CN113652471B - 一种基于fret荧光比率的dna生物传感器及其检测方法和细胞分类方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种基于FRET荧光比率的DNA生物传感器及其检测方法和细胞分类方法。该DNA生物传感器至少包括四面体DNA纳米结构和含柔性铰链的DNA传感结构，含柔性铰链的DNA传感结构包括带有FRET供体和FRET受体的核苷酸链，核苷酸链与如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列发生链杂交反应，或者核苷酸链与SEQ ID NO:1～2及SEQ IDNO:4任一核苷酸序列的延长链的3’端发生链杂交反应，即得DNA生物传感器。该DNA生物传感器对细胞内拥挤环境产生非特异性力敏感，可用于细胞内大分子拥挤情况的直接测定，将DNA生物传感器用于多种细胞的分类研究中，达到了90％的分类准确率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种基于FRET荧光比率的DNA生物传感器及其检测方法和细胞分类方法。
背景技术
细胞作为生物体结构和功能的基本单位，其胞内充满着大量的核酸、蛋白质、多糖、脂质等生物大分子，胞内生物大分子含量会随着细胞种类乃至分型的不同而有所差异。总体而言，胞内生物大分子总量约占细胞总容积的20％～30％，因此胞内是一个十分拥挤的环境。源于排除体积的拥挤理论分析表明：拥挤环境对细胞内生化反应的动力学和热力学有很大影响。拥挤环境作为细胞内重要的生理因素，不容忽视，且已经证明很多疾病的发生与大分子拥挤之间存在着某种相关性。例如，癌细胞中的游离水的数量少于正常细胞，导致细胞内拥挤环境不同，这种差异与癌细胞恶性增殖及侵袭转移等多种疾病的发生相关；此外，拥挤环境能够影响细胞内蛋白质的反应平衡，蛋白质的折叠，病理蛋白质的聚集等，如拥挤环境能够促进原纤维化，而帕金森病和阿尔兹海默症等都与人类淀粉样蛋白的原纤维化相关。
近年来的研究显示，当受到低渗或高渗压力干扰时，细胞膜内外渗透压出现差异，细胞可以诱导细胞体积恢复系统，通过失水或者吸水调节体积减少(RVD)或者增加(RVI)，进而细胞内的大分子拥挤情况发生变化，且响应渗透刺激变化程度与细胞的种类相关。因此可以通过各种各样的生物传感器来检测大分子拥挤这一变化因素，从而实现对不同细胞的区分，这对生物医学特别是肿瘤治疗领域具有重大意义。
目前用于研究细胞内大分子拥挤的传感器包括以下三类：(1)小分子探针，(2)荧光蛋白传感器，(3)DNA分子传感器，但这些研究方法具有一定的局限性。例如小分子探针，一些小分子物质(荧光染料等)易于穿透细胞膜，且无明显的细胞毒性，被广泛用于细胞内大分子拥挤环境的检测，但该类检测方法通过小分子与蛋白质等物质结合，通过蛋白质等的扩散速率估算细胞内的拥挤程度，因此不能实现定量检测；荧光蛋白生物传感器，由于其具有良好的生物相容性，且易于表达的特性被广泛运用于大分子拥挤环境的检测，但该类方法存在蛋白质设计和合成复杂，表达时间周期较长的问题；DNA分子传感器，在转运至细胞内的方法上存在一定的缺陷(转染剂的细胞毒性较大，显微注射方法的操作复杂)，故应用受到限制。因此，开发一种简单、高效、低成本且能够直接定量检测活细胞内拥挤环境的生物传感器具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种基于FRET荧光比率的DNA生物传感器及其检测方法和细胞分类方法。本发明中四面体纳米DNA纳米结构具有可拓展性，当四面体纳米DNA纳米结构与DNA传感结构发生链杂交后，获得的DNA生物传感器可以实现多样本的检测；在拥挤环境产生的非特异性力作用下，由于FRET供体和FRET受体之间的空间距离的可调控性，从而发生FRET效应，使得DNA生物传感器对细胞内拥挤环境产生的非特异性力敏感，可用于细胞内大分子拥挤情况的直接测定；将DNA生物传感器用于多种细胞的分类研究中，达到了90％的分类准确率，将为解析相关疾病与细胞内拥挤环境的发病机制提供了一种全新的方法论。