CN113684134A - 一种适用于野外采样期间藻类活体的保存方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种适用于野外采样期间藻类活体的保存方法和装置。本发明第一方面提供一种适用于野外采样期间藻类活体的保存方法，包括如下步骤：收集包括所述藻类活体的水体样本；测定所述水体样本的初始pH值；将二氧化碳通入所述水体样本中；调节pH值至所述初始pH值；进行藻类活体的保存。本发明提供的保存方法能够快速高效的杀灭水体样本中的浮游动物且不影响藻类活力，提高从野外采集的藻种在带回实验室途中的质量和数量；此外，本发明提供的方法操作方法简便、对设备要求低，能够适应紧凑的野外采样工作，满足科研人员从野外采集藻种后其种类与初始情况基本保持一致并以较高的数量带回实验室分离的需要。

Description

一种适用于野外采样期间藻类活体的保存方法及装置
技术领域
本发明涉及一种适用于野外采样期间藻类活体的保存方法及装置，涉及藻类保存技术领域。
背景技术
从野外收集藻种并培养是开展后续生理生化研究的基础工作，但在野外环境条件下没有对藻种进行挑取和培养的条件，并且由于采样日程的安排较为紧凑，所以通常是在野外采样，并带回实验室后再进行藻种的挑取和培养工作。由于采集的水体样本种不仅含有藻类，而且含有很多浮游动物，在将水体样本从野外带回实验室的过程中，藻类大多数都会被浮游动物捕食，致使藻类的种类和数量大为下降，为后期挑藻选育培养的研究工作带来了很大的困难。
现有的保存活藻的方法主要包括超低温保存法、脱水低温保存法、包埋脱水法和保鲜液保存法，然而这些方法由于设备要求高或适用对象专一且要求为纯培养因此均不适用于野外采样期间的藻种保存。现阶段在野外采样期间多采用少量多瓶分装的方式来保存活藻，然而依然存在藻种被浮游动物捕食导致的藻的种类和数量不高的问题。
发明内容
本发明提供一种适用于野外采样期间藻类活体的保存方法及装置，用于解决现阶段野外采样期间藻种保存过程中，藻的种类和数量下降的问题。
本发明第一方面提供一种适用于野外采样期间藻类活体的保存方法，包括如下步骤：
收集包括所述藻类活体的水体样本；
测定所述水体样本的初始pH值；
将二氧化碳通入所述水体样本中；
调节pH值至所述初始pH值；
进行藻类活体的保存。
图1为本发明一实施例提供的藻类活体保存方法的流程示意图，如图1所示，所述方法具体包括如下步骤：
S1、收集包括藻类活体的水体样本：
本领域技术人员可根据常规技术手段对包括待研究藻类生物的水体进采样，得到包括藻类活体的水体样本；
S2、测定所述水体样本的初始pH值；
S3、将二氧化碳通入所述水体样本中；
由于水体样本中浮游动物是影响藻类种类和数量的最大因素，通入二氧化碳能够杀灭水体中的浮游动物，从而达到保存藻种的目的。为了进一步提高浮游动物的灭活率，发明人对二氧化碳通入过程中的通入流量和通气时间进行研究分析，具体过程及分析结果阐述如下：
将从野外采集的水体样本混合均匀后倒入锥形瓶中定容至150mL，分别选用20mL/min、30mL/min、40mL/min、50mL/min、60mL/min的通入流量，将二氧化碳通入锥形瓶中，每隔一分钟立即取1mL进行镜检，并在Nikon 50i显微镜下观察，参照书籍文献进行浮游动物的鉴定，浮游动物鉴定到属，统计浮游动物的存活情况，存活的数量以及种类。根据浮游动物的死亡情况共分为六个等级，从0到+++++表示，+越多表示浮游动物的死亡情况越差，具体结果如表1-5所示：
表1流量为20mL/min时各时间段浮游动物的情况
Figure BDA0003160559690000021
Figure BDA0003160559690000031
表2流量为30mL/min时各时间段浮游动物的情况
Figure BDA0003160559690000032
表3流量为40mL/min时各时间段浮游动物的情况
Figure BDA0003160559690000033
Figure BDA0003160559690000041
表4流量为50mL/min时各时间段浮游动物的情况
Figure BDA0003160559690000042
Figure BDA0003160559690000051
表5流量为60mL/min时各时间段浮游动物的情况
Figure BDA0003160559690000052
