CN113698595A - 靶向葡萄糖转运蛋白1的多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向葡萄糖转运蛋白1的多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物及制备方法与应用，该共聚物具有式(Ⅰ)所示结构：
Figure DDA0003241743700000011
本发明该共聚物能在不同环境下自组装成不同形式的纳米药物载体(如纳米球形胶束、纳米棒状胶束和纳米囊泡)。该类靶向GLUT1、纳米药物载体可用于多种药物的研究开发，能够负载药物分子，制成缓释控释的靶向药物输送系统，能够将药物分子定向的送到病变部位，降低给药频率、提高治疗效果等。本发明该共聚物兼具一般氨基酸类共聚物优势的同时，既具备了硒的多种生物学功能，又具备了靶向GLUT1的特异性，适用于GLUT1异常相关多种疾病的各类药物的药物载体研究、开发及临床应用。

Description

靶向葡萄糖转运蛋白1的多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物 及制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医用药物载体与缓释材料技术领域，尤其涉及一种靶向葡萄糖转运蛋白1的多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物及制备方法与应用。
背景技术
人体内拥有十分复杂的生理环境，药物从摄取到发挥作用需要经过多重障碍，往往最终只有一小部分药物能发挥药效，严重影响治疗效果，同时还会带来毒副作用。如何增强药物的利用率、安全性等对于提升疾病的治疗效果和人类健康具有极为重要的意义。近些年来，不同类型的药物载体相关研究受到人们的高度重视。
药物载体主要是天然或合成的高分子材料，以不同的形式与药物分子通过化学键合、物理吸附或包裹，构成药物控制系统，可在不降低原药物分子药效并抑制其副作用的情况下，通过一系列物理、化学及生物控制，实现药物定时、定位、定量释放，协助增强其疗效。药物载体系统已经被运用于多种给药途径，包括注射、口服、透皮吸收等。药物载体种类较多，纳米药物载体是指粒径在10～ 1000nm的一类新型载体，由于其粒径比毛细血管通路小，且具有降低药物毒副作用、提高药物稳定性、缓释控释药物和药物靶向释放等优点，近年来，纳米药物载体逐渐引起人们的高度重视。纳米药物载体有聚合物胶束、纳米囊和纳米球、纳米脂质体、固体脂质纳米粒以及磁性纳米颗粒等。多种高分子材料可用于纳米药物载体的研究开发，但生物相容性、生物降解性和安全性等是必须要考虑的重要问题。
氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成机体营养所需蛋白质的基本物质。采用天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸等制备的聚氨基酸是一类低毒、生物相容性好、容易被机体吸收和代谢的生物全降解高分子材料，在药物载体领域发展潜力极大。但由于氨基酸分子之间的强氢键作用等，该类药物载体材料存在水溶性较差、在体内降解速率和周期难以掌控等不足，且难以实现靶向传输等。
因此，现有技术仍有待于改进和发展。
发明内容
功能化、智能化已是当前纳米药物载体发展的战略性趋势。PEG(聚乙二醇)具有柔韧的亲水性长链，无毒无免疫原性，FDA已经批准用于临床使用，是目前已知亲水载体中最具有发展前途的材料之一。PEG与聚氨基酸结合形成嵌段共聚物，能够改善聚氨基酸嵌段的亲水性，减少体内蛋白质在材料表面的吸附和细胞的粘附，可以保护聚氨基酸不受免疫系统的破坏，延长材料在体内的循环时间等。此外，PEG两端可引入多种官能团，显著增强聚氨基酸类纳米药物载体的综合性能。
研究发现，人体必需微量元素硒具有抗氧化、调节免疫、拮抗有害重金属、抗衰老等重要生物功能。硒缺乏与许多人类疾病的发病有关，包括糖尿病、癌症和神经退行性疾病等。人体摄入硒主要有两种方式：无机硒，利用率低，毒性大；有机硒，如硒代氨基酸，生物相容性更好，利用率高，更容易被人体吸收，具有更低的毒性和更高的安全性。故，硒代氨基酸的引入有望积极推动功能化纳米聚氨基酸类药物载体的研究开发。
葡萄糖转运蛋白1(facilitative glucose transporter1，GLUT1)是负责D-葡萄糖和其他己糖转运的主要功能蛋白，其异常在多种重大疾病发病过程中发挥重要调控作用，包括恶性肿瘤、神经退行性疾病等。恶性肿瘤细胞内葡萄糖的消耗量远高于正常细胞，且肿瘤细胞表面的GLUT1呈现出特征性高表达。大脑的葡萄糖消耗量占全身的30％，而GLUT1亦在脑毛细血管内皮细胞的腔侧和近腔侧高表达，是负责葡萄糖和其他己糖跨血脑屏障的主要转运途径，其异常对多种中枢神经系统疾病都具有重要促进作用。因此，GLUT1可作为功能纳米药物载体靶向传输药物的重要靶点。
为此，鉴于当前多聚氨基酸类纳米载体主要功能单一，只能作为药物载体，缺乏靶向性等不足，本发明提供了一种靶向、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物，兼具一般氨基酸类共聚物优势的同时，既具备了硒的多种生物学功能，又特异性靶向GLUT1，是一类新型、靶向、多功能聚合物。
具体地，本发明的技术方案如下：
一种靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物，具有式(Ⅰ)所示结构：
Figure BDA0003241743680000021
其中，22≤n≤454、2≤x≤50、2≤y≤50，n、x、y均为整数；
-R1选自
Figure BDA0003241743680000031
中的一种；
-R2选自-CH(CH3)CH3、
Figure BDA0003241743680000032
-H、-CH3、-CH2CH(CH3)CH3、-CH(CH3)CH2CH3、
Figure BDA0003241743680000033
-CH2OH、
Figure BDA0003241743680000034
-CH2SH、 -CH2CH2SCH3、
Figure BDA0003241743680000035
-CH(OH)CH3、
Figure BDA0003241743680000036
中的一种；
-R3选自-CH2CH2SeCH3、-CH2SeH中的一种。
一种本发明所述的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物的制备方法，其中，包括步骤：
将叔丁酯乙酸聚乙二醇胺溶解在有机溶剂中，得到叔丁酯乙酸聚乙二醇胺溶液；
将氨基酸-N-内羧酸酐溶解在有机溶剂中，得到氨基酸-N-内羧酸酐溶液；
将硒代-氨基酸-N-内羧酸酐溶解在有机溶剂中，得到硒代-氨基酸-N-内羧酸酐溶液；
将叔丁酯乙酸聚乙二醇胺溶液和氨基酸-N-内羧酸酐溶液混合，置于惰性气氛下，搅拌反应；
反应结束后，加入硒代-氨基酸-N-内羧酸酐溶液，继续搅拌反应，得到两亲性嵌段共聚物；
将所述两亲性嵌段共聚物溶解于碳酸钾水溶液中，得到两亲性嵌段共聚物水溶液，Cbz-Cl溶于二氧六环中并在冰浴条件下添加至所述两亲性嵌段共聚物水溶液中，添加结束后撤掉冰浴，升至室温并保持反应过夜，反应完全后得到末端氨基Cbz保护的两亲性嵌段共聚物；
将所述末端氨基Cbz保护的两亲性嵌段共聚物溶解于过量三氟乙酸中，搅拌反应，得到羧基端脱保护的两亲性嵌段共聚物；
将所述羧基端脱保护的两亲性嵌段共聚物溶解在有机溶剂中，依次加入DCC、NHS，搅拌反应，得到羧基活化的两亲性嵌段共聚物溶液；
将葡萄糖溶解在有机溶剂中，加入三乙胺，搅拌，得到葡萄糖溶液；
将所述葡萄糖溶液添加到羧基活化的两亲性嵌段共聚物溶液中，置于惰性气氛下，搅拌反应，得到所述靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物；
将所述糖基化两亲性嵌段共聚物末端的Cbz去除，得到末端氨基脱保护的所述靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物。
一种本发明所述的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物在药物载体中的应用。
