CN113679824A - 具有抗氧化和抗炎功能的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有抗氧化和抗炎功能的组合物,属于制药领域。该组合物包含艾草精油和多肽或其复合物,所述多肽或其复合物为GHK、GHK‑Cu、GQPR中的一种或多种。本发明首次发现,艾草精油与GHK‑Cu联合使用具有协同增效的抗氧化和抗炎作用,艾草精油与GHK‑Cu联合使用在制备具有抗氧化和抗炎功能的日化用品和药物中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于制药领域,具体提供了一种具有抗氧化和抗炎功能的组合物。
背景技术
艾草,又名艾蒿,具有广泛的药用价值。《本草纲目》记载:艾草具有驱邪、净化的功效,还有温经活络、驱寒止痛、美容养颜、延缓衰老等功能。与普通的艾草不同,高原艾草具有独特的产品特色和优势,其经济指标和成分指标均居于全国领先甚至世界罕见的地位。2018年,从会东艾草中首次提取出了蓝色的精油。经专业的科研单位检测,会东的艾草精油药用物质含量居全国首位,共有109个有益化学成分,比国内其他艾草精油多出了33个化学成分。精油中桉叶油醇、萜品烯、冰片、萜品醇、丁香烯占比均远远高于国内其他艾草精油。而其独特的蓝色成分经初步鉴定为愈创木薁类,为全国独有,可用于烧烫伤、皲裂、冻疮、湿疹和皮炎等治疗及预防,具有极高的药用价值和商业价值。但是,会东艾草精油的抗氧化和抗炎效果仍然有待进一步提高。
GHK是一种含有三个氨基酸的活性多肽,其氨基酸序列是Gly-His-Lys。GHK作为载体肽,主要功能是结合和运输铜离子,同时作为信号肽,还可以促进胶原蛋白的聚集。有大量研究表明,GHK和铜离子形成的GHK-Cu复合物在伤口愈合方面具有明显的促进作用,能够提高机体接受移植皮肤的接受能力,还能抑制炎症反应。同时,GHK-Cu在较低的浓度范围内就可以激活胶原、硫酸皮肤素、硫酸几丁质和小分子蛋白、糖蛋白等的合成。另一方面,GHK-Cu还可以作为细胞粘附分子,帮助细胞粘附到细胞外基质中,帮助细胞迁移、增殖、分化和修复皮肤细胞。近年来有研究认为,含GHK-Cu的护肤产品具有收紧松弛皮肤,提高皮肤弹性,减少色斑、细纹,增加角质细胞增殖等功能,这些功能大大促进了其在护肤品领域的应用。但是,以GHK-Cu作为唯一活性成分的护肤产品的抗炎效果还有待进一步提高。
目前还未见将艾草精油与GHK-Cu联合使用来制备具有抗氧化和抗炎功能的药物或日化用品的报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种具有抗氧化和抗炎功能的组合物;本发明的另一个目的在于提供艾草精油与多肽或其复合物联合使用在制备具有抗氧化和抗炎功能的产品中的用途。
本发明提供了艾草精油和多肽或其复合物在制备具有抗氧化和/或抗炎作用的联合用制剂中的用途,所述多肽或其复合物为GHK、GHK-Cu、GQPR中的一种或多种。
进一步地,所述多肽或其复合物为GHK-Cu;所述艾草精油和GHK-Cu的质量比为(0.01~100):1,优选为(0.1~10):1,更优选为(0.8~1.6):1。
本发明还提供了一种组合物,它包含艾草精油和多肽或其复合物,所述多肽或其复合物为GHK、GHK-Cu、GQPR中的一种或多种,所述艾草精油和多肽或其复合物的质量比为(0.01~100):1。
进一步地,所述多肽或其复合物为GHK-Cu;所述艾草精油和GHK-Cu的质量比为(0.1~10):1。
进一步地,所述艾草精油和GHK-Cu的质量比为(0.8~1.6):1,优选为0.8:1、1:1或1.6:1。
进一步地,它是以艾草精油和多肽或其复合物为活性成分,加上药学领域或日化用品领域常用的辅料制得的制剂。
进一步地,所述制剂为外用制剂。
进一步地,所述药学领域或日化用品领域常用的辅料选自增稠剂、保湿剂、乳化剂、中和剂中的一种或多种;
