CN113699045A - 一种促进细胞贴壁和生长的装置及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种促进细胞贴壁和生长的装置及其使用方法，所述装置包括：细胞培养器材、支撑所述细胞培养器材的托盘、位于所述细胞培养器材和托盘之间的驻极体以及将所述驻极体密封在细胞培养器材和托盘之间的密封圈；所述细胞培养器材的底壁厚度为0.1～0.5mm。本发明还提供了所述促进细胞贴壁和生长的装置的使用方法。本发明所述促进细胞贴壁和生长的装置结构简单，生产效率高，使用方便，不改变培养基的组分，对细胞的生理状态影响较小，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种促进细胞贴壁和生长的装置及其使用方法。
背景技术
贴壁型细胞需要粘附在培养装置表面才能进行迁移、增殖和分化等。培养贴壁型细胞时一般通过在培养装置表面包被促贴壁基质的方式，增强其细胞膜表面的整联蛋白(受体)与促贴壁基质中的粘附蛋白(配体)间的相互作用，提高细胞的贴壁率，或者在含有吸附细胞功能的微结构的培养装置中进行培养。
CN112458048A公开了一种牙髓干细胞原代培养促贴壁基质及原代牙髓干细胞的培养方法，该发明提供了一种可促进细胞贴壁生长的材料，用其包被培养皿，为牙髓干细胞原代培养、建立成熟的体外培养体系并且为后续实验研究提供了优质及丰富的细胞来源。该发明在牙髓干细胞原代培养时，使用多酚蛋白作为促贴壁试剂预包被培养皿，增加了组织块细胞爬出率及原代细胞的数量，缩短了原代制备时间，提升了原代培养的成功率。但添加多酚蛋白会改变培养基的组分，影响细胞正常的生理代谢。此外，该方法仅对牙髓干细胞的培养具有促进作用，适用性较差。
目前，通过添加促贴壁基质或使用具有细胞吸附微结构的培养装置来促进贴壁细胞的贴壁与生长往往存在改变培养基成分、适应性较差以及制造难度大的问题。因此，如何提供一种可以促进细胞贴壁及增殖的产品及相应的方法，可以有效解决上述问题，且对不同种类的细胞具有良好的适用性，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种促进细胞贴壁和生长的装置及其使用方法，该装置通过电场作用来促进细胞的贴壁，不需要使用促贴壁基质包被培养器材，也无需使用特殊的微结构来吸附细胞，对细胞的生理状态影响较小，应用价值较高。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种促进细胞贴壁和生长的装置，所述装置包括：
细胞培养器材、支撑所述细胞培养器材的托盘、位于所述细胞培养器材和托盘之间的驻极体以及将所述驻极体密封在细胞培养器材和托盘之间的密封圈；
所述细胞培养器材的底壁厚度为0.1～0.5mm，例如可以是0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm或0.5mm等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明中，通过设置预先极化好的驻极体，可以产生稳定的电场，从而促进贴壁细胞的贴壁，进而促进细胞的增殖，细胞的增长速率更快，培养效果更好。这一过程并未向培养基中添加促贴壁基质或使用相应的基质包被细胞培养装置，也未借助于具有特殊微结构的装置，使用方便，容易生产。
本发明中，细胞培养器材的底壁厚度在0.1～0.5mm的范围内可以达到较好的促贴壁以及促进细胞增殖的效果，若细胞培养器材的底壁厚度小于0.1mm，会因受到的电场强度过大从而影响细胞正常的生理活动，若细胞培养器材的底壁厚度大于0.5mm，则会因受到的电场强度过小无法产生促进细胞贴壁、增殖的效果。
优选地，所述细胞培养器材包括细胞培养瓶、细胞培养皿或细胞培养板中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述托盘包括托臂和托底。