根据表1-表5所示的情况可知，随着通气时间越长，浮游动物的灭活情况越好，其中，当流量为60mL/min时通气7min对浮游动物的杀灭能力最好，但是在该条件下藻类的保存情况也较差，因此，发明人测定了20mL/min、30mL/min、40mL/min条件下通气7min，并保存三天后藻类的存活细胞数，测试结果如图2所示，当二氧化碳的通入流量为30mL/min时，藻类的存活细胞数最多，可以兼顾藻类细胞的保存和浮游动物的灭活。
S4、调节pH值至所述初始pH值：
通气结束后，随着藻类保存时间的延长，藻的质体与对照组相比有向内收缩的情况，分析原因后可能为pH改变所致，因此，在通入二氧化碳后需要将水体样本的pH调节为初始pH值。由于实验室常规培养的裸藻、金藻、硅藻培养基中均采用磷酸盐作为磷源，故而采用了磷酸缓冲液作为pH的调整剂。
为探究磷酸缓冲液的最佳添加时间，设置实验组：通气前加，通气后立即加，15分钟后加，30分钟后加。各实验组浮游动物存活情况如图3所示，在通气结束后半小时再调节pH可以达到浮游动物最佳杀灭状态，虽然在调节完pH后仍有2.33个/mL的浮游动物，但在后续监测中全部浮游动物将在通气结束后60min内死亡。通气后放置半个小时再调节pH有助于进一步提高藻类数量和种类，这是由于水体样本中无节幼体和原生动物的抗逆性很强，如果提前调整pH会导致后续培养中存在无节幼体和原生动物，3天后存在大量的原生动物，从而达不到尽可能多的保存藻的数量和种类的目的。
为了进一步探究不同通气量对藻种生存能力的影响，分别按照20mL/min通气8min、30mL/min通气7min、30mL/min通气8min、40mL/min通气8min、50mL/min通气8min、60mL/min通气7min后放置半小时，再用pH为7.4的磷酸缓冲液将pH调回至初始值，摇晃均匀后放置于自然光照充足处(非阳光直射)。每天摇晃换均匀水体2-3次，分别于第0、1、3、5、7天取样100μl后于40倍镜下按照40视野法进行观察计数，实验结果如图4所示，由图4可知，20*8组，30*7组，30*8组的数量始终比对照组高。综合图表来看20*8组虽然在后期增长势头迅猛，但是该组停止通气后及其半小时后仍有非常多的浮游动物(++++)。30*7与30*8组浮游动物杀灭情况差不多分别为++和+半小时后没有差异均为0，因此30*7组应为最佳选择。40*8组，50*8组，60*7组情况均不理想，在D3时均低于对照组，60*7组更是在D7时低于了对照。由此可以说明通入过多的二氧化碳虽然杀灭浮游动物的效果好，但是会影响藻类的生长情况。
为了进一步提高藻类的保存数量，所述方法还包括：向所述采样瓶中补充原液，所述原液由所述水体样本经0.2μm过滤后得到。
考虑到野外采样期间材料的易获得性与便于携带的特点，我们将用0.2μm过滤过的水体样品作为营养补充液，具体地，将采集得到的水体样品采用0.2μm滤网进行过滤，以除去水体样品中的藻类和浮游动物，而仅包括藻类生长所需的全部营养物质，添加原液可以为藻类补充生长必要的营养物质，使与其自然生活环境相当，延长藻类的保存时间，为了获得与最初采样时相同相似的群落组成，故而应在3天内完成藻类的挑取工作。
以探究最佳的添加时间，分别于D0、D1天向采样瓶内补充原液，添加量为调整pH后原培养液总体积的一半，由于添加了原体积一半的原液，相当于稀释了一倍，为了方便与对照组进行比对将实验组实际观察到的细胞数扩大两倍，细胞数情况如图5所示，根据图5可知，添加原液能够促进藻类细胞生长，且添加时间越早，藻类的存活细胞数越多，藻类的保存效果越好。
再来看种类组成，在第三天时D0组与对照组的种类比较情况见图6，图7为补充原液三天后D0组与对照组的藻种比较情况，由图6-7可见，在第三天时，与对照组相比D0组除了角星鼓藻(Staurastrum sp.)未检测外包含了对照组其余种类微藻，且D0组比对照组多出两种微藻(小环藻(Cycotella sp.)与直链藻(Melosira sp.)，除去抽样误差的情况这可能由于营养条件充足且没有捕食者使得原本数量较少的藻种能够迅速生长而被抽样检测到。
通常情况下，将采集到的所述水体样本分装至采样瓶中，并将二氧化碳通入不同的采样瓶中。
当采样瓶中包括不同体积的水体样本时，二氧化碳的通气量也不相同，本发明进一步研究了不同体积的水体样本与二氧化碳通气量的关系，具体地，以40mL/min的通气流量向50ml、100ml、150ml的水体样本中通入二氧化碳，探究不同通气时间下浮游动物的灭活情况，具体见表6-8：