有益效果：本发明提供的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物具有式(Ⅰ)所示结构，其是由含糖基化修饰的聚乙二醇亲水链段、离子型聚氨基酸和聚硒代氨基酸疏水链段构成的两亲性三嵌段共聚物。本发明靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物，能够与同种两亲性嵌段共聚物或不同种两亲性嵌段共聚物进行自组装，如不带电荷的两亲性嵌段共聚物之间，不带电荷的与带电荷的两亲性嵌段共聚物之间，带同种电荷的两亲性嵌段共聚物之间，或带相反电荷的两亲性嵌段共聚物之间等均可以完成自组装；亦能够在不同环境下自组装成不同形式的纳米胶束，如纳米球形胶束、纳米棒状胶束或纳米囊泡等。本发明所述一种靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物自组装形成的纳米胶束可以用作药物载体，负载药物分子，制成缓释控释的靶向药物输送系统，能够将药物分子定向的送到病变部位，可通过各种方式给药，所包载的药物可以根据需要从输送系统中缓释控释的释放，从而降低给药频率、提高治疗效果，并减少药物的毒副作用。与现有技术相比，本发明提供的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物兼具一般氨基酸类共聚物优势的同时，既具备了硒的多种生物学功能，又具备了靶向GLUT1的特异性，是一类新型、靶向、多功能两亲性嵌段共聚物，适用于GLUT1异常相关多种疾病的各类药物的药物载体研究、开发及临床应用。
附图说明
图1为本发明所述糖基化聚乙二醇胺Glu-PEG45-NH2的1H NMR谱图。
图2为本发明所述靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物Glu-PEG45-PBLA2-PMet(Se)2的1H NMR谱图。
图3为本发明所述靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸纳米球形胶束的TEM(透射电镜)图。
图4为本发明所述靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸纳米棒状胶束的TEM(透射电镜)图。
图5为本发明所述靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸纳米囊泡的TEM(透射电镜)图。
图6为本发明所述糖基化修饰多聚硒代氨基酸纳米球形胶束的细胞靶向摄取激光共聚焦图。
具体实施方式
本发明提供一种靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物及制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物，具有式(Ⅰ)所示结构：
Figure BDA0003241743680000051
其中，22≤n≤454、2≤x≤50、2≤y≤50，n、x、y均为整数；
-R1选自
Figure BDA0003241743680000052
等中的一种；
-R2选自-CH(CH3)CH3、
Figure BDA0003241743680000061
-H、-CH3、-CH2CH(CH3)CH3、-CH(CH3)CH2CH3、
Figure BDA0003241743680000062
-CH2OH、
Figure BDA0003241743680000063
-CH2SH、 -CH2CH2SCH3、
Figure BDA0003241743680000064
-CH(OH)CH3、
Figure BDA0003241743680000065
等中的一种；
-R3选自-CH2CH2SeCH3、-CH2SeH等中的一种。
本发明实施例提供的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物具有式(Ⅰ)所示结构，其是由糖基化修饰聚乙二醇亲水链段、离子型聚氨基酸和聚硒代氨基酸疏水链段构成的两亲性三嵌段共聚物。本发明实施例所述靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物，能够与同种两亲性嵌段共聚物或不同种两亲性嵌段共聚物进行自组装，如不带电荷的两亲性嵌段共聚物之间，不带电荷的与带电荷的两亲性嵌段共聚物之间，带同种电荷的两亲性嵌段共聚物之间，或带相反电荷的两亲性嵌段共聚物之间等均可以完成自组装；亦能够在不同环境下自组装成不同形式的纳米胶束，如纳米球形胶束、纳米棒状胶束或纳米囊泡等。本发明实施例所述一种靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物自组装形成的纳米胶束可以用作药物载体，负载药物分子，制成缓释控释的靶向药物输送系统，能够将药物分子定向的送到病变部位，可通过各种方式给药，所包载的药物可以根据需要从输送系统中缓释控释的释放，从而降低给药频率、提高治疗效果，并减少药物的毒副作用。与现有技术相比，本发明实施例提供的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物兼具一般氨基酸类优势的同时，既具备了硒的多种生物学功能，又具备了靶向GLUT1的特异性，是一类新型、多功能两亲性嵌段共聚物，适用于GLUT1异常相关多种疾病的各类药物的药物载体研究、开发及临床应用。
本发明实施例中的糖基化(即R1基团)修饰聚乙二醇胺嵌段一方面用于提供亲水端，形成纳米胶束的外壳，这样可以延长纳米胶束在体内循环时间；另一方面靶向基团糖基可以显著提高药物传输的靶向性。聚硒代氨基酸嵌段提供疏水端，用于载药，以提供一种稳定的、既具有药物缓释控释功能，又具备硒的多种生物学功能的纳米药物载体；离子型聚氨基酸中的活泼离子基团可用于嵌段共聚物之间的交联，以提供一种更稳定、功能更优的药物缓释控释载体。
本发明实施例提供一种如上所述的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物的制备方法，其中，包括步骤：
S10、将叔丁酯乙酸聚乙二醇胺溶解在有机溶剂中，得到叔丁酯乙酸聚乙二醇胺溶液；
S11、将氨基酸-N-内羧酸酐溶解在有机溶剂中，得到氨基酸-N-内羧酸酐溶液；
S12、将硒代-氨基酸-N-内羧酸酐溶解在有机溶剂中，得到硒代-氨基酸-N-内羧酸酐溶液；
S13、将叔丁酯乙酸聚乙二醇胺溶液和氨基酸-N-内羧酸酐溶液混合，置于惰性气氛下，搅拌反应；
S14、反应结束后，加入硒代-氨基酸-N-内羧酸酐溶液，继续搅拌反应，得到两亲性嵌段共聚物；
S15、将所述两亲性嵌段共聚物溶解于碳酸钾水溶液中，得到两亲性嵌段共聚物水溶液，氯甲酸苄酯(分子式ClCO2CH2C6H5，简写为Cbz-Cl)溶于二氧六环并在冰浴条件下缓慢滴加于所述两亲性嵌段共聚物水溶液中，滴加结束后撤掉冰浴，缓慢升至室温并保持反应过夜，反应完全后得到末端氨基Cbz保护的两亲性嵌段共聚物；
S16、将所述末端氨基Cbz保护的两亲性嵌段共聚物溶解于过量三氟乙酸(TFA)中，室温搅拌过夜，得到羧基端脱保护的两亲性嵌段共聚物；
S17、将所述羧基端脱保护的两亲性嵌段共聚物溶解在有机溶剂中，依次加入DCC、NHS，搅拌反应，得到羧基活化的两亲性嵌段共聚物溶液；
S18、将葡萄糖(Glu)溶解在有机溶剂中，加入三乙胺(TEA)，搅拌，得到葡萄糖溶液；
S19、将所述葡萄糖溶液加到羧基活化的两亲性嵌段共聚物溶液中，置于惰性气氛下，搅拌反应，得到糖基化两亲性嵌段共聚物；
S20、将所述糖基化两亲性嵌段共聚物末端的Cbz去除，得到末端氨基脱脱保护的所述靶向 GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物。合成反应式如下式所示：
Figure 1
需说明的是，叔丁酯乙酸聚乙二醇嵌段一端的叔丁酯脱掉，得到羧基聚乙二醇嵌段，然后通过羧基与葡萄糖上的氨基进行酰胺缩合，使得所述葡萄糖连接至嵌段聚合物中。
在一种实施方式中，所述氨基酸-N-内羧酸酐为L-缬氨酸-N-内羧酸酐、ε-苄氧羰基-L-赖氨酸 -N-内羧酸酐、γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-2-氯乙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、甘氨酸-N-内羧酸酐、L-丙氨酸-N-内羧酸酐、L-亮氨酸-N-内羧酸酐、L-异亮氨酸-N-内羧酸酐、L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐、L- 色氨酸-N-内羧酸酐、L-丝氨酸-N-内羧酸酐、L-酪氨酸-N-内羧酸酐、ε-苄氧羰基-L-半胱氨酸-N- 内羧酸酐、L-天冬酰胺-N-内羧酸酐、L-谷氨酰胺-N-内羧酸酐、L-苏氨酸-N-内羧酸酐、精氨酸-N- 内羧酸酐或组氨酸-N-内羧酸酐。
