CN113671072B - 大体积进样-变温聚焦超临界流体色谱质谱分析系统及分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大体积进样‑变温聚焦超临界流体色谱质谱分析系统，包括改性剂泵、二氧化碳泵、混合器、自动进样器、用于切换流路的六通阀、定量环、柱温箱、微量预热器、色谱柱、补充泵、三通连接器、背压调节器、质谱检测器以及用于连接各部件的连接管路；所述混合器、微量预热器和色谱柱均设置于所述柱温箱内部。本发明还涉及用所述系统进行的分析方法，包括如下步骤：(1)变温；(2)自动进样器载样；(3)大体积进样‑柱头聚焦；(4)色谱分离及质谱分析。本发明解决了超临界流体色谱中的溶剂不兼容问题，从而避免因大体积进样引起的色谱峰展宽问题，改善化合物的色谱峰形，提高分析的灵敏度。

Description

大体积进样-变温聚焦超临界流体色谱质谱分析系统及分析 方法

技术领域

本发明属于分析化学色谱分析方法领域，具体涉及一种大体积进样-变温聚焦超临界流体色谱质谱分析系统及分析方法。

背景技术

超临界流体色谱(supercritical fluid chromatography,SFC)作为一种分析速度快、准确度高灵敏度好的高通量色谱分离技术，近年来已广泛应用于手性对映体分离、生物代谢物的检测，食品分析，天然产物有效成分快速定量，脂质组学和代谢组学研究等领域。超临界流体色谱中最常用的流动相为超临界二氧化碳。与其他超临界流体相比，超临界二氧化碳的操作条件相对简单(7.39MPa，31.1℃)。和液相色谱方法相比，超临界二氧化碳的性质介于气体和液体之间，粘度低，扩散速率高，可获得更好的色谱峰形。同时，SFC分析过程中溶剂残留少，样品的回收简单，是一种绿色的色谱分离技术。

为了提高低丰度化合物的检测，SFC分析中可以采用增加进样量的方法来提高化合物的响应。目前，已报导的方法包括结合额外的在线样品前处理方法或执行多次小体积进样。由于存在溶剂效应，单次大体积进样会引起明显的色谱峰展宽甚至变形等问题，这在SFC分析中更加明显。因为超临界流体色谱中，样品溶剂常为甲醇或乙醇等极性较大溶剂，而超临界色谱分析中的起始分析梯度通常为较低比例的甲醇或乙醇等改性剂。起始梯度的流动相含有较高比例的超临界二氧化碳，与样品溶剂的性质差异较大。当样品进入色谱柱头时，由于存在溶剂不兼容的问题，目标化合物容易在色谱柱头扩散，引起色谱峰展宽。另外，进样时样品溶剂破环改性剂在固定相表面的吸附平衡以及粘性指进等因素均会引起色谱峰展宽甚至峰变形。已有的解决SFC峰展宽问题的方法主要是通过采用弱溶剂稀释或对自动进样器进行改造，目前还没有基于变温聚焦的方法来解决SFC中大体积进样引起的色谱峰展宽的报导。

发明内容

基于此，本发明提供一种大体积进样-变温聚焦超临界流体色谱质谱分析系统，拟解决超临界流体色谱中的溶剂不兼容问题，从而避免因大体积进样引起的色谱峰展宽问题，改善化合物的色谱峰形，提高分析的灵敏度。

本发明采取的技术方案如下：

一种大体积进样-变温聚焦超临界流体色谱质谱分析系统，包括改性剂泵、二氧化碳泵、混合器、自动进样器、用于切换流路的六通阀、定量环、柱温箱、微量预热器、色谱柱、补充泵、三通连接器、背压调节器、质谱检测器以及用于连接各部件的连接管路；

所述六通阀和定量环均设置于所述自动进样器内部，所述六通阀按顺时针顺序依次设置有六个接口，所述定量环的两个端口分别接入所述六通阀的第二接口和第五接口；

所述六通阀可切换阀位至载样模式和进样模式，所述载样模式为：第一接口连接第六接口，第二接口连接第三接口，第四接口连接第五接口；所述进样模式为：第一接口连接第二接口，第三接口连接第四接口，第五接口连接第六接口；

所述混合器、微量预热器和色谱柱均设置于所述柱温箱内部；所述混合器具有第一入口、第二入口和出口，所述混合器的出口连接到所述六通阀的第一接口；所述微量预热器的入口与所述六通阀的第六接口连接，其出口连接到所述色谱柱的入口；所述色谱柱的出口连接到所述三通连接器的第一接口；