表6 50ml水体样本下不同通气时间下浮游动物的情况
Figure BDA0003160559690000071
表7 100ml水体样本下不同通气时间下浮游动物的情况
Figure BDA0003160559690000072
Figure BDA0003160559690000081
表8 150ml水体样本下不同通气时间下浮游动物的情况
Figure BDA0003160559690000082
根据表6-8提供的数据可知，以50mL为基础体积的情况下，每增加一单位体积的水样相应的通气时间应该在5min的基础上增加1分钟。
S5、进行藻类活体的保存：
通过步骤1-4即可有效杀灭水体样本中的浮游动物并最大程度上保护藻类存活细胞数，完成上述步骤后，即可将水体样本带回实验室进行后续试验，在保存过程中，将采样瓶敞口放置于自然光照良好处，每天摇动所述采样瓶2-5次，确保藻类活体与上清液混合均匀。
夏天蚊虫较多时应注意将瓶口用透气纱布覆盖以防止蚊虫于水样中产卵。如此即可确保瓶内藻的数量能够保持在较高水平且瓶内藻的种类与初始情况基本一致。不过需要注意的是，该方法适用于绿藻，硅藻，蓝藻，隐藻，裸藻，对金藻和甲藻的效果并不佳，均会在处理后停止活动且不可恢复，虽然尚且可以原样保存3天左右，但是不久后均会解体。
综上，本发明提供的适用于野外采样期间藻类活体的保存方法具体包括如下步骤：采集水体样本后，将其分装至采样瓶中，测定水体样本的初始pH值，以30mL/min的流量向采样瓶中通入二氧化碳7min，然后静置半小时，使用pH为7.4的磷酸缓冲液将样本pH调整至初始值。摇匀后静置10分钟向培养瓶内添加用0.2μm滤膜过滤过的原液，添加量为调整pH后原培养液总体积的一半。后将透明的培养瓶敞口放置于自然光照良好处，每天摇晃2-5次，确保沉底藻细胞与上清混合均匀即可。
本发明第二方面提供了一种实施上述任一所述方法的装置，包括二氧化碳存储装置、采样瓶，所述采样瓶用于收集所述藻类活体的水体样本，所述二氧化碳存储装置用于存储所述二氧化碳。
图8为本发明一实施例提供的保存装置的结构示意图，如图8所示，该装置包括二氧化碳存储装置1和采样瓶2，二者相互连通，在使用过程中，首先将从野外采集到的水体样本放置于采样瓶2中，测定pH后，将采样瓶2密封并与二氧化碳存储装置1连接，将二氧化碳通入采样瓶中，随后打开采样瓶2调节pH至初始pH后进行保存。
进一步地，所述装置还包括流量计，所述流量计的两端分别与所述二氧化碳存储装置、采样瓶连接，用于检测二氧化碳的通入流量。
图9为本发明又一实施例提供的保存装置的结构示意图，如图9所示，该装置还包括流量计3，流量计设置于二氧化碳存储装置1和采样瓶2中间，用于检测二氧化碳的通入流量，本实施例所使用的二氧化碳存储装置1、采样瓶2以及流量计3均为本领域常规装置。
本发明提供的保存方法能够快速高效的杀灭水体样本中的浮游动物且不影响藻类活力，提高从野外采集的藻种在带回实验室途中的质量和数量；此外，本发明提供的方法操作方法简便、对设备要求低，能够适应紧凑的野外采样工作，满足科研人员从野外采集藻种后其种类与初始情况基本保持一致并以较高的数量带回实验室分离的需要。另外，本发明提供的的方法步骤简单，所需材料成本低廉，具有普及和推广意义。
附图说明
图1为本发明一实施例提供的藻类活体保存方法的流程示意图；
图2为不同通气流量下保存三天后藻类的存活细胞数；
图3为不同时间点调节pH值的浮游动物的存活情况；
图4为不同通气量对藻种生存能力的影响示意图；
图5为不同时间添加原液后藻类的存活细胞数；
图6为补充原液后初始情况下D0组与第三天D0组的藻种比较情况；
图7为补充原液三天后D0组与对照组的藻种比较情况；
图8为本发明一实施例提供的保存装置的结构示意图；
图9为本发明又一实施例提供的保存装置的结构示意图；
图10为本发明实施例1提供的保存方法下保存时间和藻类存活细胞数的比较示意图；
图11本发明实施例1初始状态下藻种数量示意图；
图12为本发明实施例2提供的保存方法下保存时间和藻类存活细胞数的比较示意图；
图13本发明实施例2初始状态下藻种数量示意图。
附图标记说明：
1-二氧化碳存储装置；
2-采样瓶；
3-流量计。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、用25号浮游生物网采集上海市康健园公园水体1L；
2、测定初始pH为7.58，将水样分装至150mL锥形瓶中。