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一目的，本发明提供一种基于FRET荧光比率的DNA生物传感器，所述DNA生物传感器至少包括四面体DNA纳米结构和含柔性铰链的DNA传感结构，所述四面体DNA纳米结构由SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4的核苷酸序列组成；所述含柔性铰链的DNA传感结构包括带有FRET供体和FRET受体的核苷酸链，核苷酸链与如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列发生链杂交反应，或者核苷酸链与SEQ ID NO:1～2及SEQ ID NO:4任一核苷酸序列的延长链的3’端发生链杂交反应，最终形成基于FRET荧光比率的DNA生物传感器。
本发明结合DNA纳米技术和荧光共振能量转移技术(FRET)，开发出一种基于FRET荧光比率的DNA生物传感器，该DNA生物传感器包含四面体DNA纳米结构和含柔性铰链对拥挤环境有敏感响应的DNA传感结构，四面体DNA纳米结构由四条核苷酸单链根据碱基互补配对原则形成的空间纳米结构，具有可扩展性；通过链杂交反应将四面体DNA纳米结构和含柔性铰链的DNA传感结构连接获得DNA生物传感器，可以实现多样本检测。本发明DNA生物传感器将细胞内拥挤环境产生的非特异性力学变化转化成荧光基团间的距离和角度变化，从而引起实时FRET信号的变化，使得得到的DNA生物传感器从可以检测细胞内大分子拥挤的情况。
与现有的传感器相比，本发明DNA生物传感器具有合成成本低、合成方法成熟，良好的生物相容性，可扩展性以及高度灵敏性等优势。
作为本发明所述DNA生物传感器的优选实施方式，所述FRET供体或FRET受体包括荧光素类染料、罗丹明类染料、Cy系列菁染料、Alexa系列中的一种或多种；荧光素类染料包括FITC、FAM、TET及其类似物中的至少一种；罗丹明类染料包括RBITC、TAMRA、TRITC中的一种或多种；Cy系列菁染料包括Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7及其类似物中的至少一种；Alexa系列包括AlexaFluor350、AlexaFluor405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor610、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor480、AlexaFluor700、AlexaFluor750中的一种或多种。
更优选地，所述FRET供体为Cy3荧光基团，所述FRET受体为Cy5荧光基团
作为本发明所述DNA生物传感器的优选实施方式，所述核苷酸链由一条带有Cy3荧光基团的核苷酸短链和一条带有Cy5荧光基团的核苷酸短链共同组成，所述核苷酸短链的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，核苷酸短链的序列不仅限于此。
本发明含柔性铰链的DNA传感结构将细胞内拥挤环境产生的非特异性力学变化转化成荧光基团间的距离和角度变化，从而引起实时FRET信号的变化，进而可以实现细胞内大分子拥挤情况的检测；其含柔性铰链的DNA传感结构带上Cy3荧光基团和Cy5荧光基团，由于Cy3荧光基团和Cy5荧光基团之间的空间距离的可调控性，从而发生FRET效应，使得DNA生物传感器对细胞内拥挤环境产生的非特异性力敏感，便于DNA生物传感器直接检测细胞内拥挤的情况。
第二目的，本发明提供了上述DNA生物传感器在检测细胞内大分子拥挤环境中的应用。
第三目的，本发明提供了上述DNA生物传感器在检测由药物刺激或渗透压刺激造成细胞内大分子拥挤环境中的应用。
通过不同种类的药物刺激或渗透压刺激因素作用于细胞，诱导细胞体积恢复系统，通过失水或者吸水调节体积减少(RVD)或者增加(RVI)，进而使得细胞内的大分子拥挤情况发生变化，本发明利用上述DNA生物传感器中含柔性铰链的DNA传感结构响应拥挤环境非特异性作用力的原理，测定FRET荧光比率变化，从而可以直接测定细胞内大分子的拥挤程度。
第四目的，本发明提供了上述DNA生物传感器检测细胞内拥挤环境的方法，包括以下步骤：