所述改性剂泵的出口连接到所述混合器的第一入口，所述二氧化碳泵的出口连接到所述混合器的第二入口；所述补充泵的出口连接到所述三通连接器的第二接口；所述背压调节器的入口连接到所述三通连接器的第三接口，其出口连接到所述质谱检测器的入口。

本发明所述系统设置有柱温箱，并将混合器、微量预热器和色谱柱设置于柱温箱内，同时通过特定的流路布置设计，实现对进样前和进样后的组分进行预热，使得变温聚焦以及进样分析时进入色谱柱的组分与色谱柱设定的温度保持一致，保证变温聚焦效果，为基于变温聚焦的方法解决SFC中大体积进样引起的色谱峰展宽问题提供了硬件装置。

进一步地，所述微量预热器的入口通过特定连接管路连接到所述六通阀的第六接口；所述特定连接管路的内径为0.3mm，长度为1000mm，且其中收纳于所述柱温箱内部的长度不小于700mm。此设置有利于对来自自动进样器的混合溶剂充分预加热。

进一步地，所述定量环的体积不小于20μL，保证大体积进样效果。

进一步地，所述混合器的体积为180μL，确保分析时能够对流动相进行预加热，提供足量且温度与色谱柱柱温一致的流动相用于定量环中的大体积样品进样。

进一步地，所述柱温箱为模块加热式柱温箱，温度设置范围为4-90℃，温度增量为0.1℃，可实现不小于5℃/min的变温速度。

进一步地，所述改性剂泵和所述补充泵均内置有低压梯度比例阀。

本发明还提供采用所述系统进行的分析方法，包括如下步骤：

(1)变温：将柱温箱的温度设定为变温聚焦时的温度，使柱温箱达到设定的变温聚焦温度，其内部的混合器、微量预热器和色谱柱也达到设定的变温聚焦温度，变温完成；

(2)自动进样器载样：六通阀保持在载样模式，将样品从六通阀的第四接口推至定量环中，载样完成，同时改性剂泵和二氧化碳泵分别输送改性剂和二氧化碳，在混合器中混合并预热后得到的流动相，经过六通阀后进入微量预热器中再预热至设定的变温聚焦温度，然后进入色谱柱以平衡色谱柱；

(3)大体积进样-柱头聚焦：六通阀切换阀位至进样模式，从混合器出来的、预热至设定变温聚焦温度的流动相，经过六通阀将定量环中的样品携带至柱温箱内，再经过微量预热器重新预热至设定的变温聚焦温度后进入色谱柱，进行柱头聚焦；

(4)色谱分离及质谱分析：六通阀切换至载样模式，将柱温箱的温度设定为分析温度，使柱温箱达到设定的分析温度，其内部的混合器、微量预热器和色谱柱也达到设定的分析温度，改性剂泵和二氧化碳泵按照分析梯度输送改性剂和二氧化碳，在混合器中混合并预热后得到的流动相，经过六通阀后进入微量预热器中再预热至设定的分析温度，然后进入色谱柱洗脱目标分析物，得到的洗脱液与补充泵输送的补充溶液在三通连接器混合，随后经过背压调节器后进入质谱检测器中分析。

本发明所述分析方法采用变温聚焦策略，通过改变进样过程中柱温箱的温度，改变进样过程中色谱柱中超临界流体的性质。由于进样时柱温箱内温度与分析时存在差异，进样时色谱柱内超临界流体性质为亚临界状态或气态，溶剂的溶解能力降低，目标化合物在色谱柱头聚焦，色谱峰展宽现象得到减轻。

本发明采用带溶剂预热功能的模块加热式柱温箱，先以每分钟不低于5℃的速度，在5min内达到变温聚焦的温度，改变色谱柱内超临界二氧化碳的性质，为色谱柱头聚焦提供合适条件。变温完成后采用经过预热的混合流动相将大体积定量环中的样品输送至色谱柱头，由于超临界二氧化碳的溶解度降低，目标化合物在色谱柱头进行聚焦，使得化合物的峰形改善。柱头聚焦完成后，化合物从色谱柱上洗脱下来，洗脱液与色谱柱后地补充液混合后进入质谱检测器，避免化合物因二氧化碳气化析出，改善化合物的电离效率，提高检测的灵敏度。

