CN107519217B - 一种含阿胶水解物和银杏叶提取物的高抗氧化抗癌组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种含阿胶水解物和银杏叶提取物的高抗氧化抗癌组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种含阿胶水解物和银杏叶提取物的高抗氧化抗癌组合物及其制备方法和应用，含有阿胶水解物和银杏叶提取物。实验证明，该组合物含有的阿胶水解物和银杏叶提取物具有协同抗氧化作用，可作为治疗由自由基引发的疾病，尤其癌症。

Description

一种含阿胶水解物和银杏叶提取物的高抗氧化抗癌组合物及 其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及食品及医药技术领域。具体及一种含阿胶水解物和银杏叶提取物的高抗氧化抗癌组合物及其制备方法和应用。
背景技术
现代研究表明，癌症是引起人类死亡的重大原因之一。自由基说理论表明体内过量的自由基会引发一系列疾病，尤其癌症。因此抗氧化剂被提议成为预防和治疗癌症的最佳选择。然而BHT、TBHQ等化学合成抗氧化剂对人体有一定的毒副作用。因此人类将目光转向了来自自然界的天然抗氧化剂。
胶原蛋白水解物因为抗氧化性高、无毒、成本低以及生物相容性好等优点逐渐吸引了人类的关注。阿胶水解物是从阿胶中水解得到的小分子物质，具有抗氧化活性。现代药理研究表明阿胶水解物具有补血止血、抑瘤增效、提高免疫力、抗疲劳和耐缺氧等作用。
银杏叶提取物是近年来国内外研究的热点，具有很高的抗氧化和抗癌活性。广泛应用于药物、保健品、食品添加剂、功能性饮料、化妆品等领域。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种含阿胶水解物和银杏叶提取物的具有高抗氧化抗癌组合物及其制备方法和应用，阿胶水解物与银杏叶提取物不同比例混合后具有协同作用，有效地提高阿胶水解物的抗氧化抗癌活性，可以用于预防和治疗与氧化应激有关的疾病，尤其癌症。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种含阿胶水解物和银杏叶提取物的高抗氧化抗癌组合物，含有阿胶水解物和银杏叶提取物，其中阿胶水解物与银杏叶提取物质量比为1-20：1-20。
在本发明的优选的实施方式中，以质量计，阿胶水解物：银杏叶提取物=20：1。
在本发明的优选的实施方式中，以质量计，阿胶水解物：银杏叶提取物=20：2。
在本发明的优选的实施方式中，以质量计，阿胶水解物：银杏叶提取物=20：4。
本发明还保护所述组合物的制备方法，具体为：
（1）阿胶水解物经碱性蛋白酶酶解，酶解时间3h，酶解温度50℃，pH 8.0，酶:底物=0.4（w/w）；
（2）按照配比将阿胶水解物与银杏叶提取物进行混合，制备所述高抗氧化抗癌组合物。
本发明还保护所述组合物在抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7生长中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明所述的阿胶水解物与银杏叶提取物的组合物有很强的抗氧化能力，包括对DPPH、ABTS以及OH自由基的清除能力。申请人意外的发现，本发明的制备方法所获得的组合物产品，阿胶水解物与银杏叶提取物不同比例混合后，通过实验证明，阿胶水解物和银杏叶提取物之间存在协同抗氧化作用，提高了阿胶水解物的抗氧化抗癌活性，因此本发明可以用于预防和治疗由自由基引发的疾病以及与氧化应激有关的疾病，尤其癌症，更具体为可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7生长。
附图说明
下面结合附图进行进一步说明：
图1为阿胶水解物对MCF-7和MDA-MB-231癌细胞的抑制能力示意图；
图2为组合物3对MCF-7和MDA-MB-231癌细胞的抑制能力示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明所包含范围不限于此。
实施例一
制备阿胶水解物
（1）采用碱性蛋白酶酶解阿胶，pH 8.0，酶：底物=0.4（w/w），酶解时间3h，酶解温度50℃，酶解结束后沸水浴灭酶15min，然后收集上清液，冷冻干燥。
（2）制备阿胶水解物与银杏叶提取物的抗氧化剂组合物
组合物1：阿胶水解物与银杏叶提取物浓度之比为20：1；
组合物2：阿胶水解物与银杏叶提取物浓度之比为20：2；
组合物3：阿胶水解物与银杏叶提取物浓度之比为20：4。
实施例二
抗氧化能力测定的方法如下：
（a）清除DPPH自由基能力测定
精密称取一定质量 DPPH 于棕色容量瓶中，配制浓度为2×10-4mol·L-1的DPPH溶液。在 96 孔板中分别加入：100µL待测溶液和100µL DPPH溶液（样品组Ax），100µL待测溶液和100µL乙醇溶液（空白组Ay），100µL的蒸馏水溶液和100µL DPPH 溶液（对照组Az）。点样完毕后，室温放置 1h，然后用酶标仪测定其在517 nm 下的吸光值，重复测量3次，取平均值。
（b）清除ABTS自由基能力测定
将7mmol/LABTS溶液与2.45mmol/LK2S2O8溶液按1:1混合，室温反应过夜（12h-16h）制成 ABTS•+储备液。使用前用蒸馏水稀释成 ABTS•+反应液，要求在 734 nm 下的吸光值为 0.70±0.02。分别吸取10μL不同浓度梯度的样品液于96孔板中，然后再加入190μL预热至37℃的ABTS•+反应液。室温下反应10min，用酶标仪于734nm下测定其吸光度并得到其IC50值。重复测量3次，取平均值。