优选地，所述托臂的高度为3～5mm，例如可以是3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm或5mm等，所述托臂的厚度为0.5～2mm，例如可以是0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm或2mm等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述托底的厚度为0.8～1.5mm，例如可以是0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm或1.5mm等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述驻极体的厚度为5～500μm，例如可以是5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm或500μm等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明中，驻极体的厚度可根据所用驻极体材料性能、细胞培养环境等条件进行确定。
优选地，所述细胞培养器材的制备原料包括聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚四氟乙烯(PTFE)、氟化乙丙烯共聚物(FEP)或聚三氟氯乙烯(PCTFE)中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述细胞培养器材由生物相容性良好的聚合材料制成，其大小和尺寸可根据具体的实际情况进行确定。
优选地，所述驻极体的制备原料包括聚丙烯和/或氟化乙丙烯共聚物。
本发明中，驻极体是一种呈现“准永久”电荷的电介质材料。驻极体中的电荷可以是“真实”电荷，如储存在材料表面的表面电荷和储存在材料体内的空间电荷；也可以是偶极电荷，即取向偶极子(或位移电荷)；或两者共有之。本发明中选用生物相容性好、电荷储存能力较好的驻极体。
本发明中，所述驻极体的大小可根据具体的实际情况进行确定。
优选地，所述密封圈的制备原料包括生物胶和/或医用胶布。
本发明中，密封圈选用密封性、防水性以及粘性均较好的材料，保证密封在细胞培养器材和托盘之间的驻极体不受潮湿等环境因素的影响，其大小可根据具体的实际情况进行确定。
作为优选技术方案，本发明所述促进细胞贴壁和生长的装置，包括：
细胞培养器材、支撑所述细胞培养器材的托盘、位于所述细胞培养器材和托盘之间的驻极体以及密封所述驻极体的密封圈；
所述细胞培养器材包括细胞培养瓶、细胞培养皿或细胞培养板中的任意一种或至少两种的组合，所述细胞培养器材的底壁厚度为0.1～0.5mm；
所述托盘包括托臂和托底，所述托臂的高度为3～5mm，所述托臂的厚度为0.5～2mm，所述托底的厚度为0.8～1.5mm；
所述驻极体的厚度为5～500μm；
所述细胞培养器材的制备原料包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、氟化乙丙烯共聚物或聚三氟氯乙烯中的任意一种或至少两种的组合；
所述驻极体的制备原料包括聚丙烯和/或氟化乙丙烯共聚物；
所述密封圈的制备原料包括生物胶和/或医用胶布。
第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的促进细胞贴壁和生长的装置的使用方法，所述使用方法包括：
对驻极体进行极化，静置；
向灭菌后的细胞培养器材中接种细胞；
将驻极体放置在细胞培养器材与托盘之间，使用密封圈密封；
将装置放置在培养环境中，培养细胞。
本发明中，所述促进细胞贴壁和生长的装置使用方便，操作简单，成功率高，容错性好，促进了相关装置的推广与使用。
优选地，所述极化前还包括对驻极体进行清洁的步骤。
优选地，所述清洁包括超声清洗。
优选地，所述清洁后还包括干燥驻极体的步骤。
优选地，所述极化的方法包括电晕充电法和/或电击穿充电法。
优选地，所述静置的时间为不少于24h，例如可以是24h、25h、26h、27h、28h、29h或30h等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明中，静置的作用在于保证驻极体所储存的电荷稳定，从而给细胞提供一个稳定的电场环境。
优选地，所述使用方法还包括更换培养基和/或驻极体的步骤。
