CN113699077A - 一种呕吐毒素的微生物降解方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种呕吐毒素的微生物降解方法，属于微生物降解技术领域。具体公开了：将植物根系土壤溶解，将所得上清液在含有镧元素、且以呕吐毒素(又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇，DON)为唯一碳源的无机盐培养液中培养，实现DON的微生物降解。本发明可从植物根系土壤中筛选得到能够降解DON的镧依赖降解混合菌，实现对DON的高特异性、高效率降解；以小麦根系土壤为对象，筛选到的镧依赖混合菌SH7能够实现DON的完全降解。本发明为保障谷物质量安全提供了技术支持，同时还为人和动物的健康保驾护航，具有重大的经济效益和社会效益。

Description

一种呕吐毒素的微生物降解方法
技术领域
本发明涉及微生物降解技术领域，特别是涉及一种呕吐毒素的微生物降解方法。
背景技术
呕吐毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇，DON)是由镰刀菌属真菌产生的B类单端孢霉烯毒素，其靶标器官是胃肠道系统，具有细胞毒性、免疫毒性和遗传毒性，为三类致癌物。根据食品安全国家标准GB 2761-2017规定，谷物及其制品中DON的限量为1000μg/kg。目前，DON污染问题日趋严重，对DON污染的控制迫在眉睫。
谷物在田间经常受到禾谷镰刀菌侵染，其在适宜的温湿度条件下繁殖并产生DON，从而导致DON含量超标。此外，谷物在储藏期间由于干燥不彻底或储存不当也可能导致DON含量超标。DON是一种潜在致癌性霉菌毒素，可与核糖体60S亚基的肽转酶活性中心结合，触发核糖体应激反应，抑制DNA、RNA和蛋白质合成，诱导细胞凋亡，破坏人和动物的肠道和免疫系统，具有一定的细胞毒性、免疫毒性和遗传毒性。目前，在全世界范围内，彻底根除谷物中的DON非常困难。
目前，DON的降解主要有物理、化学和生物法。由于DON的稳定性较高导致其很难降解，物理法主要是物理吸附作用，对DON的吸附性较差且并未改变毒性的大小；化学法虽然会有较好的效果，但会引入其他有毒物质而且会影响谷物的营养品质；生物法主要是从自然界中筛选微生物，微生物在温和条件下释放胞外酶，特异性强、效率高，且是环境友好型，并可用于不同食品加工阶段，可以有效阻止DON进入食物链，减少其对健康的不良影响。
研究资料显示，某些微生物通过改变DON的C12-13环氧基团以减轻其毒性，如鸡肠道菌Eggerthella sp.DII-9和土壤混合菌PGC3。细菌Slackia sp.D-G6能将DON脱环氧化为无毒的DOM-1，其基因组中发现13个潜在的DON脱环氧基因。此外，部分微生物能氧化C3羟基产生相应酮类物，从而实现DON脱毒，如土壤细菌Sphingomonas sp.S3-4、Paradevosiashaoguanensis和乳酸菌Lactobacillus rhamnosus SHA113能将DON转化为3-epi-DON，显著降低其毒性，而细菌Devosia insulae A16和Pelagibacterium halotolerans ANSP101能将DON氧化成3-keto-DON以减轻DON毒性。
发明内容
本发明的目的是提供一种呕吐毒素的微生物降解方法，以解决上述现有技术存在的问题，在环境友好的基础上，实现对呕吐毒素的高特异性、高效率降解。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种呕吐毒素的微生物降解方法，包括以下步骤：
将植物根系土壤溶解，将所得上清液在含有镧元素、且以呕吐毒素为唯一碳源的无机盐培养液中培养，实现呕吐毒素的微生物降解；
所述植物根系土壤中含有镧元素依赖微生物菌群。
进一步地，所述植物根系土壤为小麦根系土壤。
进一步地，所述培养温度为30℃，所述培养时间为7天。
进一步地，培养7天后，还包括进行重复培养的步骤。
进一步地，所述无机盐培养液中呕吐毒素的浓度为10-15μg/mL。
进一步地，所述镧元素的来源为氯化镧。
进一步地，所述无机盐培养液中氯化镧的浓度为30μmol/L。