进一步地，步骤(1)至(3)中，将柱温箱的温度设为变温聚焦温度范围10-70℃中的一个选定值，使步骤(3)的流动相中的二氧化碳处于亚临界状态；步骤(4)中，将柱温箱的温度设为分析温度范围35-60℃中的一个选定值，使流动相中的二氧化碳处于超临界状态。

进一步地，步骤(2)中定量环的载样体积不小于20μL，保证大体积进样效果。

进一步地，步骤(3)中，流动相的改性剂体积比例为0-5％，流动相的流速为0-1mL/min，变温聚焦持续时间(即步骤(3)六通阀从进样模式切换到步骤(4)载样模式之间的时间)小于或等于5min。

优选地，步骤(3)中背压调节器的压力设定为小于1100psi。步骤(4)中背压调节器的压力设定范围为1500-3000psi，补充泵的流速设置范围为0-0.3mL/min，提高目标分析物的电离效率。

相对于现有技术，本发明的系统及其分析方法具有以下有益效果：

1)结合变温聚焦技术，解决了大体积进样引起的色谱峰展宽问题，所述系统可以采用体积不低于20μL的定量环进行大体积进样，相较于普通分析系统进样体积有所增加且峰形更加尖锐对称，有利于的定量分析。

2)采用带溶剂预热功能模块加热式柱温箱可在5min内以每分钟不低于5℃的变化速度完成变温聚焦所需温度的调节，通过降低进样过程中流动相的密度，从而降低流动相对目标化合物的溶解度，实现化合物在色谱柱头聚焦，改善色谱峰展宽问题。同时采用柱温箱内置混合器、特定连接管路以及色谱柱前配置微量预热器的方法对进样前和进样后的组分进行预热，保证变温聚焦效果。

3)采用配置低压梯度比例阀的改性剂泵控制改性剂的比例，使得变温聚焦时改性剂的比例不高于5％，保证可以通过控制温度变化改变流动相的性质，提供变温聚焦条件。

4)通过色谱柱后的补充泵输送补充溶液，保证进入质谱检测器的待测液流量不低于0.3mL/min，避免目标化合物因二氧化碳气化而析出，同时增加补充溶液可以提高化合物的电离效率，保证质谱检测器的响应稳定。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1为本发明的大体积进样-变温聚焦超临界流体色谱质谱分析系统的装置示意图；

图2为本发明的系统用于不同温度下测定的20种脂质的色谱图。

附图标记的对应关系：改性剂泵-1，二氧化碳泵-2，混合器-3，自动进样器-4，六通阀-5，定量环-6，柱温箱-7，特定连接管路-8，微量预热器-9，色谱柱-10，补充泵-11，三通连接器-12，背压调节器-13，质谱检测器-14。

具体实施方式

请参阅图1，其为本发明的大体积进样-变温聚焦超临界流体色谱质谱分析系统的装置示意图。

所述系统包括改性剂泵1、二氧化碳泵2、混合器3、自动进样器4、用于切换流路的六通阀5、定量环6、柱温箱7、微量预热器9、色谱柱10、补充泵11、三通连接器12、背压调节器13、质谱检测器14以及用于连接各部件的连接管路；

所述六通阀5和定量环6均设置于所述自动进样器4内部，所述六通阀5按顺时针顺序依次设置有六个接口，所述定量环6的两个端口分别接入所述六通阀5的第二接口e和第五接口h；

所述六通阀5可切换阀位至载样模式和进样模式，所述载样模式为：第一接口d连接第六接口i，第二接口e连接第三接口f，第四接口g连接第五接口h；所述进样模式为：第一接口d连接第二接口e，第三接口f连接第四接口g，第五接口h连接第六接口i；

所述混合器3、微量预热器9和色谱柱10均设置于所述柱温箱7内部；所述混合器3具有第一入口a、第二入口b和出口c，所述混合器3的出口c连接到所述六通阀5的第一接口d；所述微量预热器9的入口连接到所述六通阀5的第六接口i，其出口连接到所述色谱柱10的入口；所述色谱柱10的出口连接到所述三通连接器12的第一接口j；

所述改性剂泵1的出口连接到所述混合器3的第一入口a，所述二氧化碳泵2的出口连接到所述混合器3的第二入口b；所述补充泵11的出口连接到所述三通连接器12的第二接口k；所述背压调节器13的入口连接到所述三通连接器12的第三接口l，其出口连接到所述质谱检测器14的入口。

所述改性剂泵1用于输送改性剂，调整流动相极性。所述二氧化碳泵2用于输送二氧化碳。具体地，所述改性剂泵1和补充泵11均内置有低压梯度比例阀，可用于选择不同极性的溶剂，一次输送1-4种不同种类的溶剂。