优选地,所述药学领域或日化用品领域常用的辅料为卡波姆940、甘油、丁二醇、三乙醇胺中的一种或多种。
本发明还提供了一种药物或日化用品,它是由上述的组合物制得的。
本发明还提供了上述的组合物在制备抗氧化和/或抗炎的药物或日化用品中的用途。
进一步地,所述药物或日化用品能够清除DPPH;和/或,所述药物或日化用品能够抑制细胞生成NO;和/或,所述药物或日化用品能够降低细胞内ROS含量;和/或,所述药物或日化用品能够降低炎症因子含量。
本发明中,日化用品包括洗发水、沐浴露、护肤品、化妆品等。
本发明中,艾草精油指以艾草为原料提取得到的精油。会东艾草指生长于四川省会东县的艾草。
本发明中,GHK是一种含有三个氨基酸的活性多肽,其氨基酸序列是Gly-His-Lys。
GHK-Cu(Copper peptide,CAS号:89030-95-5)是GHK和铜离子形成的复合物,其中GHK:Cu=1:1(摩尔比)。
GQPR是一种由四个氨基酸组成的活性多肽,其氨基酸序列为Gly-Gln-Pro-Arg(SEQ ID NO.1)。它是免疫球蛋白IgG中的活性片段,能显著降低细胞中炎症因子IL-6的水平。有研究表明,GQPR可以延缓和抑制过量白介素的生成,从而抑制一些不必要的炎症反应和糖基化损伤。在照射紫外线后受损的细胞中,这种抑制白介素产生的效应更加明显,得益于其显著的抑制炎症因子的作用,GQPR能改善淋巴循环、促进胶原蛋白生成,阻止弹力蛋白流失,还能提高皮肤的紧致和弹力,减轻皱纹的加深,使皮肤恢复活力状态。
本发明首次发现,艾草精油与GHK-Cu联合使用具有协同增效的抗氧化和抗炎作用,具体表现为:
1.本发明由艾草精油与GHK-Cu联合使用组成的组合物在清除DPPH时发挥了协同增效的作用,具有协同增效的抗氧化能力;
2.本发明由艾草精油与GHK-Cu联合使用组成的组合物对抑制巨噬细胞内NO发挥了协同增效的作用;
3.本发明由艾草精油与GHK-Cu联合使用组成的组合物对降低巨噬细胞内ROS含量发挥了协同增效的作用;
4.本发明由艾草精油与GHK-Cu联合使用组成的组合物对降低巨噬细胞内炎症因子含量发挥了协同增效的作用。
因此,艾草精油与GHK-Cu联合使用在制备具有抗氧化和抗炎功能的日化用品和药物中具有广阔的应用前景。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为DPPH清除率测试结果。
图2为细胞培养上清中TNF-α浓度测试结果。
图3为细胞培养上清中IL-6浓度测试结果。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品,通过购买市售产品所得。
本发明实施例使用的GHK-Cu为市售产品,购买于上海源叶生物科技有限公司。GHK-Cu(Copper peptide,CAS号:89030-95-5)是GHK和铜离子形成的复合物,其中GHK:Cu=1:1(摩尔比)。
本发明实施例使用的艾草精油来源于会东县艾王生物科技有限公司,符合中华人民共和国轻工行业标准QB/T 4237-2011:《艾蒿(精)油》。
实施例1、复合艾草精华液1的制备
将艾草精油和GHK-Cu加入纯化水中,混合均匀,得到复合艾草精华液1。复合艾草精华液1中,艾草精油的浓度为0.16wt.%,GHK-Cu的浓度为0.10wt.%。
实施例2、复合艾草精华液2的制备
将艾草精油和GHK-Cu加入纯化水中,混合均匀,得到复合艾草精华液2。复合艾草精华液2中,艾草精油的浓度为0.08wt.%,GHK-Cu的浓度为0.08wt.%。
实施例3、复合艾草精华液3的制备
将艾草精油和GHK-Cu加入纯化水中,混合均匀,得到复合艾草精华液3。复合艾草精华液3中,艾草精油的浓度为0.04wt.%,GHK-Cu的浓度为0.05wt.%。
实施例4、复合艾草精华液4的制备