1)构建四面体DNA纳米结构溶液；
2)将一条带有Cy3荧光基团的核苷酸短链和一条带有Cy5荧光基团核苷酸短链加入至四面体DNA纳米结构溶液中混合形成混合液，然后将混合液置于60～70℃下保持5～10min，缓慢降至室温，得DNA生物传感器；
3)将合成的DNA生物传感器加入至拥挤剂中，室温孵育，在500nm的激发波长下记录500nm至800nm的荧光发射图谱，观察Cy3荧光基团和Cy5荧光基团的荧光强度变化，计算FRET荧光比率。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述拥挤剂的种类或分子量至少一项不同。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤1)中，构建四面体DNA纳米结构溶液包括以下具体步骤：
取如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4所示的核苷酸单链按照质量比为1:1:1:1加入至TM buffer中混合，四条核苷酸单链的终浓度为1μM，将混合好的溶液放入置于92～96℃保持5～10min，然后迅速降温至4℃保持30min以上，即得四面体DNA纳米结构溶液。
本发明制备的四面体DNA纳米结构具有良好的生物相容性及可扩展性。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述拥挤剂包括分子量分别为200、1000、2000、8000的聚乙二醇溶液。
根据实验可知，FRET荧光比率随着分子量为200的聚乙二醇溶液浓度的增加没有显著变化，FRET荧光比率随着分子量为1000、2000和8000的聚乙二醇溶液浓度的增加而升高。
更优选地，所述拥挤剂的质量分数为10％～40％，更为优选为，所述拥挤剂的质量分数为40％。
根据实施例3的实验数据可知，FRET荧光比率随着拥挤剂的质量分数的增加而升高。
第五目的，本发明提供了一种采用线性判别分析算法联合上述DNA生物传感器在精准区分不同种类细胞中的应用。
第六目的，本发明提供了一种细胞分类方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采用上述的DNA生物传感器与已知细胞的重悬液混合，收集已知细胞在不同渗透压刺激下的FRET供体和FRET受体的荧光强度，计算已知细胞的重悬液在不同渗透压刺激下的FRET比率，基于已知细胞的重悬液的FRET比率构建已知细胞的指纹图谱；
S2、采用上述的DNA生物传感器与未知细胞的重悬液混合，收集未知细胞在不同渗透压刺激下的FRET供体和FRET受体的荧光强度，计算未知细胞的重悬液在不同渗透压刺激下的FRET比率，将未知细胞的重悬液的FRET比率与步骤S1已知细胞的指纹图谱匹配，根据匹配结果得到所述未知细胞的种类。
更优选地，步骤S1中，基于已知细胞的重悬液的FRET比率获得“指纹”数据，采用线性判别分析算法对所得“指纹”数据进行处理获得指纹图谱。在Rstudio中进行操作，具体代码如下：
setwd("E:/te‘st")#设置D盘下test文件夹为工作文件夹，将csv格式的数据文件放入其中
setwd("E:/test")
library(devtools)
library(ggord)
library(MASS)
library(ggplot2)
data<-read.csv("metal ions.csv",sep＝",",header＝T)
data$group<-as.factor(data$group)
model1＝lda(group～.,data＝data)
model1
plot(model1,dimen＝2)
ld<-predict(model1)$x
ord<-lda(group～.,data)
p<-ggord(ord,data$group,arrow＝0,vec_ext＝0,size＝5,txt＝NULL,poly＝FALSE,coord_fix＝F)#画图
p+theme(panel.grid＝element_blank())
将所得数据用MATLAB中的分类插件线性分析进行计算，采用5折交叉验证，确定未知细胞的种类。