（c）清除OH自由基能力测定
取1.0mLl,10-菲啰啉(1.865mmol/L)与2.0mL样品液于具塞试管中混合，加入1.0mLFeS04·7H20 (1.865mmol/L)，最后加入1.0mLH2O2溶液(0.03%，v/v)启动反应，将试管置于37°C水浴中反应60min，于536nm处测量反应混合液吸光度，并以蒸馏水代替样品液做阴性对照，以蒸馏水代替过氧化氢作为空白对照。样品对自由基的清除活性按式计算：
OH自由基清除率(%)=[(As-An)/(Ab-An)] ×100%
式中：As为样品吸光度，An为阴性对照吸光度，Ab为空白对照吸光度。
水解阿胶与银杏叶提取物抗氧化测定结果如表1所示
表1 阿胶水解物和银杏叶提取物抗氧化性测定（Mean±S.D.,n=3）
Figure 109158DEST_PATH_IMAGE001
实验数据表明，阿胶水解物与银杏叶提取物均具有不同程度的抗氧化作用。银杏叶提取物抗氧化作用明显高于阿胶水解物。
实施例三
运用等高线图解分析法对其抗氧化协同增效作用进行评价，通常包括以下几个步骤：
（a）测定阿胶水解物和银杏叶提取物不同比例混合后在抗氧化实验中的IC50mix值，通过以下公式计算不同混合比例的理论IC50add。比较IC50mix和IC50add值，若IC50mix值小于IC50add值，表示相互作用为协同作用。
Figure 698402DEST_PATH_IMAGE002
式中：R为A、B两种抗氧化剂单独应用时的效价比，即R=IC50A/IC50B；P1为抗氧化剂A在复配组中所占的比例；P2为抗氧化剂B在复配组中所占的比例，P2=1－P1。
（b）根据下式进一步计算相互作用指数λ，可以用来评价协同、相加或拮抗作用的程度。
Figure 884664DEST_PATH_IMAGE003
DPPH自由基为例，若λ＝１，表明二者之间为相加作用；λ＞１，表明为拮抗作用，且λ越大拮抗作用越强；λ ＜１，表明是协同作用，且λ越小协同作用越强。
表2阿胶水解物和银杏叶提取物协同作用分析（Mean±S.D.,n=3）
Figure 388195DEST_PATH_IMAGE004
实验数据表明，将阿胶水解物和银杏叶提取物混合物的实验测量值和理论值进行比较分析。阿胶水解物与银杏叶提取物在DPPH、ABTS和OH三种抗氧化体系中表现出了协同作用，并且在5:1时协同作用最强，相互作用指数γ分别为0.739，0.741和0.788。值得注意的是，在三种抗氧化体系中，当银杏叶提取物所占的比例增加时，二者的协同作用越强，说明银杏叶提取物在协同作用中起到了主导作用。
实施例四
抗癌能力测定如下：
本发明以人肿瘤细胞株为模型，采用cell counting kit-8(CCK-8)检测体外抗肿瘤活性。
(a) 建立体外癌细胞模型：
取人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231细胞株，采用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基，在37℃，5% CO2条件下常规培养。
(b) 阿胶水解物和银杏叶提取物组合物对癌细胞增殖的抑制作用：
分别取对数生长期的MCF-7和MDA-MB-231癌细胞，正常小鼠纤维细胞L929做对照，细胞浓度为104/孔，接种于96孔板，每孔200μL；细胞培养24h待其贴壁后吸出培养基，然后加入含有样品的培养基100μL，每个浓度5个复孔，然后将其放入CO2培养箱下培养72h，酶标仪450nm波长下检测各孔吸收度值，按下列公式计算抑制率：
Figure 546775DEST_PATH_IMAGE005
。
实施例五
取阿胶水解物浓度0、0.25、0.5、1、2、4mg/mL；组合物3浓度0、0.15、0.3、0.6、1.2、2.4mg/mL；按实施例四操作步骤分别对阿胶水解物及其组合物3对癌细胞的抑制作用进行评价并计算其半抑制浓度IC50值。分别得图1：阿胶水解物对癌细胞抑制作用示意图。图2：组合3对癌细胞抑制作用示意图。
从图1、图2得出，阿胶水解物对MDA-MB-231和MCF-7癌细胞均有抑制作用且IC50值分别为23.10±1.63 mg/mL 和1.60±0.03 mg/mL。阿胶水解物和银杏叶提取物混合后，组合3对MDA-MB-231和MCF-7癌细胞的IC50值分别提高到4.32±0.12mg/mL和0.39±0.01mg/mL。另外，图1和图2中可以分别看出阿胶水解物和组合物3对正常小鼠表皮纤维细胞L929没有毒性。说明银杏叶提取物和阿胶水解物的组合物对正常小鼠纤维细胞没有伤害作用，但对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7具有抑制作用，且银杏叶提取物可以明显地提高阿胶水解物的抗癌活性。
尽管通过参照本发明的优选实施例，已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (2)

1.一种含阿胶水解物和银杏叶提取物的高抗氧化抗癌组合物，其特征在于，由阿胶水解物和银杏叶提取物制成，其中阿胶水解物与银杏叶提取物质量比为20：1-4；其制备方法为：
（1）阿胶经碱性蛋白酶酶解，酶解时间3h，酶解温度50℃，pH 8.0，酶：底物的质量比为0.4；
（2）按照配比将阿胶水解物与银杏叶提取物进行混合，制备所述高抗氧化抗癌组合物。
2.权利要求1所述的高抗氧化抗癌组合物在制备抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7生长的组合物的应用。
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