镧系元素是原子序数57至71的金属元素的总称，与化学性质相似的钪和钇一起被称为“稀土元素”，虽然被叫做“稀土”，但是他们在地壳的含量相对丰富，镧系元素一直被认为不参与任何生命活动，但近期研究发现镧系元素对吡咯并喹啉醌(PQQ)依赖的甲醇脱氢酶(XoxF)和乙醇脱氢酶(PedH)的酶活性发挥着重要作用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明的呕吐毒素降解方法，是以DON为唯一碳源和能量来源、氯化镧为生长因子，从植物根系土壤中筛选得到能够降解DON的镧依赖降解混合菌，从而实现对DON的高效降解；采用本发明的降解方法，以小麦根系土壤为对象，筛选到的镧依赖混合菌SH7能够实现DON的完全降解；本发明利用HPLC检测发现，添加氯化镧能提高镧依赖降解混合菌的降解效率。
本发明以DON为唯一碳源、氯化镧为生长因子，对于植物根系土壤均能实现镧依赖菌种的筛选，实现对DON高特异性、高效率降解。
本发明有助于筛选镧依赖DON脱毒菌，通过鉴定其DON脱毒酶基因，为其在体外大量表达和镧依赖微生物在粮食行业的应用提供了理论依据，为保障谷物质量安全提供技术支持，同时也在一定程度上为人和动物的健康保驾护航，具有重大的经济效益和社会效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为1μg/mL DON标准溶液HPLC色谱图；
图2为DON标准曲线；
图3为镧依赖DON降解混合菌SH7对DON的降解率；
图4为PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；
图5为镧依赖混合菌SH7的菌种组成(属水平)；
图6为氯化镧对镧依赖混合菌SH7降解DON的代谢产物影响差异。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1 1000倍浓缩的T.E.溶液的配制：
分别称取400mg ZnSO4·7H2O，15.72mg MnCl2·4H2O，50mg CoCl2·6H2O，10mgNiCl2·6H2O，15g H3BO3溶于水中，充分搅拌均匀，定容至1L，用0.22μm无菌滤膜过滤，置于4℃冰箱备用。
实施例2 1000倍浓缩的FeSO4·7H2O盐酸溶液的配制：
称取13.9g FeSO4·7H2O溶于0.1mol/L稀盐酸溶液，充分搅拌均匀，定容至1L，置于4℃冰箱备用。
实施例3 1000倍浓缩的CuCl2·2H2O溶液的配制：
称取1.4g CuCl2·2H2O溶于水中，充分搅拌均匀，定容至1L，用0.22μm无菌滤膜过滤，置于4℃冰箱备用。
实施例4 1000倍浓缩的LaCl3·7H2O溶液的配制：
称取11.1411g LaCl3·7H2O溶于水中，充分搅拌均匀，定容至1L，用0.22μm无菌滤膜过滤，置于4℃冰箱备用。
实施例5 100倍浓缩的维生素溶液的配制：
分别称取200mg生物素，200mg叶酸，500mg硫胺素，500mg泛酸钙，10mg维生素B12，500mg维生素B2，500mg烟酰胺溶于水，充分搅拌均匀，定容至1L，用0.22μm无菌滤膜过滤，置于4℃冰箱备用。
实施例6 100倍浓缩的PBS溶液的配制：
分别称取26g KH2PO4和62g Na2HPO4溶于水，充分搅拌均匀，定容至1L，用0.22μm无菌滤膜过滤，置于4℃冰箱备用。
实施例7无机盐培养液的配制(NMS，含30μmol/L LaCl3)：
分别称取1g MgSO4·7H2O，1g KNO3，0.232g CaCl2溶于水中，充分搅拌至完全溶解，加入1mL 1000倍浓缩的T.E.溶液(提前配好)和1mL1000倍浓缩的FeSO4·7H2O盐酸溶液(提前配好)，定容至400mL，另准备1L水，二者同时在121℃下高压灭菌20min。待灭菌结束，向400mL培养液中分别加入1mL过滤除菌的1000倍浓缩的CuCl2·2H2O溶液(提前配好)，1mL过滤除菌的1000倍浓缩的LaCl3·7H2O溶液(提前配好)，10mL过滤除菌的100倍浓缩的维生素溶液(提前配好)，10mL过滤除菌的100倍浓缩的PBS溶液(提前配好)，最后用已灭菌的水将培养液定容至1L，分装成200mL装入无菌玻璃瓶中密封，置于保存4℃冰箱备用。
实施例8 DON无机盐培养液的制备：
根据实验需要，任选一瓶200mL NMS培养液，加入一定体积的5mg/mL DON溶液，制备含10μg/mL DON和30μmol/L LaCl3的无机盐培养液。可根据实际实验需要，通过调整添加的DON溶液的体积确定培养液中DON的最终浓度。
实施例9对DON的降解