本发明基于不同种类的细胞内拥挤情况的差异，以及响应渗透刺激变化程度的差异，获取不同细胞内拥挤环境变化的统计学信号，结合机器学习算法，建立细胞指纹图谱，实现了对不同种类细胞的精准区分，其细胞分类准确率可达到90％。
根据实施例的实验结果可知，随着渗透压刺激因素的增加，细胞的分类的效果越来越好。因此说明，采用线性判别分析算法对不同细胞产生的“指纹“数据是切实有效的。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明结合DNA纳米技术和荧光共振能量转移技术(FRET)，开发出一种基于FRET荧光比率的DNA生物传感器，该DNA生物传感器将细胞内拥挤环境产生的非特异性力学变化转化成荧光基团间的距离和角度变化，从而引起实时FRET信号的变化，使得得到的DNA生物传感器从可以检测细胞内拥挤的情况；
2)本发明基于不同种类的细胞内拥挤情况的差异，以及响应渗透刺激变化程度的差异，获取不同细胞内拥挤环境变化的统计学信号，结合机器学习算法，建立细胞指纹图谱，实现了对不同种类细胞的精准区分，将为解析相关疾病与细胞内拥挤环境的发病机制提供指导意义；
3)与现有的传感器相比，本发明DNA生物传感器具有合成成本低、合成方法成熟，良好的生物相容性，可扩展性以及高度灵敏性等优势。
附图说明
图1为本发明DNA生物传感器的基本结构图以及细胞分类工作原理图；
图2为本发明DNA生物传感器的琼脂糖凝胶电泳结果图；
图3为本发明DNA生物传感器的粒径图；
图4为随着PEG-200质量浓度的增加，Cy3荧光基团和Cy5荧光基团荧光强度的变化图；
图5为随着PEG-1K质量浓度的增加，Cy3荧光基团和Cy5荧光基团荧光强度的变化图；
图6为随着PEG-2K质量浓度的增加，Cy3荧光基团和Cy5荧光基团荧光强度的变化图；
图7为随着PEG-8K质量浓度的增加，Cy3荧光基团和Cy5荧光基团荧光强度的变化图；
图8为本发明的DNA生物传感器在不同种类和不同质量分数的聚乙二醇中FRET荧光比率变化影响图；
图9为流式细胞术检测HeLa细胞对DNA生物传感器的摄取率结果图；
图10为不同细胞在不同渗透压条件下的FRET荧光比率Fmax；
图11为不同细胞在不同渗透压条件下的FRET荧光比率增量ΔF；
图12为不同细胞的FRET荧光比率增量热点图；
图13为采用不同渗透压条件刺激传感响应示意图(a，d，g，j)、不同细胞的分类图(b，e，h，k)和混淆矩阵图(c，f，i，l)。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、一种基于FRET荧光比率的DNA生物传感器
本发明的DNA生物传感器包括四面体DNA纳米结构和含柔性铰链的DNA传感结构，四面体DNA纳米结构由S1、S2、S3、S4共四条核苷酸单链(如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4的核苷酸序列所示)组成；含柔性铰链的DNA传感结构包括带有Cy3荧光基团和Cy5荧光基团的核苷酸链，核苷酸链由分别带有Cy3荧光基团和Cy5荧光基团的核苷酸短链Seq1、Seq2(如SEQID NO:5和SEQ ID NO:6的核苷酸序列所示)组成，核苷酸链与SEQ ID NO:3核苷酸序列的3’端发生链杂交反应，最终获得基于FRET荧光比率的DNA生物传感器(DNA生物传感器可参考图1)。
上述基于FRET荧光比率的DNA生物传感器的合成方法，包括以下步骤：
1)首先用超纯水将S1、S2、S3、S4共四条核苷酸单链溶解，使得四条核苷酸单链的最终浓度均为100μM，将四条溶解的核苷酸单链按照质量比为1:1:1:1加入至TM buffer(20mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH 8.0)中混合，将混合好的溶液放入PCR仪中95℃保持10min，然后迅速降温至4℃保持30min以上，即得四面体DNA纳米结构溶液；