本发明中，更换培养基和/或驻极体并非是必须要进行的操作，可以根据具体的细胞生长状态(如细胞形态、细胞密度等)来确定，如达到要求，则不需要更换培养基和/或驻极体；如没达到要求，则需要更换培养基和/或驻极体。通常而言，当细胞传代周期远小于驻极体对细胞的作用时间时，需要定期更换培养基，以保证细胞生长所需的养分；当细胞传代周期远大于驻极体对细胞的作用时间时，需要定期更换驻极体，以保证驻极体对细胞生长的持续作用。
作为优选技术方案，本发明所述促进细胞贴壁和生长的装置的使用方法，包括以下步骤：
对驻极体进行超声清洗，干燥后，通过电晕充电法和/或电击穿充电法对驻极体进行极化，静置不少于24h；
向灭菌后的细胞培养器材中接种细胞；
将驻极体放置在细胞培养器材与托盘之间，使用密封圈密封；
将装置放置在培养环境中，培养细胞；
根据细胞的生长状态，更换培养基和/或驻极体，继续培养。
具体的使用操作流程图如图1所示：
裁剪大小、厚度合适的驻极体并进行清洁；
通过电晕充电法和/或电击穿充电法对驻极体进行极化，放置至少24h；
向消毒灭菌后的细胞培养器材中接种细胞，例如可以是向细胞培养皿中加入含有待培养细胞的培养基；
在细胞培养器材和托盘之间放置驻极体，并使用密封圈密封；
将整个装置放置在适合细胞生长的温度、湿度的环境中，培养细胞；
细胞培养8～48小时后，观察细胞的生长状态是否达到了要求，若细胞状态满足相关的要求，则可以收集细胞，细胞培养结束；若细胞状态未满足相关的要求，则更换培养基和驻极体，密封后继续培养。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明所述促进细胞贴壁和生长的装置结构简单，适用性强，通过驻极体产生的电场来促进细胞的贴壁与增殖，无需借助复杂的培养设备或添加促贴壁基质，对细胞的生理状态影响较小，不影响后续的实验操作，获得的实验结果也更加准确；通过对装置的制备原料、底壁厚度等相关参数进行优化，进一步提高了细胞的贴壁率，细胞贴壁率在40％～50％之间；所述装置制备简单高效，使用方便灵活，具有应用于实际科研工作中的价值，应用前景广阔。
附图说明
图1是本发明所述促进细胞贴壁和生长的装置的使用操作流程图；
图2为本发明实施例1中的促进细胞贴壁和生长的装置的结构示意图(图中，1-细胞培养皿，2-托盘，3-驻极体，4-密封圈)；
图3为本发明实施例2中的促进细胞贴壁和生长的装置的结构示意图(图中，1-细胞培养瓶，2-托盘，3-驻极体，4-密封圈)；
图4为本发明实施例3中的促进细胞贴壁和生长的装置的结构示意图(图中，1-细胞培养板，2-托盘，3-驻极体，4-密封圈)。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料：
细胞培养皿、细胞培养瓶和细胞培养板购自泰州鑫联诚润生物技术有限公司，均为未经包被处理的产品。
驻极体购自上海驻极新材料有限公司。
生物胶购自深圳市康利邦科技有限公司。
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HT1080人纤维肉瘤细胞来自购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
DMEM培养基和FBS购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
实施例1
本实施例提供一种促进细胞贴壁和生长的装置，其结构图如图2所示。所述促进细胞贴壁和生长的装置包括细胞培养皿1、支撑所述细胞培养皿1的托盘2、位于所述细胞培养皿1和托盘2之间的驻极体3以及将所述驻极体3密封在细胞培养皿1和托盘2之间的密封圈4；
所述细胞培养皿1的底壁直径为35mm，底壁厚度为0.3mm；
所述托盘2包括托臂和托底，所述托臂的高度为4mm，所述托臂的厚度为1mm，所述托底的厚度为1mm；
所述驻极体3的厚度为30μm；
所述细胞培养皿1的制备原料为聚苯乙烯；
所述驻极体3的制备原料为氟化乙丙烯共聚物；
所述密封圈4的制备原料为医用胶布。
实施例2
本实施例提供一种促进细胞贴壁和生长的装置，其结构图如图3所示。所述促进细胞贴壁和生长的装置包括细胞培养瓶1、支撑所述细胞培养瓶1的托盘2、位于所述细胞培养瓶1和托盘2之间的驻极体3以及将所述驻极体3密封在细胞培养瓶1和托盘2之间的密封圈4；
所述细胞培养瓶1的底壁面积直径为50mm，底壁厚度为0.5mm；