选取驻马店正阳县某农田小麦根际土壤为实验样品，称取5g土样，溶解于50mL无菌生理盐水中，在转速为180rpm、温度为30℃的恒温培养摇床上充分震荡30min，吸取1mL菌悬上清液转移到10mL以10μg/mL DON为唯一碳源的含有30μmol/L LaCl3的无机盐培养液(实施例7所配)中，在30℃，180rpm条件下培养7d后，取1mL培养物转移到10mL新鲜的上述培养液中，30℃，180rpm条件下培养7d，此过程重复8-10次，获得镧依赖DON降解混合菌SH7，实现对DON的降解。
实施例10DON标准曲线绘制及HPLC检测
HPLC检测条件：沃特世高效液相色谱仪(e2695)，C18反相色谱柱，4.6mm×250mm，填料粒径5μm；流动相：甲醇+水(体积比为2∶8)，在线脱气，等度洗脱；柱温35℃，流速0.8mL/min，进样量20μL；紫外检测，波长218nm。
取质量浓度为100μg/mL的DON标准储备液，使用流动相配制成质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、2、5μg/mL的DON标准溶液，经0.22μm有机滤膜过滤后，4℃避光保存备用。在上述HPLC检测条件下检测不同浓度的DON标准溶液，DON标准品在7.84min左右出峰，1μg/mL的DON标准溶液HPLC色谱图如图1所示。以DON标准溶液质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制DON标准曲线(图2)，经计算，标准曲线方程为y＝2.674×104x-7.361×102，R2＝0.9986，p<0.01，回归效应显著，该检测方法在DON质量浓度为0.1～5μg/mL范围内具有良好线性关系。
精密度分析：取7份1μg/mL DON标准品，按上述优化的方法进行处理、测定，平行测定7次，计算结果的平均值及相对标准偏差(RSD)，结果如表1，DON标品的RSD值为0.724％<5.00％，说明该检测方法精密度良好。
表1精密度实验
Figure BDA0003251743330000081
回收率实验：在菌液中加入100μg/mL的DON标准品，按上述优化的方法进行处理、测定，平行测定5次，计算结果的平均值及相对标准偏差(RSD)，结果如表2，DON标品的平均回收率为101.704％，RSD值为1.093％<2.00％,说明该检测方法准确度良好，可用于检测菌液中DON含量的检测。
表2回收率实验
Figure BDA0003251743330000082
实施例11镧依赖DON降解混合菌SH7 DON降解率测定：
取镧依赖DON降解混合菌SH7菌体，用NMS培养液(不含LaCl3)调节其OD600值至0.3-0.5，吸取0.5mL分别接种至新鲜的10mL以15μg/mL DON为唯一碳源的含有30μmol/L LaCl3与不含有LaCl3的无机盐培养液中，在30℃，180rpm条件下的恒温培养摇床中培养，对照组为未接种混合菌SH7的DON无机盐培养液(不含LaCl3)。在第0d、2d、4d、6d、8d、10d、12d的同一时段取样，取培养液用无菌水将DON浓度稀释至1μg/mL(控制在标曲范围内)，在4℃、12000r/min条件下离心15min，之后取上清液于0.22μm微孔滤膜过滤，4℃避光保存，待进样。
在上述HPLC检测条件下进样，将峰面积代入DON标准曲线方程，得到样品中DON含量，计算降解率Dr＝(1-Ct/Cck)×100％，Ct和Cck分别为实验组和对照组样品中DON浓度。镧依赖DON降解混合菌SH7在加氯化镧的培养液中第2、4、6天的降解率分别为0.55％、16.24％、77.9％，在第8天达到100％，降解完全；混合菌SH7在无氯化镧的培养液中第2、4、6、8、10天的降解率分别为2.04％、7.11％、21.02％、49.49％、74.23％，在第12天降解完全(图3；图3中SH7+La表示含氯化镧，SH7-La表示不含氯化镧)。由此可见，氯化镧能够提高镧依赖DON降解混合菌SH7的DON降解能力。
实施例12镧依赖DON降解混合菌SH7的菌种组成分析
取在30℃，180rpm条件下的恒温培养摇床中培养5d的镧依赖DON降解混合菌SH7培养液，12000r/min条件下离心10min，弃去上清，收集SH7菌体，用
Figure BDA0003251743330000091