在一种实施方式中，所述硒代-氨基酸-N-内羧酸酐为硒代-L-蛋氨酸-N-内羧酸酐或硒代-L-半胱氨酸-N-内羧酸酐。
在一种实施方式中，所述葡萄糖为3,5-O-苯亚甲基-1,2-O-异亚丙基-α-D-吡喃葡萄糖、4-氨基苯基-β-D-吡喃葡萄糖或2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖。
在一种实施方式中，所述叔丁酯乙酸聚乙二醇胺、氨基酸-N-内羧酸酐和硒代氨基酸-N-内羧酸酐的摩尔比为1：(2～50)：(2～50)。
在一种实施方式中，所述有机溶剂包括无水N,N-二甲基甲酰胺、无水四氢呋喃和无水三氯甲烷中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述末端氨基Cbz保护的两亲性嵌段共聚物与三氟乙酸的用量比为100mg： (5～10mL)，反应时间为2～8h。
在一种实施方式中，所述羧基端脱保护的两亲性嵌段共聚物与DCC、NHS的摩尔比为1：(1.05 ～1.5)：(1.2～1.6)。
在一种实施方式中，所述羧基端脱保护的两亲性嵌段共聚物与DCC、NHS的反应时间为6～24h，反应温度为20～30℃。
在一种实施方式中，所述葡萄糖与三乙胺的摩尔比为1：(2～8)。
在一种实施方式中，所述羧基端脱保护的两亲性嵌段共聚物与葡萄糖溶液的摩尔比为1：(0.6 ～1.5)，反应时间为6～24h。
在一种实施方式中，按所述羧基端脱保护的两亲性嵌段共聚物和有机溶剂的用量比为(1～5)g： 100mL，将羧基端脱保护的两亲性嵌段共聚物溶解在有机溶剂中。
在一种实施方式中，按所述葡萄糖和有机溶剂的用量比为(1～5)g：100mL，将葡萄糖溶解在有机溶剂中。
在一种实施方式中，按所述叔丁酯乙酸聚乙二醇胺和有机溶剂的用量比为(1～5)g：100mL，将叔丁酯乙酸聚乙二醇胺溶解在有机溶剂中。
在一种实施方式中，按所述氨基酸-N-内羧酸酐和有机溶剂的用量比为(1～5)g：100mL，将氨基酸-N-内羧酸酐溶解在有机溶剂中。
在一种实施方式中，按所述硒代-氨基酸-N-内羧酸酐和有机溶剂的用量比为(1～5)g：100mL，将硒代-氨基酸-N-内羧酸酐溶解在有机溶剂中。
在一种实施方式中，所述叔丁酯乙酸聚乙二醇胺和氨基酸-N-内羧酸酐反应的时间为24～72h；所述反应的温度为25～30℃。
一种本发明实施例所述的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物在药物载体中的应用。
本发明实施例提供一种靶向GLUT1的多功能纳米药物载体，其中，由式(Ⅰ)所示结构的靶向 GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物自组装而成；
Figure BDA0003241743680000101
其中，22≤n≤454、2≤x≤50、2≤y≤50，其中n、x、y均为整数；
-R1选自
Figure BDA0003241743680000102
等；
-R2选自-CH(CH3)CH3、
Figure BDA0003241743680000103
-H、-CH3、-CH2CH(CH3)CH3、-CH(CH3)CH2CH3、
Figure BDA0003241743680000104
-CH2OH、
Figure BDA0003241743680000105
-CH2SH、-CH2CH2SCH3、
Figure BDA0003241743680000111
-CH(OH)CH3、
Figure BDA0003241743680000112
-R3选自-CH2CH2SeCH3或-CH2SeH。
本发明实施例提供的靶向纳米药物载体由式(Ⅰ)所示结构的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物自组装而成。所述靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物，能够与同种两亲性嵌段共聚物或不同种两亲性嵌段共聚物进行自组装，如不带电荷的两亲性嵌段共聚物之间，不带电荷的与带电荷的两亲性嵌段共聚物之间，带同种电荷的两亲性嵌段共聚物之间，或带相反电荷的两亲性嵌段共聚物之间等均可以完成自组装；亦能够在不同环境下自组装成不同形式的纳米胶束，如纳米球形胶束、纳米棒状胶束或纳米囊泡等。本发明实施例所述一种靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物自组装形成的纳米胶束可以用作药物载体，负载药物分子，制成缓释控释的靶向药物输送系统，能够将药物分子定向的送到病变部位，可通过各种方式给药，所包载的药物可以根据需要从输送系统中缓释控释的释放，从而降低给药频率、提高治疗效果，并减少药物的毒副作用。与现有技术相比，本发明提供的靶向GLUT1、多功能纳米药物载体兼具一般氨基酸类纳米药物载体优势的同时，既具备了硒的多种生物学功能，又具备了靶向GLUT1的特异性，是一类新型、靶向、多功能药物载体，适用于GLUT1异常相关多种疾病的各类药物的药物载体研究、开发及临床应用。
在一种实施方式中，所述靶向GLUT1、纳米药物载体以纳米球状胶束、纳米棒状胶束或纳米囊泡等的形式存在。
本发明实施例中，疏水链段与亲水链段的分子量之比P不同，决定了自组装形成的纳米药物载体的结构的不同，具体为：P≤1/3时，形成纳米球形胶束；1/3≤P≤1/2时，形成纳米棒状胶束； 1/2≤P≤1时，形成纳米囊泡。其中，所述疏水链段为
Figure BDA0003241743680000113
所述亲水链段为
Figure BDA0003241743680000121
本发明实施例提供一种如上所述的靶向GLUT1、多功能纳米药物载体的制备方法，其中，包括以下步骤：
S20、将式(Ⅰ)所示结构的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物溶解于第一有机溶剂中，振荡至混合均匀，得到聚合物溶液；
S21、向所述聚合物溶液中加入去离子水，搅拌反应2-3h，得到混合溶液；
S22、将得到的混合溶液用装有去离子水的透析袋透析，然后过滤透析袋内液，得到纳米棒状胶束形式的纳米药物载体。
在一种实施方式中，所述第一有机溶剂包括但不限于二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和三氯甲烷等中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物和第一有机溶剂的用量比为10mg：(1～3)mL；所述靶向、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物和去离子水的用量比为10mg： (2～5)mL。
在一种实施方式中，所述透析袋透析的时间为3～7天，每隔一天换一次水。
在一种实施方式中，所述透析袋截留分子量为1000～5000Da。
本发明实施例提供一种如上所述的靶向纳米药物载体的制备方法，其中，包括以下步骤：
S30、将式(Ⅰ)所示结构的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物溶解于第二有机溶剂中，除去有机溶剂制成薄膜；
S31、然后加入至双蒸水中水化，震荡混匀，超声，离心，冷冻，干燥，得到纳米囊泡形式的靶向、纳米药物载体。
在一种实施方式中，所述除去有机溶剂制成薄膜的步骤，具体包括：旋转蒸发制成均匀薄膜，并抽真空除去残留的有机溶剂。
在一种实施方式中，所述第二有机溶剂包括但不限于二氯甲烷、四氢呋喃等易挥发溶剂中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物和第二有机溶剂的用量比为10mg：(1～2)mL；靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物和双蒸水的用量比为10mg： (2～5)mL。
在一种实施方式中，所述水化温度为50～70℃。
在一种实施方式中，所述水化时间为1～2h。