2)一条带有Cy3荧光基团的核苷酸短链Seq1(10μL)和一条带有Cy5荧光基团核苷酸短链Seq2(10μL)一起加入至980μL步骤1)合成的四面体DNA纳米结构溶液中混合形成混合液，使得核苷酸短链Seq1和核苷酸短链Seq2的终浓度为1μM，然后将混合液放入PCR仪中65℃保持8min，缓慢降至室温后，得到基于FRET荧光比率的DNA生物传感器。
合成上述基于FRET荧光比率的DNA生物传感器使用到的核苷酸序列如表1所示。
表1
实施例2、琼脂糖凝胶电泳表征及动态光散射(DLS)表征
1、琼脂糖凝胶电泳表征合成的基于FRET荧光比率的DNA生物传感器
电泳缓冲液的配制：直接稀释50×TAE，将其稀释到1×TAE。
琼脂糖凝胶的制备：首先将1.5g琼脂糖加入到100mL已稀释至1×TAE中摇匀，放入微波炉中加热至溶解。待温度降至50℃左右，往100mL胶中加入10μL 10000×的Gel-Red染料，混合均匀，然后用胶带将胶板的两端封好，插入适当的梳子，将凝胶倒入胶板中，室温冷却凝固。电泳前先将胶在4℃冰箱放置30min以上，电泳结束后直接使用凝胶成像系统进行成像。
分别使用等量的S1，S2，S3，S4，S1+S2+S3+S4采用与合成四面体DNA相同的实验步骤得到实验产物。将所有最终合成的样品，各取10μL加入适量DNA上样缓冲液(含有二甲苯青和溴酚蓝)，加入之前准备好的琼脂糖凝胶中进行电泳实验，其中电泳电压为85V，在1×TAE(Tris-acetic acid-EDTA)缓冲液中持续50min。待电泳结束后将胶放置凝胶成像系统进行成像分析，所得数据通过软件处理分析(参考图2)。
2、动态光散射(DLS)表征合成的基于FRET荧光比率的DNA生物传感器
使用马尔文纳米电位仪ZS90获得粒径数据。具体实验步骤为：将最终所得的DNA生物传感器放入纳米电位仪中进行检测，传感器的终浓度为100nM。对应的检测参数为：散射角设定为90°，室温25℃，功率为200mW，光源为相干辐射的全固态激光器(DPPS)。对次实验进行3次平行实验，所得数据通过软件处理(参考图3)。
实施例3、本发明的DNA生物传感器在不同种类和不同质量分数的聚乙二醇中FRET荧光比率变化影响
选取分子量分别为200、1000、2000、8000的聚乙二醇溶液(即PEG 200，PEG-1K，PEG-2K，PEG-8K)作为拥挤剂在体外构建不同的大分子拥挤环境。
具体实验步骤如下：配制实验所需的不同分子量(PEG-200，PEG-1K，PEG-2K，PEG-8K)、不同质量分数(10％，20％，30％，40％)的PEG溶液，以质量分数为10％(w/v)的PEG 200为例，首先称量10g PEG 200溶解于配制好的buffer 2(100mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH7.5)中，将溶解后的溶液加入100mL容量瓶中，定容后，拧紧瓶塞摇匀备用，将配制好的PEG溶液于4℃下保存。上述不同质量分数且不同分子量的PEG溶液均采用质量分数为10％(w/v)的PEG 200溶液的方法进行配置。
使用荧光光谱仪测量本发明DNA生物传感器对拥挤环境的敏感性。具体实验步骤如下：将最终合成的DNA生物传感器加入到配制好的PEG溶液中，使得探针的终浓度为0.5μM，在黑暗环境下室温孵育20min。取适量的反应液加入到微量石英比色皿中，在500nm的激发波长下记录500nm至800nm的荧光发射图谱，观察供体分子(Cy3荧光基团)和受体分子(Cy5荧光基团)荧光强度的变化，计算FRET荧光比率。所有实验均重复三次。
参考图4-8，FRET荧光比率随着PEG-200质量浓度的增加没有显著变化；FRET荧光比率随着PEG-1K、PEG-2K、PEG-8K质量分数的增加而升高，其中随着PEG-8K质量分数的增加FRET荧光比率升高的程度显著高于PEG-200、PEG-1K、PEG-2K，随着PEG-2K质量分数的增加FRET荧光比率升高的程度要高于PEG-1K。
实施例4、不同渗透压条件下FRET比率变化的影响
1、细胞培养