所述三通连接器12的第一接口j为柱后溶剂入口，第二接口k为补充液入口，第三接口l为待测混合溶剂出口。

具体地，所述自动进样器4内置的定量环6的体积要求不小于20μL。

优选地，所述混合器3的体积为180μL，且混合器3需置于柱温箱7内部，确保分析时能够对流动相进行预加热，提供足量且温度与色谱柱10柱温一致的流动相用于定量环6中的大体积样品进样。

优选地，所述柱温箱7为模块加热式柱温箱，温度设置范围为4-90℃，温度增量为0.1℃，可实现每分钟不低于5℃的快速变温，在5min内完成变温的过程。

所述微量预热器9用于对来自自动进样器4的混合溶剂进行预加热。作为进一步优选，所述微量预热器9的入口通过特定连接管路8与所述六通阀5的第六接口i连接；所述特定连接管路8的内径为0.3mm，长度为1000mm，且其中收纳于所述柱温箱7内部的长度不小于700mm，可对来自自动进样器4的混合溶剂进行预加热。

采用所述系统进行的分析方法，包括如下步骤：

(1)变温：自动进样器4载样前，将柱温箱7的温度设定为变温聚焦时的温度，使柱温箱7达到设定的变温聚焦温度，其内部的混合器3、微量预热器9和色谱柱10也达到设定的变温聚焦温度，变温完成。

该步骤中，具体将柱温箱7的温度设为变温聚焦温度范围10-70℃中的一个选定值，柱温箱7以每分钟不小于5℃的变温速度升至设定的变温聚焦温度。色谱柱10达到变温聚焦时所需的温度。

同时，二氧化碳泵2的输送比例设置为100％，而改性剂泵1的输送比例设置为0％，总流速设为0.5mL/min；背压调节器13的压力设为1000psi。

(2)自动进样器载样：六通阀5保持在载样模式，将样品从六通阀5的第四接口g推至定量环6中，载样完成，同时改性剂泵1和二氧化碳泵2分别输送改性剂和二氧化碳，在混合器3中混合并预热后得到的流动相，经过出口c、六通阀5的接口d、接口e后进入微量预热器9中再预热至设定的变温聚焦温度，然后进入色谱柱10以平衡色谱柱。

该步骤中，将柱温箱7的温度保持设定在步骤(1)的选定值。色谱柱10维持变温聚焦时所需温度进行色谱柱平衡。

具体地，利用进样针吸取不小于20μL的样品推进定量环6中，定量环6的载样体积不小于20μL。

同时，二氧化碳泵2的输送比例设置为100％，而改性剂泵1的输送比例设置为0％，总流速设为0.5mL/min；背压调节器13的压力设为1000psi。

(3)大体积进样-柱头聚焦：载样完成后，六通阀5切换阀位至进样模式，从混合器3的出口c出来的、预热至设定的变温聚焦温度的流动相，经过六通阀5的接口d、接口e将定量环6中的样品从接口h、接口i携带出去，从自动进样器4流至柱温箱7内，再经过特定连接管路8、微量预热器9再次预热至设定的变温聚焦温度后进入色谱柱10，进行柱头聚焦。

进样期间，柱温箱7的温度恒定在10-70℃间设定的变温聚焦温度，并维持0-5min，进行快速变温聚焦。

该步骤中，二氧化碳泵2的输送比例设置为100％，改性剂泵1输送比例为0％，总流速设为0.5mL/min；背压调节器13的压力设为1000psi。

步骤(1)至(3)中，将柱温箱7的温度设为变温聚焦温度范围10-70℃中的一个选定值，使步骤(3)的流动相中的二氧化碳处于亚临界状态。

(4)色谱分离及质谱分析：六通阀5切换至载样模式，将柱温箱7的温度设定为分析温度，使柱温箱7达到设定的分析温度，其内部的混合器3、微量预热器9和色谱柱10也达到设定的分析温度，改性剂泵1和二氧化碳泵2按照分析梯度输送改性剂和二氧化碳，在混合器3中混合并预热后得到的流动相，经过六通阀5后进入微量预热器9中再预热至设定的分析温度，然后进入色谱柱10洗脱目标分析物，得到的洗脱液与补充泵11输送的补充溶液在三通连接器12混合，随后经过背压调节器13后进入质谱检测器14中分析。