在一种实施方式中，所述离心速度为2000～3000r/min，离心时间为25～35min。
本发明实施例提供一种如上所述的靶向纳米药物载体的制备方法，其中，包括以下步骤：
S40、将式(Ⅰ)所示结构的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物溶解于油相溶液中，得到共聚物油相溶液；
S41、用注射器吸取水相溶液至共聚物油相溶液中，并进行超声处理，然后用注射器将超声后的溶液全部吸出后，注入到外水相溶液中，进行搅拌；
S42、最后离心、洗涤、冷冻、干燥，得到纳米球状胶束形式的靶向、纳米药物载体。
在一种实施方式中，所述油相溶液包括但不限于二氯甲烷溶液和四氢呋喃溶液等中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述水相溶液和外水相溶液均为聚氧乙烯醚、聚氧丙烯醚、聚乙烯醇等乳化剂的水溶液中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述水相溶液的质量分数为0.1％～0.2％。
在一种实施方式中，所述外水相溶液的质量分数为0.25％～0.5％。
在一种实施方式中，所述靶向、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物和油相溶液的用量比为(1～ 5)g：100mL。
在一种实施方式中，所述超声处理的时间为30秒/次，共两次，间隔30秒。
在一种实施方式中，所述搅拌时间为2～4小时；所述搅拌速率为400r/min。
本发明实施例提供一种载药组合物，其中，包括本发明实施例所述的靶向纳米药物载体和包裹于所述靶向纳米药物载体内的药物。
在一种实施方式中，所述药物选自抗AD药物、抗肿瘤药物、甾体类或非甾体抗炎药物、代谢调节类药物、抗生素、心血管药物、抗病毒药物、抗真菌药物、免疫调节剂等各类药物中的一种或多种，但不限于此。
在一种实施方式中，所述靶向纳米药物载体与药物的质量比为1mg：(0.1～10)mg。
本发明实施例提供一种如上所述的载药组合物的制备方法，其中，包括以下步骤：
将式(Ⅰ)所示结构的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物溶解于第一有机溶剂中，振荡至混合均匀，得到聚合物溶液；
向所述聚合物溶液中加入药物，并搅拌，然后加入去离子水，搅拌2-3h，得到混合溶液；
将得到的混合溶液用装有去离子水的透析袋透析，然后过滤透析袋内液，得到载药组合物。
在一种实施方式中，所述靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物与药物的质量比为 1mg：(0.1～10)mg。
本发明实施例提供一种如上所述的载药组合物的制备方法，其中，包括以下步骤：
将式(Ⅰ)所示结构的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物与药物溶解于第二有机溶剂中，除去第二有机溶剂制成薄膜；
然后加入至双蒸水中水化，震荡混匀，超声，离心，冷冻，干燥，得到载药组合物。
在一种实施方式中，所述靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物与药物的质量比为 1mg：(0.1～10)mg。
本发明实施例提供一种如上所述的载药组合物的制备方法，其中，包括以下步骤：
将式(Ⅰ)所示结构的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物与药物溶解于油相溶液中，并用注射器吸取水相溶液至所述油相溶液中，进行超声处理，然用注射器将超声后的溶液全部吸出，注入至外水相溶液中，进行搅拌；
最后离心、洗涤、冷冻、干燥，得到载药组合物。
在一种实施方式中，所述靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物与药物的质量比为1mg： (0.1～10)mg。
下面通过具体的实施例对本发明作进一步地说明。
实施例1：
糖基化聚乙二醇胺(GLU-PEGn-NH2)的合成
取100mg BocNH-PEGn-COOH(0.05mmol，Mn＝2000)溶于5mL DMF溶液中，依次加入13mg DCC、9mg NHS，室温下搅拌过夜，去除副产物，得到羧基端活化的BocNH-PEGn-COOH。15mg葡萄糖苯胺 (Glu-NH2)溶于1mL超干DMF溶液中，搅拌5min后加入三乙胺，搅拌15min后滴加到羧基端活化的BocNH-PEGn-COOH溶液中，室温反应12h。反应结束后，将反应液逐滴滴入到剧烈搅拌的无水乙醚中，离心，得到黄色粗产物，再次把粗产物溶于THF中，用无水乙醚沉淀，离心，最后在室温下真空干燥过夜，得到Glu-PEGn-NH-Boc。将1mg Glu-PEGn-NH-Boc溶于5mL三氟乙酸(TFA)中，室温搅拌过夜，脱去PEG氨基端上的Boc基团，得到葡萄糖苯胺聚乙二醇胺(Glu-PEGn-NH2)。对本实施例产物进行核磁共振检测(溶剂为氘代二甲基亚砜)，检测结果见图1。具体合成路线如下：
Figure BDA0003241743680000151
下面列举了三个不同P值的糖基化聚乙二醇聚天冬氨酸聚硒代蛋氨酸两亲性嵌段共聚物 (GLU-PEGn-PASpx-PMet(Se)y)(P＝总聚氨基酸的分子量与糖基化聚乙二醇胺的分子量之比)，以制备三种不同自组装形貌的多功能纳米药物载体，具体见实施例2～4。具体合成路线如下：
Figure BDA0003241743680000161
实施例2：
糖基化聚乙二醇聚天冬氨酸聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物(Glu-PEG45-PAsp2-PMet(Se)2)的合成称量0.1g tBu-PEG45-NH2(0.05mmol，Mn＝2000)于真空干燥箱真空干燥4小时，然后溶解在 3ml经过干燥处理的DMF中作为大分子引发剂。称量25mg新制备的L-天冬氨酸苄酯NCA(BLA-NCA) (0.1mmol)溶于1ml超干DMF中，然后用注射器将两个反应液混合，置于氮气环境下，搅拌反应 24h。反应结束后，称量22.3mg新制备的硒代-L-蛋氨酸NCA(0.1mmol)溶于1ml超干DMF中，加入上述混合反应液中，继续搅拌反应。24小时后，反应结束。将三嵌段聚合物在冰无水异丙醚中沉降、离心，真空烘箱中干燥24h，得到产物叔丁酯乙酸聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物tBu-PEG45-PBLA2-PMet(Se)2。产物通过常规氨基保护策略，将嵌段共聚物末端的氨基通过 Cbz-Cl保护起来。产物进一步用三氟乙酸溶解冰浴搅拌反应2h脱掉PEG端的叔丁酯基，在冰无水异丙醚中沉降、离心、干燥，得到羧基聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物，再将产物加入1.2e.q.DCC(二环己基碳二亚胺)和1.5e.q.NHS(N-羟基丁二酰亚胺)中室温搅拌活化过夜，然后加入1.2e.q.的Glu-NH2和1.5e.q.的三乙胺室温搅拌过夜，得到糖基化聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物Glu-PEG45-PBLA2-PMet(Se)2。产物再通过碱水解反应除去嵌段共聚物中的苄酯。将嵌段共聚物溶于适量0.5mol/LNaOH溶液中，并搅拌1h，然后将溶液用去离子水透析(MWCO：2000)，并冻干以获得最终产物Glu-PEG45-PAsp2-PMet(Se)2。对本实施例产物进行核磁共振检测(溶剂为氘代三氟乙酸)，检测结果见图2。
实施例3：
糖基化聚乙二醇聚天冬氨酸聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物(Glu-PEG45-PAsp2-PMet(Se)4)的合成