本实验中所用A549细胞使用RMPI-1640培养基培养，HeLa、3T3、Raw、ct26、HepG2细胞均用DMEM高糖培养基培养，培养各种细胞所用完全培养基均含有10％的胎牛血清(FBS)和1％双抗(Penicillin-Streptomycin Solution)。所有细胞均培养在恒温培养箱(37℃、5％二氧化碳浓度)。以A549细胞为例，待细胞铺满培养瓶80％～90％，进行传代，细胞使用0.25％胰酶-EDTA消化约2min，在细胞变圆且未脱落时加入新鲜的完全培养基终止消化，将胰酶消化后的细胞离心(转速1000rmp/min，5min)，将上清液吸出，然后加入完全培养基重悬，并按1：3分瓶培养。其余细胞可按照上述细胞培养，其中Raw细胞在传代时不需要胰酶消化，轻轻拍打瓶壁，细胞即可脱落。
2、流式细胞仪测定DNA生物传感器的摄取效率
本实验中所用HeLa细胞按照上述步骤传代培养。将胰酶消化后的细胞离心(转速1000rmp/min，5min)，将上清液吸出，然后加入完全培养基重悬。使用细胞计数板计数细胞含量，将稀释后的细胞悬浮液加入到12孔板(每孔约105个细胞)，混匀后，在37℃恒温培养箱中培养12h，使其贴壁。将孔板内培养基吸出，使用PBS洗涤三次(每次1mL)，然后加入包含有本发明DNA生物传感器的DMEM培养基，使得DNA生物传感器的终浓度为20nM。探针和细胞在37℃恒温培养箱中孵育6h，然后吸出培养基，使用PBS洗涤三次(每次1mL)，每孔加入500μL含0.25％胰酶-EDTA消化30s，然后加入500μL培养基终止消化，用移液枪轻轻吹打30s，将液体转移至1.5mL的EP管中离心(转速1000rmp/min，5min)，吸出上清液，然后用PBS洗涤3次，吸出上清液，加入500μL保存在4℃的PBS，轻轻吹打重悬，重悬液使用滤膜过滤后，转入流式玻璃离心管。然后通过流式细胞仪测定。以上实验均重复三次。
参考图9，采用流式细胞术检测HeLa细胞对传感器的摄取率为60.2％。
3、本实验中所用的细胞(Raw、HeLa、3T3、A549、HepG2、ct26)均按照上述培养步骤培养，将胰酶消化后的细胞离心(转速1000rmp/min，5min)，吸出上清液后，加入培养基重悬，先用细胞计数板计数，将稀释的细胞悬浮液加入至12孔板(每孔约3×104个)，在37℃恒温培养箱中培养12h，使其贴壁。加入包含有DNA生物传感器的DMEM培养基(其中A549使用RMPI-1640培养基)，使得DNA生物传感器的终浓度为20nM。DNA生物传感器和细胞在37℃恒温培养箱中孵育6h，吸出培养基，使用PBS洗涤三次，每孔加入500μL胰酶消化30s，用移液枪轻轻吹打30s，将液体转移至1.5mL的离心管中离心(转速1000rmp/min，5min)，离心后的细胞加入100μL渗透液(50％H2O，20％PEG，250mM NaCl，500mM NaCl，750mM NaCl)重悬，所得细胞重悬液加入至96孔黑色酶标板，在532nm激发下测定FRET荧光比率的变化。以上实验均重复八次。
参考图10-12，与对照组相比，Raw、HeLa、3T3、HepG2、ct26细胞在20％PEG的渗透液中FRET荧光比率Fmax最高；A549细胞在500mM NaCl的渗透液中FRET荧光比率Fmax最高；Raw、HeLa、HepG2、ct26细胞在20％PEG的渗透液中FRET荧光比率增量ΔF最高；3T3细胞和A549细胞在500mM NaCl的渗透液中FRET荧光比率增量ΔF最高。
实施例5、一种采用线性判别分析算法联合上述DNA生物传感器精准分类细胞的方法
在实施例4的基础上，采用不同的渗透压刺激因素作用于Raw、HeLa、3T3、A549、HepG2、ct26等细胞，获取细胞内FRET信号变化，为了实现对不同种类细胞的分类，结合LDA分析方法实现细胞分类。
一种细胞分类方法，包括以下步骤：
S1、采用实施例1制备的DNA生物传感器与已知细胞的重悬液混合，收集已知细胞在不同渗透压刺激下的Cy3荧光基团和Cy5荧光基团的荧光强度，计算已知细胞的重悬液在不同渗透压刺激下的FRET比率，基于已知细胞的重悬液的FRET比率构建已知细胞的指纹图谱；
S2、采用实施例1制备的DNA生物传感器与未知细胞的重悬液混合，收集未知细胞在不同渗透压刺激下的FRET供体和FRET受体的荧光强度，计算未知细胞的重悬液在不同渗透压刺激下的FRET比率，将未知细胞的重悬液的FRET比率与步骤S1已知细胞的指纹图谱匹配，根据匹配结果得到所述未知细胞的种类。