该步骤中，具体将柱温箱7的温度设为分析温度范围35-60℃中的一个定值，例如55℃，柱温箱7以每分钟不小于5℃的变温速度达到设定的分析温度，使流动相中的二氧化碳处于超临界状态。

同时，背压调节器13的压力设为1600psi；总流速为1.5mL/min。

(5)色谱柱平衡：分析完成后，二氧化碳泵2和改性剂泵1按照分析梯度的起始比例输送流动相，从混合器3的出口c流出的流动相经六通阀5的接口d进入自动进样器4，随后经接口i进入柱温箱7内进行色谱柱平衡，平衡时间为2min，为下一次分析做准备。

本发明通过大体积进样-变温聚焦超临界色谱质谱分析系统，采用变温聚焦策略，通过迅速改变进样过程中柱温箱7的温度，改变进样过程中色谱柱10中超临界流体的性质，降低流动相的密度，从而降低目标化合物在在流动相中的溶解度，有效减轻色谱峰展宽的现象。

相对于现有技术，本发明所述系统只需改变柱温箱7的温度，聚焦方法简单易行，无需对仪器进行改造，也无需增加额外的仪器设备进行辅助。通过结合变温聚焦技术可实现大体积进样，提高低含量化合物的响应，有利于低丰度化合物的检测。

下面结合实施例进一步说明本发明的分析方法及应用。

实施例1

使用本发明的大体积进样-变温聚焦超临界流体色谱质谱系统及其分析方法，对抑郁症大鼠脑组织中的18种代谢物进行分析检测。18种脂质依次为CE(20:4)、TG(50:1)、TG(52:1)、TG(54:4)、FA(17:1)、AA、DHA、Cholesterol、DG(16:1/22:5/0:0)、DG(18:2/22:5/0:0)、PC(32:2)、MG、OEA、Cer(d18:1/16:0)、Cer(42:2)、PA(16:0/18:1)、SM(d18:2/24:0)、LPC(20:4)、LPE(18:0)、LPI(18:0)。

本实施例中，所述柱温箱7内置的定量环6的体积为20μL，所述色谱柱10的型号为Waters ACQUITY Torus^TM DIOL column(规格为3.0mm×100mm，1.7μm，

)。

样品前处理方法为：称取1mg冻干脑组织粉末于1.5mL离心管中，加入400μL三氯甲烷，于4℃下1500rpm转速振荡30min；加入300μL纯水，涡旋3min于4℃下孵育3min；于4℃下以10000rpm转速离心10min，吸取下层清液至于新的EP管中；于45℃下氮气吹干1h；分析前加入200μL二氯甲烷/甲醇(1:4，v/v)溶液复溶。

在步骤(1)中，柱温箱7设置为10-70℃间的一个设定值，背压调节器13的压力设为1000psi，色谱柱10达到变温聚焦时的温度。此时，总流速设为0.5mL/min。

在步骤(2)中，自动进样器4的进样体积设置为20μL；柱温箱7的温度设置为10-70℃间的一个选定值；背压调节器13的压力设置为1000psi；总流速设置为0.5mL/min；二氧化碳泵2的比例设置为100％；改性剂泵1的比例设置为0％；自动进样器载样完成。

在步骤(3)中，柱温箱7的温度设置为10-70℃间的一个选定值；背压调节器13的压力设置为1000psi；总流速设置为0.5mL/min；二氧化碳泵2的比例设置为100％；改性剂泵1的比例设置为0％；变温聚焦时间为0-2min；大体积进样-变温聚焦完成。

在步骤(4)中，柱温箱7的温度设置为55℃；背压调节器13的压力设置为1600psi；总流速设置为1.5mL/min；二氧化碳泵2的比例设置为99-49％；改性剂泵1的比例设置为1-51％；补充液为甲醇/水(99:1，v/v)溶液，补充泵11流速设为0.15mL/min；分析时间为2.01-11min；SFC分析完成。

变温聚焦温度分别选取10℃、30℃、50℃和70℃，测得的四个色谱如图2所示。由图2的分析结构可看出，压力一定的条件下，变温聚焦过程随着温度的升高，目标化合物的峰形更加尖锐对称，1-6min内保留较弱的化合物峰形得到显著的改善。1-5号弱保留化合物在低温时检测不到，这是因为温度较低时，溶剂的密度大，溶解能力大，在变压聚焦过程中被洗脱下来，导致漏检。因此，变温聚焦还可以通过升高进样时的柱温，降低流动相对目标化合物的溶解能力，改善弱保留化合物的保留，避免弱保留化合物的漏检。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种大体积进样-变温聚焦超临界流体色谱质谱分析系统，其特征在于：包括改性剂泵、二氧化碳泵、混合器、自动进样器、用于切换流路的六通阀、定量环、柱温箱、微量预热器、色谱柱、补充泵、三通连接器、背压调节器、质谱检测器以及用于连接各部件的连接管路；