配方:艾草精油0.16wt.%,GHK-Cu 0.10wt.%,卡波姆940 0.25wt.%,甘油5wt.%,丁二醇5wt.%,三乙醇胺0.5wt.%,其余为纯化水。
制备方法:
(1)将卡波姆940缓慢加入部分纯化水中,无需搅拌浸泡过夜,再加入三乙醇胺,调节pH值至7,得到A相;
(2)将甘油、1,3-丁二醇和部分超纯水按照一定比例混合,得到B相;
(3)将艾草精油、GHK-Cu和部分超纯水按照一定比例混合,得到C相;
(4)按照1:1的重量比预先混合A相和B相,缓慢搅拌均匀后再按2:1的重量比加入C相,搅拌均匀后得到复合艾草精华液4。
实施例5、复合艾草精华液5的制备
配方:艾草精油0.08wt.%,GHK-Cu 0.08wt.%,卡波姆940 0.25wt.%,甘油5wt.%,丁二醇5wt.%,三乙醇胺0.5wt.%,其余为纯化水。
制备方法:同实施例4。
实施例6、复合艾草精华液6的制备
配方:艾草精油0.04wt.%,GHK-Cu 0.05wt.%,卡波姆940 0.25wt.%,甘油5wt.%,丁二醇5wt.%,三乙醇胺0.5wt.%,其余为纯化水。
制备方法:同实施例4。
以下为对照样品的制备方法。
对比例1
将艾草精油加入纯化水中,混合均匀,得到对比例1样品。对比例1样品中,艾草精油的浓度为0.16wt.%。
对比例2
将GHK-Cu加入纯化水中,混合均匀,得到对比例2样品。对比例2样品中,GHK-Cu的浓度为0.10wt.%。
对比例3
将艾草精油加入纯化水中,混合均匀,得到对比例3样品。对比例3样品中,艾草精油的浓度为0.08wt.%。
对比例4
将GHK-Cu加入纯化水中,混合均匀,得到对比例4样品。对比例4样品中,GHK-Cu的浓度为0.08wt.%。
对比例5
将艾草精油加入纯化水中,混合均匀,得到对比例5样品。对比例5样品中,艾草精油的浓度为0.04wt.%。
对比例6
将GHK-Cu加入纯化水中,混合均匀,得到对比例6样品。对比例6样品中,GHK-Cu的浓度为0.05wt.%。
对比例7
纯化水。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、DPPH自由基清除实验
1实验原理
作为一种稳定的自由基,1,1二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)能在有机溶剂中稳定存在,其醇溶液呈紫色,且需低温避光储藏。DPPH具有单一电子,能接受一个电子或氢离子,在波长517nm下具有最大吸收值。有自由基清除剂存在时,DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅,在最大光吸收波长处的吸光值下降,且下降程度呈线性关系,吸光值的下降表明抗氧化性的增加。自由基清除剂的抗氧化能力用DPPH清除率来表示,DPPH清除率越大,抗氧化性越强。
2实验步骤
(1)将80μL 0.5mM DPPH和40μL待测样品混合,加入乙醇至总体积为400μL,作为待测液;其中待测样品为实施例1-3或对比例1-7的样品;
将80μL 0.5mM DPPH和乙醇混合至总体积为400μL,作为对照液;
(2)待测液避光反应30min,检测待测液和对照液在517nm的吸光值,以乙醇在517nm的吸光值为空白,得到扣除空白的待测液和对照液的吸光值,分别记为As和Ao;
(3)根据公式I(%)=100%×(Ao-As)/Ao,计算得到待测样品的DPPH清除率。
3实验结果
结果如图1所示,与不含艾草精油和GHK-Cu的对比例7相比,实施例1-3制备的复合艾草精华液均能有效清除DPPH,具有明显的抗氧化能力。具体表现为:实施例1、2、3制备的复合艾草精华液对DPPH的清除率分别为56.14%、41.95%和29.59%,均显著高于对比例7的11.90%。
表1对DPPH的清除率提高效果比较
测试样品 | 对DPPH的清除率提高效果 |