步骤S1中，基于已知细胞的重悬液的FRET比率获得“指纹”数据，采用线性判别分析算法对所得“指纹”数据进行处理获得指纹图谱。在Rstudio中进行操作，具体代码如下：
setwd("E:/te‘st")#设置D盘下test文件夹为工作文件夹，将csv格式的数据文件放入其中
setwd("E:/test")
library(devtools)
library(ggord)
library(MASS)
library(ggplot2)
data<-read.csv("metal ions.csv",sep＝",",header＝T)
data$group<-as.factor(data$group)
model1＝lda(group～.,data＝data)
model1
plot(model1,dimen＝2)
ld<-predict(model1)$x
ord<-lda(group～.,data)
p<-ggord(ord,data$group,arrow＝0,vec_ext＝0,size＝5,txt＝NULL,poly＝FALSE,coord_fix＝F)#画图
p+theme(panel.grid＝element_blank())
将所得数据用MATLAB中的分类插件(线性分析)进行计算，采用5折交叉验证(5-fold cross validation)，当采用不同种类的渗透压刺激因素作用于细胞时，其具有对应的分类准确度。在采用5种渗透压刺激因素时，对不同种类细胞的分类效果可以达到90％。
如图13和图1所示，随着渗透压刺激因素的增加，细胞的分类的效果越来越好。因此说明，采用线性判别分析算法对不同细胞产生的“指纹“数据是切实有效的。
当渗透压刺激因素为50％H2O+20％PEG 200时，对不同种类细胞的分类效果达到60.4％；当渗透压刺激因素为50％H2O+20％PEG 200+750mM NaCl时，对不同种类细胞的分类效果达到75％；当渗透压刺激因素为50％H2O+20％PEG200+750mM NaCl+500mM NaCl时，对不同种类细胞的分类效果达到87.5％；当渗透压刺激因素为50％H2O+20％PEG 200+750mM NaCl+500mM NaCl+250mM NaCl，对不同种类细胞的分类效果达到90％。
本发明基于不同种类的细胞内拥挤情况的差异，以及响应渗透刺激变化程度的差异，获取不同细胞内拥挤环境变化的统计学信号，结合机器学习算法，实现了对不同细胞的精准区分。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
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<110> 中山大学
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<213> S2
<400> 2
acgagcgagt tgatgtgatg caagctgaat gcgagggtcc t 41
<210> 3
<211> 53
<212> DNA
<213> S3
<400> 3
tcaactcgct cgtaactaca ctgtgcaata ctctggtgac cttaccatgg ctg 53
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> S4
<400> 4
tctgacgtag tgtatgcaca gtgtagtaag gaccctcgca t 41
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213> Seq1
<400> 5
gtcggtacca tt 12
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> Seq2
<400> 6
aatggtaccg acaaaaacag ccatggtaa 29
Claims (6)