称量0.1g tBu-PEG-NH2(0.05mmol，Mn＝2000)于真空干燥箱真空干燥4小时，然后溶解在3ml 经过干燥处理的DMF中用作大分子引发剂。称量25mg新制备的L-天冬氨酸苄酯NCA(0.1mmol)溶于1ml超干DMF中，然后用注射器将两个反应液混合，置于氮气环境下，搅拌反应24h。反应结束后，称量44.6mg新制备的硒代-L-蛋氨酸NCA(0.2mmol)溶于1ml超干DMF中，加入上述混合反应液中，继续搅拌反应。24小时后，反应结束。将三嵌段聚合物在冰无水异丙醚中沉降、离心，真空烘箱中干燥24h，得到产物叔丁酯乙酸聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物 tBu-PEG45-PBLA2-PMet(Se)4。产物通过常规氨基保护策略，将嵌段共聚物末端的氨基通过Cbz-Cl保护起来。产物进一步用三氟乙酸溶解冰浴搅拌反应2h脱掉PEG端的叔丁酯基，在冰无水异丙醚中沉降、离心、干燥，得到羧基聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物，再将产物加入1.2e.q. DCC和1.5e.q.NHS中室温搅拌活化过夜，然后加入1.2e.q.的Glu-NH2和1.5e.q.的三乙胺室温搅拌过夜，得到糖基化聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物Glu-PEG45-PBLA2-PMet(Se)4。产物再通过碱水解反应除去嵌段共聚物中的苄酯。将嵌段共聚物溶于适量0.5mol/LNaOH溶液中，并搅拌1h，然后将溶液用去离子水透析(MWCO：2000)，并冻干以获得最终产物 Glu-PEG45-PAsp2-PMet(Se)4。
实施例4：
糖基化聚乙二醇聚天冬氨酸聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物(Glu-PEG45-PAsp2-PMet(Se)6)的合成
称量0.1g tBu-PEG-NH2(0.05mmol，Mn＝2000)于真空干燥箱真空干燥4小时，然后溶解在3ml 经过干燥处理的DMF中用作大分子引发剂。称量25mg新制备的L-天冬氨酸苄酯NCA(0.1mmol)溶于1ml超干DMF中，然后用注射器将两个反应液混合，置于氮气环境下，搅拌反应24h。反应结束后，称量66.9g新制备的硒代-L-蛋氨酸NCA(0.3mmol)溶于1ml超干DMF中，加入上述混合反应液中，继续搅拌反应。24小时后，反应结束。将三嵌段聚合物在冰无水异丙醚中沉降、离心、真空烘箱中干燥24h得到产物叔丁酯乙酸聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物tBu-PEG45-PBLA2-PMet(Se)6。产物通过常规氨基保护策略，将嵌段共聚物末端的氨基通过Cbz-Cl保护起来。产物进一步用三氟乙酸溶解冰浴搅拌反应2h脱掉PEG端的叔丁酯基，在冰无水异丙醚中沉降、离心、干燥，得到羧基聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物，再将产物加入1.2e.q. DCC和1.5e.q.NHS中室温搅拌活化过夜，然后加入1.2e.q.的Glu-NH2和1.5e.q.的三乙胺室温搅拌过夜，得到糖基化聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物Glu-PEG45-PBLA2-PMet(Se)6。产物再通过碱水解反应除去嵌段共聚物中的苄酯。将嵌段共聚物溶于适量0.5mol/L NaOH溶液中，并搅拌1h，然后将溶液用去离子水透析(MWCO：2000)，并冻干以获得最终产物 Glu-PEG45-PAsp2-PMet(Se)6。
下面还列举了三个不同P值的糖基化聚乙二醇聚赖氨酸聚硒代蛋氨酸两亲性阳离子三嵌段共聚物(Glu-PEGn-PLLx-PMet(Se)y)(P＝总聚氨基酸的分子量与糖基化聚乙二醇胺的分子量之比)，以制备三种不同自组装形貌的多功能纳米药物载体，具体见实施例5～7。具体合成路线如下：
Figure BDA0003241743680000181
实施例5：
糖基化聚乙二醇聚赖氨酸聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物Glu-mPEG45-PLL2-PMet(Se)2)的合成
称量0.1g tBu-PEG-NH2(0.05mmol，Mn＝2000)于真空干燥箱真空干燥4小时，然后溶解在3ml 经过干燥处理的DMF中用作大分子引发剂。称量31mg新制备的ε-苄氧羰基-L-赖氨酸NCA(Lys(Z) -NCA)(0.1mmol)溶于1ml超干DMF中，然后用注射器将两个反应液混合，置于氮气环境下，搅拌反应24h。反应结束后，称量22.3mg新制备的硒代-L-蛋氨酸NCA(0.1mmol)溶于1ml超干DMF中，加入上述混合反应液中，继续搅拌反应。24小时后，反应结束。将三嵌段聚合物在冰无水异丙醚中沉降、离心、真空烘箱中干燥24h，得到产物叔丁酯乙酸聚乙二醇聚苄氧羰基赖氨酸聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物tBu-PEG45-PLL2-PMet(Se)2。产物通过常规氨基保护策略，将嵌段共聚物末端的氨基通过 Cbz-Cl保护起来。产物进一步用三氟乙酸溶解冰浴搅拌反应2h脱掉PEG端的叔丁酯基，在冰无水异丙醚中沉降、离心、干燥，得到羧基聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物，再将产物加入1.2e.q.DCC和1.5e.q.NHS中室温搅拌活化过夜，然后加入1.2e.q.的Glu-NH2和1.5e.q. 的三乙胺室温搅拌过夜，得到糖基化聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物 Glu-PEG45-PBLA2-PMet(Se)2。产物再通过酸解反应除去嵌段共聚物中的苄氧羰基。将嵌段共聚物溶于适量三氟乙酸中，在冰浴搅拌下加入5倍量的33％HBr/AcOH溶液，反应4h后在无水乙醚中沉淀离心得到粗产物。再把粗产物用DMSO完全溶解，然后将溶液用去离子水透析(MWCO：2000)，在去离子水中透析24h后转入到PH 9.0的氨水中透析24h，然后再PH 5.0的HCl溶液中透析24h，最后在去离子水中透析24h，并冻干以获得最终产物Glu-PEG45-PLL2-PMet(Se)2。
实施例6：
糖基化聚乙二醇聚赖氨酸聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物(Glu-PEG45-PLL2-PMet(Se)4)的合成
称量0.1g tBu-PEG-NH2(0.05mmol，Mn＝2000)于真空干燥箱真空干燥4小时，然后溶解在3ml 经过干燥处理的DMF中用作大分子引发剂。称量31mg新制备的ε-苄氧羰基-L-赖氨酸NCA(Lys(Z) -NCA)(0.1mmol)溶于1ml超干DMF中，然后用注射器将两个反应液混合，置于氮气环境下，搅拌反应24h。反应结束后，称量44.6mg新制备的硒代-L-蛋氨酸NCA(0.2mmol)溶于1ml超干DMF中，加入上述混合反应液中，继续搅拌反应。24小时后，反应结束。将三嵌段聚合物在冰无水异丙醚中沉降、离心、真空烘箱中干燥24h，得到产物叔丁酯乙酸聚乙二醇聚苄氧羰基赖氨酸聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物tBu-PEG45-PLL2-PMet(Se)4。产物通过常规氨基保护策略，将嵌段共聚物末端的氨基通过Cbz-Cl保护起来。产物进一步用三氟乙酸溶解冰浴搅拌反应2h脱掉PEG端的叔丁酯基，在冰无水异丙醚中沉降、离心、干燥，得到羧基聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物，再将产物加入1.2e.q.DCC和1.5e.q.NHS中室温搅拌活化过夜，然后加入1.2e.q.的Glu-NH2和1.5e.q. 的三乙胺室温搅拌过夜，得到糖基化聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物 Glu-PEG45-PBLA2-PMet(Se)4。产物再通过酸解反应除去嵌段共聚物中的苄氧羰基。将嵌段共聚物溶于适量三氟乙酸中，在冰浴搅拌下加入5倍量的33％HBr/AcOH溶液，反应4h后在无水乙醚中沉淀离心得到粗产物。再把粗产物用DMSO完全溶解，然后将溶液用去离子水透析(MWCO：2000)，在去离子水中透析24h后转入到PH9.0的氨水中透析24h，然后再PH5.0的HCl溶液中透析24h，最后在去离子水中透析24h，并冻干以获得最终产物Glu-PEG45-PLL2-PMet(Se)4。