实施例1 | 371.79% |
对比例1 | 190.15% |
对比例2 | 138.70% |
实施例2 | 252.48% |
对比例3 | 109.89% |
对比例4 | 102.77% |
实施例3 | 148.63% |
对比例5 | 62% |
对比例6 | 58.45% |
表1中,对DPPH的清除率提高效果=(测试样品对DPPH的清除率-对比例7样品对DPPH的清除率)/对比例7样品对DPPH的清除率。
另外,通过计算各测试样品对DPPH的清除率提高效果发现(参见表1),实施例1制备的复合艾草精华液对DPPH的清除率提高效果为371.79%,对比例1样品对DPPH的清除率提高效果为190.15%,对比例2样品对DPPH的清除率提高效果为138.70%。可以看出,实施例1制备的复合艾草精华液对DPPH的清除率的提高效果优于对比例1和对比例2的提高效果之和。也就是说,本发明实施例1制备的复合艾草精华液对DPPH的清除效果优于相同剂量下的艾草精油和GHK-Cu单独使用的效果之和。因此,本发明实施例1制备的复合艾草精华液中的艾草精油和GHK-Cu在清除DPPH时发挥了协同增效的作用。
同样的,实施例2制备的复合艾草精华液对DPPH的清除率的提高效果优于对比例3和对比例4的提高效果之和;实施例3制备的复合艾草精华液对DPPH的清除率的提高效果优于对比例5和对比例6的提高效果之和。本发明实施例2和实施例3制备的复合艾草精华液中的艾草精油和GHK-Cu在清除DPPH时也发挥了协同增效的作用。
上述实验结果表明,本发明实施例1-3的复合艾草精华液中,艾草精油和GHK-Cu在清除DPPH时发挥了协同增效的作用,具有协同增效的抗氧化能力。
实验例2、NO抑制实验
1实验原理
一氧化氮(NO)在生物体内作为一种反应性极强的自由基,兼有第二信使和神经递质的作用,同时又是一种效应分子,在体内具有广泛的生理作用,如松弛血管平滑肌,抑制血小板聚集,介导细胞毒效应和免疫调节等。NO本身半衰期极短,血液中的NO主要由血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、血小板、巨噬细胞等产生以亚硝酸盐及硝酸盐的形式存在,通过测定其浓度可以间接测定NO浓度。
NO在体内或水溶液中极易氧化为NO2,在酸性条件下,NO与重氮盐磺胺发生重氮反应,并生成重氮化合物,后者进一步与萘基乙烯基二胺发生耦合反应,该反应生成的产物浓度与NO浓度具有线性关系,在540nm处有最大吸收峰。
2实验步骤
(1)分小鼠巨噬细胞Raw264.7至96孔细胞板,5×104个细胞/孔。使用含10%FBS,不含酚红的DMEM培养基,孵育16h;
(2)将待测样品加入培养基中(样品:培养基=1:9),反应30min,再加入脂多糖LPS(1μg/ml)继续孵育16h;其中,待测样品为实施例3、对比例5、6、7的样品;
(3)取100μl Griess试剂与50μl步骤(2)得到的混合培养基,混合后避光反应10min,在540nm处检测吸光值,并通过亚硝酸盐标准曲线计算得到各测试样品组的亚硝酸盐浓度(具体见试剂盒使用步骤);
(4)利用以下公式计算亚硝酸盐的下降比例:下降比例(%)=(对比例7组亚硝酸盐浓度–测试样品组的亚硝酸盐浓度)/对比例7组亚硝酸盐浓度。
3实验结果
表2细胞内亚硝酸盐浓度(μM)
结果如表2所示,与不含艾草精油和GHK-Cu的对比例7相比,实施例3制备的复合艾草精华液能明显降低细胞内NO的含量。具体表现为:施用实施例3制备的复合艾草精华液后,细胞内亚硝酸盐的浓度为40.03μM;而施用对比例7样品后,细胞内亚硝酸盐的浓度为58.18μM。