3、将二氧化碳气瓶，减压阀，流量计，气泡石依次连接好后，打开阀门将流量调整为30mL/min后将二氧化碳通入锥形瓶的水样中通气7min；
4、通气结束后将该锥形瓶放于光照良好处，30min后用pH为7.4的磷酸缓冲液调节pH至7.58附近；
5、将锥形瓶常敞口放置于光照良好处，每天摇动该锥形瓶2-5次，确保沉底藻细胞与上清混合均匀。
图10为本发明实施例1提供的保存方法下保存时间和藻类存活细胞数的比较示意图，图11本发明实施例1初始状态下藻种数量示意图，如图10-11所示，相比于对照组，实施例1提供的保存方法藻类的存活细胞数明显较高，并且图11所示的初始状态有而第三天30*7组未检测到活体的两种藻分别是鱼鳞藻(Mallomonas sp.)和多甲藻(Peridinium sp.)，在第三天30*7组多出来的是卵囊藻(Oocystis sp.)。
实施例2
1、用25号浮游生物网采集上海市康健园公园水体1L；
2、测定初始pH为7.58，后将水样分装至150mL锥形瓶中；
3、将二氧化碳气瓶，减压阀，流量计，气泡石依次连接好后，打开阀门将流量调整为60mL/min后将二氧化碳通入锥形瓶的水样中通气7min；
4、通气结束后将该锥形瓶放于光照良好处，30min后用pH为7.4的磷酸缓冲液调节pH至7.58附近；
5、将锥形瓶敞口放置于光照良好处，每天摇动该锥形瓶2-5次，确保沉底藻细胞与上清混合均匀。
图12为本发明实施例2提供的保存方法下保存时间和藻类存活细胞数的比较示意图，图13本发明实施例2初始状态下藻种数量示意图，如图12-13所示，相比于对照组，实施组的藻细胞数整体呈负增长趋势甚至比不做任何处理的对照组要低；根据图13可见该实施组的种类数也比对照组低，在三天60*7组较初始状态未检测到活体的藻分别为鱼鳞藻(Mallomonas sp.)，针杆藻(Synedra sp.)，弓形藻(Schroederia sp.)，小环藻(Cycotellasp.)，多甲藻(Peridinium sp)，角星鼓藻(Staurastrum sp.)。故而不推荐使用60mL/min的流量通气7分钟的方式进行水样处理。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种适用于野外采样期间藻类活体的保存方法，其特征在于，包括如下步骤：
收集包括所述藻类活体的水体样本；
测定所述水体样本的初始pH值；
将二氧化碳通入所述水体样本中；
调节pH值至所述初始pH值；
进行藻类活体的保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述藻类包括绿藻、硅藻、蓝藻、隐藻、裸藻中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将采集到的所述水体样本分装至采样瓶中。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于每150ml的所述水体样本，所述二氧化碳的通入流量为30mL/min，通入时间为7min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
基于每150ml的所述水体样本，在二氧化碳通入所述水体样本结束后，放置30min再调节pH值。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
向所述采样瓶中补充原液，所述原液由所述水体样本经0.2μm过滤后得到。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在调节pH值后向所述采样瓶中补充原液。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述藻类活体的保存过程中，每天摇动所述采样瓶2-5次，确保藻类活体与上清液混合均匀。
9.一种实施权利要求1-8任一项所述方法的装置，其特征在于，包括相互连通的二氧化碳存储装置和采样瓶，所述采样瓶用于收集所述藻类活体的水体样本，所述二氧化碳存储装置用于存储所述二氧化碳。
10.根据权利要求9所述的装置，其特征在于，所述装置还包括流量计，所述流量计的两端分别与所述二氧化碳存储装置、采样瓶连接，用于检测二氧化碳的通入流量。
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