所述六通阀和定量环均设置于所述自动进样器内部，所述六通阀按顺时针顺序依次设置有六个接口，所述定量环的两个端口分别接入所述六通阀的第二接口和第五接口；所述定量环的体积不小于20μL；

所述六通阀可切换阀位至载样模式和进样模式，所述载样模式为：第一接口连接第六接口，第二接口连接第三接口，第四接口连接第五接口；所述进样模式为：第一接口连接第二接口，第三接口连接第四接口，第五接口连接第六接口；

所述混合器、微量预热器和色谱柱均设置于所述柱温箱内部；所述混合器具有第一入口、第二入口和出口，所述混合器的出口连接到所述六通阀的第一接口；所述微量预热器的入口连接到所述六通阀的第六接口，其出口连接到所述色谱柱的入口；所述色谱柱的出口连接到所述三通连接器的第一接口；

所述改性剂泵的出口连接到所述混合器的第一入口，所述二氧化碳泵的出口连接到所述混合器的第二入口；所述补充泵的出口连接到所述三通连接器的第二接口；所述背压调节器的入口连接到所述三通连接器的第三接口，其出口连接到所述质谱检测器的入口；

所述变温聚焦为通过改变进样过程中柱温箱的温度，来改变进样过程中色谱柱中超临界流体的性质为亚临界状态或气态；

所述柱温箱为模块加热式柱温箱，温度设置范围为4-90℃，温度增量为0.1℃，可实现每分钟不小于5℃的变温速度。

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：所述微量预热器的入口通过特定连接管路与所述六通阀的第六接口连接；所述特定连接管路的内径为0.3mm，长度为1000mm，且其中收纳于所述柱温箱内部的长度不小于700mm。

3.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于：所述混合器的体积为180μL。

4.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于：所述改性剂泵和所述补充泵均内置有低压梯度比例阀。

5.采用权利要求1所述系统进行的分析方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)变温：将柱温箱的温度设定为变温聚焦时的温度，使柱温箱达到设定的变温聚焦温度，其内部的混合器、微量预热器和色谱柱也达到设定的变温聚焦温度，变温完成；

(2)自动进样器载样：六通阀保持在载样模式，将样品从六通阀的第四接口推至定量环中，载样完成，同时二氧化碳泵输送二氧化碳或者改性剂泵和二氧化碳泵分别输送改性剂和二氧化碳，在混合器中预热后得到的流动相，经过六通阀后进入微量预热器中再预热至设定的变温聚焦温度，然后进入色谱柱以平衡色谱柱；

(3)大体积进样-柱头聚焦：六通阀切换阀位至进样模式，从混合器出来的、预热至设定的变温聚焦温度的流动相，经过六通阀将定量环中的样品携带至柱温箱内，再经过微量预热器重新预热至设定的变温聚焦温度后进入色谱柱，进行柱头聚焦；

(4)色谱分离及质谱分析：六通阀切换至载样模式，将柱温箱的温度设定为分析温度，使柱温箱达到设定的分析温度，其内部的混合器、微量预热器和色谱柱也达到设定的分析温度，改性剂泵和二氧化碳泵按照分析梯度输送改性剂和二氧化碳，在混合器中混合并预热后得到的流动相，经过六通阀后进入微量预热器中再预热至设定的分析温度，然后进入色谱柱洗脱目标分析物，得到的洗脱液与补充泵输送的补充溶液在三通连接器混合，随后经过背压调节器后进入质谱检测器中分析；

步骤(2)中定量环的载样体积不小于20μL；

步骤(1)至(3)中，将柱温箱的温度设为变温聚焦温度范围10-70℃中的一个选定值，使步骤(3)的流动相中的二氧化碳处于亚临界状态；步骤(4)中，将柱温箱的设定温度设为分析温度范围35-60℃中的一个选定值，使流动相中的二氧化碳处于超临界状态。

6.根据权利要求5所述的分析方法，其特征在于：步骤(3)中，流动相的改性剂体积比例为0-5％，流动相的流速小于或等于1mL/min，背压调节器的压力设置为小于1100psi，变温聚焦持续时间小于或等于5min。

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