所述托盘2包括托臂和托底，所述托臂的高度为5mm，所述托臂的厚度为2mm，所述托底的厚度为1.5mm；
所述驻极体3的厚度为500μm；
所述细胞培养瓶1的制备原料为聚丙烯；
所述驻极体3的制备原料为聚丙烯；
所述密封圈4的制备原料为生物胶。
实施例3
本实施例提供一种促进细胞贴壁和生长的装置，其结构图如图4所示。所述促进细胞贴壁和生长的装置包括细胞培养板1、支撑所述细胞培养板1的托盘2、位于所述细胞培养板1和托盘2之间的驻极体3以及将所述驻极体3密封在细胞培养板1和托盘2之间的密封圈4；
所述细胞培养板1的底壁直径为20mm，底壁厚度为0.1mm；
所述托盘2包括托臂和托底，所述托臂的高度为3mm，所述托臂的厚度为0.5mm，所述托底的厚度为0.8mm；
所述驻极体3的厚度为5μm；
所述细胞培养板1的制备原料为氟化乙丙烯共聚物；
所述驻极体3的制备原料为氟化乙丙烯共聚物；
所述密封圈4的制备原料为医用胶布。
实施例4
与实施例1的区别仅在于，本实施例中驻极体3的厚度为1μm，其余材料与实施例1相同。
实施例5
与实施例1的区别仅在于，本实施例中细胞培养皿1的制备原料为聚乙烯，其余材料与实施例1相同。
实施例6
与实施例1的区别仅在于，本实施例中驻极体3的制备原料为聚四氟乙烯，其余材料与实施例1相同。
实施例7
与实施例1的区别仅在于，本实施例中密封圈4的制备原料为硅胶，其余材料与实施例1相同。
对比例1
与实施例1的区别仅在于，本对比例中细胞培养皿1的底壁厚度为0.05mm，其余材料与实施例1相同。
对比例2
与实施例1的区别仅在于，本对比例中细胞培养皿1的底壁厚度为1mm，其余材料与实施例1相同。
对比例3
与实施例1的区别仅在于，本对比例中细胞培养皿1和托盘2之间不放置驻极体3，其余材料与实施例1相同。
贴壁率检测
使用实施例1～7以及对比例1～3制备的促进细胞贴壁和生长的装置，对HT1080人纤维肉瘤细胞进行培养，培养步骤如下：
(1)对驻极体3进行超声清洗，干燥后，通过电晕充电法对驻极体3进行极化，静置24h；
所述电晕充电法的具体步骤如下：
①清洁后的驻极体3薄膜放置在极化装置底座上；
②将极化装置的栅网电压调节到相应的电压值，具体为：实施例1、实施例3～7以及对比例1～3为1kV，实施例2为2kV；
③将极化装置的极化针电压调节到相应的电压值，具体为：实施例1、实施例3～7以及对比例1～3为25kV，实施例2为20kV；
④秒表计时30s，结束后，关掉极化针电压、栅网电压，取出所极化的驻极体3。
(2)向灭菌后的细胞培养器材中接种HT1080人纤维肉瘤细胞，使用的培养基为体积分数为1％双抗和10％FBS的DMEM培养基。
(3)将驻极体3放置在细胞培养器材与托盘2之间，使用密封圈4密封。
(4)将装置放置在37℃、CO2浓度为5％的培养环境中，培养细胞。
贴壁率计算
培养细胞48h后，去除培养液上的清液，加入含0.1％结晶紫染液(PBS溶液配制)至总体积为2mL，置于37℃恒温孵育30min，消化，吹打让细胞从培养皿底表面脱落，于血球计数板上进行细胞计数，计算各组贴壁率。
贴壁率(％)＝贴壁细胞数/接种细胞数×100％。
结果显示，实施例1～3中的细胞贴壁率在40％～50％之间，比普通培养皿有明显提高，细胞生长状态良好；
与实施例1～3进行比较，实施例4中驻极体的厚度偏小，产生的电场强度较小，贴壁率略有下降；实施例6中选用了其他的驻极体材料，对贴壁率的影响较为明显，仅为27％；实施例5中选用了聚乙烯作为培养皿的材料，细胞贴壁率无明显影响，但细胞的生长状态稍差，表明聚乙烯的生物相容性较差；实施例7中选用硅胶作为密封圈材料，对细胞贴壁无明显影响，但硅胶的价格较高，相应产品的生产成本有所提升，不利于产品的推广与使用；
对比例2中培养皿的底壁较厚，影响了驻极体对细胞的作用，细胞贴壁率受到了明显的影响，仅为32％；对比例1中培养皿底壁偏薄，但细胞的贴壁率无显著提高，说明当底壁厚度小于0.8mm后，驻极体对细胞的促贴壁作用相对稳定，但底壁过薄影响了培养皿的结实程度，在后续的实验操作过程中易发生破裂；对比例3中的细胞培养不受驻极体的电场作用，其细胞贴壁率不到10％。