另外,通过计算亚硝酸盐的下降比例发现,施用实施例3的复合艾草精华液后,细胞内亚硝酸浓度下降比例高达31.20%,明显高于对比例5(14.75%)和对比例6(8.44%)的下降比例之和。也就是说,本发明实施例3制备的复合艾草精华液对降低细胞内NO的效果优于相同剂量下的艾草精油和GHK-Cu单独使用的效果之和。因此,本发明实施例3制备的复合艾草精华液中的艾草精油和GHK-Cu对抑制巨噬细胞内NO发挥了协同增效的作用。
实验例3、细胞内ROS含量检测实验
1实验原理
活性氧(ROS)包括超氧自由基、过氧化氢及其下游产物过氧化物和羟化物等,活性氧参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。
2',7'-二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)本身没有荧光,可以自由穿过细胞膜,进入细胞后,可以被细胞内的酯酶水解生成2',7'-二氯二氢荧光素(DCFH)。而DCFH不能通透细胞膜,从而使探针很容易被标记到细胞内。在活性氧存在的条件下,DCFH被氧化生成荧光物质2',7'-二氯荧光素(DCF),绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比,检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
2实验步骤
(1)分小鼠巨噬细胞Raw264.7至96孔细胞板,5×104个细胞/孔;
(2)将待测样品加入培养基中(样品:培养基=1:9),反应30min,再加入LPS(1μg/ml)继续孵育16h;其中,待测样品为实施例3、对比例5、6、7的样品;
(3)孵育结束后,每孔中加入50μM H2DCFDA(DCFH-DA)试剂,混合后避光反应1h,在荧光酶标仪上设置激发波长485nm,发射波长535nm,测量各测试样品组细胞内的荧光强度(具体见试剂盒使用步骤);
(4)利用以下公式计算荧光强度的下降比例:下降比例(%)=(对比例7组荧光信号强度-测试样品组荧光信号强度)/对比例7组荧光信号强度。
3实验结果
表3细胞内荧光强度
结果如表3所示,与不含艾草精油和GHK-Cu的对比例7相比,实施例3制备的复合艾草精华液能显著降低细胞内ROS的含量。具体表现为:施用实施例3制备的复合艾草精华液后,细胞的荧光强度为2879.25;而施用对比例7样品后,细胞的荧光强度为4488。
另外,通过计算细胞内荧光强度的下降比例发现,施用实施例3的复合艾草精华液后,细胞内荧光强度下降比例高达35.85%,明显高于对比例5(19.15%)和对比例6(10.90%)的下降比例之和。也就是说,本发明实施例3制备的复合艾草精华液对降低细胞内ROS的效果优于相同剂量下的艾草精油和GHK-Cu单独使用的效果之和。因此,本发明实施例3制备的复合艾草精华液中的艾草精油和GHK-Cu对降低巨噬细胞内ROS含量发挥了协同增效的作用。
实验例4、细胞内TNF-α和IL-6含量检测实验
1实验原理
TNF-α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质,能激活中性粒细胞和淋巴细胞,使血管内皮细胞通透性增加,调节其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放。IL-6能诱导B细胞分化和产生抗体,并诱导T细胞活化增殖、分化,参与机体的免疫应答,是炎症反应的促发剂。
2实验步骤
(1)分小鼠巨噬细胞Raw264.7至96孔细胞板,2×104个细胞/孔。使用含10%FBS(胎牛血清),100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素的DMEM培养基;
(2)将待测样品加入到培养基(样品:培养基=1:9)中,混匀后加至各细胞孔中,每孔1mL,3个平行;其中,待测样品为实施例3、对比例5、6、7的样品;
(3)加步骤(2)制得的混合物2小时后,加入LPS(脂多糖,1μg/ml)继续孵育48小时,吸取培养基上清,用于IL-6和TNF-α浓度测定;