1.一种基于FRET荧光比率的DNA生物传感器，其特征在于，所述DNA生物传感器包括四面体DNA纳米结构和含柔性铰链的DNA传感结构，所述四面体DNA纳米结构由SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4的核苷酸序列组成；所述含柔性铰链的DNA传感结构包括带有FRET供体和FRET受体的核苷酸链，核苷酸链与如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列发生链杂交反应，或者核苷酸链与SEQ ID NO:1～2及SEQ ID NO:4任一核苷酸序列的延长链的3’端发生链杂交反应，最终形成基于FRET荧光比率的DNA生物传感器；
所述带有FRET供体和FRET受体的核苷酸链由两条核苷酸短链共同组成；
所述核苷酸短链的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
2.如权利要求1所述的DNA生物传感器，其特征在于，所述FRET供体或FRET受体为FITC、FAM、TET、RBITC、TAMRA、TRITC、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、AlexaFluor350、AlexaFluor405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor610、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor480、AlexaFluor700、AlexaFluor750中的一种。
3.如权利要求1或2所述的DNA生物传感器在制备检测细胞内大分子拥挤环境产品中的应用。
4.如权利要求1或2所述的DNA生物传感器在制备检测由药物刺激或渗透压刺激造成细胞内大分子拥挤环境产品中的应用。
5.如权利要求1所述的DNA生物传感器检测细胞内拥挤环境的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）构建四面体DNA纳米结构溶液；
2）将一条带有Cy3荧光基团的核苷酸短链和一条带有Cy5荧光基团核苷酸短链加入至四面体DNA纳米结构溶液中混合形成混合液，然后将混合液置于60～70℃下保持5～10min，缓慢降至室温，得如权利要求1所述的DNA生物传感器；
3）将合成的DNA生物传感器加入至拥挤剂中，室温孵育，在500 nm的激发波长下记录500 nm至800 nm的荧光发射图谱，观察Cy3荧光基团和Cy5荧光基团的荧光强度变化，计算FRET荧光比率；
所述步骤1）中，构建四面体DNA纳米结构溶液包括以下具体步骤：
取如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4所示的核苷酸单链按照质量比为1:1:1:1加入至TMbuffer中混合，四条核苷酸单链的终浓度为1 μM，将混合好的溶液放入置于 92～96 °C保持5～10min，然后迅速降温至 4 °C 保持30 min以上，即得四面体DNA纳米结构溶液；
所述拥挤剂为分子量分别为200、1000、2000、8000的聚乙二醇溶液。
6.一种采用线性判别分析算法联合权利要求1或2所述的DNA生物传感器在精准区分不同种类细胞中的应用，其特征在于，区分不同种类细胞的方法，
包括以下步骤：
S1、采用权利要求1或2所述的DNA生物传感器与已知细胞的重悬液混合，收集已知细胞在不同渗透压刺激下的FRET供体和FRET受体的荧光强度，计算已知细胞的重悬液在不同渗透压刺激下的FRET比率，基于已知细胞的重悬液的FRET比率构建已知细胞的指纹图谱；
S2、采用权利要求1或2所述的DNA生物传感器与未知细胞的重悬液混合，收集未知细胞在不同渗透压刺激下的FRET供体和FRET受体的荧光强度，计算未知细胞的重悬液在不同渗透压刺激下的FRET比率，将未知细胞的重悬液的FRET比率与步骤S1已知细胞的指纹图谱匹配，根据匹配结果得到所述未知细胞的种类；所述细胞为Raw、HeLa、3T3、A549、HepG2或ct26。
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