实施例7：
糖基化聚乙二醇聚赖氨酸聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物(Glu-PEG45-PLL2-PMet(Se)6)的合成
称量0.1g tBu-PEG-NH2(0.05mmol，Mn＝2000)于真空干燥箱真空干燥4小时，然后溶解在3ml 经过干燥处理的DMF中用作大分子引发剂。称量31mg新制备的ε-苄氧羰基-L-赖氨酸NCA(Lys(Z) -NCA)(0.1mmol)溶于1ml超干DMF中，然后用注射器将两个反应液混合，置于氮气环境下，搅拌反应24h。反应结束后，称量66.9mg新制备的硒代-L-蛋氨酸NCA(0.3mmol)溶于1ml超干DMF中，加入上述混合反应液中，继续搅拌反应。24小时后，反应结束。将三嵌段聚合物在冰无水异丙醚中沉降、离心、真空烘箱中干燥24h，得到产物叔丁酯乙酸聚乙二醇聚苄氧羰基赖氨酸聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物tBu-PEG45-PLL2-PMet(Se)6。产物通过常规氨基保护策略，将嵌段共聚物末端的氨基通过 Cbz-Cl保护起来。产物进一步用三氟乙酸溶解冰浴搅拌反应2h脱掉PEG端的叔丁酯基，在冰无水异丙醚中沉降、离心、干燥，得到羧基聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物，再将产物加入1.2e.q.DCC和1.5e.q.NHS中室温搅拌活化过夜，然后加入1.2e.q.的Glu-NH2和1.5e.q. 的三乙胺室温搅拌过夜，得到糖基化聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物 Glu-PEG45-PBLA2-PMet(Se)6。产物再通过酸解反应除去嵌段共聚物中的苄氧羰基。将嵌段共聚物溶于适量三氟乙酸中，在冰浴搅拌下加入5倍量的33％HBr/AcOH溶液，反应4h后在无水乙醚中沉淀离心得到粗产物。再把粗产物用DMSO完全溶解，然后将溶液用去离子水透析(MWCO：2000)，在去离子水中透析24h后转入到PH9.0的氨水中透析24h，然后再PH5.0的HCl溶液中透析24h，最后在去离子水中透析24h，并冻干以获得最终产物Glu-PEG45-PLL2-PMet(Se)6。
下面还列举了一种糖基化聚乙二醇聚缬氨酸聚硒代蛋氨酸两亲性三嵌段共聚物(Glu-PEGn-PVx-PMet(Se)y)，以制备一种不带电荷的多功能纳米药物载体，具体见实施例8～10。具体合成路线如下：
Figure BDA0003241743680000211
实施例8：
糖基化聚乙二醇聚缬氨酸聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物(Glu-PEG45-PV2-PMet(Se)2)的合成
称量0.1g tBu-PEG-NH2(0.05mmol，Mn＝2000)于真空干燥箱真空干燥4小时，然后溶解在3ml 经过干燥处理的DMF中用作大分子引发剂。称量15mg新制备的L-缬氨酸NCA(0.1mmol)溶于1ml 超干DMF中，然后用注射器将两个反应液混合，置于氮气环境下，搅拌反应24h。反应结束后，称量23mg新制备的硒代-L-蛋氨酸NCA(0.1mmol)溶于1ml超干DMF中，加入上述混合反应液中，继续搅拌反应。24小时后，反应结束。将三嵌段聚合物在冰无水异丙醚中沉降、离心、真空烘箱中干燥24h，得到产物叔丁酯乙酸聚乙二醇聚苄氧羰基赖氨酸聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物 tBu-PEG45-PV2-PMet(Se)2。产物通过常规氨基保护策略，将嵌段共聚物末端的氨基通过Cbz-Cl保护起来。产物进一步用三氟乙酸溶解冰浴搅拌反应2h脱掉PEG端的叔丁酯基，在冰无水异丙醚中沉降、离心、干燥，得到羧基聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物，再将产物加入1.2e.q.DCC 和1.5e.q.NHS中室温搅拌活化过夜，然后加入1.2e.q.的Glu-NH2和1.5e.q.的三乙胺室温搅拌过夜，得到糖基化聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物Glu-PEG45-PV2-PMet(Se)2。
实施例9：
糖基化聚乙二醇聚缬氨酸聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物(Glu-PEG45-PV2-PMet(Se)4)的合成
称量0.1g tBu-PEG-NH2(0.05mmol，Mn＝2000)于真空干燥箱真空干燥4小时，然后溶解在3ml 经过干燥处理的DMF中用作大分子引发剂。称量15mg新制备的L-缬氨酸NCA(0.1mmol)溶于1ml 超干DMF中，然后用注射器将两个反应液混合，置于氮气环境下，搅拌反应24h。反应结束后，称量46mg新制备的硒代-L-蛋氨酸NCA(0.2mmol)溶于1ml超干DMF中，加入上述混合反应液中，继续搅拌反应。24小时后，反应结束。将三嵌段聚合物在冰无水异丙醚中沉降、离心、真空烘箱中干燥24h，得到产物叔丁酯乙酸聚乙二醇聚苄氧羰基赖氨酸聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物 tBu-PEG45-PV2-PMet(Se)4。产物通过常规氨基保护策略，将嵌段共聚物末端的氨基通过Cbz-Cl保护起来。产物进一步用三氟乙酸溶解冰浴搅拌反应2h脱掉PEG端的叔丁酯基，在冰无水异丙醚中沉降、离心、干燥，得到羧基聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物，再将产物加入1.2e.q.DCC 和1.5e.q.NHS中室温搅拌活化过夜，然后加入1.2e.q.的Glu-NH2和1.5e.q.的三乙胺室温搅拌过夜，得到糖基化聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物Glu-PEG45-PV2-PMet(Se)4。
实施例10：
糖基化聚乙二醇聚缬氨酸聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物(Glu-PEG45-PV2-PMet(Se)6)的合成
称量0.1g tBu-PEG-NH2(0.05mmol，Mn＝2000)于真空干燥箱真空干燥4小时，然后溶解在3ml 经过干燥处理的DMF中用作大分子引发剂。称量15mg新制备的L-缬氨酸NCA(0.1mmol)溶于1ml 超干DMF中，然后用注射器将两个反应液混合，置于氮气环境下，搅拌反应24h。反应结束后，称量69mg新制备的硒代-L-蛋氨酸NCA(0.3mmol)溶于1ml超干DMF中，加入上述混合反应液中，继续搅拌反应。24小时后，反应结束。将三嵌段聚合物在冰无水异丙醚中沉降、离心、真空烘箱中干燥24h，得到产物叔丁酯乙酸聚乙二醇聚苄氧羰基赖氨酸聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物 tBu-PEG45-PV2-PMet(Se)6。产物通过常规氨基保护策略，将嵌段共聚物末端的氨基通过Cbz-Cl保护起来。产物进一步用三氟乙酸溶解冰浴搅拌反应2h脱掉PEG端的叔丁酯基，在冰无水异丙醚中沉降、离心、干燥，得到羧基聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物，再将产物加入1.2e.q.DCC 和1.5e.q.NHS中室温搅拌活化过夜，然后加入1.2e.q.的Glu-NH2和1.5e.q.的三乙胺室温搅拌过夜，得到糖基化聚乙二醇聚天冬氨酸苄酯聚硒代蛋氨酸嵌段共聚物Glu-PEG45-PV2-PMet(Se)6。
实施例11：
纳米球形胶束的制备
取20mg Glu-PEG45-PV2-PMet(Se)2(P＝0.28)完全溶解于2mL DMSO中，振荡使聚合物混合均匀，得到聚合物溶液；然后向其中逐滴滴加去离子水5mL，搅拌2小时，得到溶液；将得到的溶液直接加入截留分子量为2000DA的透析袋中，在2L去离子中室温透析7天，每天换一次水，然后使用水相滤头过滤(孔径450nm)透析袋内液，过滤掉大分子沉淀和聚集的胶束颗粒，得到目的产物 Glu-PEG45-PV2-PMet(Se)2纳米球形胶束。