Blood&Tissue试剂盒(QIAGEN,Hilden,Germany)提取菌体总DNA。DNA浓度和纯度用NanoDrop 2000UV-vis分光光度计(Thermo Scientific,Wilmington,USA)测定(表3)，DNA质量用1％琼脂糖凝胶电泳检测。用引物对338F(5’-ACT CCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)扩增SH7的16S rRNA基因的V3-V4高变异区，设置3个生物学重复样本(SH71、SH72、SH73)，PCR产物目的条带大小正确(图4；图4中1、2、3分别代表SH71、SH72、SH73)，浓度合适，可进行后续实验。将扩增后的DNA样品送至生物公司进行第二代高通量测序，分析SH7的菌群结构。
表3样品质检结果
Figure BDA0003251743330000101
镧依赖混合菌SH7的菌种组成及比例如图5和表4所示，固氮氢自养单胞菌属(Azohydromona)和贪铜菌属(Cupriavidus)是混合菌SH7的优势菌属，分别占42.70％和24.81％。Zhai Yaoyao等(2019)从各地区农田和未开垦土壤中分离出DON降解混合菌LZ-N1，混合菌LZ-N1在不含有镧元素的无机盐培养基中培养，LZ-N1中假单胞菌属(Pseudomonas)是优势菌，占44.98％，而假单胞菌属(Pseudomonas)在SH7中仅占3.26％，差异较大，这可能是由于筛选SH7的培养基中添加了氯化镧的原因。
表4镧依赖混合菌SH7的菌种组成及比例(属水平)
Figure BDA0003251743330000102
实施例13LC-MS非靶向代谢组学分析
分别收集培养自有无氯化镧的两种培养液的镧依赖混合菌SH7的上清液样品，于低温环境下加入提取液进行代谢物萃取处理，后离心取上清代谢产物溶剂进行LC-MS检测[色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC SHS T3(100mm×2.1mm i.d.,1.8μm；Waters,Milford，USA)；流动相A为95％水+5％乙腈(含0.1％甲酸)，流动相B为47.5％乙腈+47.5％异丙醇+5％水(含0.1％甲酸)；梯度洗脱流速为0.40mL/min，进样量为2μL，柱温为40℃；质谱条件：样品经电喷雾电离，分别采用正、负离子扫描模式采集质谱信号]。下机数据采用代谢组学软件Progenesis QI(Waters Corporation，Milford，USA)进行峰提取、对齐、鉴定等，最终得到含保留时间、峰面积、质荷比以及鉴定信息的数据矩阵，用于后期处理及生信分析。氯化镧对镧依赖混合菌SH7降解DON的代谢产物影响差异如图6所示；图6中，C：不含氯化镧培养液；T：含氯化镧培养液。从图中可以看出，与不添加氯化镧的培养液相比，添加镧的混合菌SH7的培养代谢产物中，代谢产物4-甲基噻唑-5-乙酸(4-Methylthiazole-5-acetic-acid)、铬色素(Lumichrome)和1，4-环己二酮(1，4-Cyclohexanedione)等产生了积累，而L-精氨酸(L-Arginime)和二氢香豆酰己糖苷(Dihydrocoumaroyl Hexoside)等的数量有所减少。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种呕吐毒素的微生物降解方法，其特征在于，包括以下步骤：
将植物根系土壤溶解，将所得上清液在含有镧元素、且以呕吐毒素为唯一碳源的无机盐培养液中培养，实现呕吐毒素的微生物降解。
2.根据权利要求1所述的微生物降解方法，其特征在于，所述植物根系土壤为小麦根系土壤。
3.根据权利要求1所述的微生物降解方法，其特征在于，所述培养温度为30℃，所述培养时间为7天。
4.根据权利要求3所述的微生物降解方法，其特征在于，培养7天后，还包括进行重复培养的步骤。
5.根据权利要求1所述的微生物降解方法，其特征在于，所述无机盐培养液中呕吐毒素的浓度为10-15μg/mL。
6.根据权利要求1所述的微生物降解方法，其特征在于，所述镧元素的来源为氯化镧。
7.根据权利要求6所述的微生物降解方法，其特征在于，所述无机盐培养液中氯化镧的浓度为30μmol/L。
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