
86.如权利要求81至85中任一项所述的方法，其中储存步骤持续3至10天。
87.如权利要求86中任一项所述的方法，其中储存步骤为6至9天。
88.如权利要求87所述的方法，其中储存步骤为8天。
89.如权利要求68至88中任一项所述的方法，其中所述具有中性乳糖酶活性的酶衍生自乳杆菌属。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述具有中性乳糖酶活性的酶衍生自德氏乳杆菌保加利亚亚种。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述酶与SEQ ID NO:1具有至少约60％同一性。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述酶与SEQ ID NO:1具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述酶为SEQ ID NO:1的酶，或其乳糖酶活性片段。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述具有中性乳糖酶活性的酶是经纯化的。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述具有中性乳糖酶活性的酶是经浓缩的。
96.如权利要求95所述的方法，其中所述具有中性乳糖酶活性的酶呈酶制剂的形式，所述酶制剂具有降低的水平的脂肪酶副活性。
97.如权利要求96所述的方法，其中所述具有中性乳糖酶活性的酶呈酶制剂的形式，所述酶制剂具有降低的水平的蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、果胶酶、纤维素酶和/或对硝基苯甲基酯酶副活性。
98.如权利要求97所述的方法，其中所述制剂基本上不具有脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、果胶酶、纤维素酶和/或对硝基苯甲基酯酶副活性。
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