实施例12：
纳米棒状胶束的制备
取20mg Glu-PEG45-PV2-PMet(Se)4(P＝0.46)完全溶解于2mL二氯甲烷中，在茄形瓶中旋转蒸发制成均匀薄膜，抽真空过夜除去残留的有机溶剂。在茄形瓶中加入5mL双蒸水于60℃水化1h，震荡混匀，水浴下超声即得纳米棒状胶束分散液，3000r/min离心30min，除去大的聚集粒子，清液经冷冻干燥，得到目的产物纳米棒状胶束。
实施例13：
纳米囊泡的制备
量取16mL的0.25％聚乙烯醇的水溶液于50mL烧杯中，搅拌。称量20mg Glu-PEG45-PV2-PMet(Se)6 (P＝0.64)溶于4mL的CH2Cl2溶液，然后用超声波细胞粉碎机进行两次超声,一次超声工作时间为 4s,间歇时间4s，总工作时间30s，两次超声间隔时间为30s。在开始第一次超声时用注射器吸取0.1mL0.1％聚乙烯醇的水溶液注入该溶液中，观察乳化情况。超声完毕，用注射器将溶液全部吸出，缓慢均匀注入质量分数为0.25％聚乙烯醇的水溶液中，室温下搅拌2h。最后经反复洗涤，冷冻、干燥，得到目的产物纳米囊泡。
实施例14：
阴阳离子复合纳米球形胶束的制备
取10mg Glu-PEG45-PAsp2-PMet(Se)2(P＝0.30)和10mg Glu-PEG45-PLL2-PMet(Se)2(P＝0.30) 完全溶解于2mL DMSO中，振荡使聚合物混合均匀，得到聚合物溶液；然后向其中逐滴滴加去离子水 5mL，搅拌2小时，得到溶液；将得到的溶液直接加入截留分子量为2000DA的透析袋中，在2L去离子中室温透析7天，每天换一次水，然后使用水相滤头过滤(孔径450nm)透析袋内液，过滤掉大分子沉淀和聚集的胶束颗粒，得到目的产物纳米球形胶束。用透射电子显微镜观察形成的纳米球形胶束，胶束呈规则圆球状性状，测得粒径约为150nm，结果见图3。
实施例15：
阴阳离子复合纳米棒状胶束的制备
取10mg Glu-PEG45-PAsp2-PMet(Se)4(P＝0.47)和10mg Glu-PEG45-PLL2-PMet(Se)4(P＝0.49) 完全溶解于2mL二氯甲烷中，在茄形瓶中旋转蒸发制成均匀薄膜，抽真空过夜除去残留的有机溶剂。在茄形瓶中加入5mL双蒸水于60℃水化1h，震荡混匀，水浴下超声即得纳米棒状胶束分散液， 3000r/min离心30min，除去大的聚集粒子，清液经冷冻干燥，得到目的产物纳米棒状胶束。用透射电子显微镜观察形成的纳米棒状胶束，纳米囊呈棒球状，粒径约为100nm，结果见图4。
实施例16：
阴阳离子复合纳米囊泡的制备
量取16mL的0.25％聚乙烯醇的水溶液于50mL烧杯中，搅拌。称量10mg Glu-PEG45-PAsp2-PMet(Se)6(P＝0.65)和10mg Glu-PEG45-PLL2-PMet(Se)6(P＝0.67)溶于4mL的CH2Cl2溶液，然后用超声波细胞粉碎机进行两次超声,一次超声工作时间为4s,间歇时间4s，总工作时间 30s，两次超声间隔时间为30s。在开始第一次超声时用注射器吸取0.1mL0.1％聚乙烯醇的水溶液注入该溶液中，观察乳化情况。超声完毕，用注射器将溶液全部吸出，缓慢均匀注入质量分数为0.25％聚乙烯醇的水溶液中，室温下搅拌2h。最后经反复洗涤，冷冻、干燥，得到目的产物纳米囊泡。用透射电子显微镜观察形成的纳米囊泡，纳米球呈圆球形，测得粒径约为120nm，结果见图5。
实施例17：
阴阳离子复合型载阿霉素纳米球形胶束的制备
取10mg Glu-PEG45-PAsp2-PMet(Se)2(P＝0.30)和10mg Glu-PEG45-PLL2-PMet(Se)2(P＝0.30) 与2.7mg阿霉素分别完全溶解于适量DMSO中。振荡前者使聚合物混合均匀，得到聚合物溶液，然后在快速搅拌下缓慢逐滴加入阿霉素溶液，在上述聚合物溶液中加入2.7mg阿霉素，轻微搅拌使两者混合均匀；然后向其中逐滴滴加去离子水5mL，搅拌2小时，得到溶液；将得到的溶液直接加入截留分子量为2000DA的透析袋中，在1L去离子中室温透析7天，每天换一次水，然后使用水相滤头过滤(孔径450nm)透析袋内液，过滤掉大分子沉淀和聚集的胶束颗粒，得到目的产物Glu-PEG45-PAsp2-PMet(Se)2-阿霉素纳米球形胶束。
实施例18：
阴阳离子复合型载多奈哌齐纳米囊泡的制备
量取16mL的质量分数为0.25％的聚乙烯醇的水溶液于50mL烧杯中，搅拌。称量10mg Glu-PEG45-PAsp2-PMet(Se)6(P＝0.65)和10mg Glu-PEG45-PLL2-PMet(Se)6(P＝0.67)与2.7mg多奈哌齐完全溶于4mL的CH2Cl2溶液，然后用超声波细胞粉碎机进行两次超声,一次超声工作时间为4s，间歇时间4s，总工作时间30s，两次超声间隔时间为30s。在开始第一次超声时用注射器吸取 0.1mL0.1％聚乙烯醇的水溶液注入该溶液中，观察乳化情况。超声完毕，用注射器将溶液全部吸出，缓慢均匀注入0.25％聚乙烯醇的水溶液中，室温下搅拌2h。最后经反复洗涤，冷冻、干燥，得到目的产物Glu-PEG45-PAsp2-PMet(Se)6-多奈哌齐纳米囊泡。
实施例19：
阴阳离子复合型载药纳米胶束的体外释放试验
精确称取4mg实施例17所制备的阴阳离子复合载阿霉素纳米球形胶束放入透析袋(截留分子量为2000DA)内，透析袋内加入5mL磷酸盐缓冲溶液(lmol/L，pH7.4)分散。将透析袋放入三角瓶中，加入20mL PBS(lmol/L，pH7.4)作为释放介质。将三角瓶置于37℃、100r/min的恒温摇床中进行释放实验，每隔1h取样2mL，取样后再补充相同体积的新鲜PBS保证释药外液体积恒定。通过紫外-可见分光光度计测量样品在λ＝483nm的紫外吸光度，绘制阿霉素纳米胶束的体外药物释放曲线。按照上述操作绘制阿霉素纯品的体外药物释放标准曲线。由阿霉素纳米胶束体外药物释放曲线可知，Glu-PEG45-PAsp2-PMet(Se)2纳米胶束的载药量约为10.0％，包封率50.5％。且与阿霉素体外药物释放标准曲线对比，发现本实施例提供的载药纳米胶束在体外释放过程中未出现突释现象，说明胶束表面吸附的药物比较少，绝大多数的药物被包裹在其内部，证明载药纳米胶束具有较好的控释效果，有利于减少药物的毒副作用。
实施例20：
纳米药物载体中硒抗氧化功能的检测
将乳腺癌MDA-MB-231细胞株(以下简称231细胞)用含10％胎牛血清的DMEM培养基，置于5％CO2、 37℃培养箱中培养，1～2d传代一次，取对数生长期的细胞进行实验。取对数生长期的231细胞，以8×103/孔细胞接种于96孔板，培养24h后药物处理。实验分为四组：对照组、纳米胶束组、阿霉素组和纳米胶束+阿霉素组，给药剂量为纳米胶束(100μmol/L)，阿霉素(2.0μmol/L)，每孔加 100μl，设6个复孔，对照孔加等量不含药物的DMEM培养基。24h后收集各组细胞，加入细胞裂解液冰上裂解，离心收取细胞全蛋白。BCA法测定蛋白浓度，再由WST-1法测定细胞总SOD活性、TBA 法测定细胞MDA含量，操作步骤严格按照试剂盒要求。通过测定231细胞内SOD、MDA水平可知，处理后各组与对照组相比细胞SOD活力均降低，MDA水平均升高(P＜0.05)；其中纳米胶束联合阿霉素组细胞总SOD活力下降、MDA水平升高最为显著。由此表明，纳米药物载体具备了硒的抗氧化功能，且纳米药物载体与阿霉素的联合具有相加作用。
实施例21：
阴阳离子复合型载罗丹明B纳米球形胶束的制备
取10mg Glu-PEG45-PAsp2-PMet(Se)2(P＝0.30)和10mg Glu-PEG45-PLL2-PMet(Se)2(P＝0.30) 与1.0mg罗丹明B分别完全溶解于适量DMSO中。振荡前者使聚合物混合均匀，得到聚合物溶液，然后在快速搅拌下缓慢逐滴加入罗丹明B溶液，轻微搅拌使两者混合均匀；然后向其中逐滴滴加去离子水5mL，搅拌2小时，得到溶液；将得到的溶液直接加入截留分子量为2000DA的透析袋中，在 1L去离子中室温透析7天，每天换一次水，然后使用水相滤头过滤(孔径450nm)透析袋内液，过滤掉大分子沉淀和聚集的胶束颗粒，得到目的产物载罗丹明B纳米球形胶束。
实施例22：
细胞摄取糖基化修饰阴阳离子复合型载罗丹明B纳米球形胶束的定性观察