(4)使用欣博盛生物科技有限公司生产的小鼠IL-6和TNF-αELISA试剂盒,按照说明书的步骤,进行IL-6和TNF-α浓度测定(具体见试剂盒使用步骤);
(5)利用以下公式分别计算TNF-α和IL-6浓度减少比例:减少比例(%)=(对比例7组浓度-测试样品组浓度)/对比例7组浓度。
3实验结果
表4 TNF-α和IL-6浓度
结果如图2和图3所示,与不含艾草精油和GHK-Cu的对比例7相比,实施例3制备的复合艾草精华液能有效地降低IL-6和TNF-α浓度,抑制炎症反应。
另外,通过计算TNF-α和IL-6浓度减少比例发现,施用实施例3的复合艾草精华液后,TNF-α浓度减少比例高达37.23%,明显高于对比例5(17.32%)和对比例6(12.99%)的减少比例之和;施用实施例3的复合艾草精华液后,IL-6浓度减少比例高达46.79%,明显高于对比例5(15.33%)和对比例6(23.70%)的减少比例之和。也就是说,本发明实施例3制备的复合艾草精华液减少细胞内炎症因子含量的效果优于相同剂量下的艾草精油和GHK-Cu单独使用的效果之和。因此,本发明实施例3制备的复合艾草精华液中的艾草精油和GHK-Cu对降低巨噬细胞内炎症因子含量发挥了协同增效的作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都英普博集生物科技有限公司
<120> GYKH1336-2021P0113796CC
<130> 具有抗氧化和抗炎功能的组合物
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Gln Pro Arg
1
Claims (10)
1.艾草精油和多肽或其复合物在制备具有抗氧化和/或抗炎作用的联合用制剂中的用途,所述多肽或其复合物为GHK、GHK-Cu、GQPR中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述多肽或其复合物为GHK-Cu;所述艾草精油和GHK-Cu的质量比为(0.01~100):1,优选为(0.1~10):1,更优选为(0.8~1.6):1。
3.一种组合物,其特征在于:它包含艾草精油和多肽或其复合物,所述多肽或其复合物为GHK、GHK-Cu、GQPR中的一种或多种,所述艾草精油和多肽或其复合物的质量比为(0.01~100):1。
4.根据权利要求3所述的组合物,其特征在于:所述多肽或其复合物为GHK-Cu;所述艾草精油和GHK-Cu的质量比为(0.1~10):1。
5.根据权利要求4所述的组合物,其特征在于:所述艾草精油和GHK-Cu的质量比为(0.8~1.6):1,优选为0.8:1、1:1或1.6:1。
6.根据权利要求3~5任一项所述的组合物,其特征在于:它是以艾草精油和多肽或其复合物为活性成分,加上药学领域或日化用品领域常用的辅料制得的制剂。
7.根据权利要求6所述的组合物,其特征在于:所述药学领域或日化用品领域常用的辅料选自增稠剂、保湿剂、乳化剂、中和剂中的一种或多种;
优选地,所述药学领域或日化用品领域常用的辅料为卡波姆940、甘油、丁二醇、三乙醇胺中的一种或多种。
8.一种药物或日化用品,其特征在于:它是由权利要求3~7任一项所述的组合物制得的。
9.权利要求3~7任一项所述的组合物在制备抗氧化和/或抗炎的药物或日化用品中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途,其特征在于:所述药物或日化用品能够清除DPPH;和/或,所述药物或日化用品能够抑制细胞生成NO;和/或,所述药物或日化用品能够降低细胞内ROS含量;和/或,所述药物或日化用品能够降低炎症因子含量。
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