综上所述，本发明提供了一种促进细胞贴壁和生长的装置，通过在托盘和细胞培养器材之间填入预先极化好的驻极体，通过电场促进细胞的贴壁及增殖，无需添加促贴壁基质或借助具有特殊结构的培养装置，对细胞的生理状态影响较小，实验结果更加准确；装置结构简单，生产效率高，适用性强，使用方便，应用前景广阔。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种促进细胞贴壁和生长的装置，其特征在于，所述装置包括：
细胞培养器材、支撑所述细胞培养器材的托盘、位于所述细胞培养器材和托盘之间的驻极体以及将所述驻极体密封在细胞培养器材和托盘之间的密封圈；
所述细胞培养器材的底壁厚度为0.1～0.5mm。
2.根据权利要求1所述的促进细胞贴壁和生长的装置，其特征在于，所述细胞培养器材包括细胞培养瓶、细胞培养皿或细胞培养板中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述托盘包括托臂和托底；
优选地，所述托臂的高度为3～5mm，所述托臂的厚度为0.5～2mm；
优选地，所述托底的厚度为0.8～1.5mm。
3.根据权利要求1或2所述的促进细胞贴壁和生长的装置，其特征在于，所述驻极体的厚度为5～500μm。
4.根据权利要求1～3任一项所述的促进细胞贴壁和生长的装置，其特征在于，所述细胞培养器材的制备原料包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、氟化乙丙烯共聚物或聚三氟氯乙烯中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述驻极体的制备原料包括聚丙烯和/或氟化乙丙烯共聚物；
优选地，所述密封圈的制备原料包括生物胶和/或医用胶布。
5.根据权利要求1～4任一项所述的促进细胞贴壁和生长的装置，其特征在于，所述装置包括：
细胞培养器材、支撑所述细胞培养器材的托盘、位于所述细胞培养器材和托盘之间的驻极体以及密封所述驻极体的密封圈；
所述细胞培养器材包括细胞培养瓶、细胞培养皿或细胞培养板中的任意一种或至少两种的组合，所述细胞培养器材的底壁厚度为0.1～0.5mm；
所述托盘包括托臂和托底，所述托臂的高度为3～5mm，所述托臂的厚度为0.5～2mm，所述托底的厚度为0.8～1.5mm；
所述驻极体的厚度为5～500μm；
所述细胞培养器材的制备原料包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、氟化乙丙烯共聚物或聚三氟氯乙烯中的任意一种或至少两种的组合；
所述驻极体的制备原料包括聚丙烯和/或氟化乙丙烯共聚物；
所述密封圈的制备原料包括生物胶和/或医用胶布。
6.一种权利要求1～5任一项所述的促进细胞贴壁和生长的装置的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括：
对驻极体进行极化，静置；
向灭菌后的细胞培养器材中接种细胞；
将驻极体放置在细胞培养器材与托盘之间，使用密封圈密封；
将装置放置在培养环境中，培养细胞。
7.根据权利要求6所述的促进细胞贴壁和生长的装置的使用方法，其特征在于，所述极化前还包括对驻极体进行清洁的步骤；
优选地，所述清洁包括超声清洗；
优选地，所述清洁后还包括干燥驻极体的步骤。
8.根据权利要求6或7所述的促进细胞贴壁和生长的装置的使用方法，其特征在于，所述极化的方法包括电晕充电法和/或电击穿充电法；
优选地，所述静置的时间为不少于24h。
9.根据权利要求6～8任一项所述的促进细胞贴壁和生长的装置的使用方法，其特征在于，所述使用方法还包括更换培养基和/或驻极体的步骤。
10.根据权利要求6～9任一项所述的促进细胞贴壁和生长的装置的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括：
对驻极体进行超声清洗，干燥后，通过电晕充电法和/或电击穿充电法对驻极体进行极化，静置不少于24h；
向灭菌后的细胞培养器材中接种细胞；
将驻极体放置在细胞培养器材与托盘之间，使用密封圈密封；
将装置放置在培养环境中，培养细胞；
根据细胞的生长状态，更换培养基和/或驻极体，继续培养。
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