将231细胞以2×104个/孔密度接种于48孔培养板中培养，24h后用糖基化修饰载罗丹明B纳米球形胶束的DMEM溶液在37℃条件下孵育1h，纳米球形胶束的浓度分别50，100，200，400，600 μg/mL。弃去纳米球形胶束溶液，细胞用PBS冲洗3次，洗去吸附在细胞表面的纳米球形胶束，加入3.7％的甲醛溶液固定10min，然后用100ng/mL的DAPI溶液染核10min，再用PBS漂洗3次，荧光显微镜下观察细胞对糖基化修饰载罗丹明B纳米球形胶束的摄取情况，结果显示：细胞核被DAPI 染成蓝色以定位细胞位置，载红色荧光染料的纳米胶束分布细胞核周围，充满细胞质中，证明231 细胞对糖基化修饰载罗丹明B纳米球形胶束摄取作用明显(图6)。
综上所述，本发明提供的一种靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物具有式(Ⅰ)所示结构，能在不同环境下自组装成不同形式的纳米药物载体(如纳米球状胶束、纳米棒状胶束和纳米囊泡)，负载药物分子，制成缓释控释的靶向药物输送系统，能够将药物分子定向的送到病变部位，可通过各种方式给药，所包载的药物可以根据需要从输送系统中缓释控释的释放，从而降低给药频率、提高治疗效果，并减少药物的毒副作用。与现有技术相比，本发明实施例提供的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物兼具一般氨基酸类多聚物优势的同时，既具备了硒的多种生物学功能，又具备了靶向GLUT1的特异性，是一类新型、多功能两亲性嵌段共聚物，适用于GLUT1异常相关多种疾病的各类药物的药物载体研究、开发及临床应用。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物，具有式(Ⅰ)所示结构：
Figure FDA0003241743670000011
其中，22≤n≤454、2≤x≤50、2≤y≤50，n、x、y均为整数；
-R1选自
Figure FDA0003241743670000012
中的一种；
-R2选自-CH(CH3)CH3、
Figure FDA0003241743670000013
-H、-CH3、-CH2CH(CH3)CH3、-CH(CH3)CH2CH3、
Figure FDA0003241743670000014
-CH2OH、
Figure FDA0003241743670000015
-CH2SH、-CH2CH2SCH3、
Figure FDA0003241743670000016
-CH(OH)CH3、
Figure FDA0003241743670000017
中的一种；
-R3选自-CH2CH2SeCH3、-CH2SeH中的一种。
2.一种权利要求1所述的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
将叔丁酯乙酸聚乙二醇胺溶解在有机溶剂中，得到叔丁酯乙酸聚乙二醇胺溶液；
将氨基酸-N-内羧酸酐溶解在有机溶剂中，得到氨基酸-N-内羧酸酐溶液；
将硒代-氨基酸-N-内羧酸酐溶解在有机溶剂中，得到硒代-氨基酸-N-内羧酸酐溶液；
将叔丁酯乙酸聚乙二醇胺溶液和氨基酸-N-内羧酸酐溶液混合，置于惰性气氛下，搅拌反应；
反应结束后，加入硒代-氨基酸-N-内羧酸酐溶液，继续搅拌反应，得到两亲性嵌段共聚物；
将所述两亲性嵌段共聚物溶解于碳酸钾水溶液中，得到两亲性嵌段共聚物水溶液，Cbz-Cl溶于二氧六环中并在冰浴条件下添加至所述两亲性嵌段共聚物水溶液中，添加结束后撤掉冰浴，升至室温并保持反应过夜，反应完全后得到末端氨基Cbz保护的两亲性嵌段共聚物；
将所述末端氨基Cbz保护的两亲性嵌段共聚物溶解于过量三氟乙酸中，搅拌反应，得到所述羧基端脱保护的两亲性嵌段共聚物；
将所述羧基端脱保护的两亲性嵌段共聚物溶解在有机溶剂中，依次加入DCC、NHS，搅拌反应，得到羧基活化的两亲性嵌段共聚物溶液；
将葡萄糖溶解在有机溶剂中，加入三乙胺，搅拌，得到葡萄糖溶液；
将所述葡萄糖溶液添加到羧基活化的两亲性嵌段共聚物溶液中，置于惰性气氛下，搅拌反应，得到所述靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物；
将所述糖基化两亲性嵌段共聚物末端的Cbz去除，得到末端氨基脱保护的所述靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物。
3.根据权利要求2所述的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，所述氨基酸-N-内羧酸酐为L-缬氨酸-N-内羧酸酐、ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐、γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-2-氯乙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、甘氨酸-N-内羧酸酐、L-丙氨酸-N-内羧酸酐、L-亮氨酸-N-内羧酸酐、L-异亮氨酸-N-内羧酸酐、L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐、L-色氨酸-N-内羧酸酐、L-丝氨酸-N-内羧酸酐、L-酪氨酸-N-内羧酸酐、ε-苄氧羰基-L-半胱氨酸-N-内羧酸酐、L-天冬酰胺-N-内羧酸酐、L-谷氨酰胺-N-内羧酸酐、L-苏氨酸-N-内羧酸酐、精氨酸-N-内羧酸酐或组氨酸-N-内羧酸酐；
和/或，所述硒代-氨基酸-N-内羧酸酐为硒代-L-蛋氨酸-N-内羧酸酐或硒代-L-半胱氨酸-N-内羧酸酐；
和/或，所述葡萄糖为3,5-O-苯亚甲基-1,2-O-异亚丙基-α-D-吡喃葡萄糖、4-氨基苯基-β-D-吡喃葡萄糖或2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖。
4.根据权利要求2所述的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，所述叔丁酯乙酸聚乙二醇胺、氨基酸-N-内羧酸酐和硒代氨基酸-N-内羧酸酐的摩尔比为1：(2～50)：(2～50)。
5.根据权利要求2所述的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂包括无水N,N-二甲基甲酰胺、无水四氢呋喃和无水三氯甲烷中的一种或多种；
和/或，按所述叔丁酯乙酸聚乙二醇胺和有机溶剂的用量比为(1～5)g：100mL，将叔丁酯乙酸聚乙二醇胺溶解在有机溶剂中；
和/或，按所述氨基酸-N-内羧酸酐和有机溶剂的用量比为(1～5)g：100mL，将氨基酸-N-内羧酸酐溶解在有机溶剂中；
和/或，按所述硒代-氨基酸-N-内羧酸酐和有机溶剂的用量比为(1～5)g：100mL，将硒代-氨基酸-N-内羧酸酐溶解在有机溶剂中。
6.根据权利要求2所述的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，所述末端氨基Cbz保护的两亲性嵌段共聚物与三氟乙酸的用量比为100mg：(5～10mL),反应时间为2～8h。
7.根据权利要求2所述的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，所述羧基端脱保护的两亲性嵌段共聚物与DCC、NHS的摩尔比为1：(1.05～1.5)：(1.2～1.6)；
和/或，所述羧基端脱保护的两亲性嵌段共聚物与DCC、NHS的反应时间为6～24h，反应温度为20～30℃；
和/或，所述羧基端脱保护的两亲性嵌段共聚物与葡萄糖溶液的摩尔比为1：(0.6～1.5)，反应时间为6～24h。
8.根据权利要求2所述的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，按所述羧基端脱保护的两亲性嵌段共聚物和有机溶剂的用量比为(1～5)g：100mL，将所述羧基端脱保护的两亲性嵌段共聚物溶解在有机溶剂中；
和/或，按所述葡萄糖和有机溶剂的用量比为(1～5)g：100mL，将所述葡萄糖溶解在有机溶剂中。
9.根据权利要求2所述的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，叔丁酯乙酸聚乙二醇胺和氨基酸-N-内羧酸酐反应的时间为24～72h；反应的温度为25～30℃。
10.一种权利要求1所述的靶向GLUT1、多聚硒代氨基酸两亲性嵌段共聚物在药物载体中的应用。
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